BR102020004814A2 - Polipeptídeo, processo para a obtenção de uma imunoglobulina igy, imunoglobulina igy, uso de uma imunoglobulina igy e de um polipeptídeo, e, composição imunogênica - Google Patents

Abstract

polipeptídeo, processo para a obtenção de uma imunoglobulina igy, imunoglobulina igy, uso de uma imunoglobulina igy e de um polipeptídeo, e, composição imunogênica. shigella é um patógeno gram-negativo causador de disenteria aguda, e que acomete principalmente crianças menores de cinco anos de idade em países de baixa e média renda, ocasionando milhares de óbitos por ano. em decorrência disso, diversos estudiosos têm se empenhado na busca por uma alternativa eficaz e segura, principalmente pela falta de uma vacina eficaz e pela disseminação de cepas multirresistentes. no presente pedido, proteínas de membrana externa e proteína componente de pilus tipo 1 de membrana externa de bactérias gram negativas foram utilizadas para avaliar sua capacidade de geração de uma resposta imune em mamíferos e de produção de igy (imunoglobulina y). a igy obtida e isolada, foi avaliada quanto a sua reatividade, possuindo grande potencial para utilização em métodos de imunidade passiva contra bactérias gram negativas.

Description

POLIPEPTÍDEO, PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE UMA IMUNOGLOBULINA IGY, IMUNOGLOBULINA IGY, USO DE UMA IMUNOGLOBULINA IGY E DE UM POLIPEPTÍDEO, E, COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA CAMPO DA INVENÇÃO

[001] Shigella é um patógeno Gram-negativo causador de disenteria aguda, e que acomete principalmente crianças menores de cinco anos de idade em países de baixa e média renda, ocasionando milhares de óbitos por ano. Em decorrência disso, diversos estudiosos têm se empenhado na busca por uma alternativa eficaz e segura, principalmente pela falta de uma vacina eficaz e pela disseminação de cepas multirresistentes. No presente pedido, peptídeos de proteínas de membrana externa e de proteína componente de pilus tipo 1 de membrana externa de bactérias gram negativas foram utilizadas para avaliar sua capacidade de produção de IgY (Imunoglobulina Y). A IgY obtida e isolada, foi avaliada quanto a sua reatividade.

[002] A IgY obtida possui grande potencial para utilização em métodos de imunidade passiva contra bactérias Gram negativas, como por exemplo Shigella spp., e poderá servir de base para aplicação contra doenças causadas por diversas bactérias Gram negativas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[003] A shigelose, é uma doença diarreica infecciosa causada pelo enteropatógeno bacteriano Gram-negativo Shigella (YANG et al., 2018), o qual acomete principalmente crianças na faixa etária de zero a cinco anos de idade (PARAJULI et al., 2019), sendo a maioria dos casos ocorrentes em países de baixa e média renda (BONA et al., 2019).

[004] Fatores como condições precárias de saneamento básico e baixo nível socioeconômico, colaboram para a ocorrência de milhões de infecções e óbitos por ano, sendo considerada um problema global de saúde humana (PUZARI et a., 2018; MUTHUIRULANDI et al., 2016).

[005] O gênero Shigella comporta os quatro grupos S. flexneri, S. sonnei, S. dysenteriae e S. boydii (FRENCK et al., 2018; FARZAM et al. 2017), restritas a primatas, o que as diferenciam dos demais membros da família Enterobactereaceae, a qual o gênero está inserido (MATTOCK et al., 2017; TRIKHA et al., 2017). A infecção pode se dar com uma baixa dose infecciosa de 10-100 células bacterianas, transmitida através de moscas domésticas, pessoa a pessoa, água e alimentos contaminados por via fecal-oral, podendo também ser transmitida sexualmente (BONA et al., 2019). As espécies de Shigella causam a disenteria bacilar em humanos por invasão de células epiteliais do intestino, multiplicação intracelular, disseminação para células adjacentes e consequentemente a indução de respostas inflamatória no intestino (KOESTLER et al., 2018; GOPAL et al., 2017).

[006] A Organização mundial da Saúde (OMS) preconiza a utilização de antibióticos apenas para os casos grave da doença, porém alguns estudiosos têm discutido que inclusão dos casos de diarreia leve pode colaborar com a redução da mortalidade associada a Shigella (THIKELL et a., 2017). Espécies de Shigella já foram susceptíveis a ampicilina, cloranfenicol, cotrimoxazol, ácido nalidíxico, no entanto diversas cepas já desenvolveram resistência a fluoroquinolonas, cefalosporinas e azitromicina. (PUZARI et al., 2018; TRIKHA et al., 2017). Considerando o desenvolvimento de resistência a antibióticos como parte da evolução de bactérias, a OMS declarou esta situação crítica como uma questão de crise global (PUZARI et al. 2018), indicando a necessidade de revisão imediata do tratamento recomendado para shigelose, principalmente quando o mesmo é realizado empiricamente. Apesar de existirem diversos estudos em fase de ensaios clínicos, até o momento não há nenhuma vacina segura, eficaz, licenciada e disponível (FRENCK et al., 2018; NICKERSON et al., 2017).

[007] Com a latência no desenvolvimento de novos antibióticos, há uma extrema necessidade de novas abordagens terapêuticas para infecções bacterianas, sendo o direcionamento a fatores de virulência uma estratégica abordagem para impedir a adesão bacteriana (MYDOCK-MCGRANE et al., 2017). A adesão bacteriana é facilitada pela ligação da lectina FimH a glicoproteínas manosiladas que revestem o epitélio. Esta lectina, específica para manose está localizada na extremidade distal do pili tipo 1, uma classe de microfibrila proteica altamente expressa em patógenos entéricos Gram negativos (MYDOCK-MCGRANE et al., 2017).

[008] Dentre os métodos atualmente em desenvolvimento, destaca-se o uso de anticorpos para aplicação em tratamentos por imunidade passiva. Dentre eles, a tecnologia de IgY, ou seja, a produção e aplicação de imunoglobulinas Y (IgY), tem atraído bastante atenção devido às vantagens que proporcionam como baixo custo e maior rendimento produtivo na obtenção de anticorpos e aspecto positivo quanto a ética na utilização de animais, pois possibilita a redução de animais necessários e um método não invasivo na produção anticorpos. Além disso, esses anticorpos possibilitam a redução de interferências em testes imunológicos por não apresentarem reatividade com as proteínas estafilocócica (A) e estreptocócicas(G), IgG de mamíferos, proteínas do complemento e fatores reumatoides devido à falta de receptores Fc correspondentes.

[009] As imunoglobulinas IgYs são produzidas por aves, répteis e anfíbios. A função das IgYs é semelhante à das IgGs de mamíferos. As IgYs estão presentes nos soros desses animais e são passadas para o embrião através da gema do ovo. Anticorpos IgY de ovos já foram sugeridos anteriormente contra infecções bacterianas e virais.

