BR102019023965A2 - processo de obtenção de matriz extracelular descelularizada, matriz extracelular descelularizada, uso da mesma e kit - Google Patents
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Abstract
A presente invenção descreve o processo de obtenção da matriz extracelular da pele de tilápia (Oreochromis nilótico) compreendendo as etapas de descelularização química e enzimática, detoxificação, desinfecção química, reticulação, branqueamento, desidratação e esterilização por irradiação gama, mais especificamente as etapas compreendidas por cada um desses procedimentos e o uso da matriz extracelular aplicada à ruptura de tecido, dermatites, feridas agudas, crônicas e traumáticas, feridas de campo de batalha, feridas necróticas, lacerações, abrasões, contusões, e outras lesões e afecções. A presente invenção se situa nos campos de farmácia, da medicina, da medicina veterinária, da odontologia, da química, da engenharia de tecidos, da biologia molecular e da biotecnologia.
Description
[0001] A presente invenção descreve o processo de obtenção da matriz extracelular da pele de tilápia (Oreochromis niloticus) compreendendo as etapas de descelularização química e enzimática, detoxificação, desinfecção química, reticulação, branqueamento, desidratação e esterilização por irradiação gama. A presente invenção se situa nos campos da farmácia, da medicina, da medicina veterinária, da química, da odontologia, da engenharia de tecidos, da biologia molecular e da biotecnologia.
[0002] Atualmente, não se dispõe no Brasil de nenhuma alternativa de matriz extracelular de origem animal desenvolvida no país, que possa ser incorporada ao organismo receptor, sem necessidade de trocas ou remoção. Em países desenvolvidos, sobretudo nos Estados Unidos da América, matrizes extracelulares industrializadas são utilizadas com essa finalidade e em larga escala, há várias décadas. A importação desses produtos para o Brasil vem contribuindo para onerar ainda mais a balança comercial brasileira, considerando-se seu elevado custo e a realidade econômica do país.
[0003] Na busca pelo estado da técnica em literaturas científica e patentária, foram encontrados os seguintes documentos que tratam sobre o tema:
[0004] O documento CN108355172 difere da presente invenção por apresentar processo de obtenção da pele de peixe descelularizada diferente.
[0005] Munnelly, Amy E., et al. "Porcine vena cava as an alternative to bovine pericardium in bioprosthetic percutaneous heart valves." Biomaterials 33.1 (2012): 1-8.
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[0032] Assim, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.
[0033] Dessa forma, a presente invenção resolve os problemas do estado da técnica a partir do processo de obtenção da matriz extracelular de pele de tilápia (Oreochromis niloticus) e da própria matriz extracelular de pele de tilápia, com vistas a aplicações em vários setores, como nas áreas médicas, químicas, farmacêutica, odontológica, veterinária, biotecnologia, biologia molecular e/ou engenharia de tecidos, entre outras.
[0034] A presente invenção apresenta como conceito inventivo os seguintes objetos:
[0035] Em um primeiro objeto, a presente invenção apresenta o processo de obtenção de matriz extracelular descelularizada a partir de pele de animal compreendendo as etapas de:
- a) preparação da pele para descelularização;
- b) descelularização;
- c) detoxificação e desinfecção química;
- d) desidratação e embalagem a vácuo;
- e) esterilização.
[0036] Em um segundo objeto, a presente invenção apresenta a matriz extracelular descelularizada obtida conforme definida no primeiro objeto.
[0037] Em um terceiro objeto compreende-se o uso da matriz extracelular de pele de peixe compreendendo aplicação nas áreas médicas, químicas, farmacêutica, odontológica, veterinária, biotecnologia, biologia molecular e/ou engenharia de tecidos.
[0038] Em um quarto objeto, tem-se kit compreendendo a matriz extracelular descelularizada.
[0039] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e serão descritos detalhadamente a seguir.
[0040] A presente invenção prove um processo de obtenção de matriz extracelular de pele de peixe, mais especificamente da tilápia (Oreochromis niloticus) e sua aplicação em diversas áreas.
[0041] A pele de tilápia, a partir da técnica histológica de picrosirius red, compreende aproximadamente 90,3% de colágeno, dos quais 71,4% são de colágeno tipo I e 18,9% são de colágeno tipo III.
[0042] Ainda, o presente invento tem como algumas de suas vantagens:
[0043] A descelularização com grande variedade de detergentes e suas possíveis combinações, além do uso de tripsina e DNAse levando a condições ótimas de produção da matriz extracelular. Nas condições aqui estabelecidas, o máximo de células é retirado da pele de tilápia com o mínimo de dano à matriz extracelular e a menor concentração possível de detergente. Isso resulta em uma matriz com estrutura tridimensional mais bem preservada e, portanto, com maior capacidade de estímulo à regeneração tecidual. Além disso, será uma pele descelularizada pobre em proteínas celulares do peixe (altamente imunogênicas), e rica em proteínas da matriz extracelular (principalmente colágeno), pouco imunogênicas.
[0044] O processo da presente invenção apresenta várias etapas de lavagem e incubações sucessivas com tampão de detoxificação alternada com solução fisiológica e água ultra pura para diminuir a possibilidade de resíduos de detergentes e outros contaminantes, de forma a garantir baixa toxicidade e maior segurança do material.
[0045] A liofilização e a embalagem a vácuo garantem maior estabilidade e validade da pele descelularizada, ao minimizarem a umidade necessária ao crescimento microbiano, reações de hidrólise e o contato com o oxigênio atmosférico. Além disso, ao dispensar a necessidade de refrigeração do produto, há menor custo com o transporte e armazenamento do produto.
[0046] As modificações físicas e químicas citadas no presente invento possibilitam a fabricação de uma pele descelularizada:
- a) mais resistente à tensão mecânica, com aumento de resistencia a tração, a pressão pontual e a deformação;
- b) pele descelularizada não absorvível e;
- c) pele descelularizada adesiva.
[0047] A presente invenção apresenta a utilização de Matriz Extracelular da pele de peixe (Oreochromis niloticus), processada em várias etapas, com utilização de detergente variando de 0,05% a 50% ou 0,5 a 150 mmol/L, DNAse e/ou RNAse em concentrações variando de 0,005 μg/mL a 0,5 g/mL, protease em concentrações variando de 0,005 μg/mL a 0,5 μg/mL, reagentes de reticulação ou agentes promotores de ligações cruzadas em concentrações variando de 0,01% a 2,0% ou 0,01 mg/mL a 50,0 mg/mL ou 0,05 μg/mL a 500 μg/mL, com pH variando de 2,5 a 11,5 e peróxido de hidrogênio variando de 0,5% a 85%. O processo é realizado em ambiente de Classificação Sala Limpa, sendo posteriormente realizada a desidratação, embalagem a vácuo e esterilização por irradiação gama. A matriz extracelular, aqui descrita, pode ser utilizada para uma variedade de aplicações na saúde como, por exemplo: ruptura de tecidos diversos, dermatites, feridas agudas, crônicas e traumáticas, feridas de campo de batalha, feridas necróticas, lacerações, abrasões, contusões, fasceíte necrotisante, necrólise epidérmica tóxica (NET), síndrome de Stevens Johnson, feridas por pressão, úlceras por insuficiência venosa, úlceras arteriais, úlceras diabéticas ou neuropáticas, úlceras mistas, mucormicose, feridas vasculíticas, pioderma gangrenoso, reconstrução da parede abdominal para reparação de hérnias, substituto da dura-máter, reparo dural, correção de mielomeningocele e encefalocele, timpanoplastia, tratamento de queimaduras de segundo e de terceiro graus, fístula enterocutânea, enxerto periodontal, hérnia inguinal, fistula retrovaginal, fistula anal, reconstrução de pálpebra, reparo de septo nasal, reparo sinonasal, reconstrução do forro nasal e bucal, lesões da mucosa bucal, reconstrução facial, hérnia hiatal, hérnia ventral, prolapso retal, reparo na doença de Peyronie, reconstrução de uretra e ureter, prolapso do assoalho pélvico, reparo do pericárdio, lesões esofágicas por trauma ou tumor, reconstrução de válvulas cardíacas, uso nas cirurgias cardiovasculares, agenesia vaginal congênita, construção de neovagina, reconstrução vaginal, redesignação sexual em transgêneros, invólucro para próteses de mama, bolsa para enxerto de gordura, prolapso genital, reconstrução de tímpano, lesões cutâneas e reconstruções cirúrgias em animais. Pode ser utilizado também como um material de malha ou sutura, como matéria-prima na produção de fio de sutura, ou usado para fortalecer material de malha ou sutura. Pode ser também utilizado para reforçar ou melhorar o cuidado com as feridas ou associado a um produto de suporte para reconstituição tecidual, tais como suporte para feridas, materiais de malha, ligaduras ou suturas. Pode ser usada como sling (alça) no levantamento de útero e de bexiga e outras estruturas. Associada ou não com outros materiais, pode ser utilizada para reparação e recobrimento de tendões, suturas em meninges, aneurismas de vasos (recobrindo ou reconstruindo as paredes do vaso). A matriz extracelular poderá ser utilizada sozinha ou incorporada com células-tronco, primárias, permanentes, associadas ou não a fatores de crescimento, proteínas recombinantes, fármacos ou produtos naturais. Na odontologia pode ser usado para preenchimento de mucosa oral, cavidade dentária e alvéolos.
