BR102021013160A2 - Plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos - Google Patents

Abstract

A presente patente pertence ao campo técnico de aparelhos para culturas de células, em particular, se refere a uma plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos (1) compreendendo um módulo de plataforma em silicone (2), ao menos um conector frontal (3A), caixa de suporte (4) para dito módulo de plataforma em silicone (2) e ao menos dito conector frontal (3), e tampa (5) de sobreposição e vedação do dito módulo de plataforma em silicone (2). A plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes eco toxicológicos (1) da presente invenção propicia uma plataforma de cultivo automatizado para esferoide de células de peixe que facilita a manutenção desse modelo 3D no ambiente in vitro, possibilitando, assim, a sua utilização para testes de ecotoxicidade de substâncias químicas.

Description

PLATAFORMA DE CULTIVO DE ESFEROIDES CELULARES PARA TESTES ECOTOXICOLÓGICOS

[001] A presente patente de invenção pertence ao campo técnico de aparelhos para culturas de células, em particular, se refere a uma plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos, incluindo um módulo de plataforma impressa em material de moldagem foto polimerizável com o objetivo de facilitar o cultivo de esferoides celulares a longo prazo para testes ecotoxicológicos.

ESTADO DA TÉCNICA

[002] Diversos documentos de patente encontrados no estado da técnica apresentam dispositivos para geração e cultura de células, tais como os documentos US2019322969, US2019309249 e US2017226458. Em particular, os documentos publicados sob os números WO13116449, US9701938 e BR112014010855-2 descrevem o fornecimento de fluido aos meios de cultivo de células por meio de um sistema de perfusão.

PROBLEMA TÉCNICO

[003] Alguns documentos encontrados no estado da técnica, apesar de apresentarem plataformas de cultivo de células micro fluídicas, não se equiparam ou têm o mesmo objetivo de uso da presente invenção, sendo em sua maioria voltados ao cultivo de células humanas, portanto, não conseguem atingir a necessidade de prover um cultivo de células de peixe com a finalidade técnica específica de avaliação do potencial de toxicidade ambiental/aquática, tal como proposto na presente invenção.

[004] Em particular, esferoide celular é uma cultura de substrato não aderente que favorece a agregação celular e posterior maturação das células em forma esférica. É um tipo de cultivo 3D que pode reproduzir in vitro condições mais semelhantes às condições in vivo. No que diz respeito a esferoides de células de peixe, esses modelos visam melhor representar in vitro a organização celular, tecidual ou de órgãos de peixes, recriando, assim, modelos biológicos com potencial de substituir modelos de organismos inteiros (peixes) em testes de ecotoxicidade.

[005] Esferoides celulares, apesar de serem promissores modelos de substituição a testes com animais, apresentam dificuldade de implementação no contexto industrial devido à necessidade de cuidados frequentes de manutenção do cultivo celular pelo operador. Além disso, o tempo de vida desses esferoides celulares em um cultivo tradicional estático é limitado entre 5 e 10 dias após a finalização do processo de construção.

[006] Ademais, quando o cultivo está na placa (e não na plataforma), as células vão consumindo o meio e precisam ser alimentadas, necessitando diversas ações tais como retirar a placa, trocar o meio, retornar para condição controlada, dentre outras.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[007] A presente invenção apresenta uma plataforma de cultivo de esferoides celulares que permite avaliar os danos causados ao ambiente e os seus organismos aquáticos (ex. peixes), sem os expor aos eventuais agentes nocivos, posto que não utiliza animais para a condução dos seus testes.

[008] Para que tal avaliação/simulação seja possível, a presente invenção apresenta uma plataforma altamente sustentável, permitindo o reuso de parte de seus componentes e tendo ampla longevidade para uma pluralidade de aplicações/testes.