[0010] Acredita-se que a IgY funcione ao se ligar aos patógenos, levando à sua eliminação através do intestino e à prevenção da replicação. Em alguns casos, a imunização passiva usando anticorpos IgY tem início rápido e pode ser administrada a pacientes com infecção ativa. Também pode ser usada em seres com resposta imune imatura ou prejudicada, como bebês e adultos imunocomprometidos.

[0011] Uma vantagem adicional das IgYs é o alto teor de ácido siálico, que se acredita que possa prover um aumento da sua meia-vida em comparação com outros compostos com menor teor de ácido siálico. Esse achado sugere que a terapia baseada em IgY poderia ter uma meia-vida em circulação mais longa, o que poderia aumentar sua eficácia contra infecções (Abbas, A.T., 2019)

[0012] Nesse sentido, o documento de Amro et al. (2018) descreve o uso de epítopos sintéticos de proteínas de membrana externa OmpC para imunização de camundongos contra shigelose e obtenção de anticorpos contra Shigella flexneri 3a a partir do mesmo. A invenção citada, entretanto, não reivindicaria as sequências derivadas de FimH, mas sim de OmpC. Em nenhum momento descreve o uso de FimH. O documento ensina isolamento de anticorpos IgY de aves imunizadas em larga quantidade e alto grau de pureza através da precipitação com polietileno glicol e sistema cromatográfico.

[0013] Já o documento de Jarzab et al. (2018) descreve um método de imunização em aves, incluindo um método de produção, expressão, separação, purificação, caracterização, validação e preparo de composição contendo IgY pela inoculação, via seringa, de antígenos de Salmonella typhimurium. Entretanto, a o antígeno utilizado inclui apenas proteínas de Salmonella typhimurium de grau de pureza comercial, não havendo consórcio ou combinação de outras possíveis bactérias. Portanto tal referência não supre a necessidade de obtenção de novas alternativas para aplicação no tratamento de infecções de Shigella.

[0014] Por fim, o documento WO2009141455 mostra como obter sinteticamente antígenos naturais de membrana, ou antígenos-O (Ag-O). Tais são direcionados aos lipopolissacarídeos de membrana (LPS) de bactérias gram-negativas. A Shigella flexneri sorotipo 2a foi usada como modelo para síntese dos peptídeos antigênicos. A principal aplicação é descrita na reivindicação de uso na preparação de uma vacina através dos anticorpos responsáveis por ligarem aos ditos epítopos. O método engloba o uso de peptídeos de tamanho curto (~12aa), entretanto o documento se restringe ao uso de antígenos-O. O método de produção do anticorpo revelado no documento consiste em imunizar um mamífero não-humano com uma composição compreendendo o polipeptídeo, O-Ag. Entretanto, tal anticorpo é parte da família de imunoglobulinas tipo G, de mamífero (IgG), mais especificamente um mAb F22-4 murino.

[0015] Assim, surge a necessidade da identificação de novos antígenos de Shigella adequados para utilização na produção de IgYs que possam ser úteis em métodos de imunização passiva, tratamento e prevenção de infecções causadas por patógenos Gram negativos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0016] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a um polipeptídeo possuindo pelo menos 80% de identidade com a sequência como descrita em qualquer uma das SEQ ID Nos. 1 a 12.

[0017] Em uma realização o polipeptídeo possui pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das SEQ ID Nos. 2, 6 ou 9.

[0018] Em outra realização preferencial, o polipeptídeo de acordo com a presente invenção tem a sequência como descrita na SEQ ID No. 9.

[0019] Em um segundo aspecto, o presente pedido se refere a um processo para a obtenção de uma imunoglobulina IgY compreendendo as etapas de:

• a) inocular pelo menos um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em uma ave; e
• b) recuperar as imunoglobulinas IgY a partir do ovo produzido pela referida ave.

[0020] Em uma realização, a referida imunoglobulina IgY é recuperada a partir da gema do dito ovo produzido pela ave.

[0021] Em outra realização, a referida ave é selecionada dentre as aves da família Phasianidae. Preferencialmente, a referida ave é do gênero Gallus.

[0022] Em uma realização preferencial, a referida ave é selecionada dentre as espécies Gallus gallus, Gallus lafayettii, Gallus sonneratii, e Gallus varius.

[0023] Em outra realização preferencial, a referida ave é selecionada dentre faisões, perdizes, galinhas, perus, codornas, pombas, e pavões.

[0024] Em uma realização da presente invenção, pelo menos uma dose de reforço é administrada à ave de forma a mantê-la em um estado hiperimune.

[0025] Em um terceiro aspecto, a presente invenção se refere a uma imunoglobulina IgY obtida pelo processo como descrito acima.

[0026] Em um quarto aspecto, a invenção se refere ao uso de uma imunoglobulina IgY para a manufatura de uma composição para a prevenção ou tratamento de infecções por bactérias Gram negativas.

[0027] Em outro aspecto, a presente invenção se refere ao uso de um polipeptídeo para a manufatura de uma composição para provocar uma resposta imune contra uma bactéria Gram negativa em uma ave.

[0028] Em uma realização, a referida bactéria Gram negativa é pertencente à família Enterobacteriaceae.

[0029] Em outra realização de acordo com a presente invenção, a bactéria é selecionada dentre as bactérias pertencentes aos gêneros Alishewanella, Alterococcus, Aquamonas, Aranicola, Arsenophonus, Azotivirga, Blochmannia, Brenneria, Buchnera, Budvicia, Buttiauxella, Cedecea, Citrobacter, Dickeya, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Grimontella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Phlomobacter, Photorhabdus, Plesiomonas, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Raoultella, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shigella, Sodalis, Tatumella, Trabulsiella, Wigglesworthia, Xenorhabdus, Yersinia, e Yokenella.

[0030] Em uma realização preferida, a referida bactéria é selecionada dentre as bactérias pertencentes aos gêneros Enterobacter, Escherichia, Salmonella e Shigella.

[0031] Em uma realização, a referida bactéria do gênero Enterobacter é selecionada dentre E. amnigenus, E. arachidis, E. asburiae, E. cancerogenous, E. cloacae, E. cowanii, E. dissolvens, E. gergoviae, E. helveticus, E. hormaechei, E. intermedius, E. kobei, E. ludwigii, E. mori, E. nimipressuralis, E. oryzae, E. pulveris, E. pyrinus, E. radicincitans, E. taylorae, E. turicensis, e E. soli.

[0032] Em outra realização, a referida bactéria do gênero Escherichia, é selecionada dentre E. albertii, E. coli, E. fergusonii, E. hermannii, E. marmotae, e E. vulneris.

[0033] Em mais uma realização, a referida bactéria do gênero Salmonella, é selecionada dentre Salmonella bongori, e Salmonella entérica.

[0034] Em uma outra realização, a referida bactéria do gênero Shigella, é selecionada dentre S. boydii, S. dysenteriae, S. flexneri, e S. sonnei.