[0048] A matriz extracelular é obtida a partir de pele de tilápia (Oreochromis niloticus), sendo a mesma adquirida em pisciculturas, que utilizam sistemas de cultivo em tanques-rede ou tanques utilizando o sistema de bioflocos, passando por um processo de descelularização química e enzimática, branqueamento, desidratação e esterilização, conforme descrito abaixo.
[0049] Após o abate, as peles serão removidas mecanicamente e submetidas à lavagem em água corrente, para a remoção de qualquer resquício de sangue e outras impurezas e colocadas em recipiente plástico estéril, previamente resfriado a 4°C, para o transporte até o laboratório, onde são realizadas os procedimentos de obtenção da matriz extracelular de pele de tilápia:
[0050] Em um primeiro objeto, a presente invenção apresenta o processo de obtenção de matriz extracelular descelularizada a partir de pele de animal compreendendo as etapas de:
- a) preparação da pele para descelularização;
- b) descelularização;
- c) detoxificação e desinfecção química;
- d) desidratação e embalagem a vácuo;
- e) esterilização.
[0051] Em uma concretização, a pele de animal descelularizada é preferencialmente de peixe, mais preferencialmente de peixes ósseos, opcionalmente o peixe é tilápia Oreochromis niloticus.
[0052] Em uma concretização, o processo compreende após a etapa (c) as etapas adicionais de:
- i) reticulação; e
- ii) branqueamento;
[0053] Em uma concretização, a etapa (b) compreende descelularização química e/ou enzimática, em que a descelularização química é opcionalmente assistida por microondas.
[0054] Em uma concretização, a etapa (a) compreende após a obtenção e limpeza da pele, o seu congelamento entre - 70°C e - 150°C por 1 h - 24 h; e descongelamento a 37°C em tampão Tris-HCl ou salina de tampão fosfato 50 -150 mmol/L, pH 6,5 a 7,5, sob agitação orbital de 50 a 300 rpm, em que essa incubação com a solução tampão é repetida de 1 - 10 vezes.
[0055] Em uma concretização, a descelularização química compreendida na etapa (b) compreende as seguintes subetapas:
- b1) lavagem da pele com soro fisiológico e acondicionamento em solução salina de tampão fosfato ou Tris-HCl ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio ou fosfato/citrato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico (HEPES) a 0,025 - 0,50 mol/L, pH 6,0 -8,5, adicionada opcionalmente de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1,0 -5,0 mmol/L e/ou cloreto de sódio (NaCl) 0,025 - 0,15 mol/L e/ou hidróxido de amônio (NH4OH) 0,01 - 1,0% (v/v), com um detergente em concentração variando de 0,01% a 50% (v/v) ou 0,5 a 150 mmol/L, sob agitação de 50 a 300 rpm, temperatura de 20°C à 40°C, e tempo de 30 min a 24h, com 1 a 5 trocas opcionais de tampão com detergente;
- b2) retirada da pele da solução de b1 e acondicionamento na mesma solução sem detergente, para lavagem exaustiva, onde deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C, com intervalos para 2 a 7 trocas de solução.
[0056] Em uma concretização, o dito detergente em b1 é compreendido do grupo: dodecil sulfato de sódio (lauril sulfato de sódio), deoxicolato de sódio, t-octilfenoxipolietoxietanol (Triton X-100), 3-[(3-colamidopropil)dimetilamônio]-1-propanosulfonato (CHAPS), 4-nonilfenil-polietilenoglicol (Nonidet P-40 substituto ou NP40) ou polisorbato 20 (Tween 20) ou combinações dos mesmos.
[0057] Em uma concretização, a descelularização enzimática compreendida na etapa (b) compreende a descelularização enzimática com DNAse, RNAse e/ou protease(s), opcionalmente a descelularização enzimática compreende a combinação das mesmas, em que, se feita a combinação, primeiramente o tratamento é realizado opcionalmente com nucleases e após é realizado o tratamento com proteases.
[0058] Em uma concretização, a descelularização enzimática na etapa (b) compreende as seguintes subetapas:
b3) para a incubação com DNAse e/ou RNAse, a lavagem exaustiva com a dita solução em (b2) é substituída pela solução de salina de tampão fosfato ou Tris-HCl ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio ou fosfato/citrato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico (HEPES) a 0,025 - 0,50 mol/L para incubação com DNAse ou 0,01 - 0,50 mol/L para incubação com RNAse, pH 6,0 - 8,5, adicionada opcionalmente de MgCl2 a 0,5 - 10,0 mmol/L, NaCl a 0,5 - 50,0 mmol/L e CaCl2 a 0,5 - 10,0 mmol/L, onde a pele deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C, com intervalos para 2 a 7 trocas de solução;
b4) acondicionamento das peles na solução de (b3) acrescida de DNAse ou RNAse em concentração variando de 0,005 μg/mL a 0,5 g/mL, onde a pele deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C;
b5) após o tratamento com DNAse e/ou RNAse, nova lavagem exaustiva da pele ser realizada pela retirada da solução de (b4) e acondicionamento na dita solução de (b2), onde a pele deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C, com intervalos para 2 a 7 trocas de solução;
b6) para a incubação com protease, a lavagem exaustiva com a dita solução em (b2) é substituída pela solução de salina de tampão fosfato ou Tris-HCl ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio ou fosfato/citrato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico (HEPES) a 0,025 - 0,50 mol/L, pH 6,0 - 8,5, opcionalmente adicionada de MgCl2 a 0,5 - 10,0 mmol/L, NaCl a 0,5 - 50,0 mmol/L, CaCl2 a 0,5 - 10,0 mmol/L e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1,0 - 5,0 mmol/L, com a(s) protease(s) escolhida(s) em concentrações variando de 0,005 μg/mL a 0,5 μg/mL, onde a pele deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C;
b7) após o tratamento com protease, a nova lavagem exaustiva ser realizada pela retirada da solução de (b6) e acondicionamento da pele na solução de salina de tampão fosfato ou Tris-HCl ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio ou fosfato/citrato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico (HEPES) a 0,025 - 0,50 mol/L, pH 6,0 -8,5, adicionada de CaCl2 100,0 - 200,0 mg/L e MgCl2 100,0 - 150,0 mg/L, onde a pele deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C, com intervalos para 2 a 7 trocas de solução.