[009] Considerando que o esferoide celular é uma agregação celular 3D capaz de reproduzir in vitro condições mais semelhantes ao in vivo, a solução aqui apresentada é desenvolvida, neste caso, com o propósito de simular os organismos representativos do ecossistema aquático, os quais são submetidos a diferentes concentrações de um ou mais agentes por um período de tempo pré-determinado.

[0010] A automatização do sistema de cultivo de esferoides, tal como propiciada pelas características da plataforma de cultivo de esferoides celulares da presente invenção, reduz a necessidade de cuidados frequentes pelo operador, assim como também possibilita manutenção a longo prazo, sendo importante para testes de toxicidade crônica e cumulativa. A redução do manuseio, no qual os modelos são retirados de sua condição ótima e controlada de cultivo, associado ao cultivo em perfusão (conectividade por bomba e fluxo constante de meio de cultivo) pode proporcionar melhorias nas condições fisiológicas e metabólicas das células e resultar em um modelo in vitro mais robusto para avaliação de efeitos de ecotoxicidade de produtos químicos. Além disso, de acordo com a plataforma de cultivo de esferoides da presente invenção, é permitido avaliar um maior número de amostras em um menor período, sem a necessidade de manuseio constante, ou seja, a "automatização" do sistema de cultivo de esferoides celulares, sendo isso um diferencial inusitado em relação ao estado da técnica.

[0011] A plataforma de cultivo de esferoides da presente invenção propicia uma plataforma de cultivo automatizado para esferoide de células de peixe que facilita a manutenção desse modelo 3D no ambiente in vitro, possibilitando, assim, a sua utilização para testes de ecotoxicidade de substâncias químicas em média performance.

[0012] Considerando que os avanços biotecnológicos em associação com a pressão para que se substitua a experimentação animal impulsionam o desenvolvimento de modelos in vitro (laboratório) mais fisiológicos e preditivos da resposta in vivo (animais-peixes), a plataforma de cultivo de esferoides da presente invenção promove a sustentabilidade de produtos e contribui para a promoção de métodos de substituição a testes com animais vertebrados.

[0013] Apesar de um modelo in vitro buscar a representação mais fidedigna da condição in vivo, este modelo é de difícil manutenção a longo prazo, dificultando testes com doses repetidas ou a longo prazo. Por outro lado, o dispositivo/solução da presente invenção, além de proporcionar melhorias nas condições fisiológica e metabólica das células, tornando esse modelo in vitro mais robusto para avaliação do potencial de ecotoxicidade de produtos químicos, proporciona menor demanda de manuseio, o que otimiza a atuação de um pesquisador dentro de uma empresa.

[0014] Em comparação com as demais plataformas de cultivo automatizado existentes, mesmo que por vezes sejam para finalidades diferentes, a plataforma cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos de acordo com a presente invenção, de modo inusitado em relação ao estado da técnica, além de simular organismos aquáticos para avaliação do potencial de toxicidade ambiental de produtos, apresenta componentes reutilizáveis, visando propiciar sustentabilidade no desenvolvimento de métodos de substituição a testes com animais concomitante à disponibilização de uma plataforma de cultivo de esferoides de fácil manutenção.

[0015] Os desafios e motivações que resultam o desenvolvimento da plataforma de cultivo de esferoides de acordo com a presente invenção giram em torno de elaborar uma plataforma que permita não apenas a automatização do cultivo de esferoides de peixe, mas também possibilite análises de ecotoxicidade de substâncias químicas em média performance. Deste modo, otimizações das características da plataforma são realizadas para proporcionar sua conectividade a diferentes tipos de bombas de perfusão, sendo elas do tipo bomba de infusão (seringa) de até 10 canais e bomba peristáltica de 2 canais. A conexão na bomba de infusão possibilitará testes simultâneos de 2 a 8 substâncias com “n” amostras, por exemplo de 10 esferoides cultivados individualmente mas com conexão de canais, favorecendo, assim, surpreendentemente, a não formação de multi-agregados de esferoides que é encontrada nos sistemas de cultivo do estado da técnica. A conexão na bomba peristáltica permite resultados semelhantes à bomba de infusão no que se refere ao impedimento de multi-agregados de esferoides, mas difere em proporcionar teste de uma única substância por experimento. Porém, nesse tipo de análise, o n amostral é aumentado (n=50) e as avaliações, então, podem ser conduzidas com aplicação simultânea de múltiplos marcadores de ecotoxicidade, o que pode melhorar a precisão de informações acerca dos impactos a peixes de uma dada substância química.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0016] A descrição que se segue não se limita aos desenhos ou componentes citados, tendo como referência as seguintes ilustrações referenciadas abaixo.

