BR102019027141A2 - Composições farmacêuticas antifúngicas contendo halofantrina, artesunato e amodiaquina, e uso - Google Patents

Abstract

composições farmacêuticas antifúngicas contendo halofantrina, artesunato e amodiaquina, e uso. a presente tecnologia trata de composições farmacêuticas contendo os compostos halofantrina, artesunato e amodiaquina isoladamente ou em combinação, como adjuvantes em associação com anfotericina b para produção de medicamentos para tratamento de infecções fúngicas, preferencialmente causadas por cryptococcus sp. e candida sp.

Description

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTIFÚNGICAS CONTENDO HALOFANTRINA, ARTESUNATO E AMODIAQUINA, E USO

[01] A presente tecnologia trata de composições farmacêuticas contendo os compostos halofantrina, artesunato e amodiaquina isoladamente ou em combinação, como adjuvantes em associação com Anfotericina B para produção de medicamentos para tratamento de infecções fúngicas, preferencialmente causadas por Cryptococcus sp. e Candida sp.

[02] O aumento das infecções fúngicas invasivas, especialmente causadas por fungos oportunistas como Cryptococcus sp. e Candida sp., impõe uma ameaça à saúde humana. Estima-se que mais de 2 milhões de infecções fúngicas invasivas ocorrem globalmente a cada ano e são responsáveis por mais de 1 milhão de mortes, particularmente em pacientes imunossuprimidos. A Criptococose e a Candidíase estão entre as infecções fúngicas mais frequentes dentre as micoses sistêmicas e destacam-se por apresentar taxas de mortalidade acima de 50%. Além disso, a perspectiva é que ocorra um aumento dessas infecções invasivas ao longo dos anos, devido ao aumento de indivíduos imunocomprometidos, resultante do aumento da expectativa de vida e variedade de doenças e tratamentos que comprometem o sistema imune.

[03] A criptococose é uma infecção fúngica invasiva causada por leveduras encapsuladas do gênero Cryptococcus. Sua etiologia está principalmente relacionada a duas espécies, C. neoformans e C. gattii. A doença se caracteriza inicialmente pela inalação de esporos fúngicos ou leveduras dessecadas que se instalam no parênquima pulmonar causando uma pneumonia, fase inicial da doença. Frente à incapacidade do sistema imune em controlar a infecção nos pulmões, ocorre a disseminação do fungo via hematogênica causando a meningoencefalite, forma mais grave da doença. A doença apresenta mais de um milhão de casos anualmente em todo mundo e taxas de mortalidade que variam entre 46-75% conforme a localização. O tratamento está intrinsecamente ligado ao sítio de infecção, ao estado imunológico do paciente e a disponibilidade de drogas. Normalmente, os antifúngicos utilizados são o polieno Anfotericina B (ANB) combinado com o azólico fluconazol (FCZ) e/ou 5-flucitosina (análogo de pirimidina). Para neurocriptococose, a terapia é dividida em três fases: recomenda-se o uso de ANB por duas semanas (fase de indução) seguida pela administração de fluconazol por mais oito semanas (fase de consolidação) e depois por mais 6-12 meses e/ou até a restauração da imunidade do hospedeiro (fase de erradicação). Já em casos de pneumonia leve a moderada, recomenda-se o uso de fluconazol ou itraconazol por 612 meses. Entretanto, apesar de eficiente, a Anfotericina B é nefrotóxica e seu uso prolongado pode levar a hipocalemia, disfunção renal e diurese aumentada. A fluorocitosina, apesar de apresentar boa atividade combinada a Anfotericina B, está associada ao desenvolvimento de resistência e apresenta alta toxicidade medular, além de não estar disponível no Brasil. O fluconazol, apesar de apresentar baixa toxicidade, está associado ao desenvolvimento de resistência.

[04] A candidíase, outra micose invasiva frequente, é causada por leveduras do gênero Candida, sendo a espécie de Candida albicans a mais prevalente; embora nos últimos anos tenha se observado a emergência de candidíase invasiva causada por espécies não albicans, como: C. tropicalis, C. glabrata, C. krusei, C. parapsilosis e C. auris. Isso tem impacto direto na terapia da candidíase uma vez que algumas espécies, como C. krusei e C. glabrata, apresentam resistência intrínseca a alguns azólicos, como o fluconazol e o voriconazol. Essa levedura faz parte da microbiota normal do trato gastrointestinal, da pele e da mucosa vaginal. Em determinados contextos, como procedimentos cirúrgicos no trato gastrointestinal, uso de antibióticos e corticosteroides, podem ocorrer eventos de disbiose, levando à candidemia. Uma vez que a candidemia se estabelece, ocorre a translocação para outros órgãos, levando a infecções metastáticas nos pulmões, fígado, baço, rins, ossos ou olhos. Ainda, devido à capacidade de formar biofilme, a Candida sp pode colonizar cateteres, prótese ou outros dispositivos médicos, que também podem atuar como fontes de infecção.