b3) para a incubação com DNAse e/ou RNAse, a lavagem exaustiva com a dita solução em (b2) é substituída pela solução de salina de tampão fosfato ou Tris-HCl ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio ou fosfato/citrato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico (HEPES) a 0,025 - 0,50 mol/L para incubação com DNAse ou 0,01 - 0,50 mol/L para incubação com RNAse, pH 6,0 - 8,5, adicionada opcionalmente de MgCl2 a 0,5 - 10,0 mmol/L, NaCl a 0,5 - 50,0 mmol/L e CaCl2 a 0,5 - 10,0 mmol/L, onde a pele deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C, com intervalos para 2 a 7 trocas de solução;
b4) acondicionamento das peles na solução de (b3) acrescida de DNAse ou RNAse em concentração variando de 0,005 μg/mL a 0,5 g/mL, onde a pele deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C;
b5) após o tratamento com DNAse e/ou RNAse, nova lavagem exaustiva da pele ser realizada pela retirada da solução de (b4) e acondicionamento na dita solução de (b2), onde a pele deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C, com intervalos para 2 a 7 trocas de solução;
b6) para a incubação com protease, a lavagem exaustiva com a dita solução em (b2) é substituída pela solução de salina de tampão fosfato ou Tris-HCl ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio ou fosfato/citrato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico (HEPES) a 0,025 - 0,50 mol/L, pH 6,0 - 8,5, opcionalmente adicionada de MgCl2 a 0,5 - 10,0 mmol/L, NaCl a 0,5 - 50,0 mmol/L, CaCl2 a 0,5 - 10,0 mmol/L e ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 1,0 - 5,0 mmol/L, com a(s) protease(s) escolhida(s) em concentrações variando de 0,005 μg/mL a 0,5 μg/mL, onde a pele deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C;
b7) após o tratamento com protease, a nova lavagem exaustiva ser realizada pela retirada da solução de (b6) e acondicionamento da pele na solução de salina de tampão fosfato ou Tris-HCl ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio ou fosfato/citrato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico (HEPES) a 0,025 - 0,50 mol/L, pH 6,0 -8,5, adicionada de CaCl2 100,0 - 200,0 mg/L e MgCl2 100,0 - 150,0 mg/L, onde a pele deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C, com intervalos para 2 a 7 trocas de solução.
[0059] Em uma concretização, a dita protease em (b6) ser escolhida do grupo selecionado entre: tripsina e/ou subtilisina e/ou colagenase e/ou dispase e/ou bromelaína e/ou pepsina ou combinações das mesmas.
[0060] Em uma concretização, a etapa (c) compreende as seguintes subetapas:
c1) incubação da pele em recipiente estéril contendo agente bactericida a 0,005 - 1,0% (m/v), por 15 - 60 minutos, sob agitação de 50 a 300 rpm, à temperatura de 20°C a 40°C, seguida de enxágue em água ultrapura estéril e incubação com água ultrapura estéril no mesmo recipiente por 15 - 60 minutos, nas mesmas condições de agitação e temperatura, em uma a dez repetições;
em que o agente bactericida é selecionado do grupo que compreende: digluconato de clorexidina, clorito de sódio, cloreto de cetilpiridínio, cloramina T, dicloroisocianurato de sódio, opcionalmente o agente bactericida é o digluconato de clorexidina;
c2) incubação da pele em recipiente estéril contendo tampão ácido acético/acetato ou glicina/HCl ou ácido cítrico/citrato ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio a 0,025 - 0,50 mol/L, pH 3,0 - 6,0, por 30 - 120 minutos, sob agitação de 50 a 300 rpm, à temperatura de 20°C a 40°C, seguida de incubação com água ultrapura estéril no mesmo recipiente por 15 - 60 minutos, nas mesmas condições de agitação e temperatura, em uma a dez repetições;
c3) incubação da pele em recipiente estéril contendo tampão Tris-HCl ou salina de tampão fosfato ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio ou fosfato/citrato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico (HEPES) a 0,025 - 0,50 mol/L, pH 6,0 - 8,5, por 30 minutos - 24 horas, sob agitação de 50 a 300 rpm, à temperatura de 20°C a 40°C, em cinco a trinta repetições.
c1) incubação da pele em recipiente estéril contendo agente bactericida a 0,005 - 1,0% (m/v), por 15 - 60 minutos, sob agitação de 50 a 300 rpm, à temperatura de 20°C a 40°C, seguida de enxágue em água ultrapura estéril e incubação com água ultrapura estéril no mesmo recipiente por 15 - 60 minutos, nas mesmas condições de agitação e temperatura, em uma a dez repetições;
em que o agente bactericida é selecionado do grupo que compreende: digluconato de clorexidina, clorito de sódio, cloreto de cetilpiridínio, cloramina T, dicloroisocianurato de sódio, opcionalmente o agente bactericida é o digluconato de clorexidina;
c2) incubação da pele em recipiente estéril contendo tampão ácido acético/acetato ou glicina/HCl ou ácido cítrico/citrato ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio a 0,025 - 0,50 mol/L, pH 3,0 - 6,0, por 30 - 120 minutos, sob agitação de 50 a 300 rpm, à temperatura de 20°C a 40°C, seguida de incubação com água ultrapura estéril no mesmo recipiente por 15 - 60 minutos, nas mesmas condições de agitação e temperatura, em uma a dez repetições;
c3) incubação da pele em recipiente estéril contendo tampão Tris-HCl ou salina de tampão fosfato ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio ou fosfato/citrato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico (HEPES) a 0,025 - 0,50 mol/L, pH 6,0 - 8,5, por 30 minutos - 24 horas, sob agitação de 50 a 300 rpm, à temperatura de 20°C a 40°C, em cinco a trinta repetições.
[0061] Em uma concretização, a descelularização química compreendida na etapa (b) pode ser assistida por microondas com frequência entre 1,0 GHz e 3,0 GHz ou entre 100kHz a 300kHz, sob resfriamento contínuo da solução entre 4°C e 18°C, sob agitação de 50 a 200 rpm durante os tempos de tratamento.
[0062] Em uma concretização, a etapa adicional (i) compreende:
- - incubação da pele em recipiente estéril contendo solução de Hanks ou solução de salina de tampão fosfato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico (HEPES) ou ácido 2-(N-morfolino)etanosulfônico (MES) a 0,015 - 0,50 mol/L, pH 3,0 - 8,5, por 30 a 360 minutos, sob agitação de 50 a 300 rpm, à temperatura de 20°C a 40°C, em uma a cinco repetições;
- - incubação da pele em recipiente estéril contendo solução de Hanks ou solução de salina de tampão fosfato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico (HEPES) ou ácido 2-(N-morfolino)etanosulfônico (MES) a 0,015 - 0,50 mol/L, pH 3,0 - 8,5, acrescida de reagente de reticulação a 0,01% - 2,0% ou 0,01 - 50,0 mg/mL ou 0,05 - 500 μg/mL por 30 minutos a 24 horas, sob agitação de 50 a 300 rpm, à temperatura de 20°C a 40°C, em uma a cinco repetições;
- - incubação da pele em recipiente estéril contendo solução fisiológica por 30 minutos a 24 horas, sob agitação de 50 a 300 rpm, à temperatura de 20°C a 40°C, em uma a quinze repetições.
[0063] Em uma concretização, o dito reagente de reticulação ou agente promotor de ligações cruzadas em e2 compreende ser selecionado do grupo: glutaraldeído (GDA) e/ou genipina (GP) e/ou N-hidroxisuccinamida (NHS) e/ou N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (EDC) e/ou procianidina (PA) e/ou transglutaminase (TG) ou combinações dos mesmos.
[0064] Em uma concretização, a etapa adicional (ii) compreende as subetapas:
- - pele incubada com solução de peróxido de hidrogênio, sob agitação de 50 a 300 rpm, temperatura de 20°C à 40°C, por um período de 30 min a 24h;
- - lavagem exaustiva da pele com água ultrapura;
- - incubação das peles em tampão fosfato salino por um período de 30 min a 24 h;
- - lavagem exaustiva com água ultrapura estéril e incubação com solução fisiológica, sob agitação de 50 a 300 rpm, temperatura de 20°C à 40°C, com intervalos para troca de solução, por um período de 1h a 24h.
