BR102020005151A2 - INCLUSION COMPLEX, PREPARATION PROCESS OF AN INCLUSION COMPLEX IN THE TREATMENT OF LEISHMANIASIS - Google Patents
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Abstract
complexo de inclusão, processo de preparação de um complexo de inclusão no tratamento da leishmaniose breve apresentação. a presente patente de invenção diz respeito a um inédito processo para obtenção de complexo de inclusão de cafeato de isopentila em ß-ciclodextrina para atividade anti-leishmania. a invenção aqui revelada se refere a um processo para obtenção de complexo de inclusão através do método co-evaporação, por ser de fácil preparo e baixo custo, utilizando o polímero ß-ciclodextrina e cafeato de isopentila visando ação anti-leishmania; melhora da solubilidade do cafeato de isopentila; e favorecimento da liberação controlada da formulação farmacêutica. o processo e produto desenvolvidos se destinam preferencialmente à área de formulações farmacêuticas e veterinárias, mais especificamente aos agentes anti-leishmania, através do ancoramento do cafeato de isopentila em ß-ciclodextrina representado assim uma importante estratégia tecnológica para melhorar a eficácia deste fármaco, por serem estáveis em meios biológicos e produzidas com polímeros biocompatíveis, biodegradáveis e de custo acessível.inclusion complex, process of preparing an inclusion complex in the treatment of leishmaniasis brief presentation. The present invention patent concerns an unprecedented process for obtaining an inclusion complex of isopentyl caffeate in ß-cyclodextrin for anti-leishmanial activity. the invention disclosed herein refers to a process for obtaining inclusion complex through the co-evaporation method, as it is easy to prepare and low cost, using the polymer ß-cyclodextrin and isopentyl caffeate aiming at anti-leishmanial action; improving the solubility of isopentyl caffeate; and favoring the controlled release of the pharmaceutical formulation. the process and product developed are intended preferably for the area of pharmaceutical and veterinary formulations, more specifically for anti-leishmanial agents, through the anchoring of isopentyl caffeate in ß-cyclodextrin, thus representing an important technological strategy to improve the effectiveness of this drug, as they are stable in biological media and produced with biocompatible, biodegradable and affordable polymers.
Description
[001] A presente patente de invenção (PI) diz respeito a um processo de obtenção de um complexo de inclusão obtido a partir do polímero β-ciclodextrina. Além disso, foi incorporado o composto fenólico cafeato de isopentila. Assim, o dito pode ser categorizado como um produto farmacêutico e/ou farmacologicamente ativo tendo em vista que se trata de um processo de obtenção de complexo de inclusão preferencialmente utilizando polímero de origem natural para aplicação oral endovenosa visando atividade anti-leishmania.[001] The present patent of invention (PI) concerns a process for obtaining an inclusion complex obtained from the polymer β-cyclodextrin. Furthermore, the phenolic compound isopentyl caffeate was incorporated. Thus, this can be categorized as a pharmaceutical and/or pharmacologically active product, considering that it is a process of obtaining an inclusion complex, preferably using polymer of natural origin for intravenous oral application, aiming at anti-leishmanial activity.
[002] É importante frisar que a problemática ressaltada no estado da técnica está relacionada ao processo de tratamento da leishmaniose, onde o produto proposto possibilita condições adequadas para tratamentos de duas diferentes formas de leishmaniose (visceral e tegumentar). Além disso, os excipientes utilizados para o desenvolvimento da formulação são biocompatíveis e biodegradáveis.[002] It is important to emphasize that the problem highlighted in the prior art is related to the process of treating leishmaniasis, where the proposed product provides adequate conditions for the treatment of two different forms of leishmaniasis (visceral and integumentary). Furthermore, the excipients used to develop the formulation are biocompatible and biodegradable.
