BR102019017958A2 - formulation from peryl alcohol complexed in cyclodextrin for cancer treatment - Google Patents
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Abstract
A presente patente de invenção diz respeito a formulação obtida através a partir do monoterpeno Álcool Perílico (AP) complexado em β-ciclodextrina. A invenção aqui revelada se refere a uma formulação obtida pelo processo de malaxagem, por ser fácil preparação e baixo custo, utilizando a β-ciclodextrina e o AP com o intuito de diminuir a volatilidade e favorecer a liberação controlada da formulação farmacêutica para atividade antitumoral. O processo e produto desenvolvidos se destinam preferencialmente à área de formulações farmacêuticas, mais especificamente aos agentes antitumorais, através da incorporação do AP em β-ciclodextrina representado assim uma importante estratégia tecnológica para melhorar a eficácia deste fármaco, por serem estáveis em meios biológicos e produzidas com lipídios biocompatíveis, biodegradáveis e de custo acessível.
Description
[001] A presente patente de invenção (PI) diz respeito a um processo de obtenção de um complexo de Álcool Perílico (AP) em β-ciclodextrina. Assim, o dito pode ser categorizado como um produto farmacêutico e/ou farmacologicamente ativo tendo em vista que se trata de um processo de obtenção de formulação empregando nanotecnologia preferencialmente utilizando o polímero de origem natural para aplicação tópica, oral, endovenosa visando atividade antitumoral.[001] The present invention patent (PI) concerns a process for obtaining a Peryl Alcohol (AP) complex in β-cyclodextrin. Thus, the said can be categorized as a pharmaceutical and / or pharmacologically active product considering that it is a process of obtaining formulation using nanotechnology preferably using the naturally occurring polymer for topical, oral, intravenous application aiming at antitumor activity.
[002] É importante frisar que a problemática ressaltada no estado da técnica está relacionada ao processo de tratamento de câncer, onde o produto proposto possibilita condições adequadas para tratamentos de vários tipos de canceres, principalmente do tipo gliobastoma. Além disso, os excipientes utilizados para o desenvolvimento da formulação são biocompatíveis e biodegradáveis.[002] It is important to emphasize that the problem highlighted in the state of the art is related to the cancer treatment process, where the proposed product provides adequate conditions for the treatment of various types of cancer, mainly of the gliobastoma type. In addition, the excipients used for the development of the formulation are biocompatible and biodegradable.
[003] As ciclodextrinas são amplamente utilizadas para contornar problemas farmacotécnicos relacionados ao fármaco como solubilidade, volatilidade, estabilidade e biodisponibilidade. Com isso, a formulação proposta surge como um potencial alternativo na produção de medicamentos para tratamento antitumoral, por promover a estabilidade do sistema, liberação controlada/prolongada e liberação do ativo no alvo específico desejado. A formulação desenvolvida apresenta um processo de produção fácil, escalonável e passível de industrialização. Assim, o complexo de inclusão favorece a redução dos efeitos colaterais, biodisponibilidade e baixo custo.[003] Cyclodextrins are widely used to circumvent pharmacotechnical problems related to the drug such as solubility, volatility, stability and bioavailability. Thus, the proposed formulation emerges as an alternative potential in the production of drugs for anti-tumor treatment, as it promotes system stability, controlled / prolonged release and release of the active in the specific target desired. The developed formulation presents an easy, scalable and industrializable production process. Thus, the inclusion complex favors the reduction of side effects, bioavailability and low cost.
[004] Comprovando o mérito da invenção proposta, ressalta-se que não há no mercado produtos similares, empregando AP complexada em ciclodextrinas.[004] Proving the merit of the proposed invention, it is emphasized that there are no similar products on the market, using AP complexed in cyclodextrins.
[005] A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de uma forma farmacêutica composta da complexação do AP em β-ciclodextrinas para uso na área de nano oncologia, mas áreas de farmácia, medicina, biomedicina, química e biotecnologia. Pode ainda ser categorizada como processo e produto com aplicação na área de oncologia, preferencialmente, glioblastoma, através da disponibilização de processo de obtenção da formulação, tendo como público alvo indivíduos/pacientes acometidos de câncer.[005] The present invention relates to the development of a pharmaceutical form composed of the complexation of AP in β-cyclodextrins for use in the area of nano oncology, but in the areas of pharmacy, medicine, biomedicine, chemistry and biotechnology. It can also be categorized as a process and product with application in the area of oncology, preferably glioblastoma, through the availability of a process to obtain the formulation, targeting individuals / patients with cancer.
[006] Câncer, neoplasia maligna ou tumor maligno são sinonímias utilizadas para denominar uma classe de doenças caracterizada pelo crescimento descontrolado de células. Podem invadir tecidos e órgãos normais, por extensão direta ou por disseminação à distância através do sangue, linfa ou superfície serosa, espalham-se para outras regiões do corpo e podem desencadear a morte (Van Schaijik, B., Wickremesekera, A. C., Mantamadiotis, T., Kaye, A. H., Tan, S. T., Stylli, S. S., & Itinteang, T. (2019). Circulating tumor stem cells and glioblastoma: A review. Journal of Clinical Neuroscience).[006] Cancer, malignant neoplasm or malignant tumor are synonyms used to describe a class of diseases characterized by uncontrolled cell growth. They can invade normal tissues and organs, either by direct extension or by distance dissemination through the blood, lymph or serous surface, spread to other regions of the body and can trigger death (Van Schaijik, B., Wickremesekera, AC, Mantamadiotis, T., Kaye, AH, Tan, ST, Stylli, SS, & Itinteang, T. (2019). Circulating tumor stem cells and glioblastoma: A review. Journal of Clinical Neuroscience).
[007] Nas últimas décadas ocorreu, em todo o mundo, com expressivo aumento nos casos de tal enfermidade e isso se deve, principalmente, ao fato da maior expectativa de vida da população, pois trata-se de uma doença, geralmente, associada às últimas décadas de vida. Essa doença tem grande incidência tornando-se grande obstáculo para a saúde pública mundial (www.inca.gov.br).[007] In the last decades, there has been a significant increase in the cases of such disease worldwide, and this is mainly due to the fact that the population has a longer life expectancy, as it is a disease, generally associated with last decades of life. This disease has a high incidence and becomes a major obstacle to global public health (www.inca.gov.br).
[008] As etiologias do câncer são variadas, podem ser externas ou internas ao organismo e associadas. As causas externas relacionam-se ao meio ambiente e aos hábitos ou costumes próprios de um ambiente social e cultural, fatores esses associados ao surgimento de 80% a 90% dos casos. Inclui-se também nos fatores ambientais, o local de trabalho quando insalubre e o estilo de vida, pode se levar em consideração os hábitos, a alimentação e até mesmo medicamentos utilizados (Smith, R. A., Andrews, K. S., Brooks, D., Fedewa, S. A., Manassaram-Baptiste, D., Saslow, D., Wender, R. C. (2017). Cancer screening in the United States, 2017: A review of current American Cancer Society guidelines and current issues in cancer screening. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 67(2), 100–121).[008] The etiologies of cancer are varied, they can be external or internal to the organism and associated. External causes are related to the environment and to the habits or customs of a social and cultural environment, factors associated with the emergence of 80% to 90% of cases. Also included in environmental factors, the workplace when unhealthy and lifestyle, can take into account the habits, food and even medicines used (Smith, RA, Andrews, KS, Brooks, D., Fedewa , SA, Manassaram-Baptiste, D., Saslow, D., Wender, RC (2017). Cancer screening in the United States, 2017: A review of current American Cancer Society guidelines and current issues in cancer screening. CA: A Cancer Journal for Clinicians, 67 (2), 100–121).
[009] Nestes ambientes muitas vezes podem ser encontrados contaminantes como radiação ionizante e agentes químicos/xenobióticos. A infecção por alguns tipos de vírus (vírus hepatite B, HBV e papilomavírus, HPV) também podem contribuir para formação e propagação de câncer (Shield, K. D., Marant Micallef, C., de Martel, C., Heard, I., Megraud, F., Plummer, M., Soerjomataram, I. (2017). New cancer cases in France in 2015 attributable to infectious agents: a systematic review and meta-analysis. European Journal of Epidemiology, 33(3), 263–274).[009] In these environments, contaminants such as ionizing radiation and chemical / xenobiotic agents can often be found. Infection with some types of viruses (hepatitis B virus, HBV and papillomavirus, HPV) can also contribute to the formation and spread of cancer (Shield, KD, Marant Micallef, C., de Martel, C., Heard, I., Megraud , F., Plummer, M., Soerjomataram, I. (2017). New cancer cases in France in 2015 attributable to infectious agents: a systematic review and meta-analysis. European Journal of Epidemiology, 33 (3), 263–274 ).