[0065] Em uma concretização, a etapa (d) ocorre em um liofilizador em uma faixa de -30°C a -80°C, com pressão interna inferior a 50 μmHg, opcionalmente entre 30 e 35 μmHg e tempo de 2 a 24h, seguida por embalagem a vácuo das peles em embalagens plásticas esterilizadas com espessura de 0,15 a 0,40 μm.
[0066] Em uma concretização, a etapa (e) compreende a radioesterilização complementar por raios gama em irradiador de Cobalto 60, com dosagens que variam entre 5 a 50 kilograys.
[0067] Em um segundo objeto, a presente invenção apresenta a matriz extracelular obtida conforme definida no primeiro objeto.
[0068] Em uma concretização, compreende-se a matriz extracelular descelularizada como material de malha ou sutura, como matéria-prima na produção de fio de sutura, ou usado para fortalecer material de malha ou sutura, incorporada com células-tronco, primárias, permanentes, associadas ou não a fatores de crescimento, proteínas recombinantes, fármacos ou produtos naturais.
[0069] Em um terceiro objeto compreende-se o uso da matriz extracelular de pele de peixe compreendendo aplicação nas áreas médicas, químicas, farmacêutica, odontológica, veterinária, biotecnologia, biologia molecular e/ou engenharia de tecidos.
[0070] Em uma concrentização, compreende-se o uso para aplicação em ruptura de tecidos diversos, dermatites, feridas agudas, crônicas e traumáticas, feridas de campo de batalha, feridas necróticas, lacerações, abrasões, contusões, fasceíte necrotisante, necrólise epidérmica tóxica (NET), síndrome de Stevens Johnson, feridas por pressão, úlceras por insuficiência venosa, úlceras arteriais, úlceras diabéticas ou neuropáticas, úlceras mistas, mucormicose, feridas vasculíticas, pioderma gangrenoso, reconstrução da parede abdominal para reparação de hérnias, substituto da dura-máter, reparo dural, correção de mielomeningocele e encefalocele, timpanoplastia, tratamento de queimaduras de segundo e de terceiro graus, fístula enterocutânea, enxerto periodontal, hérnia inguinal, fistula retrovaginal, fistula anal, reconstrução de pálpebra, reparo de septo nasal, reparo sinonasal, reconstrução do forro nasal e bucal, lesões da mucosa bucal, reconstrução facial, hérnia hiatal, hérnia ventral, prolapso retal, reparo na doença de Peyronie, reconstrução de uretra e ureter, prolapso do assoalho pélvico, reparo do pericárdio, lesões esofágicas por trauma ou tumor, reconstrução de válvulas cardíacas, uso nas cirurgias cardiovasculares, agenesia vaginal congênita, construção de neovagina, reconstrução vaginal, redesignação sexual em transgêneros, invólucro para próteses de mama, bolsa para enxerto de gordura, prolapso genital, reconstrução de tímpano, lesões cutâneas e reconstruções cirúrgias em animais.
[0071] Em uma concretização, a presente invenção compreende o uso da matriz extracelular como um material de malha ou sutura, como matéria-prima na produção de fio de sutura, ou usado para fortalecer material de malha ou sutura.
[0072] Em uma concretização, compreende-se o uso da matriz extracelular como um material para reforçar ou melhorar o cuidado com as feridas ou associado a um produto de suporte para reconstituição tecidual, tais como suporte para feridas, materiais de malha, ligaduras ou suturas.
[0073] Em uma concretização, a presente invenção compreende o uso da matriz extracelular como alça no levantamento de útero e de bexiga e outras estruturas.
[0074] Em uma concretização, a presente invenção compreende o uso da matriz extracelular, associada ou não com outros materiais, na reparação e recobrimento de tendões, suturas em meninges, aneurismas de vasos (recobrindo ou reconstruindo as paredes do vaso).
[0075] Em uma concretização, a matriz extracelular, opcionalmente, pode ser utilizada sozinha ou incorporada com células-tronco, primárias, permanentes, associadas ou não a fatores de crescimento, proteínas recombinantes, fármacos ou produtos naturais.
[0076] Em uma concretização, na odontologia pode ser usado para preenchimento de mucosa oral, cavidade dentária e alvéolos.
[0077] Como um quarto objeto a presente invenção apresenta kit, compreendendo a matriz extracelular descelularizada, conforme definida no segundo objeto e sua concretização.
[0078] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar o escopo da mesma.
[0079] As tilápias (Oreochromis niloticus) são adquiradas em pisciculturas, que utilizam sistemas de cultivo em tanques-rede ou tanques utilizando o sistema de bioflocos, passando por um processo de descelularização química e enzimática, detoxificação e desinfecção química, branqueamento, desidratação, embalagem a vácuo e esterilização, conforme descrito a seguir.
[0080] Após o abate, as peles serão removidas mecanicamente e submetidas à lavagem em água corrente, para a remoção de qualquer resquício de sangue e outras impurezas, colocadas em recipiente plástico estéril e resfriadas a 4°C para o transporte até o laboratório.
[0081] No laboratório são retirados os excessos de músculo, feitos os recortes dos bordos e a lavagem com soro fisiológico estéril (solução de NaCl a 0,9%);
[0082] As peles são congeladas por 1 h - 24 h (opcionalmente 16h) entre -70°C e -150°C (opcionalmente -80°C), e descongeladas a 37°C em banho de solução de Tris-HCl ou salina de tampão fosfato, sob agitação orbital de 50 a 300 rpm (opcionalmente 100 rpm). Este ciclo é repetido de 1 a 10 (opcionalmente 1) vezes.
[0083] Na etapa 2, as peles são removidas da solução de Tris-HCl ou salina de tampão fosfato, lavadas com soro fisiológico e acondicionadas em recipientes contendo solução salina de tampão fosfato com dodecil sulfato de sódio, variando de 0,01% a 50% (opcionalmente 0,5%), sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 130 RPM), temperatura de 20°C à 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 30 min a 6h (opcionalmente 2h). Em seguida, as peles são submetidas à exaustiva lavagem na mesma solução, mas sem detergente.
[0084] Como incubação alternativa ou adicional à etapa 2 são apresentadas a seguir algumas etapas adicionais:
[0085] Etapa adicional 2A: uma incubação alternativa ou adicional à etapa 2 pode ser realizada com o detergente deoxicolato de sódio, variando de 0,01% a 50% (opcionalmente 4%) em solução salina de tampão fosfato, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 130 RPM), temperatura de 20°C à 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 30 min a 24 h (opcionalmente 1 h). Esse passo deve ser seguido por lavagem exaustiva em solução tampão fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio (NaH2PO4/Na2HPO4) 0,1 mol.L" 1; MgCl2 10,0 mmol.L"1, NaCl 5,0 mmol.L"1 e CaCl2 2,5 mmol.L"1, pH 6,5, seguida por tratamento com DNAse e RNAse, em concentrações de 0,01 μg.mL"1 a 0,5 g.mL"1 (opcionalmente 0,2 μg.mL-1) no mesmo tampão, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 130 RPM), temperatura de 20°C à 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 30 min a 24 h (opcionalmente 4 h).
[0086] Etapa adicional 2B: o detergente Triton X-100 também pode ser usado na incubação alternativa ou adicional à etapa 2, em concentração variando de 0,01% a 50% (opcionalmente 1%), juntamente com hidróxido de amônio em concentração variando de 0,01% a 1,0% (opcionalmente 1,0%), em solução de salina de tampão fosfato, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 130 RPM), temperatura de 20°C à 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 30 min a 24 h (opcionalmente 6 h). Este passo pode ser seguido por lavagem exaustiva e tratamento com DNAse e RNAse, tal qual descrito anteriormente.