[003] O cafeato de isopentila surge como um potencial alternativo no tratamento da leishmaniose por apresentar atividade leishmanicida em promastigotas de L. amazonensis e L. chagasi com um resultado de IC50 de 0,39 µg/mL para L. amazonensis e 0,43 µg/mL para L. chagasi possibilitando menor efeito colateral. Assim, ressalta-se ainda como vantagem apresentada pela invenção a biocompatibilidade, baixa toxicidade e versatilidade das matérias primas empregadas, associado ao baixo custo e aplicação de processos/etapas simplificadas.[003] Isopentyl caffeate appears as a potential alternative in the treatment of leishmaniasis as it presents leishmanicidal activity in L. amazonensis and L. chagasi promastigotes with an IC50 result of 0.39 µg/mL for L. amazonensis and 0.43 µg/mL for L. chagasi allowing less side effect. Thus, the biocompatibility, low toxicity and versatility of the raw materials used, associated with the low cost and application of simplified processes/steps, is also highlighted as an advantage presented by the invention.
[004] Comprovando o mérito da invenção proposta, ressalta-se que não há no mercado produtos similares, empregando cafeato de isopentila complexado em β-ciclodextrina.[004] Proving the merit of the proposed invention, it is noteworthy that there are no similar products on the market, using isopentyl caffeate complexed in β-cyclodextrin.
[005] A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de uma forma farmacêutica composta de cafeato de isopentila complexado em β-ciclodextrina para aplicação direta nas áreas de farmácia, medicina, biomedicina, química e biotecnologia. Pode ainda ser categorizada como processo e produto com aplicação na área de saúde pública, através da disponibilização de processo de obtenção de complexo de inclusão contendo cafeato de isopentila, tendo como público alvo indivíduos/pacientes acometidos com leishmaniose.[005] The present invention relates to the development of a pharmaceutical form composed of isopentyl caffeate complexed in β-cyclodextrin for direct application in the areas of pharmacy, medicine, biomedicine, chemistry and biotechnology. It can also be categorized as a process and product with application in the area of public health, through the availability of a process for obtaining an inclusion complex containing isopentyl caffeine, having as target audience individuals/patients affected with leishmaniasis.
[006] A leishmaniose humana, uma doença parasitária que apresenta mais de vinte espécies do protozoário tripanossomatídeo do gênero Leishmania, patógeno intracelular obrigatório que invade células hospedeiras fagocíticas (SILVA et al., 2017), é transmitida ao homem através da picada de vetores flebotomíneos fêmeas dos gêneros Phlebotomus na Europa, Ásia e África e Lutzomyia nas Américas. São encontrados principalmente nas regiões tropicais e subtropicais (LIMA et al., 2017).[006] Human leishmaniasis, a parasitic disease that presents more than twenty species of the trypanosomatid protozoan Leishmania genus, an obligatory intracellular pathogen that invades phagocytic host cells (SILVA et al., 2017), is transmitted to man through the bite of sand fly vectors females of the genus Phlebotomus in Europe, Asia and Africa and Lutzomyia in the Americas. They are found mainly in tropical and subtropical regions (LIMA et al., 2017).
[007] Considerada uma doença negligenciada, onde 80% dos casos ocorrem em populações com renda familiar de dois dólares por dia (BRASIL, 2017), é um grande problema de saúde pública e representa um complexo de doenças com importante espectro clínico e diversidade epidemiológica (HOTEZ et al., 2016).[007] Considered a neglected disease, where 80% of cases occur in populations with a family income of two dollars a day (BRASIL, 2017), it is a major public health problem and represents a complex of diseases with an important clinical spectrum and epidemiological diversity (HOTEZ et al., 2016).
[008] O tratamento adequado e oportuno da leishmaniose constitui hoje o principal alicerce para o controle da doença. A entrega inespecífica, a resistência do parasito aos medicamentos leishmanicidas e número elevado de diferentes espécies são considerados os maiores problemas no controle da leishmaniose (PONTE-SUCRE et al., 2017).[008] The adequate and timely treatment of leishmaniasis constitutes today the main foundation for the control of the disease. Nonspecific delivery, parasite resistance to leishmanicidal drugs and a high number of different species are considered the biggest problems in controlling leishmaniasis (PONTE-SUCRE et al., 2017).