[05] Entretanto, considerando o arsenal limitado de antifúngicos para o tratamento dessas infecções, os eventos de resistência e toxicidade associados a esses fármacos, o desenvolvimento de novas drogas com potencial antifúngico torna-se importante. Porém, o processo para o desenvolvimento e utilização de novas drogas é oneroso, demorado e o produto final nem sempre é garantido. Ainda, as infecções fúngicas normalmente são negligenciadas, caracterizadas pela ausência de programas de vigilância em saúde e ambiental e pelo baixo financiamento em pesquisa quando comparada a outras doenças infecciosas; o que muitas vezes dificulta a progressão dos estudos voltados para a busca de novos antifúngicos. Com isso, muitos estudos são interrompidos, não chegam a ensaios clínicos ou não são disponibilizados no mercado. Nesse contexto, o reposicionamento de fármacos surge como uma estratégia interessante para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para a Criptococose e a Candidíase invasiva. Essa vertente consiste em avaliar a aplicabilidade de um fármaco já utilizado no mercado para o tratamento de uma doença, frente a outras finalidades terapêuticas. Trata-se de um processo menos oneroso e mais rápido, uma vez que todo o processo de caracterização, síntese, farmacodinâmica e farmacocinética do fármaco já são fatores conhecidos.

[06] A Halofantrina, Amodiaquina e Artesunato são drogas pertencentes à classe das artesiminas e possuem indicação clínica primária para o tratamento da Malária. A Halofantrina atua formando complexos com a ferritoporforina IX levando a danos na membrana do parasita. A Amodiaquina não possui um mecanismo de ação bem esclarecido, mas acredita-se que ela iniba a atividade da enzima polimerase heme, o que resulta no acúmulo de heme livre, que é tóxico para o parasita, levando a danos na membrana que culminam na ação plasmocida. Além de apresentar efeito plasmocida, a Amodiaquina também apresenta efeitos benéficos no controle do câncer, inibindo a autofagia; em doenças inflamatórias crônicas como artrite reumatoide e lúpus eritematoso, via redução da resposta imune; e efeito anti-diabético por meio da ação agonista em receptores do tipo PPARy e PPARa. Já o Artesunato atua na clivagem da ligação endoperóxido através da reação com o Heme 3, levando à produção de radicais livres que alquilam as proteínas do parasita.

[07] Ho et al. (2014) relataram o efeito antifúngico de alguns derivados de artesiminas (Ho WE, Peh HY, Chan TK,Wong WSF. Artemisinins: Pharmacological actions beyond anti-malarial. Pharmacology & Therapeutics 142 (2014) 126-139), mas não se refere à halofantrina, ao artesunato ou à amodiaquina.

[08] A presente tecnologia trata de composições farmacêuticas contendo os compostos antimaláricos halofantrina, artesunato e amodiaquina, isolados ou em combinação, e seu uso como adjuvantes para produzir medicamentos para o tratamento de infecções fúngicas, preferencialmente causadas por Cryptococcus sp. e Candida sp. Por se tratar de reposicionamento de fármacos, os compostos já passaram por estudos farmacocinéticos, toxicológicos e de fármaco-vigilância, refletindo a segurança em sua utilização. A interação entre os antimaláricos e Anfotericina B resultou em sinergismo (CIF<0,5), possibilitando reduzir a concentração mínima necessária do antifúngico para inibir o crescimento de Cryptococcus sp e Candida sp.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[09] A Figura 1 demonstra que antimaláricos combinados a Anfotericina B reduzem a CIM do antifúngico frente a Cryptococcus sp. e Candida sp. (A) Halofantrina, (B) Artesunato e (C) Amodiaquina.

[010] A Figura 2 representa o percentual de viabilidade de macrófagos após exposição a diferentes concentrações de (A) Anfotericina B, (B) Halofantrina, (C) Amodiaquina e (D) Artesunato.