[0017] As Figuras 1A e 1B apresentam vistas em perspectiva superior da plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos de acordo com um primeiro modo de execução da presente invenção.

[0018] As Figuras 2A e 2B apresentam vistas em perspectiva frontal e posterior detalhando os conectores presentes na plataforma de cultivo de esferoides detalhada na Figura 1.

[0019] A Figura 3 apresenta uma vista em perspectiva da caixa de suporte e conectores da plataforma de cultivo de esferoides detalhada na Figura 1.

[0020] A Figura 4 apresenta uma vista em perspectiva detalhando o módulo de plataforma em silicone presente na plataforma de cultivo de esferoides detalhada na Figura 1.

[0021] As Figuras 5A e 5B apresentam vistas em perspectiva detalhando o módulo de plataforma em silicone juntamente com os conectores presentes na plataforma de cultivo de esferoides detalhada na Figura 1.

[0022] A Figura 6 apresenta uma vista em perspectiva superior da plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos de acordo com um segundo modo de execução da presente invenção.

[0023] A Figura 7 apresenta uma vista em perspectiva do módulo de plataforma em silicone juntamente com os conectores posicionados sobre a base de suporte da plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos de acordo com o segundo modo de execução da presente invenção.

[0024] A Figura 8 apresenta uma vista em corte perpendicular do módulo de plataforma em silicone juntamente com os conectores presentes nas plataformas de cultivo de esferoides detalhadas nas Figuras 5A, 5B e 7.

[0025] As Figuras 9A e 9B apresentam uma vista em perspectiva superior da plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos de acordo com um terceiro modo de execução da presente invenção.

[0026] A Figura 10A apresenta uma vista em perspectiva detalhando o módulo de plataforma em silicone juntamente com os conectores presentes na plataforma de cultivo de esferoides detalhada na Figura 9A e 9B.

[0027] A Figura 10B apresenta uma vista em corte perpendicular do módulo de plataforma em silicone juntamente com os conectores da Figura 10A.

[0028] As Figuras 11A e 11B apresentam vistas em perspectiva superior posterior e perspectiva superior frontal do módulo de plataforma em silicone juntamente com os conectores posicionados sobre a base de suporte da plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos de acordo com o terceiro modo de execução da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0029] Conforme apresentado nas Figuras 1A, 1B e 6, que apresentam vistas em perspectiva superior da plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos de acordo com um primeiro e um segundo modo de execução da presente invenção, a presente invenção se refere a uma plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos (1), compreendendo, essencialmente, um módulo de plataforma em silicone (2), ao menos um conector frontal (3A) e ao menos um conector posterior (3B) posicionados sobrepostos em cada extremidade oposta de uma caixa de suporte (4), dita caixa de suporte (4) para dito módulo de plataforma em silicone (2) e para ditos conectores (3A e 3B), e tampa (5) de sobreposição e vedação do dito módulo de plataforma em silicone (2).