[009] Aplicação da tecnologia no tratamento da leishmaniose possibilita novas abordagens no tratamento. As propriedades farmacocinéticas do fármaco são otimizadas, alcançando resultados positivos no que se refere à absorção, distribuição e excreção, possibilitando, dessa forma, uma melhor terapêutica (AKBARI; ORYAN; HATAM, 2017).[009] Application of technology in the treatment of leishmaniasis enables new approaches to treatment. The pharmacokinetic properties of the drug are optimized, achieving positive results with regard to absorption, distribution and excretion, thus enabling better therapy (AKBARI; ORYAN; HATAM, 2017).
[0010] A terapia medicamentosa da leishmaniose encontra-se extremamente limitada, uma vez que ainda se utiliza o fármaco antimonial há mais de meio século, mesmo apresentando severos efeitos colaterais e quimiorresistência pelos parasitos (SARAVANAN; DAS, 2018).[0010] Drug therapy for leishmaniasis is extremely limited, since the antimony drug has been used for more than half a century, even with severe side effects and chemoresistance by the parasites (SARAVANAN; DAS, 2018).
[0011] Diante de tal cenário, a descoberta de novos alvos moleculares e novas substâncias bioativas faz-se necessária para um melhoramento no tratamento da leishmaniose (SARAVANAN; DAS, 2018).[0011] In this scenario, the discovery of new molecular targets and new bioactive substances is necessary for an improvement in the treatment of leishmaniasis (SARAVANAN; DAS, 2018).
[0012] O cafeato de isopentila, éster fenilpropanoide bioativo, derivado do ácido cafeico apresenta origem vegetal e apresenta características promissoras para o desenvolvimento de medicamentos, devido a sua ação antioxidante e antimicrobiana. Tem como característica a solubilidade em acetato de etila e metanol e massa molar de 250,29 g (SARDI et al., 2016).[0012] Isopentyl caffeate, bioactive phenylpropanoid ester, derived from caffeic acid has plant origin and has promising characteristics for drug development, due to its antioxidant and antimicrobial action. Its characteristics are solubility in ethyl acetate and methanol and a molar mass of 250.29 g (SARDI et al., 2016).
[0013] O cafeato de isopentila apresenta duas hidroxilas fenólicas e grupos cromóforos, oferecendo-lhes características hidrofóbicas, necessitando a utilização de carreadores hidrofílicos para alcançar melhores taxas de biodisponibilidade. Desta forma, as ciclodextrinas são empregadas em formulações objetivando melhorar a solubilidade de fármacos (ARAÚJO, 2017).[0013] Isopentyl caffeate has two phenolic hydroxyl and chromophore groups, offering them hydrophobic characteristics, requiring the use of hydrophilic carriers to achieve better rates of bioavailability. Thus, cyclodextrins are used in formulations aiming to improve the solubility of drugs (ARAÚJO, 2017).
[0014] As ciclodextrinas (CDs) constituem uma nova classe de excipientes farmacêuticos composta por unidades de D-glucopiranose, que unidas originam estruturas cíclicas tronco-cônicas, contendo seis, sete e oito unidades de glicose, sendo denominadas de α-ciclodextrina (αCD), β-ciclodextrina (βCD) e γ-ciclodextrina (γCD), respectivamente (CUTRONE; CASAS-SOLVAS; VARGAS-BERENGUEL, 2017).[0014] Cyclodextrins (CDs) constitute a new class of pharmaceutical excipients composed of D-glucopyranose units, which together give rise to cyclic trunk-conical structures, containing six, seven and eight glucose units, being called α-cyclodextrin (αCD) ), β-cyclodextrin (βCD) and γ-cyclodextrin (γCD), respectively (CUTRONE; CASAS-SOLVAS; VARGAS-BERENGUEL, 2017).
[0015] A estrutura espacial cônica e a orientação dos grupos hidroxílicos para o exterior conferem a estes açúcares cíclicos propriedades físico-químicas únicas, sendo capazes de solubilizar-se em meio aquoso e ao mesmo tempo encapsular no seu espaço cavitário interior moléculas hidrofóbicas (SUÁREZ-CERDA et al., 2014).[0015] The conical spatial structure and the orientation of the hydroxylic groups to the outside give these cyclic sugars unique physicochemical properties, being able to solubilize in an aqueous medium and at the same time encapsulate hydrophobic molecules in its interior cavity space (SUÁREZ -CERDA et al., 2014).