[011] A Figura 3 mostra o percentual de viabilidade de macrófagos após exposição a diferentes concentrações combinadas de Anfotericina B com os antimaláricos. (A) Halofantrina, (B) Amodiaquina e (C) Artesunato.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

[012] A presente tecnologia trata de composições farmacêuticas contendo os compostos halofantrina, artesunato e amodiaquina isoladamente ou em combinação, como adjuvantes em associação com Anfotericina B para produção de medicamentos para tratamento de infecções fúngicas, preferencialmente causadas por Cryptococcus sp. e Candida sp.

[013] Mais especificamente, as composições farmacêuticas antifúngicas compreendem os compostos halofantrina, artesunato e amodiaquina, isolados ou em combinação, como adjuvantes, em associação com Anfotericina B e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[014] As composições farmacêuticas da presente tecnologia podem ser utilizadas para produzir um medicamento para tratamento de infecções fúngicas, preferencialmente por Cryptococcus sp. e Candida sp.

[015] A presente tecnologia pode ser mais bem compreendida pelos seguintes exemplos, não limitantes.

EXEMPLO 1. PREPARO DO INÓCULO

[016] O inóculo fúngico foi preparado a partir de culturas de Cryptococcus gattii incubadas a 35°C, por 48 horas em tubos contendo Ágar Sabouraud Dextrose (ASD) inclinado. Uma alçada das culturas foi adicionada a um tubo de ensaio contendo 5 mL de solução salina esterilizada para obtenção de uma suspensão. As suspensões foram homogeneizadas em vórtex, lidas no espectrofotômetro a 530 nm e ajustadas à transmitância de 77%, que corresponde à concentração de 1X106 a 5X106 UFC/mL. Logo em seguida, as amostras foram diluídas em RPMI - 1640 de modo a alcançar a concentração de 1x103 a 5x103 UFC/mL.

EXEMPLO 2. DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM)

[017] O ensaio para determinação da CIM consiste na primeira análise experimental para avaliar o potencial antifúngico de uma determinada substância. Para o teste da concentração inibitória mínima foi utilizado o método da microdiluição em caldo, conforme proposto pelo documento M27-A3 do “Clinical and Laboratory Standards Institute” (CLSI, 2008). Esse ensaio baseia-se na observação da inibição do crescimento fúngico, frente a diferentes concentrações da droga, em relação aos controles não tratados.

[018] Todos os fungos foram testados frente a três antimaláricos (Halofantrina, Amodiaquina e Artesunato) os quais foram solubilizados em metanol com concentração inicial de 15mg/mL e Anfotericina B, utilizada como controle, foi solubilizada em DMSO na concentração de 10mg/mL. A partir dessa solução, preparou-se uma diluição em série em meio RPMI-1640, obtendo um faixa de concentração de 1 a 512 μg/mL para os antimaláricos e de 0,0313 a 16 pg/mL para Anfotericina B. Após realizada a diluição seriada, 100μL de cada concentração foram dispensados em placas de 96 poços acrescido de 100μL do inóculo fúngico. As placas foram incubadas a 37°C durante 72 horas. Após esse período, procedeu-se a leitura visual, de modo que a Concentração Inibitória Mínima (CIM) foi considerada como a menor concentração capaz de inibir 100% do crescimento fúngico em relação ao controle de crescimento.

EXEMPLO 3. AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA FRACIONAL (CIF)

[019] Após avaliação da CIM, foi verificado o efeito dos antimaláricos em associação com Anfotericina B frente às diferentes linhagens de Cryptococcus e Candida. Dez diluições seriadas do antifúngico e sete diluições dos antimaláricos foram preparadas utilizando os mesmos solventes como no teste da CIM. Alíquotas de 50 μL dos antimaláricos (512 μg/mL a 8 μg/mL) foram adicionadas aos poços de uma placa de 96 poços na orientação vertical e as alíquotas de 50 μL de cada diluição da Anfotericina B (16 μg/mL a 0,03 μg/mL) foram adicionadas na horizontal, de modo que a placa ficasse com várias combinações de concentrações dos dois fármacos. Após, cada poço foi inoculado com 100μL do inóculo, preparado conforme descrito no exemplo 1. As placas incubadas a 37°C por 72 horas. A interação dos antimaláricos com o antifúngico foi expressa através do índice da concentração inibitória fracionária (CIF). A CIF de cada agente foi calculada como a CIM desse agente em combinação, dividido pela CIM do agente sozinho. A interação foi classificada como sinergismo se CIF <0,5, indiferente se 0,5 < CIF < 4 e antagonismo se CIF foi > 4,0. Sendo a faixa de concentração ideal a que apresentou sinergismo (CIF<0,5) tendo em vista a redução em quatro vezes em comparação com concentração de anfotericina B necessária para matar o fungo, de 1 -0,25mg/L para 0,06 - 0,25mg/L. Para halofantrina essa faixa variou de 8 a 128mg/L frente as linhagens de Cryptococcus e de 8 a 512mg/L dependendo da espécie de Candida avaliada. Para amodiaquina as concentrações variaram de 32 a 128mg/L frente a Cryptococcus, enquanto para as linhagens de Candida observou-se variação entre 8 a 256mg/L dependendo da Linhagem. O artesunato, por sua vez, apresentou uma faixa de 64 a 512mg/L para Cryptococcus e de 8 a 512mg/L dependendo da linhagem de Candida.