[0030] Cada conector frontal (3A) e conector posterior (3B) compreende ao menos um orifício (6) de entrada de bomba de perfusão (para cultivo em perfusão, tal como para uma bomba de infusão (seringa) ou uma bomba peristáltica) que deriva em uma pluralidade de orifícios de saída (7), por exemplo, cinco orifícios de saída, para uma plataforma de cultivo automatizado conforme é apresentado em um primeiro modo de execução exemplificado nas Figuras 2A e 2B. Neste primeiro modo de execução, sem que se limite o escopo da presente invenção, cada um dos pares de conectores frontais (3A) e conectores posteriores (3B) pode compreender um único orifício (6) de entrada de bomba de perfusão (para cultivo em perfusão, tal como para uma bomba de infusão (seringa) ou uma bomba peristáltica) que deriva em cinco orifícios de saída (7).

[0031] De modo alternativo, conforme pode ser visto nas Figuras 6 a 8, em um segundo modo de execução, sem que se limite o escopo da presente invenção, a plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos (1) compreende um único conector frontal (3A) e um único conector posterior (3B). Assim, cada conector frontal (3A) e conector posterior (3B) pode compreender um único orifício (6) de entrada de bomba de perfusão (para cultivo em perfusão, tal como para uma bomba de infusão (seringa) ou uma bomba peristáltica) que deriva em dez orifícios de saída (7).

[0032] Obviamente, a escolha de cada conjunto de conectores (3A, 3B) de entrada de bomba de perfusão, seja de acordo com o primeiro ou o segundo modo de execução da presente invenção, depende de sua utilização para bomba de infusão (seringa), ou para bomba peristáltica.

[0033] Em particular, a plataforma cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos (1) apresenta características funcionais inusitadas para incorporação de bomba de perfusão (cultivo em perfusão) por meio de seus conectores (3A e 3B) que, conforme visto, por exemplo, nas Figuras 3, 5A, 5B e 7, são sobrepostos sobre extremidades opostas da caixa de suporte (4), e permitem a passagem e retirada constante de meio, reduzindo o manuseio e prolongando o prazo de vida, sendo que tal fluxo também auxilia as células em cultivo a terem uma condição mais semelhante a um ser vivo.

[0034] Tais conectores (3A e 3B) podem ser obtidos por impressão 3D, de modo que são reutilizáveis.

[0035] A caixa de suporte (4) serve para proteger o módulo de plataforma em silicone (2) e permitir a estabilidade de todo conjunto da plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos (1), sendo preferencialmente confeccionada em material transparente de modo a possibilitar a observação do cultivo de esferoides por microscopia.

[0036] Na determinação da geometria do módulo de plataforma em silicone (2) se considera a viabilização do uso de esferoides de peixe em testes de toxicidade de média performance. Conforme detalhado nas Figuras 4 a 8, dito módulo de plataforma em silicone (2) é composto por uma pluralidade de fileiras de fossos independentes (8) de avaliação de substâncias químicas, por exemplo, por 10 fileiras independentes para avaliação de 2 a 8 substâncias químicas e controles com “n” amostras, por exemplo de 10 esferoides cultivados individualmente. Cada fileira de fosso independente (8) compreende uma pluralidade de cavidades (9) com geometria específica de orifício superior cilíndrico (10) e fundo semiesférico (11) para manutenção dos esferoides, por exemplo 10 cavidades, que por mais que sejam interconectadas por meio de um canal comum superior (12) que percorre cada fileira de fosso independente (8) de modo que o meio seja uniformemente distribuído, transpassando cada orifício superior cilíndrico (10) e compreendendo um orifício de extremidade (13), permite o cultivo de um único esferoide por cavidade (9) de fundo semiesférico (11) independente, de modo a evitar a adesão entre esferoides que muitas vezes é visualizada em outros sistemas de cultivo em perfusão.

[0037] Apesar da plataforma cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos (1) da presente invenção ser conduzida, preferivelmente, de acordo com o primeiro ou segundo modos de execução, dependendo de sua utilização para bomba de infusão (seringa), ou para bomba peristáltica, sem que se restrinja a presente invenção, é possível abarcar ainda um terceiro modo de execução, de acordo com as Figuras 9A a 11B, no qual pode haver um ou mais conector(es) (3A), compreendendo ao menos um orifício (6) de entrada e uma pluralidade de orifícios (7) de saída, sobreposto(s) somente sobre uma extremidade da caixa de suporte (4).