[0035] Em mais um aspecto, a presente invenção se refere a uma composição imunogênica que compreende:
um elemento imunologicamente ativo selecionado do grupo consistindo de uma imunoglobulina IgY da invenção, um ovo de ave obtido pelo processo de acordo com a invenção, ou uma gema isolada desse ovo; e
um excipiente, veículo ou carreador biologicamente aceitável.

[0036] Em uma realização, a formulação é formulada sob a forma de uma composição farmacêutica ou nutracêutica.

[0037] Em outra realização, o referido excipiente, veículo ou carreador biologicamente aceitável é selecionado do grupo compreendendo um desintegrante ou auxiliar de desintegrante, aglutinante, agente de revestimento, corante, diluente, base, solubilizante ou auxiliar de solubilizante, agente de isotonicidade, regulador de pH, estabilizante, propelente, adesivo e semelhantes.

[0038] Em uma outra realização, a formulação é formulada para ser administrada por via oral. Preferencialmente, a formulação está na forma de comprimido, tablete, cápsula, pó, grânulo fino, grânulo, solução, suspensão e xarope.

[0039] Em uma realização preferencial, a composição compreende como excipiente, veículo ou carreador biologicamente aceitável, pelo menos um composto selecionado de um diluente, como glucose, lactose, lactose monoidratada, D-manitol, amido, celulose cristalina; um desintegrante ou auxiliar de desintegrante, como carboximetilcelulose, amido, carboximetilcelulose de cálcio, dióxido de silício; um aglutinante, como hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, polivinilpirrolidona, gelatina; um lubrificante, como estearato de magnésio, talco; um material de base, como hidroxipropilmetilcelulose, sacarose, polietileno glicol, gelatina, caulim, glicerol, água purificada e gordura dura; e misturas dos mesmos.

[0040] Em outra realização, a composição é formulada para ser administrada por via parenteral. Preferencialmente, a composição está na forma de uma injeção, fluido intravenoso e solução ou suspensão para infusão.

[0041] Em uma realização preferencial, a composição compreende como excipiente, veículo ou carreador biologicamente aceitável, pelo menos um composto selecionado de um solubilizante ou auxiliar de solubilizante, como água destilada para injeção, solução salina, propileno glicol; um agente de isotonicidade, como glicose, cloreto de sódio, D-manitol, glicerol; um regulador de pH, como um ácido inorgânico, ácido orgânico, base inorgânica ou orgânica; e misturas dos mesmos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0042] Figura 1 - Resultado dos testes de triagem realizados para o ELISA para os peptídeos P1 a P12 e controle (CN).

[0043] Figura 2 - Peso médio dos camundongos imunizados com os peptídeos P1, P2, P6, P9, P+ (mix de P2, P6 e P9) e controle (C-) 0, 24, 48, 72 e 96 horas após infecção com a cepa M90T.

[0044] Figura 3 - Confirmação da obtenção dos anticorpos obtidos a partir de imunização. Gel de poliacrilamida 15%: (0 e 12) Marcador de peso molecular Ladder protein de 11-180 KDa (SIGMA); (1-8) tem-se IgY total (pool), provenientes das imunizações realizadas com o peptídeo sintético P9; (9) canaleta vazia; (10) IgY –padrão (anti-humano) purificada; (11) tem-se a IgY anti-P9 isolada por cromatografia de afinidade. Todas as IgYs apresentaram banda correspondente a cadeia pesada (HC) entre 65 e 75 KDa e banda correspondente a cadeia leve entre 25 e 35 KDa.

[0045] Figura 4 - Imunodetecção diferentes IgY total produzidas. Dot Blot em membrana PVDF: imunodetecção de IgY em reconhecimento aos peptídeos P9 correspondentes às imunizações realizadas (1-7).

[0046] Figura 5 - Imunodetecção dos anticorpos por Western Blot. Quadro 1: Gel de poliacrilamida contendo o extrato bruto de Shigella flexneri 5a M90T em três diferentes quantidades (A = 5 μL; B = 10 μL; C= 15 μL). Quadro 2: Membrana PVDF com imunodetecção de IgY localizado entre as bandas de 35 KDa e 48 KDa.

[0047] Figura 6 - Imunodetecção de anticorpos anti-P9 em reconhecimento de cepas-padrão de bactérias diarreiogênicas. Teste de Citometria de Fluxo (FAC’s Canto II BD Biosciences) - Reatividade das IgY a diferentes bactérias marcadas com brometo de etídeo utilizando secundário anti-chicken cabra Alexa flúor 488.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0048] De acordo com uma primeira realização, a presente invenção se refere a epítopos relacionados a proteínas de membrana externa, e de proteína componente de pilus de bactérias Gram negativas, preferencialmente bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae.

[0049] Por bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae, entende-se, por exemplo, as bactérias pertencentes aos gêneros Alishewanella, Alterococcus, Aquamonas, Aranicola, Arsenophonus, Azotivirga, Blochmannia, Brenneria, Buchnera, Budvicia, Buttiauxella, Cedecea, Citrobacter, Dickeya, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Grimontella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Phlomobacter, Photorhabdus, Plesiomonas, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Raoultella, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shigella, Sodalis, Tatumella, Trabulsiella, Wigglesworthia, Xenorhabdus, Yersinia, e Yokenella.

[0050] De forma preferencial, a presente invenção se refere às bactérias pertencentes aos gêneros Enterobacter, Escherichia, Salmonella e Shigella.

[0051] Por bactérias pertencentes ao gênero Enterobacter, entende-se preferencialmente as espécies E. amnigenus, E. arachidis, E. asburiae, E. cancerogenous, E. cloacae, E. cowanii, E. dissolvens, E. gergoviae, E. helveticus, E. hormaechei, E. intermedius, E. kobei, E. ludwigii, E. mori, E. nimipressuralis, E. oryzae, E. pulveris, E. pyrinus, E. radicincitans, E. taylorae, E. turicensis, e E. soli.

[0052] Por bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, entende-se preferencialmente as espécies E. albertii, E. coli, E. fergusonii, E. hermannii, E. marmotae, e E. vulneris.

[0053] Por bactérias pertencentes ao gênero Salmonella, entende-se preferencialmente as espécies Salmonella bongori, e Salmonella entérica.

[0054] Por bactérias pertencentes ao gênero Shigella, entende-se preferencialmente as espécies S. boydii, S. dysenteriae, S. flexneri, e S. sonnei.

[0055] Em uma modalidade específica, a presente invenção aborda epítopos com sequências sinteticamente construídas, desenvolvidas a partir de proteínas de membrana externa da Shigella flexneri, ditas OmpC e OmpA, e proteína componente de pilus tipo 1 de membrana externa de bactérias gram negativas, dita FimH.