[0010] As causas internas, geneticamente pré-determinadas, estão ligadas à capacidade do organismo de se defender das agressões externas. Esses fatores causais podem interagir de várias formas, elevam a probabilidade de células normais transformarem-se em malignas (Lichtenstein, A. V. (2018). Genetic Mosaicism and Cancer: Cause and Effect. Cancer Research, 78(6), 1375–1378).[0010] Internal causes, genetically predetermined, are linked to the body's ability to defend itself from external aggressions. These causal factors can interact in various ways, increasing the likelihood of normal cells becoming malignant (Lichtenstein, A. V. (2018). Genetic Mosaicism and Cancer: Cause and Effect. Cancer Research, 78 (6), 1375–1378).
[0011] Os tratamentos do câncer variam de acordo com o tipo de tecido afetado e a gravidade da doença. Estes tumores podem ser tratados com cirurgia, radioterapia, quimioterapia ou, ainda, com a combinação dessas técnicas. A quimioterapia antineoplasica, diferente da cirurgia e da radioterapia, é um tratamento sistêmico, à base de fármacos que impedem a reprodução celular e, consequentemente, poderão levam as células à morte (Srivastava, S. K., Medina-Sánchez, M., Koch, B., & Schmidt, O. G. (2016). Cancer Treatment: Medibots: Dual-Action Biogenic Microdaggers for Single-Cell Surgery and Drug Release (Adv. Mater. 5/2016). Advanced Materials, 28(5), 785-785).[0011] Cancer treatments vary according to the type of tissue affected and the severity of the disease. These tumors can be treated with surgery, radiotherapy, chemotherapy or even with the combination of these techniques. Antineoplasic chemotherapy, unlike surgery and radiotherapy, is a systemic treatment, based on drugs that prevent cell reproduction and, consequently, may cause cells to die (Srivastava, SK, Medina-Sánchez, M., Koch, B ., & Schmidt, OG (2016). Cancer Treatment: Medibots: Dual-Action Biogenic Microdaggers for Single-Cell Surgery and Drug Release (Adv. Mater. 5/2016). Advanced Materials, 28 (5), 785-785) .
[0012] Estes fármacos podem ser administrados isoladamente (monoquimioterapia) ou combinados (poliquimioterapia), em que a última apresenta resultados mais eficazes, pois expressam significativos respaldos a cada aplicação, diminui o risco de resistência às substâncias e podem atingir as células em diferentes fases do seu ciclo. Drogas quimioterápicas usadas no tratamento de tumores malignos apresentam sérios efeitos colaterais, os quais incluem neurotoxicidade, nefrotoxicidade, neuropatia periférica e citopenia (Yoshida, G. J. (2017). Therapeutic strategies of drug repositioning targeting autophagy to induce cancer cell death: from pathophysiology to treatment. Journal of Hematology & Oncology, 10(1)).[0012] These drugs can be administered alone (monochemotherapy) or combined (polychemotherapy), in which the latter presents more effective results, as they express significant support for each application, decrease the risk of resistance to substances and can reach cells in different stages of your cycle. Chemotherapy drugs used to treat malignant tumors have serious side effects, which include neurotoxicity, nephrotoxicity, peripheral neuropathy and cytopenia (Yoshida, GJ (2017). Therapeutic strategies of drug repositioning targeting autophagy to induce cancer cell death: from pathophysiology to treatment. Journal of Hematology & Oncology, 10 (1)).
[0013] Diversos produtos naturais estão disponíveis como agentes quimioterápicos contra câncer (A and Ghorbani A (2015). Cancer therapy with phytochemicals: evidence from clinical studies. Avicenna J Phytomed, 5(2): 84– 97).[0013] Several natural products are available as cancer chemotherapeutic agents (A and Ghorbani A (2015). Cancer therapy with phytochemicals: evidence from clinical studies. Avicenna J Phytomed, 5 (2): 84–97).
[0014] O AP é citotóxico para uma grande variedade de células cancerosas tanto in vitro como in vivo e trabalhos clínicos apontam sua utilidade em seres humanos (Chen, T., da Fonseca, C., & Schönthal, A. (2018). Intranasal Perillyl Alcohol for Glioma Therapy: Molecular Mechanisms and Clinical Development. International Journal of Molecular Sciences, 19(12), 3905.doi:10.3390/ijms19123905) (Andrade, L., Amaral, R., Dória, G., Fonseca, C., da Silva, T., Albuquerque Júnior, R., de Sousa, D. (2016). In Vivo Anti-Tumor Activity and Toxicological Evaluations of Perillaldehyde 8,9-Epoxide, a Derivative of Perillyl Alcohol. International Journal of Molecular Sciences, 17(1), 32).[0014] AP is cytotoxic to a wide variety of cancer cells both in vitro and in vivo, and clinical studies have shown its usefulness in humans (Chen, T., da Fonseca, C., & Schönthal, A. (2018). Intranasal Perillyl Alcohol for Glioma Therapy: Molecular Mechanisms and Clinical Development. International Journal of Molecular Sciences, 19 (12), 3905.doi: 10.3390 / ijms19123905) (Andrade, L., Amaral, R., Dória, G., Fonseca, C., da Silva, T., Albuquerque Júnior, R., de Sousa, D. (2016). In Vivo Anti-Tumor Activity and Toxicological Evaluations of Perillaldehyde 8,9-Epoxide, a Derivative of Perillyl Alcohol. International Journal of Molecular Sciences, 17 (1), 32).
[0015] Ele é considerado o agente anticâncer mais potente entre os monoterpenos. É encontrado em grande quantidade nas cerejas, alfazema (lavanda), hortelã, salva, artemísia, perila, capim santo (capim-limão), bergamota silvestre, folhas do gengibre, cominho-armênio e sementes de aipo (Stratton, S. P., Saboda, K. L., Myrdal, P. B., Gupta, A., McKenzie, N. E., Brooks, C., Alberts, D. S. (2008). Phase 1 Study of Topical Perillyl Alcohol Cream for Chemoprevention of Skin Cancer. Nutrition and Cancer, 60(3), 325–330).[0015] It is considered the most potent anti-cancer agent among monoterpenes. It is found in large quantities in cherries, lavender (lavender), mint, sage, mugwort, perilla, capim santo (lemongrass), wild bergamot, ginger leaves, Armenian cumin and celery seeds (Stratton, SP, Saboda, KL, Myrdal, PB, Gupta, A., McKenzie, NE, Brooks, C., Alberts, DS (2008). Phase 1 Study of Topical Perillyl Alcohol Cream for Chemoprevention of Skin Cancer. Nutrition and Cancer, 60 (3), 325–330).
[0016] Dessa maneira o AP mostrou ser uma substância promissora com atividades antitumorais in vitro e in vivo. Todavia há uma necessidade do desenvolvimento farmacotécnico de um veículo capaz de carrear esse ativo lipofílico para melhorar suas características voláteis. Sendo assim, ainda não existe relatos na literatura de um veículo farmacêutico para complexar o AP, todavia a nanotecnologia apresenta-se como veículo promissor para o bioativo melhorando assim sua biodisponibilidade.[0016] In this way, AP proved to be a promising substance with antitumor activities in vitro and in vivo. However, there is a need for the pharmacotechnical development of a vehicle capable of carrying this lipophilic asset to improve its volatile characteristics. Thus, there are still no reports in the literature of a pharmaceutical vehicle to complex the AP, however, nanotechnology presents itself as a promising vehicle for the bioactive, thus improving its bioavailability.