[0038] Apesar da escala de tamanho do módulo de plataforma em silicone (2) de acordo com o modo de execução aqui apresentado não ser elaborada em escala nanométrica, é possível prever, a partir do escopo da presente invenção, adequações de escala que permitam testes de substâncias em volume reduzido para viabilizar uso em estágios iniciais do processo de desenvolvimento e sustentabilidade de produtos.

[0039] O módulo de plataforma em silicone (2) é desenvolvido com o objetivo de facilitar a manutenção no ambiente in vitro de esferoides de células de peixe. Este módulo de plataforma em silicone (2) é elaborado de forma a automatizar o cultivo de esferoides de células de peixe, permitindo a manutenção em cultivo desses modelos 3D a curto e longo prazo.

[0040] Como o módulo de plataforma em silicone (2) tem que ser mantido em ambiente estéril e manuseado em certos momentos, apesar da automatização, também é disposta na presente invenção a caixa de suporte (4) e a tampa (5) de sobreposição e vedação do módulo de plataforma em silicone (2), por exemplo, em dimetil polissiloxano (PDMS). Essa caixa de suporte (4) pode ser 100% produzida em material foto polimerizável, sendo ainda suscetível a processos de esterilidade e reutilizável o que proporciona uma redução da quantidade de lixo descartável resultantes de processos de cultivo celular.

[0041] A tampa (5) de sobreposição e vedação do módulo de plataforma em silicone (2), compreende em uma extremidade uma série de aberturas (14), alinhadas a cada orifício de extremidade (13) de canal comum superior (12) de cada fileira de fosso independente (8) do módulo de plataforma em silicone (2), sendo dita tampa (5) preferencialmente confeccionada em material transparente de modo a possibilitar a observação do cultivo de esferoides.

[0042] O módulo de plataforma em silicone (2) presente na plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos (1) da presente invenção é obtido por meio de um molde impresso em material foto polimerizável e confecção final, por exemplo, de uso em PDMS.

[0043] A plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos (1) apresenta aplicação industrial, sendo projetada para ser utilizada como ferramenta de análise de toxicidade aquática de substâncias químicas que possa contribuir com a sustentabilidade de produtos pelo desenvolvimento de produtos ecológicos. Ademais, a plataforma de cultivo de esferoides celulares para testes ecotoxicológicos (1) é reprodutível (reutilizável) em escala industrial, compreendendo ainda um aspecto de reduzir a quantidade de lixo gerado pelo processo de cultura de células, e de reduzir a necessidade de constante acompanhamento do cultivo de esferoides celulares por profissionais.

Claims (9)