EXEMPLO 4. AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE EM MACRÓFAGOS

[020] Após avaliação do efeito dos antimaláricos associados à Anfotericina B, frente à Cryptococcus e Candida, decidimos verificar se as concentrações mínimas necessárias para reduzir a CIM da Anfotericina B apresentavam toxicidade para macrófagos. Para isso, células precursoras de macrófagos foram obtidas da medula óssea de camundongos C57BL/6. Após a obtenção, as células foram suspensas em meio RPMI 1640 suplementado com 20% SFB (Soro Fetal Bovino), 2 mM de glutamina, 25 mM de HEPES pH 7,2, penicilina, estreptomicina 30% de sobrenadante de cultura de células L-929; e posteriormente dispensadas em placas de petri 90x60mm. As placas foram incubadas em estufa de CO2 durante sete dias para a diferenciação em macrófagos. Após esse período, as células, já diferenciadas em macrófagos, foram desagregadas e dispensadas em placas de 96 poços na proporção de 0,5 x 105 cel/mL. Após 24 horas de incubação, as células foram tratadas com os antimaláricos (16 - 256pg/mL) e Anfotericina B (0,03 - 32 pg/mL), isolados ou em combinação, durante 3 horas. Em seguida, o meio foi removido e os poços foram lavados com PBS 1X para a remoção completa da droga e do meio residual. Posteriormente, foi adicionado MTT 5mg/mL em cada poço para avaliação da viabilidade celular após exposição aos diferentes tratamentos. Os dados foram expressos em porcentagem, considerando 100% de viabilidade para as células que não receberam tratamento, sendo o DMSO 50%, utilizado como controle positivo de toxicidade.

EXEMPLO 5. AVALIAÇÃO DO EFEITO ANTIFÚNGICO DOS COMPOSTOS

[021] Ao avaliar a atividade antifúngica dos antimaláricos, nós vimos inicialmente que, quando usados sozinhos, não apresentam nenhum efeito inibitório no crescimento de Cryptococcus sp e Candida sp, com valores de CIM superiores a 512mg/L. Enquanto a Anfotericina B, utilizada como controle, apresentou valores de CIM que variaram de 0,25 - 1 mg/L. Entretanto, a interação entre os antimaláricos e Anfotericina B resultou em sinergismo (CIF<0,5), ou seja, a presença do antimalárico foi capaz de reduzir a concentração mínima necessária do antifúngico para inibir o crescimento de Cryptococcus sp e Candida sp.

[022] Na interação Anfotericina B/Halofantrina (8mg/L), a CIM da Anfotericina B apresentou uma redução média de 0,45mg/L para 0,054 mg/L frente as linhagens de Cryptococcus sp, uma redução de 8,3 vezes no valor da CIM (Figura 1), com valores de CIF <0,5 dependendo da concentração de HALO (Tabela 1). Para Candida, também se observou sinergismo entre os fármacos, a interação entre ANF/ HALO resultou na redução da CIM para Anfotericina B de 1mg/L para 0,22mg/L; 4,54 vezes menor em relação a CIM inicial. Essa redução também resultou em valores de CIF < 0,5 dependendo da concentração do antimalárico (Tabela 1). Nós supomos que, quando em contato com o fungo, a Halofantrina pode causar danos na membrana que facilitam a ação da Anfotericina B, contribuindo para o efeito antifúngico sinérgico entre as drogas. Essa hipótese basea-se no fato de que a ação da Halofantrina, enquanto antimalárico, é mediada pela indução de danos na membrana do Plasmodium.

[023] Tabela 1. Valores da concentração inibitória fracionária (CIF) para linhagens de C. gattii, C. neoformans e Candida sp. obtidos da interação entre Anfotericina B (ANB) e Halofantrina (HALO). Em negrito as combinações que apresentaram sinergismo (CIF<0,5).