[0056] Os presentes inventores realizaram a construção de peptídeos sintéticos de baseados na membrana externa das espécies de Shigella. A análise inicial foi realizada in silico, seguida da síntese manual dos peptídeos. Os presentes inventores utilizaram sequências de peptídeos diferentes daquelas encontradas na literatura, uma vez que os presentes peptídeos foram inteiramente desenhados pelos inventores, além de não utilizarem apenas proteínas da OmpC como base, mas a também as proteínas OmpA e FimH. As sequências desenvolvidas estão descritas na Tabela 1.

[0057] Dentre os doze peptídeos testados, os mais reativos foram: P1 (OmpC); P2 e P6 (OmpA); e P9 (FimH). A sequência do antígeno OmpC, que já havia sido predita em um estudo realizado anteriormente (Jarzab et al., 2013), foi sintetizada e utilizada como um controle positivo para comparação com as outras. Os estudos conduzidos pelos presentes inventores demonstraram que tais peptídeos foram capazes de serem reconhecidos pelos anticorpos antiShigella, o que leva a concluir que possuem potencial para serem bons candidatos para a produção de composições para imunização passiva e para a produção de composições vacinais. Vale ressaltar que esses quatro peptídeos se sobressaíram de maneira significativa em relação aos oito demais peptídeos restantes, pois estes últimos não demonstraram uma elevada expressão quantitativa referente à densidade óptica do ELISA, ficando bem mais próximos ao controle negativo (Figura 1).

[0058] Os presentes inventores utilizaram, então, os peptídeos P2, P6, P9 e um conjunto de todos eles (P2+P6+P9), juntamente com o controle positivo da literatura P1 e o controle negativo (adjuvante), para imunizar camundongos Balb/C com 6 a 12 semanas (grupos de 10 animais). Após 4 imunizações com intervalos de 15 dias entre elas, todas as amostras responderam satisfatóriamente.

[0059] Após este período, foi realizada a infecção desafio com 0,1mL de cepa M90T viva a uma concentração de 109 via intraperitoneal e os camundongos foram monitorados por peso durante 96h. Após 48h todos os camundongos do controle negativo (imunizado apenas com adjuvante) foram a óbito, enquanto os animais imunizados com os peptídeos propostos sobreviveram até 96h, alguns inclusive tendo aumento de peso (Figura 2). Demonstrando a eficácia do uso desses peptídeos para a elaboração de composições vacinais e para a produção de composições para a imunização passiva.

[0060] Como mencionado anteriormente, a presente invenção refere-se também a uma abordagem alternativa aos antibióticos para a prevenção ou tratamento de infecções por bactérias Gram negativas, preferencialmente bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae (enterobactérias).

[0061] Mais precisamente, a presente invenção refere-se a anticorpos IgY, sendo esses anticorpos capazes de prevenir ou tratar uma infecção por essas bactérias. Mais particularmente, os anticorpos da presente invenção são capazes de impedir a adesão das enterobactérias ao intestino.

[0062] Nesse sentido, a invenção refere-se a um anticorpo imunologicamente específico para proteínas associadas à membrana externa, e para proteínas componentes de pilus de bactérias Gram negativas, sendo o anticorpo capaz de prevenir ou tratar uma infecção intestinal por essas bactérias quando administrado a um mamífero. Numa concretização preferida, o anticorpo da invenção é resistente à digestão. Mais preferencialmente, o anticorpo da invenção é um anticorpo IgY.

[0063] Como aqui utilizado, o termo "resistente" refere-se a um anticorpo que reterá substancialmente sua função imunológica mesmo após estar em contato com ácidos gástricos por um período de tempo necessário para prevenir ou tratar uma infecção. De preferência, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgY. De fato, é sabido que os anticorpos IgY mostram grande resistência a ácidos e ao calor. Entretanto, o anticorpo de acordo com a presente invenção também pode ser uma imunoglobulina humana ou animal, como lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, IgM, IgA, IgE ou IgD, contendo regiões variáveis de ratos ou camundongos, sendo quimérico, ou CDRs, sendo humanizado. Assim, a presente invenção não está restrita a anticorpos IgY, uma vez que é concebível que a capacidade de resistência de um anticorpo, caso seja necessário, pode ser fornecida ou aumentada por engenharia genética ou por qualquer outro meio conhecido por um técnico na área.

[0064] Além disso, o anticorpo de acordo com a presente invenção também pode ser conjugado com qualquer veículo ou excipiente adequado, tal como de conhecimento por um especialista na técnica, a fim de aumentar sua resistência gastrointestinal ou fornecer, por exemplo, uma liberação em um local específico ou prolongada, seja em uma área local direcionada, como o intestino ou estômago, ou seja para uma aplicação sistêmica.

[0065] De acordo com a presente invenção, um mamífero é preferencialmente um primata. De forma mais preferencial, um primata de acordo com a presente invenção é um humano.

[0066] De acordo com outro aspecto, a presente invenção também é direcionada a um processo para a obtenção do anticorpo acima mencionado. Embora muitos processos conhecidos na técnica possam ser adequados para obter os anticorpos contemplados pelos presentes inventores, é preferível que o processo da presente invenção compreenda as etapas de:

• a) a inoculação de um peptídeo de acordo com a presente invenção em uma ave para estimular a produção de anticorpos; e
• b) recuperação dos anticorpos do ovo.

[0067] Como fica claro para um técnico no assunto, o passo de imunização pode ser alcançado por métodos bem conhecidos. Por exemplo, os peptídeos de acordo com a presente invenção podem ser administrados parentericamente, por exemplo por via intravenosa, intramuscular, subcutânea.

[0068] De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção está relacionada a um processo para a obtenção de um anticorpo, conforme definido acima, compreendendo as etapas, conforme definidas acima.

[0069] De acordo com a presente invenção, a ave utilizada para o preparo do anticorpo é preferencialmente selecionada dentre as aves da família Phasianidae. Dentre as aves da família Phasianidae, são utilizadas preferencialmente as do gênero Gallus, dentre as quais são preferencialmente selecionadas as das espécies Gallus gallus, Gallus lafayettii, Gallus sonneratii, e Gallus varius. Alternativamente, as aves utilizadas de acordo com a presente invenção podem ser selecionadas dentre faisões, perdizes, galinhas, perús, codornas, pombas, e pavões.

[0070] O processo da presente invenção também pode compreender uma etapa de administração de pelo menos um reforço dos peptídeos de interesse, de forma a manter um estado hiperimune na ave.

[0071] De acordo com outro aspecto, a invenção refere-se a um ovo, e a uma gema isolada desse ovo, contendo um anticorpo como definido acima ou produzido pelo processo descrito acima.

[0072] A presente invenção também está relacionada a métodos e a composições para a prevenção ou tratamento de doenças associadas às enterobactérias. Particularmente, a invenção se relaciona a um método que compreende a etapa de administração oral a um mamífero de um anticorpo de acordo coma presente invenção, um ovo de ave e / ou uma gema isolada como definidos anteriormente. No entanto, a presente invenção também pode estar relacionada a métodos que envolvem uma administração parentérica do anticorpo da invenção.