[0017] As ciclodextrinas (CDs) são uma família de oligossacarídeos cíclicos e consistem de uma série de subunidades de glicose, as quais formam um anel referidas como α- (alfa), β- (beta) e γ- (gama). Possuem estrutura tridimensional específica das moléculas de CD, caracterizadas por uma superfície externa hidrofílica e uma cavidade interna relativamente hidrofóbica, responsável tanto pela solubilidade com água como pela capacidade de encapsular parcial ou totalmente no interior das suas moléculas hidrofóbicas de tamanho adequado (Muankaew, C., & Loftsson, T. (2017). Cyclodextrin-Based Formulations: A NonInvasive Platform for Targeted Drug Delivery. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 122(1), 46–55).[0017] Cyclodextrins (CDs) are a family of cyclic oligosaccharides and consist of a series of glucose subunits, which form a ring referred to as α- (alpha), β- (beta) and γ- (gamma). They have a specific three-dimensional structure of CD molecules, characterized by a hydrophilic external surface and a relatively hydrophobic internal cavity, responsible for both water solubility and the ability to encapsulate partially or totally within their hydrophobic molecules of adequate size (Muankaew, C. , & Loftsson, T. (2017). Cyclodextrin-Based Formulations: A NonInvasive Platform for Targeted Drug Delivery. Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 122 (1), 46–55).
[0018] As CDs são atrativas por aplicabilidades nos domínios de reconhecimento molecular de moléculas e macromoléculas hidrofóbicas orgânicas em soluções aquosas, hidrólise, catalise e polimerização. Como “hospedeiros” moleculares, possuem a capacidade de formar polímeros em complexos de inclusão e no estado solido com outros corpúsculos com inúmeras aplicabilidades nas indústrias de medicamentos, alimentícia, química, têxtil, biotecnologia, entre outras (Jacob, S., & Nair, A. B. (2018). Cyclodextrin complexes: Perspective from drug delivery and formulation. Drug Development Research, 79(5), 201–217).[0018] CDs are attractive due to their applicability in the fields of molecular recognition of organic hydrophobic molecules and macromolecules in aqueous solutions, hydrolysis, catalysis and polymerization. As molecular "hosts", they have the ability to form polymers in inclusion complexes and in the solid state with other bodies with countless applications in the pharmaceutical, food, chemical, textile, biotechnology industries, among others (Jacob, S., & Nair, AB (2018). Cyclodextrin complexes: Perspective from drug delivery and formulation. Drug Development Research, 79 (5), 201–217).
[0019] Mesmo com grande disponibilidade de recursos e tecnologias no mercado ainda há necessidade de aperfeiçoamento e melhorias no âmbito do tratamento do câncer empregando nanotecnologia, pois é necessário torná-los mais acessíveis à população dando preferência ao uso de tecnologia, eficientes e que sejam de fácil reprodução.[0019] Even with great availability of resources and technologies on the market, there is still a need for improvement and improvements in the scope of cancer treatment using nanotechnology, as it is necessary to make them more accessible to the population, giving preference to the use of technology, efficient and that are easy to reproduce.
[0023] O documento BR 1020150244088 refere-se ao processo de produção de nanopartículas poliméricas contendo o composto AP pelo método de emulsificação-evaporação do solvente e as nanopartículas, que compreende o processo de produção de nanopartículas poliméricas contendo AP, revestidas com o polímero poli (ácido-lático)-polietilenoglicol (PLA-PEG), pelo método de emulsificação-evaporação do solvente como forma alternativa para carreamento do fármaco. Este processo de invenção propicia o desenvolvimento de nanopartículas com controle do tamanho e elevada capacidade de encapsulação do AP, além de uma melhora das propriedades físico-químicas, elevando a solubilidade do fármaco, estabilidade em meios fisiológicos e cinética de liberação sustentada e direcionável aos locais de ação desejados. Além disso, as nanopartículas poliméricas contendo AP apresentam-se como um eficaz modelo de nanocarreadores para quimioterápicos, por possuírem uma superfície funcional para células cancerígenas e um sistema que permite aumentar o tempo de meia vida do fármaco. Neste contexto, a presente invenção tem como objetivo elevar a biodisponibilidade e direcionamento in vivo do AP, melhorando a farmacocinética e a biodistribuição do fármaco, para aplicação na terapia de tratamento de câncer.[0023] The document BR 1020150244088 refers to the process of producing polymeric nanoparticles containing the AP compound by the solvent emulsification-evaporation method and the nanoparticles, which comprises the process of producing polymeric nanoparticles containing AP, coated with the poly polymer (lactic acid) -polyethylene glycol (PLA-PEG), by the solvent emulsification-evaporation method as an alternative way to carry the drug. This process of invention allows the development of nanoparticles with control of the size and high capacity of encapsulation of the AP, in addition to an improvement of the physicochemical properties, increasing the solubility of the drug, stability in physiological media and sustained release kinetics and directed to the places desired action plans. In addition, polymeric nanoparticles containing AP present themselves as an effective model of nanocarriers for chemotherapeutic drugs, as they have a functional surface for cancer cells and a system that allows to increase the drug's half-life. In this context, the present invention aims to increase the bioavailability and in vivo targeting of AP, improving the pharmacokinetics and biodistribution of the drug, for application in cancer treatment therapy.
[0024] O documento C10107262-5 descreve uma composição a base de monoterpenos, com efeito quimiopreventivo e quimioterápico em neoplasias malignas de seres humanos e animais, na inibição do crescimento de células tumorais e no controle de metástases de tumores primários e método específico de utilização da composição, em seres humanos e animais. Especificamente o monoterpeno é o AP e os seus metabólitos, que são: o ácido perílico e o ácido dihidroperílico. Refere-se também à utilização dos monoterpenos na inibição do crescimento de células e no controle de metástases de tumores primários, caracterizada pelo fato de serem aplicados in vitro e in vivo em linhagens celulares de glioma C6, U87 e A172, e células de explante de glioblastoma de seres humanos.[0024] Document C10107262-5 describes a composition based on monoterpenes, with chemopreventive and chemotherapeutic effect in malignant neoplasms of humans and animals, in inhibiting the growth of tumor cells and in controlling metastasis of primary tumors and specific method of use composition, in humans and animals. Specifically, the monoterpene is AP and its metabolites, which are: perilic acid and dihydroperilic acid. It also refers to the use of monoterpenes to inhibit cell growth and to control metastasis of primary tumors, characterized by the fact that they are applied in vitro and in vivo to cell lines of glioma C6, U87 and A172, and explant cells of glioblastoma of humans.
[0025] O pedido de patente PI01072625 apresenta uma composição farmacêutica inalatória a base de monoterpenos com efeito quimiopreventivo e quimioterápico em neoplasias malignas de seres humanos e animais bem como na inibição do crescimento de células tumorais e o método específico de aplicação da composição quimiopreventiva em seres humanos e animais portadores de neoplasias malignas. Especificamente o monoterpeno é o AP e os seus metabólitos, que são: o AP e o ácido dihidroperílico. Refere-se também à utilização dos monoterpenos na inibição do crescimento de células e no controle de metástases de tumores primários, caracterizada pelo fato de serem aplicados in vitro e in vivo em células de glioma C6 e U87.[0025] Patent application PI01072625 presents an inhalation pharmaceutical composition based on monoterpenes with chemopreventive and chemotherapeutic effect in malignant neoplasms of humans and animals as well as in inhibiting the growth of tumor cells and the specific method of applying the chemopreventive composition in beings humans and animals with malignant neoplasms. Specifically, the monoterpene is AP and its metabolites, which are: AP and dihydroperylic acid. It also refers to the use of monoterpenes to inhibit cell growth and to control metastasis of primary tumors, characterized by the fact that they are applied in vitro and in vivo to C6 and U87 glioma cells.
[0026] A formulação desenvolvida apresenta-se estável em meios biológicos e produzidas com material biocompatível, biodegradável, baixo custo e baixa tóxicidade;[0026] The developed formulation is stable in biological media and produced with biocompatible, biodegradable material, low cost and low toxicity;
[0027] A formulação apresenta liberação controlada do bioativo, além de permitir direcionamento específico no tecido tumoral.[0027] The formulation presents controlled release of the bioactive, in addition to allowing specific targeting in the tumor tissue.
[0028] O desenvolvimento da formulação representa uma alternativa as formas farmacêuticas devido maior eficiência terapêutica e redução dos efeitos indesejáveis.[0028] The development of the formulation represents an alternative to pharmaceutical forms due to greater therapeutic efficiency and reduction of undesirable effects.