[0087] Etapa adicional 2C: o detergente 3-[(3-colamidopropil)dimetilamônio]-1-propanosulfonato (CHAPS) também pode ser usado na incubação alternativa ou adicional à etapa 2 em concentração variando de 0,5 a 150 mmol.L-1, (opcionalmente 8,0 mmol.L-1) em solução de NaCl 0,1 mol.L-1; EDTA 2,5 mmol.L-1, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 130 RPM), temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 30 min a 24 h (opcionalmente 4 h). Este passo pode ser seguido por lavagem exaustiva e tratamento com DNAse e RNAse, tal qual descrito anteriormente.
[0088] Etapa adicional 2D: o detergente Nonidet P-40 (NP40) também pode ser usado na incubação alternativa ou adicional à etapa 2 em concentração variando de 0,01% a 50% (opcionalmente 0,05%), em solução de salina de tampão fosfato, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 130 RPM), temperatura de 4°C à 37°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 2 h a 24 h (opcionalmente 16 h). Este passo pode ser seguido por lavagem exaustiva e tratamento com DNAse e RNAse, tal qual descrito anteriormente.
[0089] Etapa adicional 2E: o detergente Tween 20 (Polissorbato 20) também pode ser usado na incubação alternativa ou adicional à etapa 2 em concentração variando de 0,01% a 10% (opcionalmente 3%), em tampão tampão Tris-HCl 50 mmol.L-1, pH 7,5, NaCl 0,15 mol.L-1, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 130 RPM) temperatura de 4°C à 37°C (opcionalmente 37°C) , e tempo de 2 h a 24 h (opcionalmente 24 h). Este passo pode ser seguido por lavagem exaustiva e tratamento com DNAse e RNAse, tal qual descrito anteriormente.
[0090] Etapa adicional 2F: diferentes combinações dos detergentes usados nas etapas adicionais 2A - 2E podem ser utilizados. Este passo pode ser seguido por lavagem exaustiva e tratamento com DNAse e RNAse, tal qual descrito anteriormente.
[0091] Etapa adicional 2G: a descelularização com detergentes pode ser assistida por microondas com frequência entre 1,0 GHz e 3,0 GHz, sob resfriamento contínuo da solução entre 4°C e 18°C, sob agitação de 50 a 200 RPM, nos tempos de tratamento descritos nas etapas adicionais 2A - 2E ou reduzidos.
[0092] Na etapa 3, as peles são removidas da solução anterior e acondicionadas em solução de salina de tampão fosfato com EDTA 5,0 mmol.L-1, pH 8,5, com subtilisina 0,005 μg.mL-1 a 0,5 g.mL-1 (opcionalmente 0,2 mg.mL-1) permanecendo de 2 a 24h (opcionalmente 1 h), sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 130 RPM), à temperatura de 20°C a 60°C (opcionalmente 50°C).
[0093] Como incubação alternativa ou adicional à etapa 3 são apresentadas a seguir algumas etapas adicionais:
[0094] Etapa adicional 3A: a protease colagenase também pode ser usada na incubação alternativa ou adicional à etapa 3 em concentração variando de 0,005 μg.mL-1 a 0,5 g.mL-1 (opcionalmente 0,5 mg.mL-1), em tampão Tris-HCl 50 mmol.L-1, pH 7,5, NaCl 0,15 mol.L-1, pH 6,0, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 130 RPM), temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 2 h a 24 h (opcionalmente 2 h).
[0095] Etapa adicional 3B: a protease tripsina também pode ser usada na incubação alternativa ou adicional à etapa 3 em concentração variando de 0,005 μg.mL-1 a 0,5 g.mL-1 (opcionalmente 0,5 mg.mL-1), em tampão fosfato 0,05 mmol.L-1 com EDTA 5,0 mmol.L-1, pH 8,5, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 130 RPM), temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 2 h a 24 h (opcionalmente 2 h).
[0096] Etapa adicional 3C: a protease dispase também pode ser usada na incubação alternativa ou adicional à etapa 3 em concentração variando de 0,005 μg.mL-1 a 0,5 g.mL-1 (opcionalmente 0,2 mg.mL-1), em ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico (HEPES) 0,05 mmol.L-1, pH 7,5, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 130 RPM), temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 2 h a 24 h (opcionalmente 2 h).
[0097] Etapa adicional 3D: a protease bromelaína também pode ser usada na incubação alternativa ou adicional à etapa 3 em concentração variando de 0,005 μg.mL-1 a 0,5 g.mL-1 (opcionalmente 0,1 mg.mL-1), em em tampão fosfato 0,05 mmol.L-1 com EDTA 1,0 mmol.L-1, pH 6,5, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 130 RPM) temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 2 h a 24 h (opcionalmente 2 h).
[0098] Etapa adicional 3E: a protease pepsina também pode ser usada na incubação alternativa ou adicional à etapa 3 em concentração variando de 0,005 μg.mL-1 a 0,5 g.mL-1 (opcionalmente 0,5 mg.mL-1), em em tampão fosfato/citrato 0,05 mmol.L-1, pH 4,0, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 130 RPM), temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 2 h a 24 h (opcionalmente 2 h).
[0099] Na etapa 4, as peles são acondicionadas em frascos contendo a solução Tris-HCl 0,025 mol.L-1 a 0,5 mol.L-1 (opcionalmente 0,050 mol.L-1) CaCl2 100,0 a 200,0 mg.mL-1 (opcionalmente 140,0 mg.mL-1) e MgCl2 100,0 a 150,0 mg.mL-1 (opcionalmente 98,0 mg.mL-1) pH de 6,0 a 8,5 (opcionalmente 7,4), sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 130 RPM), temperatura de 20°C à 40°C (opcionalmente 37°C), com intervalos para troca de solução, por um período de 2h à 24h (opcionalmente 2 h), com intervalos para 2 a 7 (opcionalmente 3) trocas de solução.
[0100] Na etapa 5, as peles são removidas da solução anterior e acondicionadas em solução de digluconato de clorexidina com concentração entre 0,005 e 1,0% (opcionalmente 0,5%) (m/v), por 15 a 60 minutos (opcionalmente 60 minutos), sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 250 RPM) e temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), seguida de incubação com água ultrapura estéril no mesmo recipiente por 15 a 60 minutos (opcionalmente 60 minutos), nas mesmas condições de agitação e temperatura, em uma a dez repetições.
[0101] Na etapa 6, as peles são removidas da solução anterior e acondicionadas em solução de tampão ácido acético/acetato 0,1 mol.L-1, pH 3,0, por 30 a 120 minutos (opcionalmente 60 minutos), sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 250 RPM) e temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), para em seguida serem incubadas com água ultrapura estéril no mesmo recipiente por 15 - 60 minutos (opcionalmente 60 minutos), nas mesmas condições de agitação e temperatura, em uma a dez repetições (opcionalmente três repetições).
[0102] Como incubação alternativa ou adicional à etapa 6 são apresentadas a seguir algumas etapas adicionais:
[0103] Etapa adicional 6A: o tampão ácido cítrico/citrato 0,25 mol.L-1, pH 5,0, também pode ser usado na incubação alternativa ou adicional à etapa 6, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 250 RPM) temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 30 a 120 (opcionalmente 60) minutos.
[0104] Etapa adicional 6B: o tampão glicina/HCl 0,25 mol.L-1, pH 6,0, também pode ser usado na incubação alternativa ou adicional à etapa 6, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 250 RPM) temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 30 a 120 minutos (opcionalmente 60 minutos).
[0105] Etapa adicional 6C: o tampão fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio 0,050 mol.L-1, pH 4,0, também pode ser usado na incubação alternativa ou adicional à etapa 6, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 250 RPM), temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 30 a 120 minutos (opcionalmente 60 minutos).
[0106] Na etapa 7, as peles são removidas da solução anterior e acondicionadas em solução de tampão Tris-HCl 0,05 mol.L-1, pH 8,5, por 30 minutos a 24 horas (opcionalmente 60 minutos), sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 250 RPM) e temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), em cinco a trinta repetições (opcionalmente cinco repetições).