[0073] De acordo com uma modalidade preferida, a composição da invenção compreende pelo menos um elemento imunologicamente ativo contra as bactérias Gram negativas e um veículo ou carreador biologicamente aceitável. Esse elemento pode ser um anticorpo, um ovo de ave ou uma gema isolada, como descritos acima. Para a preparação das composições de acordo com a presente invenção, podem ser utilizados quaisquer métodos conhecidos pelos técnicos na área.

[0074] Como aqui utilizado, o termo "imunologicamente ativo", ou qualquer referência à atividade imunológica de um elemento, como por exemplo o anticorpo ou peptídeo da invenção, refere-se à capacidade de elemento para impedir, prevenir ou tratar uma infecção por bactérias Gram negativas um mamífero por ligação a uma proteína associada à bactéria.

[0075] Como aqui utilizado, o termo "biologicamente aceitável" referese a um veículo ou carreador que pode ser administrado de forma segura a um animal, particularmente mamíferos e humanos, sem efeitos colaterais excessivamente negativos ou tóxicos.

[0076] De acordo com uma modalidade da invenção, a composição pode ser formulada sob a forma de uma composição farmacêutica ou nutracêutica. Nesse sentido, a composição de acordo com a presente invenção também pode estar na forma de um aditivo alimentar compreendendo pelo menos um dos elementos mencionados acima, ou ainda compreendendo uma composição como definida acima.

[0077] Embora as composições sejam preferencialmente administradas por via oral, elas podem ser administradas por qualquer outra via adequada. Em uma modalidade preferencial, as composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção podem ser administradas por via oral, podendo estar na forma de comprimidos, cápsulas, pó, xaropes, suspensões, soluções e outras.

[0078] Como o aditivo farmaceuticamente e farmacologicamente aceitável, por exemplo, podemos citar um excipiente, desintegrante ou auxiliar de desintegrante, aglutinante, agente de revestimento, corante, diluente, base, solubilizante ou auxiliar de solubilizante, agente de isotonicidade, regulador de pH, estabilizante, propelente, adesivo e semelhantes podem ser usados. Exemplos de uma preparação adequada para administração oral incluem comprimido, tablete, cápsula, pó, grânulo fino, grânulo, solução, suspensão, xarope e semelhantes, e exemplos de uma preparação adequada para administração parenteral incluem injeção, fluido intravenoso, solução ou suspensão para infusão, pó inalante, e semelhantes. Contudo, a forma da preparação não deve ser limitada apenas a essas.

[0079] Uma preparação adequada para administração oral pode conter, como um aditivo, por exemplo, excipientes tais como glucose, lactose, lactose monoidratada, D-manitol, amido, celulose cristalina e semelhantes; desintegrante ou auxiliar de desintegrante, tal como carboximetilcelulose, amido, carboximetilcelulose de cálcio, dióxido de silício e semelhantes; aglutinante, tal como hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, polivinilpirrolidona, gelatina e semelhantes; lubrificante, tal como estearato de magnésio, talco e semelhantes; base, tal como hidroxipropilmetilcelulose, sacarose, polietileno glicol, gelatina, caulim, glicerol, água purificada, gordura dura, e semelhantes.

[0080] Uma preparação adequada para injeção ou fluido intravenoso pode conter aditivos para preparação, tais como solubilizante ou auxiliar de solubilizante, capazes de constituir uma injeção aquosa ou uma injeção para ser dissolvida quando em uso, como por exemplo, em água destilada para injeção, solução salina, propileno glicol, e semelhantes; agente de isotonicidade, como por exemplo, glicose, cloreto de sódio, D-manitol, glicerol, e semelhantes; regulador de pH tal como um ácido inorgânico, ácido orgânico, base inorgânica ou orgânica ou ainda semelhantes.

[0081] Embora a dose do agente farmacêutico da presente invenção deva ser variada, dependendo do tipo de doença a ser aplicado, condições de pacientes, tais como idade, peso corporal, sintomas, e semelhantes. Em geral, a dose adequada pode ser administrada em de uma a várias porções por dia, ou pode ser administrada a cada poucos dias. Quando dois ou mais tipos de ingredientes ativos estiverem envolvidos, a quantidade total pode ser ajustada.

[0082] A presente invenção é também descrita pelos exemplos não limitantes abaixo, que são meramente ilustrativos. Várias modificações e variações das concretizações são evidentes ao técnico no assunto, sem se afastar do espírito e do escopo da invenção.

[0083] Inúmeras variações incidindo no escopo de proteção do presente pedido são permitidas. Dessa forma, reforça-se o fato de que a presente invenção não está limitada às configurações / concretizações particulares acima descritas.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 1.1 Produção de anticorpos

[0084] Com base nos resultados obtidos pelos presentes inventores, o peptídeo P9 foi escolhido para o desenvolvimento de estudos mais aprofundados.

[0085] O peptídeo P9 (FimH) de Shigella flexneri foi utilizado para imunização em aves afim de produzir e avaliar IgY (Imunoglobulina Y). Tal anticorpo foi obtido e isolado por métodos de precipitação, e testado para reatividade, sendo visto que é capaz de reconhecer o antígeno-alvo de Shigella flexneri 5a M90T.

[0086] Para a imunização de aves, foi utilizado o peptídeo sintético P9 (SEQ ID No. 9), correspondentes a epítopos imunogênicos do antígeno Fim-H de Shigella flexneri 5a M90T. Inicialmente, o peptídeo foi acoplado em um nanotubo de carbono (NTC) solubilizado e ativado como molécula carreadora, de acordo com o método descrito na patente BR 10 2018 071933 5. A ativação do carreador NTC solubilizado e o acoplamento de peptídeos sintéticos foi promovida pelos agentes químicos EDAC [Cloreto de 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida] e NHS (N-hidroxissuccinimida).

[0087] Para a produção de anticorpos policlonais, as aves da espécie Gallus gallus mantidas sob manutenção da empresa EZscience Biotecnologia, foram imunizadas sete vezes com um inóculo de 200 μg de peptídeo P9, o qual foi preparado com 50μL de peptídeo (5,5 mg/mL) acoplado em 200 μL de Nanotubo de carbono solubilizado e ativado (NTC) e 300 μL de Adjuvante de Freund, totalizando volume final de 500 μL.

[0088] A amostra foi homogeneizada em ciclos alternados de sonicação e vortequização em gelo até aquisição de consistência não dispersante em água. Para a primeira imunização foi utilizado o Adjuvante Completo de Freund e, para as inoculações posteriores, o Adjuvante Incompleto de Freud. Para o procedimento de imunização, as aves foram imobilizadas manualmente e inoculadas por via intramuscular, em quatro pontos distintos do músculo peitoral, com um buster quinze dias após a primeira imunização e coleta de gema de ovo hiperimune, após sete dias.
Tabela 2 - Informações sobre os peptídeos utilizados para a imunização das aves.