[0029] A formulação apresentou atividade anticâncer em ensaios in vivo e in vitro. Além disso, não apresentou citotoxicidade em células normais do tipo fibroblastos.[0029] The formulation showed anticancer activity in in vivo and in vitro assays. In addition, it did not show cytotoxicity in normal fibroblast-type cells.
[0030] Processo que compreende matérias primas versáteis, baixo custo e processo simplificado. As matérias primas utilizadas são compatíveis fisiologicamente[0030] Process comprising versatile raw materials, low cost and simplified process. The raw materials used are physiologically compatible
[0031] O processo de obtenção é prático, seguro, e, pode ser aplicado em escala industrial.[0031] The procurement process is practical, safe, and can be applied on an industrial scale.
[0032] O processo de obtenção é prático e seguro.[0032] The procurement process is practical and safe.
[0033] Após as vantagens apresentadas e para que o processo da invenção proposta nesse documento de patente possa ser mais bem compreendido e avaliado, a descrição dos desenhos será feita a seguir.[0033] After the advantages presented and so that the process of the invention proposed in that patent document can be better understood and evaluated, the description of the drawings will be made below.
[0034] Figura 1. Analise termogravimétrica das amostras: (A) AP e β-ciclodextrina, (B) mistura física (MF) (1:0,25, 1:1 e 1:2 (β-CD:AP)), (C) malaxagem (MA) (1:0,25, 1:1 e 1:2 (β-CD:AP)) e (D) co-evaporado (CE) (1:0,25, 1:1 e 1:2 (β-CD:AP)).[0034] Figure 1. Thermogravimetric analysis of the samples: (A) AP and β-cyclodextrin, (B) physical mixture (MF) (1: 0.25, 1: 1 and 1: 2 (β-CD: AP)) , (C) malaxagem (MA) (1: 0.25, 1: 1 and 1: 2 (β-CD: AP)) and (D) co-evaporated (CE) (1: 0.25, 1: 1 and 1: 2 (β-CD: AP)).
[0035] Figura 2. Análise diferencial de varredura AP, β-ciclodextrina, mistura física AP- β-CD (1:1), malaxagem AP- β-CD (1:1) e co-evaporado AP- β-CD (1:1).[0035] Figure 2. Differential scan analysis AP, β-cyclodextrin, physical mixture AP- β-CD (1: 1), AP-β-CD (1: 1) and co-evaporated AP- β-CD ( 1: 1).
[0036] Figura 3. Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (A) AP e β-ciclodextrina, (B) mistura física (MF) (1:0,25, 1:1 e 1:2 (β-CD:AP)), (C) malaxagem (MA) (1:0,25, 1:1 e 1:2 (β-CD:AP)) e (D) co-evaporado (CE) (1:0,25, 1:1 e 1:2 (β-CD:AP)).[0036] Figure 3. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (A) AP and β-cyclodextrin, (B) physical mixture (MF) (1: 0.25, 1: 1 and 1: 2 (β-CD: AP )), (C) malaxagem (MA) (1: 0.25, 1: 1 and 1: 2 (β-CD: AP)) and (D) co-evaporated (CE) (1: 0.25, 1 : 1 and 1: 2 (β-CD: AP)).
[0037] Figura 4. Difratogramas de raio X da β-ciclodextrina, mistura física (MF) (1:1 β-CD:AP), malaxagem (MA) (1:1 β-CD:AP) e co-evaporado (CE) (1:1 β-CD:AP).[0037] Figure 4. X-ray diffractograms of β-cyclodextrin, physical mixture (MF) (1: 1 β-CD: AP), malaxagem (MA) (1: 1 β-CD: AP) and co-evaporated ( EC) (1: 1 β-CD: AP).
[0038] Figura 5. Fotomicrografias da β-CD isolada com tamanhos de 50, 10, 10, 5 e 1 µm em aumentos de 500, 1.000, 2.500, 5.000 e 10.000 vezes, demonstrada, respectivamente, em 1A, 1C, 1E, 1G e 1I e do complexo coevaporado AP- β-CD tamanhos de 50, 10, 10, 5 e 1 µm em aumentos de 500, 1.000, 2.500, 5.000 e 10.000 vezes, demonstrada, respectivamente, em 1D, 1F, 1H e 1J.[0038] Figure 5. Photomicrographs of the isolated β-CD with sizes of 50, 10, 10, 5 and 1 µm in increments of 500, 1,000, 2,500, 5,000 and 10,000 times, demonstrated, respectively, in 1A, 1C, 1E, 1G and 1I and the AP- β-CD coevaporated complex sizes of 50, 10, 10, 5 and 1 µm in increments of 500, 1,000, 2,500, 5,000 and 10,000 times, demonstrated, respectively, in 1D, 1F, 1H and 1J .
[0039] Figura 6. Estrutura molecular da β-ciclodextrina (A e B) e a docagem molecular do AP na posição de menor valor absoluto de afinidade (kcal/mol) (C) e o diagrama de interações moleculares entre AP e a β-ciclodextrina (D).[0039] Figure 6. Molecular structure of β-cyclodextrin (A and B) and the molecular docking of the AP in the position of lowest absolute affinity value (kcal / mol) (C) and the diagram of molecular interactions between AP and β -cyclodextrin (D).
[0040] Figura 7. Efeito do AP, β-CD e β-CD-AP na viabilidade de fibroblastos humanos L929 determinadas pelo ensaio de MTT. O controle negativo foi tratado com o veículo usado para diluir a droga (DMSO 5%). Os dados correspondem à média ± E.P.M. de quatro experimentos independentes.[0040] Figure 7. Effect of AP, β-CD and β-CD-AP on the viability of human L929 fibroblasts determined by the MTT assay. The negative control was treated with the vehicle used to dilute the drug (
[0041] Figura 8. Valores da massa tumoral (g) após o tratamento com β-CD-AP produzido por co-evaporação na proporção molar de 1:1 nas concentrações 50, 100 e 200 mg/kg/dia em camundongos inoculados com células S180. Os animais foram tratados via i.p., iniciados um dia após a implantação do tumor, por 7 dias consecutivos. O veículo foi usado como controle negativo. 5-FU 25 mg/kg/dia foi usado como controle positivo. Dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 6 animais/grupo) e os resultados avaliados por análise de variância de uma via ANOVA de duas vias seguido de pós teste de NewmanKeuls Multiple Comparison Test (p < 0,05). Comparado com o grupo veiculo, *p < 0,05, comparado ao grupo #5-FU e comparado ao grupo ∆50.[0041] Figure 8. Tumor mass values (g) after treatment with β-CD-AP produced by co-evaporation at a molar ratio of 1: 1 at
[0042] Figura 9. O gráfico apresenta os valores da inibição do crescimento tumoral (%) após o tratamento com β-CD-AP produzido por co-evaporação na proporção molar de 1:1, 50, 100 e 200 mg/kg/dia em relação aos grupos veículo (controle negativo) e 5-FU (25 mg/Kg/dia) – controle positivo, em camundongos inoculados com células S180. Os animais foram tratados via i.p., iniciado um dia após a implantação do tumor, por 7 dias consecutivos. O veículo foi usado como controle negativo. 5-FU 25 mg/kg/dia foi usado como controle positivo. Dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 6 animais/grupo) e os resultados avaliados por análise de variância de uma via ANOVA de duas vias seguido de pós teste de Newman-Keuls Multiple Comparison Test (p < 0,05). Comparado ao grupo veiculo, #p < 0,05 comparado com o grupo 5-FU.[0042] Figure 9. The graph shows the values of tumor growth inhibition (%) after treatment with β-CD-AP produced by co-evaporation in the molar ratio of 1: 1, 50, 100 and 200 mg / kg / day in relation to the vehicle groups (negative control) and 5-FU (25 mg / Kg / day) - positive control, in mice inoculated with S180 cells. The animals were treated via i.p., started one day after the tumor implantation, for 7 consecutive days. The vehicle was used as a negative control. 5-FU 25 mg / kg / day was used as a positive control. Data are presented as mean ± standard error of the mean (n = 6 animals / group) and the results evaluated by analysis of variance of a two-way ANOVA path followed by a Newman-Keuls Multiple Comparison Test post test (p <0.05 ). Compared to the vehicle group, #p <0.05 compared to the 5-FU group.