[0107] Como incubação alternativa ou adicional à etapa 7 são apresentadas a seguir algumas etapas adicionais:
[0108] Etapa adicional 7A: a solução salina de tampão fosfato 0,10 mol.L-1, pH 6,5, também pode ser usada na incubação alternativa ou adicional à etapa 7, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 250 RPM), temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 30 minutos a 24 horas (opcionalmente 60 minutos).
[0109] Etapa adicional 7B: o tampão fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio 0,05 mol.L-1, pH 7,5, também pode ser usado na incubação alternativa ou adicional à etapa 7, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 250 RPM), temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 30 minutos a 24 horas (opcionalmente 60 minutos).
[0110] Etapa adicional 7C: o ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico (HEPES) 0,25 mol.L-1, pH 7,5, também pode ser usado na incubação alternativa ou adicional à etapa 7, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 250 RPM), temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 30 minutos a 24 horas (opcionalmente 60 minutos).
[0111] Etapa adicional 7D: o tampão fosfato/citrato 0,15 mol.L-1, pH 6,0, também pode ser usado na incubação alternativa ou adicional à etapa 7, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 250 RPM), temperatura de 20°C a 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 30 minutos a 24 horas (opcionalmente 60 minutos).
[0112] Na etapa 8, as peles são lavadas exaustivamente e incubadas com solução de Hanks ou solução de salina de tampão fosfato ou ácido 4-(2-Hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico (HEPES) ou ácido 2-(N-Morfolino)etanosulfônico (MES) a 0,015 - 0,50 mol.L-1 (opcionalmente 50 mmol.L-1 e 0,2 mol.L-1, respectivamente), pH 3,0 - 8,5 (opcionalmente 7,4 e 5,0, respectivamente), sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 150 RPM), temperatura de 20°C à 40°C (opcionalmente 37°C), com intervalos para troca de solução, por um período de 30 min a 24h (opcionalmente 1 h). A solução selecionada para incubação das peles deve ser a mesma utilizada como meio reacional para a reticulação a seguir.
[0113] Na etapa 9, as peles são incubadas com o agente promotor de ligações cruzadas ou reagente de reticulação glutaraldeído (GDA), em concentrações de 0,01% a 2% (opcionalmente 0,625%), em tampão HEPES 50 mmol.L-1 (pH 7,4), sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 150 RPM), temperatura de 20°C à 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 2 h a 72 h (opcionalmente 2 h). Esse passo deve ser seguido por lavagem exaustiva em solução fisiológica.
[0114] Como incubação alternativa ou adicional à etapa 9 são apresentadas a seguir algumas etapas adicionais:
[0115] Etapa adicional 9A: uma incubação alternativa ou adicional à etapa 9 pode ser realizada com o agente promotor de ligações cruzadas ou reagente de reticulação genipina (GP), em concentrações de 0,3% a 1% (opcionalmente 0,5%), em tampão HEPES 50 mmol.L-1 (pH 7,4), sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 150 RPM), temperatura de 20°C à 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 2 h a 72 h (opcionalmente 3 h). Esse passo deve ser seguido por lavagem exaustiva em solução fisiológica.
[0116] Etapa adicional 9B: uma incubação alternativa ou adicional à etapa 9 pode ser realizada com o agente promotor de ligações cruzadas ou reagente de reticulação N-hidroxisuccinamida (NHS), em concentrações de 0,05% a 0,2% (opcionalmente 0,1%), em tampão MES 0,2 mol.L-1 (pH 5,0), sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 150 RPM), temperatura de 20°C à 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 2 h a 24 h (opcionalmente 2 h). Esse passo deve ser seguido por lavagem exaustiva em solução fisiológica.
[0117] Etapa Adicional 9C: uma incubação alternativa ou adicional à etapa 9 pode ser realizada com o agente promotor de ligações cruzadas ou reagente de reticulação N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida (EDC), em concentrações de 0,05% a 0,5% (opcionalmente 0,25%), em tampão MES 0,2 mol.L-1 (pH 5,0), sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 150 RPM), temperatura de 20°C à 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 2 h a 24 h (opcionalmente 2 h). Esse passo deve ser seguido por lavagem exaustiva em solução fisiológica.
[0118] Etapa Adicional 9D: uma incubação alternativa ou adicional à etapa 9 pode ser realizada com o agente promotor de ligações cruzadas ou reagente de reticulação procianidina (PA), em concentrações de 1,0 a 50,0 mg.mL-1 (opcionalmente 1,0 mg.mL-1) em solução de D-Hanks (pH 7,4), sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 150 RPM), temperatura de 20°C à 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 2 h a 24 h (opcionalmente 16 h). Esse passo deve ser seguido por lavagem exaustiva em solução fisiológica.
[0119] Etapa Adicional 9E: uma incubação alternativa ou adicional à etapa 9 pode ser realizada com o agente promotor de ligações cruzadas ou reagente de reticulação transglutaminase (TG), em concentrações de 1,0 a 200 μg.mL-1 (opcionalmente 0,1 mg.mL-1), em tampão fosfato salino (pH 6,0, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 150 RPM), temperatura de 20°C à 40°C (opcionalmente 37°C), e tempo de 2 h a 24 h (opcionalmente 2 h). Esse passo deve ser seguido por lavagem exaustiva em solução fisiológica.
[0120] Na etapa 10 as peles são incubadas com solução de peróxido de hidrogênio 10%, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 150 RPM), temperatura de 20°C à 40°C (opcionalmente 37°C), durante 30 minutos. Após a incubação com peróxido de hidrogênio, a matriz é incubada três vezes com água ultrapura estéril. Terminada a lavagem com água ultrapura, as matrizes são adcionadas em 50 mL de tampão fosfato salino estéril para incubar por um período de 30 min à 24h (opcionalmente 2 h).
[0121] Após a incubação com o tampão fosfato salino, foi realizado nova lavagem das peles por 30 min em 50 mL de água ultrapura estéril, em temperatura de 37°C e 120 rpm.
[0122] Na etapa 11, as peles são lavadas exaustivamente e incubadas com solução fisiológica, sob agitação de 50 a 300 RPM (opcionalmente 250 RPM), temperatura de 20°C à 40°C (opcionalmente 37°C), com intervalos para troca de solução, por um período de 1h à 24h (opcionalmente 1 h);
[0123] Na etapa 12, as peles são desidratadas a baixas temperaturas e baixas pressões e, posteriormente, embaladas à vácuo em embalagens plásticas apropriadas. Esta etapa foi executada em um liofilizador em uma faixa de -30°C a -80°C, com pressão interna inferior a 50 μmHg ( opcionalmente na faixa de 30 a 35 μmHg, opcionalmente o valor sendo 30 μmHg) e tempo de 2 a 24h (opcionalmente 3h30 min), seguida por embalagem a vácuo das peles em embalagens plásticas esterilizadas com espessura de 0,15 a 0,40 μm.
[0124] Na etapa 13 é realizada a esterilização complementar por irradiação gama, em um irradiador de Cobalto 60, com doses que variam entre 5 a 50 kilograys (opcionalmente 25 kGy), dependendo dos níveis de Bioburden (contagem microbiana).
[0125] A matriz extracelular, ao interagir com tecidos, promove a aceleração dos processos de cicatrização e de reparação da matriz dérmica (por ação do Colágeno Tipo I existente em sua estrutura histológica).
[0126] Ainda, a pele descelularizada do presente invento pode ser modificada para apresentar as seguintes propriedades:
- a) Pele descelularizada mais resistente à tensão mecânica: para aplicações que requerem maior resistência mecânica (ex.: reparo de hérnias e tendões), a pele descelularizada pode ser prensada com outras lâminas do mesmo tipo de matriz extracelular (a vácuo ou em atmosfera controlada). O biomaterial resultante da prensagem terá várias camadas de matriz extracelular e apresentará um aumento de sua resistência à tração, à pressão pontual e à deformação. As lâminas prensadas podem ser posicionadas em orientações perpediculares umas às outras (de acordo com a direção das fibras de colágeno), para que o biomaterial resultante ofereça resistência mecânica tanto na direção longitudinal quanto na transversal. Para aprimorar a adesão entre as camadas durante a prensagem, entre elas pode ser adicionada uma cola biológica (fibrina, ácido hialurônico, quitosana), química (hidroximetilpropilcelulose) ou, como é o caso do presente invento, um agente indutor de ligações cruzadas [glutaraldeído, genipina, procianidina, transglutaminase, N-hidroxisuccinimida, N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida, N-hidroxisucinimida-polietilenoglicol] .