1.2. Extração de anticorpos utilizando PEG

[0089] Os anticorpos foram extraídos a partir da separação entre a fração proteica da gema de ovo e sua fração lipídica utilizando o método de precipitação com polietilenoglicol (PEG) de Pauly e colaboradores (2011). Para isso, foi adicionado à gema PBS 1X (NaHPO4, NaH2PO4, NaCl2) equivalente a duas vezes o seu volume e 3,5% v/m de PEG- 6000, com homogeneização durante 10 minutos em vórtex e posterior centrifugação a 4 °C por 20 minutos a 13.000xg. Após esse período, o pellet foi descartado e ao volume do sobrenadante foram adicionados 8,5% v/m de PEG, sendo o sistema submetido às condições de agitação e centrifugação, anteriormente descritas. Porém, após a centrifugação o sobrenadante foi descartado. Ao pellet foram adicionados 10 mL de PBS- 1X e 12% v/m de PEG, sendo submetido a condições de agitação e centrifugação já descritas, com descarte do sobrenadante. Após essa etapa, o pellet foi solubilizado em 800 μL de PBS1X com volume final completado para 1,2 mL. Após esse processo, o pool de anticorpos obtido foi submetido à diálise em PBS 0,1% a 4 °C por 24 horas e posteriormente analisado eletroforeticamente em SDS-PAGE 15% e detecção de bandas proteicas utilizando Coomassie Brilliant Blue.

1.3. Purificação de anticorpos anti-peptídeo

[0090] Inicialmente, o peptídeo sintético P9 (5,5mg/mL) foi acoplado através de ligação covalente a resina cromatográfica NHS-Activated Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences) conforme recomendações do fabricante, para a obtenção de uma matriz sepharose-P9 (FimH). Após esse processo, a matriz cromatográfica foi lavada com 10 mL de água mili-Q e equilibrada com 10 mL de Binding buffer (Na2HPO4 0,02M pH 7,0). O pool de anticorpos (IgY total) obtidos no processo descrito no item 1.2, foi diluído a 1μL /10 μL em Binding buffer, adicionado a sistema cromatográfico e mantido sob incubação durante 60 minutos a temperatura ambiente (T.A).

[0091] Posteriormente, a matriz foi lavada com 15 mL de Binding buffer e em seguida os anticorpos foram coletados em eluições de 450 μL de Elution buffer (Glicina-HCl 0,1 M pH 2,7) e 50 μL de Neutralizer (Tris 1M pH 9,0), utilizando o reagente de detecção de proteínas Bradford (SIGMA). Em seguida, a matriz foi lavada com 10 mL de Binding buffer e preservada com álcool etílico a 30% (EtOH). Posteriormente, o anticorpo foi concentrado 10X em coluna Amicon ® Ultra-2 Centrifugal Filter Devices de 30 KDa conforme recomendações do fabricante (Mili-Pore). Posteriormente, os anticorpos foram novamente analisados por SDS-PAGE 15% para confirmação da obtenção de IgYs anti-P9.

[0092] A eficiência dos métodos empregados para o isolamento dos anticorpos foi confirmada por meio de SDS-PAGE 15% (Figura 3). As IgYs obtidas pelo método de precipitação descritos por Pauly e colaboradores (2011), apresentaram bandas correspondentes a cadeia pesada (HC) entre 48 e 75 KDa e cadeia leve (HL) entre 17 e 25 KDa (Ladder Protein SIGMA). A IgY específica anti-P9 (B:11) purificada por cromatografia de afinidade também apresentou bandas nas alturas descritas, além de corresponder a uma IgY padrão purificada por cromatografia (B:10).

[0093] A eletroforese também evidenciou a presença de impurezas menores representadas por banda proteica de peso molecular entre 35-48 KDa. Foi possível observar que os diferentes pools de anticorpos variaram em quantidade obtida, o que pode estar relacionado a padronização do processo de isolamento do anticorpo. Em virtude dos fatos evidenciados por SDS-PAGE, considera-se que a obtenção dos anticorpos foi alcançada com êxito.

EXEMPLO 2 2.1. Imunodetecção por Dot blot

[0094] O reconhecimento dos anticorpos produzidos foi avaliado quanto ao reconhecimento do peptídeo sintético P9 imobilizado em membrana PVDF. Para isso, a membrana PVDF foi hidratada em tampão de blot (0,025 M Tris, 0,192 M glicina pH 8,5, 20% MeOH), MeOH (100%) e água destilada. Após hidratada, a membrana foi imobilizada com peptídeo P9 a 16 μg/mL em sistema de trans-blot. Em seguida, ao sistema foi adicionado 50 μL de uma solução de bloqueio PBS 1X a acrescida com 3% v/m de BSA (Bovin Serum Albumin) por 60 minutos a 37 °C. Posteriormente, os primários IgY total obtidos foram diluídos em solução de bloqueio a 1 μL /100 μL e adicionados ao sistema e incubados durante 60 minutos a 37 °C. Após esse período, a o sistema foi lavado com PBS 1X e o secundário anti-chicken cabra (peroxidase) a 1 μL /500 μL foi adicionado ao sistema e mantido sob incubação em condições descritas anteriormente.

[0095] Após esse período, o sistema foi lavado com PBS 1X e para revelação do teste, foi utilizado o cromógeno DAB (Diaminobenzidina-3,3) durante10 minutos. O parâmetro de detecção considerado, foi presença/ausência de precipitação de coloração marrom como indício de detecção positiva/negativa dos anticorpos produzidos.

[0096] Os diferentes pools de IgY total foram testados contra os antígenos sintéticos a P9 (16μg/mL) e detectados por Dot-Blot, pelo qual foi possível a visualização de precipitação caracterizada por precipitação de coloração marrom resultante da reação antígeno-anticorpo presente na membrana PVDF. Através desse teste, pode-se observar a detecção de anticorpos em diferentes níveis, variando a coloração fraca, média e forte, correlacionando-se às quantidades de anticorpos detectadas na eletroforese em gel de Poliacrilamida, anteriormente discutido.

[0097] O Protocolo desenvolvido nesse estudo, apresentou boa resolução/reação demonstrando que a IgY obtida por precipitação com PEG funcionou de forma eficiente nesse teste imunológico. Logo, pode-se afirmar que os diferentes pools de IgY total isolados nesse estudo foram e detectados através da técnica de Dot-Blot, foram eficientes quanto a atividade biológica funcional esperada, evidenciada pelos pontos circulares sobre a membrana PVDF, formados após a aplicação do substrato de revelação, apresentados na Figura 4.