[0043] Figura 10. Valores da massa corpórea (g) dos animais transplantados com tumor S180 avaliados por grupo tratado com β-CD-AP produzido por coevaporação na proporção molar de 1:1, nas concentrações 50, 100 e 200 mg/kg/dia em relação aos grupos veículo (controle negativo) e 5-FU (25 mg/Kg/dia) – controle positivo. Os animais foram tratados via i.p., iniciado um dia após a implantação do tumor, por 7 dias consecutivos. Dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 6 animais/grupo) e os resultados avaliados por análise de variância de uma via ANOVA de duas vias seguido de pós teste de Newman-Keuls Multiple Comparison Test (p < 0,05). Comparado com o grupo veiculo, *p < 0,05, comparado ao grupo #5-FU e comparado ao grupo ∆50.[0043] Figure 10. Body mass values (g) of animals transplanted with S180 tumor evaluated by group treated with β-CD-AP produced by coevaporation in a molar ratio of 1: 1, in
[0044] Figura 11. O efeito da β-CD-AP produzido por co-evaporação na proporção molar de 1:1, nas concentrações 50, 100 e 200 mg/kg/dia (i.p.) na avaliação da variação da massa do fígado (g) de camundongos com tumor S180, durante 8 dias. Os dados são apresentados como a média ± o erro padrão da média de 6 animais por grupo. Os resultados foram avaliados por ANOVA de duas vias seguido de pós-teste de Newman-Keuls Multiple Comparison Test. *p < 0,05 comparado com o grupo de animais com tumor tratado com salina e #5- FU e demais tratamentos. Veículo foi usado com controle negativo e 5-FU como controle positivo.[0044] Figure 11. The effect of β-CD-AP produced by co-evaporation at a molar ratio of 1: 1, at
[0045] Figura 12. O efeito da β-CD-AP produzido por co-evaporação na proporção molar de 1:1, 50, 100 e 200 mg/kg/dia (i.p.) na avaliação da variação da massa do baco (g) de camundongos com tumor S180, durante 8 dias. Os dados são apresentados como a média ± o erro padrão da média de 6 animais por grupo. Os resultados foram avaliados por ANOVA de duas vias seguido de pós-teste de Newman-Keuls Multiple Comparison Test. Comparado com o grupo veiculo, *p < 0,05 e comparado ao grupo #5-FU.[0045] Figure 12. The effect of β-CD-AP produced by co-evaporation at a molar ratio of 1: 1, 50, 100 and 200 mg / kg / day (ip) in the evaluation of the variation in the mass of the bacillus (g ) of mice with S180 tumor, for 8 days. The data are presented as the mean ± the standard error of the mean of 6 animals per group. The results were evaluated by two-way ANOVA followed by a Newman-Keuls Multiple Comparison Test post-test. Compared with the vehicle group, * p <0.05 and compared to the # 5-FU group.
[0046] Figura 13. O efeito da β-CD-AP produzido por co-evaporação na proporção molar de 1:1, 50, 100 e 200 mg/kg/dia (i.p.) na avaliação da variação da massa do rin (g) de camundongos com tumor S180, durante 8 dias. Os dados são apresentados como a média ± o erro padrão da média de 6 animais por grupo. Os resultados foram avaliados por ANOVA de duas vias seguido de pósteste de Newman-Keuls Multiple Comparison Test. Comparado com o grupo veiculo, *p < 0,05 e comparado ao grupo #5-FU.[0046] Figure 13. The effect of β-CD-AP produced by co-evaporation at a molar ratio of 1: 1, 50, 100 and 200 mg / kg / day (ip) in the evaluation of the variation in the mass of the kidney (g ) of mice with S180 tumor, for 8 days. The data are presented as the mean ± the standard error of the mean of 6 animals per group. The results were evaluated by two-way ANOVA followed by Newman-Keuls Multiple Comparison Test post-test. Compared with the vehicle group, * p <0.05 and compared to the # 5-FU group.
[0047] Figura 14. Fotomicrografias de secções histológicas coradas em HE exibindo as principais características histopatológicas dos tumores desenvolvidos a partir da implantação de células S100. (A) Células tumorais proliferam em lençóis compactos (100 ×). (B) Células tumorais predominantemente redondas e ovoides permeiam vasos capilares neoformados (400 ×). (C e D) Células tumorais S180 infiltram, dissociam e destroem fibras musculares e (E e F) células do panículo adiposo (400 ×). Legenda: Cap - vasos capilares; Fm - fibras musculares estriadas esqueléticas; S180 - células tumorais de sarcoma 180; seta escura - área de necrose d fibras musculares; Ad - células adiposas; seta branca - área de necrose do tecido adiposo.[0047] Figure 14. Photomicrographs of histological sections stained in HE showing the main histopathological characteristics of tumors developed from the implantation of S100 cells. (A) Tumor cells proliferate in compact sheets (100 ×). (B) Tumor cells predominantly round and ovoid permeate newly formed capillary vessels (400 ×). (C and D) S180 tumor cells infiltrate, dissociate and destroy muscle fibers and (E and F) cells of the adipose panicle (400 ×). Caption: Cap - capillary vessels; Fm - skeletal striated muscle fibers; S180 -
[0048] Figura 15. Fotomicrografias de secções histológicas coradas em HE exibindo as principais características histopatológicas dos tumores desenvolvidos a partir da implantação de células S100. (A e B) Tumor exibindo extensas áreas de necrose coagulativa intraparenquimatosa, de forma e limites irregulares (400 × e 100 ×, respectivamente). (C e D) Tumor exibindo menor abundância de áreas necróticas, que se apresentam sob a forma de trabiques delgados permeando os lençóis de células neoplásicas (400 × e 100 ×, respectivamente). (E e F) Maior detalhe das áreas de necrose, representadas pela presença de células com citoplasma intensamente eosinofílico e ausência de estruras nucleares (400 ×). Legenda: Ne – necrose coagulativa intraparenquimatosa..[0048] Figure 15. Photomicrographs of histological sections stained in HE showing the main histopathological characteristics of tumors developed from the implantation of S100 cells. (A and B) Tumor showing extensive areas of intraparenchymal coagulative necrosis, with irregular shape and borders (400 × and 100 ×, respectively). (C and D) Tumor showing less abundance of necrotic areas, which present themselves in the form of thin trabicles permeating the sheets of neoplastic cells (400 × and 100 ×, respectively). (E and F) Greater detail of the necrosis areas, represented by the presence of cells with intensely eosinophilic cytoplasm and absence of nuclear structures (400 ×). Caption: Ne - intraparenchymal coagulative necrosis.
[0049] Figura 16. Fotomicrografias de secções histológicas coradas em HE exibindo as principais características histopatológicas dos tumores desenvolvidos a partir da implantação de células S100. (A) Células tumorais apresentando morfologia predominante redonda e ovoide, relativamente isomórficas (400 ×), (B) com citoplasma eosinofílico amplo e núcleos volumosos centrais ou excêntricos (1000 ×). (C e D) Células tumorais exibindo intenso pleomorfismo celular e hipercromatismo nuclear (400 × e 1000 ×, respectivamente). (E e F) Presença de células gigantes tumorais de aspecto morfológico bizarro (400 ×). Legenda: Seta branca – Células gigantes tumorais.[0049] Figure 16. Photomicrographs of histological sections stained in HE showing the main histopathological characteristics of tumors developed from the implantation of S100 cells. (A) Tumor cells with predominantly round and ovoid morphology, relatively isomorphic (400 ×), (B) with broad eosinophilic cytoplasm and large or central or eccentric bulky nuclei (1000 ×). (C and D) Tumor cells exhibiting intense cellular pleomorphism and nuclear hyperchromatism (400 × and 1000 ×, respectively). (E and F) Presence of giant tumor cells with a bizarre morphological aspect (400 ×). Caption: White arrow - Giant tumor cells.
[0050] Figura 17. Fotomicrografias de secções histológicas coradas em HE exibindo células S100 em mitose típica na fase de (A) prófase, (B) metáfase, (C) anáfase e (D) telófase (800 ×). (E) Figura de mitose atípica em prófase e (F) metáfase (fuso mitótico tripolar) (800 ×). (G) Invasão perineural e (H) vascular por células tumorais (400 ×).[0050] Figure 17. Photomicrographs of histological sections stained in HE showing S100 cells in typical mitosis in the phase of (A) prophase, (B) metaphase, (C) anaphase and (D) telophase (800 ×). (E) Figure of atypical mitosis in prophase and (F) metaphase (tripolar mitotic spindle) (800 ×). (G) Perineural and (H) vascular invasion by tumor cells (400 ×).