- b) Pele descelularizada não absorvível: em aplicações que exijam a estabilidade a longo prazo do biomaterial usado em cirurgias, as faces externas da matriz extracelular descelularizada podem ser tratadas com agentes de ligação cruzada [glutaraldeído, genipina, procianidina, transglutaminase, N-hidroxisucinimida, N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida, N- hidroxisucinimida-polietilenoglicol] . As faces externas do biomaterial são aquelas que entram em contato direto com os tecidos do organismo hospedeiro. A formação de ligações cruzadas nessas faces inibe o reconhecimento da estrutura proteica da pele descelularizada por enzimas do hospedeiro. Consequentemente, a reabsorção da pele descelularizada é inibida. Essa característica é desejável, por exemplo, em substitutos de tendões, vasos e válvulas cardíacas artificialmente construídas, que devem permanecer íntegros dentro do organismo receptor por vários anos.
- c) Pele descelularizada adesiva: algumas aplicações cirúrgicas exigem que o biomaterial usado seja capaz de selar rapidamente as lesões sob reparo, para evitar a perda de fluidos corporais (ex.: reparos hemostáticos e durais em geral). Para esses casos, é possível tornar uma das faces da pele descelularizada prontamente adesiva. Essa face da matriz será empregada na oclusão imediata da lesão/incisão. Para obter esse biomaterial, após a descelularização, a futura face adesiva deverá ser tratada com substâncias que a tornem reativa [N-hidroxisucinimida-polietilenoglicol, N-(3-dimetilaminopropil)-N-etilcarbodiimida, N-hidroxisucinimida] ou aderente (ácido hialurônico, quitosana e hidroximetilpropilcelulose), enquanto a outra face permanece sem qualquer tratamento adicional. A reatividade ou aderência permitirá que a face adesiva se fixe prontamente ao sítio da lesão/incisão, interrompendo imediatamente o extravasamento de fluidos.
- d) As associações da pele descelularizada a fármacos e biofármacos resultarão em biomateriais com novas propriedades úteis ao emprego como dispositivo médico. Ou seja, as associações podem conferir propriedades extras à matriz extracelular descelularizada ou potencializar seu estímulo regenerativo. Por exemplo, a pele descelularizada pode ser usada no reparo de uma lesão onde intensa angiogênese é necessária para o restabelecimento dos tecidos atingidos. Nesse caso,a matriz usada poderia ser previamente associada com uma substância pró-angiogênica, como o VEGF (fator de crescimento vascular-endotelial). Assim, além do esperado estímulo à regeneração dos tecidos de preenchimento, a matriz também deverá promover a intensa formação de novos vasos sanguíneos (angiogênese), conforme necessidade específica da região atingida. Associações com antibióticos para evitar a contaminação com bactérias, ou com analgésicos para reduzir a dor do paciente também são possíveis.
[0127] A matriz descelularizada de pele de tilápia foi testada e aprovada quanto à toxicidade in vitro, conforme diretrizes da ISO 10993-5, pois proporcionou viabilidade celular superior a 75% no teste de citotoxicidade por extrato com a linhagem L929 (fibroblasto murino). Testes em ratos estão em execução neste momento.
[0128] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes e alternativas, abrangidas pelo escopo das reivindicações a seguir.
Claims (15)
- Processo de obtenção de matriz extracelular descelularizada a partir de pele de animal caracterizado por compreender as etapas de:
- a) preparação da pele para descelularização;
- b) descelularização;
- c) detoxificação e desinfecção química;
- d) desidratação e embalagem a vácuo;
- e) esterilização.
- Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela pele de animal ser proveniente de peixe, opcionalmente o peixe é tilápia Oreochromis niloticus.
- Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender após a etapa (c) as etapas adicionais de:
- i) reticulação; e
- ii) branqueamento;
- Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa (b) compreender descelularização química e/ou enzimática, em que a descelularização química é opcionalmente assistida por microondas.
- Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa (a) compreender após a obtenção e a limpeza da pele, o seu congelamento entre - 70°C e - 150°C por 1 h - 24 h; e descongelamento a 37°C em tampão Tris-HCl ou salina de tampão fosfato 50 - 150 mmol/L, pH 6,5 a 7,5, sob agitação orbital de 50 a 300 rpm, em que essa incubação com a solução tampão é repetida de 1 - 10 vezes.
- Processo, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, caracterizado pela descelularização química compreendida na etapa (b) compreender as subetapas:
- b1) lavagem da pele com soro fisiológico e acondicionamento em solução salina de tampão fosfato ou Tris-HCl ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio ou fosfato/citrato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico a 0,025 - 0,50 mol/L, pH 6,0 - 8,5, adicionada opcionalmente de ácido etilenodiaminotetracético 1,0 - 5,0 mmol/L e/ou cloreto de sódio 0,025 - 0,15 mol/L e/ou hidróxido de amônio 0,01 - 1,0% (v/v), com um detergente em concentração variando de 0,01% a 50% (v/v) ou 0,5 a 150 mmol/L, sob agitação de 50 a 300 rpm, temperatura de 20°C à 40°C, e tempo de 30 min a 24h, com 1 a 5 trocas opcionais de tampão com detergente;
- b2) retirada da pele da solução de b1 e acondicionamento na mesma solução sem detergente, para lavagem, onde deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C, com intervalos para 2 a 7 trocas de solução;
- Processo, de acordo com a reivindicação 4 ou 6, caracterizado pela descelularização química compreendida na etapa (b) ser opcionalmente assistida por microondas com frequência entre 1,0 GHz e 3,0 GHz ou entre 100kHz a 300kHz, sob resfriamento contínuo da solução entre 4°C e 18°C, sob agitação de 50 a 200 rpm durante os tempos de tratamento; e pela descelularização enzimática compreendendida na etapa (b) compreender a descelularização enzimática com DNAse, RNAse e/ou protease(s), opcionalmente a descelularização enzimática compreende a combinação das mesmas, em que, primeiramente é tratado opcionalmente com nucleases e após é realizado o tratamento com proteases.