EXEMPLO 3 3.1. Imunodetecção por Western Blot

[0098] Os anticorpos produzidos foram avaliados, utilizando o método de imunodetecção Western Blot, quanto à capacidade de reconhecimento do antígeno na forma denaturada. A fim disso, o extrato bacteriano de Shigella flexneri 5a M90T foi separado por SDSPAGE 15% e eletrotransferido para uma membrana PVDF. Inicialmente, o gel de poliacrilamida e a membrana PVDF, foram devidamente hidratados, como descrito no Exemplo 2, item 2.1, e submetidos a eletrotransferência no equipamento transblotting (BIO-RAD), a voltagem constante de 10 V por 60 minutos. Após a eletrotransferência, a membrana foi incubada com tampão de bloqueio PBS-BSA 3% por 60 minutos a 37 °C. Após esse período, a membrana foi lava com PBS 1X e o primário IgY total a 1 μL /100 μL foi colocado em contato com a membrana por 60 minutos a 37 °C, sob agitação constante. Após esse período, a membrana foi lavada com PBS 1X e o secundário anti-chicken de cabra (peroxidase) a 1 μL /5.000 μL foi colocado em contato com a membrana por 60 minutos a 37 °C, sob agitação leve. Posteriormente, a membrana foi lava com PBS 1X e revelada com cromógeno DAB (10 mg/mL) durante 10 minutos e neutralização da reação com água destilada. A membrana foi seca a temperatura ambiente para análise da imunodetecção, considerando os parâmetros descritos anteriormente (item 2.6).

[0099] A partir da técnica de Western Blot, foi possível observar a reatividade do anticorpo a apenas uma banda proteica do extrato bacteriano de Shigella flexneri 5a M90T, evidenciado pela imunoprecipitação formada na altura de 30 KDa aproximadamente, localizada na faixa de 25-35 KDa (Figura 5). A imunodetecção da IgY anti-P9 vai de encontro aos resultados de Barati e colaboradores (2018) e Grando e colaboradores (2017), quanto a validação do reconhecimento de IgYs produzidas em seus trabalhos utilizando a mesma técnica.

[00100] O antígeno Fim-H (30 KDa) é uma proteína que constitui a membrana externa de diversas bactérias Gram-negativas, como a Shigella. Considerando que o peptídeo P9 foi predito in silico a partir fragmentos da sequência peptídica desse antígeno FimH, com o presente experimento foi possível observar que a reatividade da IgY anti-P9 produzida pelos presentes inventores foi específica, pois foi direcionada apenas a uma banda correspondente ao antígeno-alvo na forma desnaturada e não apresentou reatividade cruzada com outras proteínas do extrato bacteriano. A imunodetecção de IgY foi realizada com a utilização do secundário antichicken de cabra adsorvido com enzima peroxidase.

EXEMPLO 4 4.1. Imunodetecção por Citometria de fluxo

[00101] Todas as cepas bacterinas utilizadas nesse estudo, foram provenientes da coleção bacteriológica do Instituto Leônidas e Maria Deane (ILMD-FIOCRUZ-AM), cedidas pela Prof. Dra. Patrícia Puccinelli Orlandi Nogueira do Laboratório de Diagnóstico e Controle de Doenças Infecciosas na Amazônia (DCDIA).

[00102] O reconhecimento da IgY anti-P9 foi avaliada quanto à reatividade com antígenos nativos, presentes na superfície celular de Shigella flexneri 5a M90T, através de imunodetecção realizada em citometria de fluxo, utilizando como anticorpo de detecção o anti-chicken de cabra adsorvido ao fluorocromo Alexa flúor 488. A reatividade da IgY anti-P9 foi também foi avaliada contra cepas heterólogas de Escherichia coli, EAEC (ATCC042), EIEC (ATCC1381), EHEC (CDC-EDL9933-171-0157:H3), ETEC (LT2871), ETEC (ST8), EPEC (ATCCE234869), DAEC (F1845), BL21 e Top-10. O painel do experimento constituiu-se de quatro condições: C1 (somente bactéria), C2 (bactéria + brometo), C3 (bactéria + anticorpo secundário) e C4 (bactéria + brometo+ anticorpo primário + anticorpo secundário).

[00103] Inicialmente, os microrganismos foram cultivados em meio líquido Luria Bertani (LB) a 37 °C, durante 24 horas sob agitação constante. Após o cultivo, 50 μL de cada crescido bacteriano foram distribuídos em tubos de citometria e centrifugadas a 14.000 rpm, durante cinco minutos para a obtenção de um pellet. Em seguida, somente os tubos C3 e C4 foram incubados com 01 μL de brometo de etídeo (C21H20BrN3) durante 30 minutos a T.A., sob privação de energia luminosa. Após esse período, os pellets foram lavados 02 vezes por centrifugação com PBS-1X (filtrado e autoclavado). Posteriormente, os tubos C4 foram incubados com primário 1 μL /100 μL IgY anti-P9 por 01 hora, seguido de lavagem por centrifugação. Após essa etapa, os tubos C3 e C4 foram incubados com secundário 1 μL /200 μL anti-chicken durante 01 hora a T.A. e posteriormente lavados por centrifugação, com ressuspensão de pellet em 200 μL de PBS-1X.

[00104] Após esse processo, a leitura foi realizada no Citômetro FACS canto II (BD Biosciences), na Plataforma de Citometria de Fluxo do ILMD/FIOCRUZ-AM, utilizando os programas FACS Diva Software versão 6.1.2. A obtenção dos dados brutos e a análise de porcentagem de eventos, média de intensidade de fluorescência e formatação dos gráficos de citometria, foi realizado através do programa Flow-Jo versão 5.6.7.

[00105] A fim de avaliar o reconhecimento específico da IgY anti-P9 produzida, foi utilizada a técnica de Citometria de fluxo. Foi possível observar que o anti-P9 foi capaz de reconhecer o antígeno-alvo na forma nativa presente na superfície celular de uma cepa padrão de Shigella flexneri 5a M90T. Além disso, o anticorpo apresentou reatividade com algumas cepas de Escherichia coli diarreiogênicas (DEC) utilizadas como controle do ensaio, evidenciando uma reatividade direcionada a EIEC, EPEC, EAEC e EHEC (Figura 6). Acredita-se que isso pode estar relacionado ao fato do antígeno-alvo (P9) compor a superfície celular de outros membros da família Enterobacteriaceae (BRAVO, et al., 2015), como os patótipos de E. coli utilizados na avaliação do anticorpo anti-P9.

[00106] Esses resultados, evidenciaram que os anticorpos produzidos nesse estudo não apresentaram especificidade de reconhecimento para Shigella spp. Ressalta-se que Shigella tem um mecanismo de patogênese indistinguível de alguns patótipos de E. coli como EIEC (HAZEN et al., 2016), e que o anticorpo anti-P9 apresentou um reconhecimento cruzado, porém direcionado para Shigella flexneri e os patótipos de E. coli EIEC, EPEC, EAEC e EHEC.