[0051] Figura 18. Fotomicrografias de secções histológicas coradas em HE exibindo as principais características histopatológicas dos tumores desenvolvidos no grupo SALINA a partir da implantação de células S100. (A) Margem superficial dérmica do tumor exibindo pseudocápsula descontínua (Cap) mostrando nítida infiltração neoplásica (setas brancas) (40 ×) e (B) áreas extensas de necrose coagulativa (Ne) no interior dos blocos de células neoplásicas (40 ×). (C) Detalhe das células tumorais exibindo intensa atipia e promovendo dissociam e destruição de fibras musculares estriadas esqueléticas (setas negras) (400×). (D) Célula gigante tumoral bizarra (400×).[0051] Figure 18. Photomicrographs of histological sections stained in HE showing the main histopathological characteristics of the tumors developed in the SALINA group from the implantation of S100 cells. (A) Dermal superficial margin of the tumor showing discontinuous pseudocapsule (Cap) showing clear neoplastic infiltration (white arrows) (40 ×) and (B) extensive areas of coagulative necrosis (Ne) within the neoplastic cell blocks (40 ×). (C) Detail of the tumor cells showing intense atypia and promoting dissociation and destruction of skeletal striated muscle fibers (black arrows) (400 ×). (D) Bizarre giant tumor cell (400 ×).
[0052] Figura 19. Fotomicrografias de secções histológicas coradas em HE exibindo as principais características histopatológicas dos tumores desenvolvidos no grupo SALINA a partir da implantação de células S100. (A) Células neoplásicas promovendo infiltração e destruição maciça de feixes de fibras musculares estriadas esqueléticas (100 ×). (B) Células tumorais fortemente dissociadas dispostas em cordões tipo “fileira indiana” (400 ×). (C) Células neoplásicas promovendo invasão perineural em fibras nervosas periféricas (Fne) (100×). (D) Células neoplásicas observadas no interior de vaso linfático formando êmbolo tumoral (contorno vermelho) (100×).[0052] Figure 19. Photomicrographs of histological sections stained in HE showing the main histopathological characteristics of the tumors developed in the SALINA group from the implantation of S100 cells. (A) Neoplastic cells promoting infiltration and massive destruction of striated skeletal muscle fiber bundles (100 ×). (B) Strongly dissociated tumor cells arranged in “Indian row” cords (400 ×). (C) Neoplastic cells promoting perineural invasion in peripheral nerve fibers (Fne) (100 ×). (D) Neoplastic cells observed inside a lymphatic vessel forming a tumoral embolus (red outline) (100 ×).
[0053] Figura 20. Fotomicrografias de secções histológicas coradas em HE exibindo as principais características histopatológicas dos tumores desenvolvidos no grupo SALINA a partir da implantação de células S180. (A) e (B) Células neoplásicas (S180) promovendo infiltração maciça do panículo adiposo hipodérmico (Pa) (100 ×e 400×, respectivamente). (C) Intensa neoformação vascular capilar (setas negras) na periferia do tumor e (D) em áreas intraparenquimatosas (400 ×).[0053] Figure 20. Photomicrographs of histological sections stained in HE showing the main histopathological characteristics of the tumors developed in the SALINA group from the implantation of S180 cells. (A) and (B) Neoplastic cells (S180) promoting massive infiltration of the hypodermic adipose panicle (Pa) (100 × and 400 ×, respectively). (C) Intense capillary vascular neoformation (black arrows) on the periphery of the tumor and (D) in intraparenchymal areas (400 ×).
[0054] Figura 21. Fotomicrografias de secções histológicas coradas em HE exibindo as principais características histopatológicas dos tumores desenvolvidos no grupo 5-FU a partir da implantação de células S180. (A) Zona superficial mostrando pseudocápsula e blocos de células tumorais separados por trabiques de tecido necrótico, conferindo aspecto pseudolobular (40 ×). (B) Porção profunda voltada para a hipoderme mostrando, de maneira semelhante, os trabiques neccríticos que separam blocos de células tumorais em pseudolóbulos; notar a delimitação bem marcada do tumor por fibras musculares estriadas esqueléticas (40 ×). (C) Detalhe das faixas estreitas de tecido necrótico (trabiques) separando os pseudolóbulos (100 ×). (D) Porção central do tumor mostrando células tumorais invadindo feixes de fibras musculares, separandoos em blocos relativamente bem preservados (100 ×). Legenda: Cap – pseudocápsula superficial; Ne – necrose coagulativa; Plb – pseudolóbulos; Fm - fibras musculares estriadas esqueléticas; S180 – células tumorais de sarcoma 180 viáveis.[0054] Figure 21. Photomicrographs of histological sections stained in HE showing the main histopathological characteristics of the tumors developed in the 5-FU group from the implantation of S180 cells. (A) Superficial area showing pseudocapsule and blocks of tumor cells separated by necrotic tissue trabecules, giving a pseudolobular aspect (40 ×). (B) Deep portion facing the hypodermis, showing, in a similar way, the neccritic trabecules that separate blocks of tumor cells into pseudolobules; note the well-marked delimitation of the tumor by striated skeletal muscle fibers (40 ×). (C) Detail of the narrow bands of necrotic tissue (trabiques) separating the pseudolobules (100 ×). (D) Central portion of the tumor showing tumor cells invading bundles of muscle fibers, separating them into relatively well preserved blocks (100 ×). Caption: Cap - superficial pseudocapsule; Coagulative neecrosis; Plb - pseudolobules; Fm - skeletal striated muscle fibers; S180 -
[0055] Figura 22. Fotomicrografias de secções histológicas coradas em HE exibindo as principais características histopatológicas dos tumores desenvolvidos no grupo 5-FU a partir da implantação de células S180. (A) Células tumorais mostrando atipia leve a moderada, com células ora exibindo núcleos de cromatina ora densa (asterisco branco) ora dispersa (asterisco negro) (400 ×, detalhe em 800 ×). (B) Figura de mitose típica em prófase (400 ×, detalhe em 800 ×). (C) e (D) Intenso infiltrado inflamatório e edema intersticial em meio ao parênquima tumoral (400 × e 800 ×, respectivamente; detalhes em 1500 ×). Legenda: Seta amarela – Célula tumoral; Seta negra – polimorfonuclear neutrófilo; Seta vermelha – linfócito.[0055] Figure 22. Photomicrographs of histological sections stained in HE showing the main histopathological characteristics of tumors developed in the 5-FU group from the implantation of S180 cells. (A) Tumor cells showing mild to moderate atypia, with cells sometimes showing nuclei of chromatin, sometimes dense (white asterisk) or dispersed (black asterisk) (400 ×, detail in 800 ×). (B) Figure of typical mitosis in prophase (400 ×, detail in 800 ×). (C) and (D) Intense inflammatory infiltrate and interstitial edema in the middle of the tumor parenchyma (400 × and 800 ×, respectively; details in 1500 ×). Legend: Yellow arrow - Tumor cell; Black arrow - neutrophil polymorphonuclear; Red arrow - lymphocyte.