- Processo, de acordo com a reivindicação 4 ou 7, caracterizado pela descelularização enzimática compreendida na etapa (b) compreender as subetapas:
b3) para a incubação com DNAse e/ou RNAse, a lavagem exaustiva com a dita solução em (b2) é substituída pela solução de salina de tampão fosfato ou Tris-HCl ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio ou fosfato/citrato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico a 0,025 -0,50 mol/L para incubação com DNAse ou 0,01 - 0,50 mol/L para incubação com RNAse, pH 6,0 - 8,5, adicionada opcionalmente de MgCl2 a 0,5 - 10,0 mmol/L, NaCl a 0,5 - 50,0 mmol/L e CaCl2 a 0,5 - 10,0 mmol/L, onde a pele deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C, com intervalos para 2 a 7 trocas de solução;
b4) acondicionamento das peles em solução de salina de tampão fosfato ou Tris-HCl ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio ou fosfato/citrato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico a 0,025 -0,50 mol/L para incubação com DNAse ou 0,01-0,50 mol/L para incubação com RNAse, pH 6,0 - 8,5, adicionada opcionalmente de MgCl2 a 0,5 - 10,0 mmol/L, NaCl a 0,5 - 50,0 mmol/L e CaCl2 a 0,5 - 10,0 mmol/L, acrescida de DNAse ou RNAse em concentração variando de 0,005 μg/mL a 0,5 g/mL, onde a pele deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C;
b5) após o tratamento com DNAse e/ou RNAse, nova lavagem exaustiva da pele ser realizada pela retirada da solução de (b4) e acondicionamento na dita solução de (b2), onde a pele deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C, com intervalos para 2 a 7 trocas de solução;
b6) para a incubação com protease, a lavagem exaustiva com a dita solução em (b2) é substituída pela solução de salina de tampão fosfato ou Tris-HCl ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio ou fosfato/citrato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico a 0,025 - 0,50 mol/L, pH 6,0 - 8,5, opcionalmente adicionada de MgCl2 a 0,5 - 10,0 mmol/L, NaCl a 0,5 -50,0 mmol/L, CaCl2 a 0,5 - 10,0 mmol/L e ácido etilenodiaminotetracético 1,0 -5,0 mmol/L, com a(s) protease(s) escolhida(s) em concentrações variando de 0,005 μg/mL a 0,5 μg/mL, onde a pele deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C;
b7) após o tratamento com protease, a nova lavagem exaustiva é realizada pela retirada da solução de (b6) e acondicionamento da pele na solução de salina de tampão fosfato ou Tris-HCl ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio ou fosfato/citrato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico a 0,025 - 0,50 mol/L, pH 6,0 - 8,5, adicionada de CaCl2 100,0 - 200,0 mg/L e MgCl2 100,0 - 150,0 mg/L, onde a pele deve permanecer sob agitação orbital de 50 a 300 rpm por 30 min a 24h, à temperatura de 20°C à 40°C, com intervalos para 2 a 7 trocas de solução;
em que a dita protease em (b6) é selecionada do grupo compreendendo: tripsina, subtilisina, colagenase, dispase, bromelaína, pepsina ou combinações das mesmas. - Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa (c) compreender as sub-etapas:
c1) incubação da pele em recipiente estéril contendo agente bactericida a 0,005 - 1,0% (m/v), por 15 - 60 minutos, sob agitação de 50 a 300 rpm, à temperatura de 20°C a 40°C, seguida de enxágue em água ultrapura estéril e incubação com água ultrapura estéril no mesmo recipiente por 15 - 60 minutos, nas mesmas condições de agitação e temperatura, em uma a dez repetições;
em que o agente bactericida é selecionado do grupo que compreende: digluconato de clorexidina, clorito de sódio, cloreto de cetilpiridínio, cloramina T, dicloroisocianurato de sódio, opcionalmente o agente bactericida é o digluconato de clorexidina;
c2) incubação da pele em recipiente estéril contendo tampão ácido acético/acetato ou glicina/HCl ou ácido cítrico/citrato ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio a 0,025 - 0,50 mol/L, pH 3,0 - 6,0, por 30 - 120 minutos, sob agitação de 50 a 300 rpm, à temperatura de 20°C a 40°C, seguida de incubação com água ultrapura estéril no mesmo recipiente por 15 - 60 minutos, nas mesmas condições de agitação e temperatura, em uma a dez repetições;
c3) incubação da pele em recipiente estéril contendo tampão Tris-HCl ou salina de tampão fosfato ou fosfato monobásico de sódio/fosfato dibásico de sódio ou fosfato/citrato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico a 0,025 - 0,50 mol/L, pH 6,0 - 8,5, por 30 minutos - 24 horas, sob agitação de 50 a 300 rpm, à temperatura de 20°C a 40°C, em cinco a trinta repetições. - Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela etapa adicional (i) compreender:
- - incubação da pele em recipiente estéril contendo solução de Hanks ou solução de salina de tampão fosfato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico ou ácido 2-(N-morfolino)etanosulfônico a 0,015 - 0,50 mol/L, pH 3,0 - 8,5, por 30 a 360 minutos, sob agitação de 50 a 300 rpm, à temperatura de 20°C a 40°C, em uma a cinco repetições;
- - incubação da pele em recipiente estéril contendo solução de Hanks ou solução de salina de tampão fosfato ou ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico ou ácido 2-(N-morfolino)etanosulfônico a 0,015 - 0,50 mol/L, pH 3,0 - 8,5, acrescida de reagente de reticulação a 0,01% - 2,0% ou 0,01 - 50,0 mg/mL ou 0,05 - 500 μg/mL por 30 minutos a 24 horas, sob agitação de 50 a 300 rpm, à temperatura de 20°C a 40°C, em uma a cinco repetições;
- - incubação da pele em recipiente estéril contendo solução fisiológica por 30 minutos a 24 horas, sob agitação de 50 a 300 rpm, à temperatura de 20°C a 40°C, em uma a quinze repetições;
- Processo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pela etapa adicional (ii) compreender:
- - pele incubada com solução de peróxido de hidrogênio 10%, sob agitação de 50 a 300 rpm, temperatura de 20°C à 40°C, por um período de 30 min a 24h;
- - lavagem exaustiva da pele com água ultrapura;
- - incubação das peles em tampão fosfato salino por um período de 30 min a 24 h;
- - lavagem exaustiva com água ultrapura estéril e incubação com solução fisiológica, sob agitação de 50 a 300 rpm, temperatura de 20°C à 40°C, com intervalos para troca de solução, por um período de 1h a 24h.
- Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela etapa (d) compreender ser em liofilizador em uma faixa de -30°C a -80°C, com pressão interna inferior a 50 μmHg, opcionalmente na faixa de 30 e 35 μmHg e tempo de 2 a 24h, seguida por embalagem a vácuo das peles em embalagens plásticas esterilizadas com espessura de 0,15 a 0,40 μm; e pela etapa (e) compreender a radioesterilização por raios gama em irradiador de Cobalto 60, com dosagens que variam entre 5 a 50 kilograys.
- Matriz extracelular descelularizada, caracterizada por ser obtida conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
- Uso da matriz extracelular descelularizada, conforme definida na reivindicação 13, caracterizado por ser para a produção de produtos médicos, químicos, farmacêuticos, veterinários, odontológicos de forma a tratar ruptura de tecidos diversos, dermatites, feridas agudas, crônicas e traumáticas, feridas de campo de batalha, feridas necróticas, lacerações, abrasões, contusões, fasceíte necrotisante, necrólise epidérmica tóxica, síndrome de Stevens Johnson, feridas por pressão, úlceras por insuficiência venosa, úlceras arteriais, úlceras diabéticas ou neuropáticas, úlceras mistas, mucormicose, feridas vasculíticas, pioderma gangrenoso, reconstrução da parede abdominal para reparação de hérnias, substituto da dura-máter, reparo dural, correção de mielomeningocele e encefalocele, timpanoplastia, tratamento de queimaduras de segundo e de terceiro graus, fístula enterocutânea, enxerto periodontal, hérnia inguinal, fistula retrovaginal, fistula anal, reconstrução de pálpebra, reparo de septo nasal, reparo sinonasal, reconstrução do forro nasal e bucal, lesões da mucosa bucal, reconstrução facial, hérnia hiatal, hérnia ventral, prolapso retal, reparo na doença de Peyronie, reconstrução de uretra e ureter, prolapso do assoalho pélvico, reparo do pericárdio, lesões esofágicas por trauma ou tumor, reconstrução de válvulas cardíacas, uso nas cirurgias cardiovasculares, agenesia vaginal congênita, construção de neovagina, reconstrução vaginal, redesignação sexual em transgêneros, invólucro para próteses de mama, bolsa para enxerto de gordura, prolapso genital, reconstrução de tímpano, lesões cutâneas e reconstruções cirúrgias em animais, preenchimento de mucosa oral, cavidade dentária e alvéolos, como um material de malha ou sutura, como matéria-prima na produção de fio de sutura, ou usado para fortalecer material de malha ou sutura; sendo que a matriz pode ser utilizada sozinha ou adicionalmente pode ser incorporada células-tronco, primárias, permanentes, associadas a fatores de crescimento, proteínas recombinantes, fármacos ou produtos naturais ou combinação destes.
- Kit, caracterizado por compreender a matriz extracelular descelularizada conforme definida na reivindicação 13.
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