[00107] Tendo em vista, que a utilização de antígenos imunogênicos comuns a patógenos é uma estratégia promissora para o controle de coinfecções (RAFIQ et al., 2019), os presentes inventores acreditam que a IgY anti-P9 pode ser útil na utilização em métodos de imunidade passiva, sendo uma promissora alternativa não antibiótica para tratamento da shigelose e de outras doenças causadas por outros patógenos Gram negativos, como por exemplo as cepas de DEC, tais como as utilizadas no presente experimento.

[00108] Isto, pode ser bastante útil não apenas para o contexto das doenças diarreicas, as quais são responsáveis por um elevado índice de mortalidade em todo o mundo, como também como base para que estes achados sirvam de base para aplicação contra outras doenças.

REFERÊNCIAS

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Claims (29)

1. Polipeptídeo caracterizado pelo fato de ter pelo menos 80% de identidade com a sequência como descrita em qualquer uma das SEQ ID Nos. 1 a 12.
2. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ter pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das SEQ ID Nos. 2, 6 ou 9.
3. Polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de ter a sequência como descrita na SEQ ID No. 9.
4. Processo para a obtenção de uma imunoglobulina IgY caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:

   • a) inocular pelo menos um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 em uma ave; e
   • b) recuperar as imunoglobulinas IgY a partir do ovo produzido pela referida ave.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a referida imunoglobulina IgY é recuperada a partir da gema do dito ovo produzido pela ave.
6. Processo, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que a referida ave é selecionada dentre as aves da família Phasianidae.
7. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que a referida ave é do gênero Gallus.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a referida ave é selecionada dentre as espécies Gallus gallus, Gallus lafayettii, Gallus sonneratii, e Gallus varius.
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que a referida ave é selecionada dentre faisões, perdizes, galinhas, perus, codornas, pombas, e pavões.
10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma dose de reforço é administrada de forma a manter um estado hiperimune na ave.
11. Imunoglobulina IgY caracterizada pelo fato de que é obtida pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 10.
12. Uso de uma imunoglobulina IgY, como definida na reivindicação 11, caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de uma composição para a prevenção ou tratamento de infecções por bactérias Gram negativas.
13. Uso de um polipeptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3 caracterizado pelo fato de ser para a manufatura de uma composição para provocar uma resposta imune contra uma bactéria Gram negativa em uma ave.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que a referida bactéria Gram negativa é pertencente à família Enterobacteriaceae.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a bactéria pertencente à família Enterobacteriaceae, é selecionada dentre as bactérias pertencentes aos gêneros Alishewanella, Alterococcus, Aquamonas, Aranicola, Arsenophonus, Azotivirga, Blochmannia, Brenneria, Buchnera, Budvicia, Buttiauxella, Cedecea, Citrobacter, Dickeya, Edwardsiella, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Ewingella, Grimontella, Hafnia, Klebsiella, Kluyvera, Leclercia, Leminorella, Moellerella, Morganella, Obesumbacterium, Pantoea, Pectobacterium, Phlomobacter, Photorhabdus, Plesiomonas, Pragia, Proteus, Providencia, Rahnella, Raoultella, Salmonella, Samsonia, Serratia, Shigella, Sodalis, Tatumella, Trabulsiella, Wigglesworthia, Xenorhabdus, Yersinia, e Yokenella.
16. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 15, caracterizado pelo fato de que a referida bactéria é selecionada dentre as bactérias pertencentes aos gêneros Enterobacter, Escherichia, Salmonella e Shigella.
17. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a referida bactéria do gênero Enterobacter é selecionada dentre E. amnigenus, E. arachidis, E. asburiae, E. cancerogenous, E. cloacae, E. cowanii, E. dissolvens, E. gergoviae, E. helveticus, E. hormaechei, E. intermedius, E. kobei, E. ludwigii, E. mori, E. nimipressuralis, E. oryzae, E. pulveris, E. pyrinus, E. radicincitans, E. taylorae, E. turicensis, e E. soli.
18. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a referida bactéria do gênero Escherichia, é selecionada dentre E. albertii, E. coli, E. fergusonii, E. hermannii, E. marmotae, e E. vulneris.
19. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a referida bactéria do gênero Salmonella, é selecionada dentre Salmonella bongori, e Salmonella entérica.
20. Uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a referida bactéria do gênero Shigella, é selecionada dentre S. boydii, S. dysenteriae, S. flexneri, e S. sonnei.
21. Composição imunogênica caracterizada pelo fato de que compreende:
    um elemento imunologicamente ativo selecionado do grupo consistindo de uma imunoglobulina IgY como definida na reivindicação 11, um ovo de ave obtido pelo processo como definido em qualquer uma das reivindicações 4 a 10, ou uma gema isolada desse ovo; e
    um excipiente, veículo ou carreador biologicamente aceitável.
22. Composição, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que é formulada sob a forma de uma composição farmacêutica ou nutracêutica.
23. Composição, de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que o referido excipiente, veículo ou carreador biologicamente aceitável é selecionado do grupo compreendendo um desintegrante ou auxiliar de desintegrante, aglutinante, agente de revestimento, corante, diluente, base, solubilizante ou auxiliar de solubilizante, agente de isotonicidade, regulador de pH, estabilizante, propelente, adesivo e semelhantes.
24. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizada pelo fato de que é formulada para ser administrada por via oral.
25. Composição, de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que está na forma de comprimido, tablete, cápsula, pó, grânulo fino, grânulo, solução, suspensão e xarope.
26. Composição, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizada pelo fato de que compreende como excipiente, veículo ou carreador biologicamente aceitável, pelo menos um composto selecionado de um diluente, como glucose, lactose, lactose monoidratada, D-manitol, amido, celulose cristalina; um desintegrante ou auxiliar de desintegrante, como carboximetilcelulose, amido, carboximetilcelulose de cálcio, dióxido de silício; um aglutinante, como hidroxipropilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, polivinilpirrolidona, gelatina; um lubrificante, como estearato de magnésio, talco; um material de base, como hidroxipropilmetilcelulose, sacarose, polietileno glicol, gelatina, caulim, glicerol, água purificada e gordura dura; e misturas dos mesmos.
27. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 23, caracterizada pelo fato de que é formulada para ser administrada por via parenteral.
28. Composição, de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo fato de que está na forma de injeção, fluido intravenoso e solução ou suspensão para infusão.
29. Composição, de acordo com a reivindicação 27 ou 28, caracterizada pelo fato de que compreende como excipiente, veículo ou carreador biologicamente aceitável, pelo menos um composto selecionado de um solubilizante ou auxiliar de solubilizante, como água destilada para injeção, solução salina, propileno glicol; um agente de isotonicidade, como glicose, cloreto de sódio, D-manitol, glicerol; um regulador de pH, como um ácido inorgânico, ácido orgânico, base inorgânica ou orgânica; e misturas dos mesmos.

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