[0056] Figura 23. Fotomicrografias de secções histológicas coradas em HE exibindo as principais características histopatológicas dos tumores desenvolvidos no grupo G3 a partir da implantação de células S180. (A), (B) e (C) Células tumorais organizadas em padrão pseudolobular (ora septadas por tecido conjuntivo fibroso ora por faixas irregulares de tecido necrótico) (40 ×). (D) Trabique delgado de tecido necrótico em meio a lençol de células tumorais (400 ×). Legenda: Ne – necrose coagulativa; Plb – pseudolóbulos; S180 – células tumorais de sarcoma 180 viáveis.[0056] Figure 23. Photomicrographs of histological sections stained in HE showing the main histopathological characteristics of tumors developed in the G3 group from the implantation of S180 cells. (A), (B) and (C) Tumor cells organized in a pseudolobular pattern (sometimes septated by fibrous connective tissue and sometimes by irregular bands of necrotic tissue) (40 ×). (D) Small necrotic tissue trabic amid a sheet of tumor cells (400 ×). Caption: Coagulative neecrosis; Plb - pseudolobules; S180 -
[0057] Figura 24. Figura 22. Fotomicrografias de secções histológicas coradas em HE exibindo as principais características histopatológicas dos tumores desenvolvidos no grupo G3 a partir da implantação de células S180. (A) Células tumorais mostrando atipia leve a moderada, com células ora exibindo núcleos de cromatina ora densa (asterisco branco) ora dispersa (asterisco negro) (400 ×, detalhe em 800 ×). (B) Figura de mitose típica em prófase (400 ×, detalhe em 800 ×). (C) e (D) Intenso infiltrado inflamatório e edema intersticial em meio ao parênquima tumoral (400 × e 800 ×, respectivamente; detalhes em 1500 ×). Legenda: Seta amarela – Célula tumoral; Seta negra – polimorfonuclear neutrófilo; Seta vermelha – linfócito.[0057] Figure 24. Figure 22. Photomicrographs of histological sections stained in HE showing the main histopathological characteristics of tumors developed in the G3 group from the implantation of S180 cells. (A) Tumor cells showing mild to moderate atypia, with cells sometimes showing nuclei of chromatin, sometimes dense (white asterisk) or dispersed (black asterisk) (400 ×, detail in 800 ×). (B) Figure of typical mitosis in prophase (400 ×, detail in 800 ×). (C) and (D) Intense inflammatory infiltrate and interstitial edema in the middle of the tumor parenchyma (400 × and 800 ×, respectively; details in 1500 ×). Legend: Yellow arrow - Tumor cell; Black arrow - neutrophil polymorphonuclear; Red arrow - lymphocyte.
[0058] Figura 25. Fotomicrografias de secções histológicas coradas em HE exibindo as principais características histopatológicas dos tumores desenvolvidos nos grupos G4 e G5 a partir da implantação de células S180. (A e B) Limites tumorais irregulares e áreas de necrose coagulativa periféricas e (C e D), bem como blocos extensos de necrose nas zonais mais centrais das massas tumorais observadas nos grupos G4 e G5, respectivamente (100 ×). (E) Dissociação intensa de fibras musculares por células tumorais tanto no grupo G4 quanto (F) no G5 (100 ×). Nos detalhes, notam-se figuras de mitose em diferentes fases do ciclo celular (400 ×). Legenda: S180 – Células tumorais viáveis de sarcoma 180; Ne – necrose coagulativa; Setas negras delgadas – fibras musculares estriadas esqueléticas; Seta azul – mitose em anáfase; Seta vermelha – mitose em metáfase; Seta laranja – mitose em prófase.[0058] Figure 25. Photomicrographs of histological sections stained in HE showing the main histopathological characteristics of tumors developed in groups G4 and G5 from the implantation of S180 cells. (A and B) Irregular tumor limits and areas of peripheral coagulative necrosis and (C and D), as well as extensive blocks of necrosis in the most central areas of the tumor masses observed in groups G4 and G5, respectively (100 ×). (E) Intense dissociation of muscle fibers by tumor cells in both the G4 and (F) groups in the G5 (100 ×). In the details, there are figures of mitosis in different phases of the cell cycle (400 ×). Legend: S180 - Viable tumor cells of
[0059] O objeto principal deste pedido de patente de invenção é descrever com detalhes o processo e o produto relacionado ao FORMULAÇÃO A PARTIR DE ÁLCOOL PERÍLICO COMPLEXADO EM CICLODEXTRINA PARA TRATAMENTO DE CÂNCER.[0059] The main object of this patent application is to describe in detail the process and the product related to FORMULATION FROM CYCLODEXTRIN COMPLEXED PERYLIC ALCOHOL FOR TREATING CANCER.
[0060] Assim, mais especificamente, a invenção aqui revelada se refere a uma formulação a partir de uma complexação de β-ciclodextrina e AP para aplicação no tratamento do câncer.[0060] Thus, more specifically, the invention disclosed herein refers to a formulation from a complexation of β-cyclodextrin and AP for application in the treatment of cancer.
[0061] Assim, o dito processo pode ser categorizado como um produto farmacêutico e/ou farmacologicamente ativo tendo em vista que se trata de um processo de obtenção de bioproduto utilizando β-ciclodextrina como carreador de fármaco para atividade antitumoral.[0061] Thus, said process can be categorized as a pharmaceutical and / or pharmacologically active product considering that it is a process of obtaining a bioproduct using β-cyclodextrin as a drug carrier for antitumor activity.
[0062] O tratamento de câncer por quimioterapia de forma geral, causa efeitos colaterais exacerbados, tempo de internação prolongada e complicações secundárias com isso estimulam pesquisadores a buscarem formulações e princípios ativos mais eficientes para tratamento desses pacientes, buscando melhora da qualidade de vida.[0062] The treatment of cancer by chemotherapy in general, causes exacerbated side effects, prolonged hospital stay and secondary complications, thereby encouraging researchers to seek more efficient formulations and active principles for the treatment of these patients, seeking to improve the quality of life.
[0063] O uso de bioativos oriundos da flora surgem como um potencial alternativo na produção de novos medicamentos. Ressalta o emprego da nanotecnologia que permite um direcionamento específico do ativo fazendo que haja somente no tecido tumoral, reduzindo os efeitos colaterais.[0063] The use of bioactives from flora emerges as an alternative potential in the production of new medicines. It emphasizes the use of nanotechnology that allows a specific targeting of the asset, making it only exist in the tumor tissue, reducing side effects.
[0064] Dentro do contexto apresentado, e, para que o processo desenvolvido e produto obtido, objeto de proteção desse pedido de patente, possam ser compreendidos e avaliados de forma mais clara e objetiva, sua descrição detalhada será feita a seguir.[0064] Within the context presented, and, so that the developed process and product obtained, object of protection of this patent application, can be understood and evaluated more clearly and objectively, its detailed description will be made below.
[0065] Nesta seção serão revelados todos os detalhes do processo de desenvolvimento do dito FORMULAÇÃO A PARTIR DE ÁLCOOL PERÍLICO COMPLEXADO EM CICLODEXTRINA PARA TRATAMENTO DE CÂNCER, cujo intuito é o de descrever suficiente e clara, todas as etapas que envolvem o processo de obtenção, e dessa forma, embasar a suficiência descritiva desta invenção.[0065] In this section, all the details of the development process of the said FORMULATION FROM CYCLODEXTRINE COMPLEXED PERYLIC ALCOHOL FOR CANCER TREATMENT will be revealed, whose purpose is to describe sufficiently and clearly, all the steps that involve the process of obtaining, and thus, support the descriptive sufficiency of this invention.
[0066] As formulações desenvolvidas empregam Álcool Perílico (AP) e β-ciclodextrinas (β -CD) nas proporções molares de 1:0,25, 1:1 e 1:2 (β-CD:AP) selecionado a concentração de 1:1 e água.[0066] The formulations developed employ Peryl Alcohol (AP) and β-cyclodextrins (β-CD) in molar ratios of 1: 0.25, 1: 1 and 1: 2 (β-CD: AP) selected at a concentration of 1 : 1 and water.
[0067] Para desenvolvimento do dito processo de obtenção das formulações foram utilizados os processos de mistura física, co-evaporação e malaxagem, bem como as formulações obtidas.[0067] For the development of said process of obtaining the formulations, the physical mixing, co-evaporation and malaxagem processes were used, as well as the formulations obtained.
[0068] O desenvolvimento da formulação pelo método de mistura física consistiu em homogeneizar em um almofariz AP e β-CD nas razões molar 1:0,25, 1:1 e 1:2 (β-CD:AP).[0068] The development of the formulation by the method of physical mixing consisted of homogenizing in a mortar AP and β-CD in molar ratios 1: 0.25, 1: 1 and 1: 2 (β-CD: AP).
[0069] O desenvolvimento da formulação pelo método de co-evaporação foi realizada por meio da homogeneização manual da β-CD e AP e adição progressiva de 10 mL água destilada até a formação de uma pasta. As concentrações molares de β-CD:AP estudas foram 1:0,25, 1:1 e 1:2 (β-CD:AP).[0069] The development of the formulation by the co-evaporation method was carried out by means of manual homogenization of β-CD and AP and progressive addition of 10 mL distilled water until the formation of a paste. The molar concentrations of β-CD: AP studied were 1: 0.25, 1: 1 and 1: 2 (β-CD: AP).