1. “PLATAFORMA DE CULTIVO DE ESFEROIDES CELULARES PARA TESTES ECOTOXICOLÓGICOS”, caracterizada por compreender um módulo de plataforma em silicone (2), ao menos um conector frontal (3A), caixa de suporte (4) para dito módulo de plataforma em silicone (2) e dito conector frontal (3A), e tampa (5) de sobreposição e vedação do dito módulo de plataforma em silicone (2); em que o conector frontal (3A) é sobreposto sobre uma das extremidades da caixa de suporte (4), e compreende ao menos um orifício (6) de entrada de bomba de perfusão que deriva em uma pluralidade de saídas (7) para o módulo de plataforma em silicone (2); em que o módulo de plataforma em silicone (2) é composto por uma pluralidade de fileiras de fossos independentes (8); em que cada fileira de fosso independente (8) compreende uma pluralidade de cavidades (9), em que cada dita cavidade (9) é constituída por uma geometria de orifício superior cilíndrico (10) e fundo semiesférico (11) de manutenção e cultivo de um único esferoide; sendo ditas cavidades (9) de cada fileira de fosso independente (8) interconectadas por meio de um canal comum superior (12) que percorre cada fileira de fosso independente (8), transpassando cada orifício superior cilíndrico (10) e compreendendo o ao menos um orifício de extremidade (13); em que a tampa (5) de sobreposição e vedação do módulo de plataforma em silicone (2) compreende, ao menos em uma extremidade, uma série de aberturas (14), alinhadas a cada orifício de extremidade (13) de canal comum superior (12) de cada fileira de fosso independente (8) do dito módulo de plataforma em silicone (2).
2. “PLATAFORMA DE CULTIVO DE ESFEROIDES CELULARES PARA TESTES ECOTOXICOLÓGICOS”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por o módulo de plataforma em silicone (2), compreender adicionalmente: ao menos um conector posterior (3B), e a caixa de suporte (4) ser para dito módulo de plataforma em silicone (2) e ditos conectores (3A e 3B); em que o conector posterior (3B) é sobreposto sobre uma extremidade da caixa de suporte (4), oposta à extremidade em que ao menos um conector frontal (3A) é sobreposto, e compreende ao menos um orifício (6) de entrada de bomba de perfusão que deriva em uma pluralidade de saídas (7) para o módulo de plataforma em silicone (2); em que a tampa (5) de sobreposição e vedação do módulo de plataforma em silicone (2) compreende, adicionalmente, em uma segunda extremidade oposta à primeira extremidade, uma série de aberturas (14), alinhadas a cada orifício de extremidade (13) de canal comum superior (12) de cada fileira de fosso independente (8) do dito módulo de plataforma em silicone (2).
3. “PLATAFORMA DE CULTIVO DE ESFEROIDES CELULARES PARA TESTES ECOTOXICOLÓGICOS”, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada por compreender dois conectores frontais (3A), em que cada um dos dois conectores frontais (3A) compreendem um único orifício (6) de entrada de bomba de perfusão que deriva em cinco saídas (7) para o módulo de plataforma em silicone (2).
4. “PLATAFORMA DE CULTIVO DE ESFEROIDES CELULARES PARA TESTES ECOTOXICOLÓGICOS”, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por compreender adicionalmente dois conectores posteriores (3B), em que cada um dos dois conectores posteriores (3B) compreendem um único orifício (6) de entrada de bomba de perfusão que deriva em cinco saídas (7) para o módulo de plataforma em silicone (2).
5. “PLATAFORMA DE CULTIVO DE ESFEROIDES CELULARES PARA TESTES ECOTOXICOLÓGICOS”, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada por compreender um único conector frontal (3A) compreendendo um único orifício (6) de entrada de bomba de perfusão que deriva em dez saídas (7) para o módulo de plataforma em silicone (2).
6. “PLATAFORMA DE CULTIVO DE ESFEROIDES CELULARES PARA TESTES ECOTOXICOLÓGICOS”, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por compreender adicionalmente um único conector posterior (3B) compreendendo um único orifício (6) de entrada de bomba de perfusão que deriva em dez saídas (7) para o módulo de plataforma em silicone (2).
7. “PLATAFORMA DE CULTIVO DE ESFEROIDES CELULARES PARA TESTES ECOTOXICOLÓGICOS”, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizada por qualquer um dos conectores (3A, 3B), a caixa de suporte (4) e a tampa (5) serem constituídos por material impresso em 3D reutilizável.
8. “PLATAFORMA DE CULTIVO DE ESFEROIDES CELULARES PARA TESTES ECOTOXICOLÓGICOS”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a caixa de suporte (4) ser constituída por material transparente.
9. “PLATAFORMA DE CULTIVO DE ESFEROIDES CELULARES PARA TESTES ECOTOXICOLÓGICOS”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por a tampa (5) ser constituída por material transparente.

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