[024] A Amodiaquina, outro antimalárico avaliado nesse estudo, também apresentou sinergismo quando combinada a Anfotericina B. Nesse caso, o efeito sinérgico entre os dois fármacos foi dependente da concentração. Para Cryptococcus, a interação ANB/ AMO resultou na redução no valor da CIM da Anfotericina B de 0,5 até 0,066mg/L (Figura 1), e valores de FIC inferiores a 0,5 a partir de 32mg/L e 16mg/L do antimalárico, frente a C. gattii e C. neoformans respectivamente (Tabela 2). Em geral, a CIM da Anfotericina B apresentou redução de até 7,5 vezes para Cryptococcus, dependendo da concentração de antimalárico utilizada. Para Candida, a redução ocorreu linhagem dependente, mas a maioria apresentou FIC < 0,05 a partir de 8mg/L do antimalárico, com redução média da CIM do antifúngico de 1mg/L para 0,37mg/L (Figura 1).

[025] O mecanismo de ação da Amodiaquina ainda é pouco esclarecido, portanto ainda não sabemos ao certo como a sua interação com a Anfotericina B pode resultar em efeito antifúngico. Porém, sabe-se que o antimalárico também apresenta ação anti-inflamatória e pode atuar como agonista de receptores do tipo PPAr. Dessa forma, essas características podem ser promissoras considerando o contexto da Criptococose, onde o balanço da resposta imune é importante no controle da doença.

[026] Tabela 2. Valores da concentração inibitória fracionária (CIF) para linhagens de C. gattii, C. neoformans e Candida sp. obtidos da interação entre Anfotericina B (ANB) e Amodiaquina (AMO). Em negrito as combinações que apresentaram sinergismo (CIF<0,5).

[027] O artesunato, por sua vez, apresentou um efeito semelhante ao encontrado para a Amodiaquina; o sinergismo quando associado à Anfotericina B também foi dependente de concentração. Para C. gattii os valores de FIC foram menores que 0,5 a partir da concentração de 128 mg/L do Artesunato quando combinado a Anfotericina B, enquanto para C. neoformans esse perfil foi observado a partir da concentração de 64 mg/L (Tabela 3). Para as concentrações menores do antimalárico, o FIC foi indiferente. Para as linhagens de Candida sp, a maioria apresentou FIC inferior a 0,5 a partir de 8mg/L, menor concentração testada do antimalárico (Tabela 3). A ação do Artesunato enquanto antimalárico baseia-se principalmente na indução de danos no DNA via estresse oxidativo.

[028] A Anfotericina B também é capaz de causar estresse oxidativo na célula fúngica. Dessa forma, acreditamos que a combinação com o antimalárico pode potencializar esse efeito oxidativo e consequentemente reduzir a concentração necessária para a Anfotericina B apresentar seu efeito fungicida.

[029] Após verificar o efeito sinérgico entre a Anfotericina B e os antimaláricos nós verificamos se a combinação entre essas drogas poderia apresentar toxicidade para células de mamíferos. Nesse ensaio, nós consideramos tóxica a concentração capaz de reduzir a viabilidade celular em 50% quando comparada ao controle sem tratamento. Para Anfotericina B, somente na concentração de 32mg/L as células apresentaram uma redução média de 49,4% na viabilidade. Para a Halofantrina, observa-se redução da viabilidade em 75% a partir de 64 mg/L, enquanto para Amodiaquina e Artesunato a toxicidade foi acima da concentração testada (256 mg/L), onde observamos redução na viabilidade de apenas 42% e 37%, respectivamente (Figura 2). Quando avaliamos o efeito da interação entre os antimaláricos e a Anfotericina B na viabilidade celular, nós vimos que as concentrações efetivas na redução do crescimento fúngico apresentaram toxicidade inferior a 50% (Figura 3). No entanto, supõe-se que a combinação entre os fármacos seja segura para utilização em modelo murino.

[030] Tabela 3. Valores da concentração inibitória fracionária (CIF) para linhagens de C. gattii, C. neoformans e Candida sp. obtidos da interação entre Anfotericina B (ANB) e Artesunato (ART). Em negrito as combinações que apresentaram sinergismo (CIF<0,5).

Claims (2)

1. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTIFÚNGICAS, caracterizadas por compreenderem os compostos halofantrina, artesunato e amodiaquina, isolados ou em combinação em associação com Anfotericina B e de excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
2. USO das composições farmacêuticas definidas na reivindicação 1, caracterizado por ser para produzir um medicamento para o tratamento de infecções fúngicas, preferencialmente por Cryptococcus sp. e Candida sp.

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