[0070] O desenvolvimento da formulação pelo método de malaxagem consistiu na homogeneização de AP, β-CD e com adição de entre 10 a 40 mL de água, preferencialmente 20 mL. As concentrações molares de β-CD:AP foram 1:0,25, 1:1 e 1:2 (β-CD:AP). A mistura foi submetida a uma homogeneização, durante 36 24 a 48 horas e transferida para o dessecador para remoção de toda umidade.[0070] The development of the formulation by the bagging method consisted of the homogenization of AP, β-CD and with the addition of between 10 to 40 ml of water, preferably 20 ml. The molar concentrations of β-CD: AP were 1: 0.25, 1: 1 and 1: 2 (β-CD: AP). The mixture was subjected to homogenization for 36 24 to 48 hours and transferred to the desiccator to remove all moisture.
[0071] As técnicas de caracterização realizadas através das análises térmicas são empregadas para acompanhar uma propriedade física específica de cada análise. A termogravimetria (TG) é uma técnica que acompanha a perda ou ganho de massa em função do tempo ou temperatura, determinando a estabilidade térmica da amostra. Com isso, reúne informações termo analíticas, como percentual de massa perdida, tipo de decomposição do material analisado e estágios de decomposição. Na análise de calorimetria exploratória diferencial (DSC), é usada para medir a alteração de energia em função da mudança de temperatura, sendo possível realizar as análises estruturais das formulações, essas análises são feitas por aparecimento ou desaparecimento de picos endotérmicos e exotérmicos.[0071] The characterization techniques performed through thermal analysis are used to accompany a specific physical property of each analysis. Thermogravimetry (TG) is a technique that accompanies the loss or gain of mass as a function of time or temperature, determining the thermal stability of the sample. With this, it gathers term analytical information, such as percentage of lost mass, type of decomposition of the analyzed material and stages of decomposition. In the differential exploratory calorimetry (DSC) analysis, it is used to measure the energy change as a function of the temperature change, being possible to carry out structural analyzes of the formulations, these analyzes are made by the appearance or disappearance of endothermic and exothermic peaks.
[0072] As análises por espectrofotometria de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) permitem a identificação de grupos funcionais presentes nas formulações. Os resultados foram comparados dos constituintes da formulação isolados e das formulações obtidas pelos diferentes métodos e observou-se mudancas nas bandas caracteristicas sugerindo a complexação entre o AP e a β-CD.[0072] The analysis by absorption spectrophotometry in the infrared region with Fourier transform (FTIR) allows the identification of functional groups present in the formulations. The results were compared between the constituents of the formulation isolated and the formulations obtained by the different methods and changes in the characteristic bands were observed suggesting the complexation between the AP and the β-CD.
[0073] O espalhamento de raio X a baixo ângulo forneceu informações importantes quanto à sua organização molecular e cristalinidade das formulações. Com o desenvolvimento da formulação observa-se diminuição das estruturas cristalinas sugerindo a formação de formulação com característica amorfa.[0073] The X-ray scattering at low angle provided important information regarding its molecular organization and crystallinity of the formulations. With the development of the formulation, a decrease in crystalline structures is observed, suggesting the formation of a formulation with amorphous characteristics.
[0074] A docagem molecular foi empregada com o objetivo de compreender o comportamento do AP no ancoramento na superfície da β-CD. Com isso, foram estudados os locais de interação através da docagem molecular. A formação de um complexo fármaco-receptor se inicia através do processo de reconhecimento molecular, em que o receptor precise reconhecer as propriedades moleculares do fármaco que se aproxima para realizar interação forte e específica. A etapa de reconhecimento molecular ocorre a distâncias consideravelmente grandes e precede a formação das interações que sacramentam a formação do complexo.[0074] Molecular docking was used in order to understand the behavior of the AP in anchoring on the surface of the β-CD. With that, the interaction sites through molecular docking were studied. The formation of a drug-receptor complex begins through the process of molecular recognition, in which the receptor needs to recognize the molecular properties of the drug that is coming in order to carry out strong and specific interaction. The molecular recognition stage occurs at considerably great distances and precedes the formation of the interactions that sacrament the formation of the complex.
[0075] A linha celular L929 de fibroblastos é uma linha celular normal, utilizada para diferentes estudos experimentais, principalmente quando se estuda a biocompatibilidade do material, visando sua possível citotoxicidade.[0075] The fibroblast cell line L929 is a normal cell line, used for different experimental studies, mainly when studying the biocompatibility of the material, aiming at its possible cytotoxicity.
[0076] Para avaliar a possível toxicidade, a formulação na concentração 1:1 AP:β-CD foram testadas em linhas celulares de fibroblastos L929. Os resultados mostraram que a AP, β-CD, AP:β-CD (1:1) apresentaram valores de 100% de células viáveis. Nenhuma amostra apresentou citotoxicidade significativa (>80% de viabilidade) contra células L929 de fibroblastos. Dessa forma, a formulação AP:β-CD (1:1) são biocompatíveis, não apresentando citotoxicidade frente as células de fibroblastos L929.[0076] To evaluate the possible toxicity, the formulation in the concentration 1: 1 AP: β-CD were tested in L929 fibroblast cell lines. The results showed that AP, β-CD, AP: β-CD (1: 1) showed values of 100% viable cells. No sample showed significant cytotoxicity (> 80% viability) against L929 fibroblast cells. Thus, the formulation AP: β-CD (1: 1) are biocompatible, showing no cytotoxicity against L929 fibroblast cells.
[0077] Para avaliar a atividade in vivo do AP:β-CD (1:1) foi empregado a metodologia in vivo com camundongos com tumor sarcoma 180.[0077] To evaluate the in vivo AP activity: β-CD (1: 1) the in vivo methodology was used with mice with
[0078] Os resultados mostraram que a média da massa tumoral dos animais do grupo controle negativo inoculados com S180 foi de 2,32 ± 0,39 g, enquanto que os animais tratados com AP-CD foram de 0,90 ± 0,42 g, 1,31 ± 0,24 g e 1,34 ± 0,47 para as doses de 50, 100 e 200 mg/kg/dia, respectivamente (p < 0,05). A administração de 5-FU (25 mg/kg/dia) apresentou valores de 0,14 ± 0,26 g (p < 0,05). AP-CD nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg/dia apresentou taxas de inibição de massa tumoral de 57,8, 35,3 e 39,69 %, respectivamente.[0078] The results showed that the mean tumor mass of the animals in the negative control group inoculated with S180 was 2.32 ± 0.39 g, whereas the animals treated with AP-CD were 0.90 ± 0.42 g g, 1.31 ± 0.24 g and 1.34 ± 0.47 for the doses of 50, 100 and 200 mg / kg / day, respectively (p <0.05). The administration of 5-FU (25 mg / kg / day) showed values of 0.14 ± 0.26 g (p <0.05). AP-CD at doses of 50, 100 and 200 mg / kg / day showed tumor mass inhibition rates of 57.8, 35.3 and 39.69%, respectively.
[0079] A formulação proposta, após administração por via i.p., inibiu o crescimento tumoral em 57,8, 35,9 e 39,6% nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg/dia, respectivamente. O grupo tratado com salina, utilizado como controle negativo, foi considerado com inibição igual a 0 e resultado inibição tumoral induzida pelo 5-FU foi de 92,87%[0079] The proposed formulation, after i.p. administration, inhibited tumor growth by 57.8, 35.9 and 39.6% at doses of 50, 100 and 200 mg / kg / day, respectively. The group treated with saline, used as a negative control, was considered with inhibition equal to 0 and the tumor inhibition result induced by 5-FU was 92.87%
[0080] Houve alteração de forma significativa (p<0,05) da massa do baço no tratamento dos camundongos por via i.p. com 5-FU (0,20 ± 0,20 g), comparado com o grupo controle negativo do mesmo grupo (0,51 ± 0,09 g), o que demonstra uma diminuição na massa do órgão quando exposto ao tratamento com 5-FU (25 mg/kg/dia) (p < 0,05).[0080] There was a significant change (p <0.05) in the spleen mass in the treatment of mice by i.p. with 5-FU (0.20 ± 0.20 g), compared to the negative control group of the same group (0.51 ± 0.09 g), which demonstrates a decrease in organ mass when exposed to treatment with 5 -FU (25 mg / kg / day) (p <0.05).
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