[0016] Essas características têm sido exploradas na área farmacêutica principalmente no acréscimo da solubilidade, estabilidade e biodisponibilidade de medicamentos, podendo ainda destacar o seu uso para mascarar odores e sabores desagradáveis de certos fármacos, para reduzir ou eliminar irritações oculares ou gastrointestinais e na prevenção de interações e compatibilidades (BAI et al., 2017).[0016] These characteristics have been explored in the pharmaceutical area mainly in the increase of solubility, stability and bioavailability of drugs, and may also highlight their use to mask unpleasant odors and tastes of certain drugs, to reduce or eliminate eye or gastrointestinal irritation and to prevent of interactions and compatibilities (BAI et al., 2017).
[0017] Mesmo com grande disponibilidade de recursos e tecnologias no mercado ainda há necessidade de aperfeiçoamento e melhorias no âmbito do tratamento da leishmaniose empregando nanotecnologia, pois é necessário torná-los mais acessíveis à população dando preferência ao uso de tecnologia, eficientes e que sejam de fácil reprodução.[0017] Even with the wide availability of resources and technologies on the market, there is still a need for improvement and improvements in the treatment of leishmaniasis using nanotechnology, as it is necessary to make them more accessible to the population, preferring the use of efficient and efficient technology. easy to reproduce.
[0018] A literatura técnica especializada revela alguns documentos de patentes que fazem referência a preparações/composições/compostos farmacêuticos(as) com emprego do polímero ciclodextrina, como por exemplo, os pedidos, BR1020170252930, BR1120160224051, BRPI0116658, UY0001027113. Nesse sentido, e, para embasar o critério de novidade e atividade inventiva foi realizada uma pesquisa na base de patentes do Instituto Nacional de Propriedade Industrial (INPI) que compila o acervo de patentes depositadas do Brasil, e na base europeia de Patentes (Espacenet) que compila o acervo de patentes depositadas em mais de 80 países. Na pesquisa realizada não foi identificada nenhum documento de patente que faz referência ao processo de produção de complexo de inclusão obtido pela técnica de co-evaporação ancorando o composto cafeato de isopentila.[0018] The specialized technical literature reveals some patent documents that make reference to pharmaceutical preparations/compositions/compounds using the cyclodextrin polymer, for example, applications, BR1020170252930, BR1120160224051, BRPI0116658, UY0001027113. In this sense, and to support the criterion of novelty and inventive activity, a search was carried out in the patent database of the National Institute of Industrial Property (INPI) which compiles the collection of patents filed in Brazil, and in the European Patent Database (Espacenet) which compiles the collection of patents filed in more than 80 countries. In the research carried out, no patent document was identified that refers to the process of production of an inclusion complex obtained by the co-evaporation technique anchoring the isopentyl caffeate compound.
[0019] O documento de patente brasileiro BR1020170252930 refere-se a uma composição farmacêutica nanoparticulada para uso tópico no tratamento e prevenção de distúrbios de pele, composta por carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) funcionalizados com timol (TML) na forma de complexo de inclusão com uma ciclodextrina (CDX). O presente desenvolvimento permite uma melhora das características físico-químicas associadas ao fármaco e direciona a liberação do timol na pele de maneira controlada, específica e segura, resultando em redução da dose, da frequência de aplicação e de efeitos adversos, além de levar a uma potencialização do efeito do fármaco. Dessa forma, a composição possibilita a produção de medicamentos ou cosméticos para distúrbios de pele que sejam efetivos e seguros.[0019] The Brazilian patent document BR1020170252930 refers to a nanoparticulate pharmaceutical composition for topical use in the treatment and prevention of skin disorders, composed of nanostructured lipid carriers (CLN) functionalized with thymol (TML) in the form of an inclusion complex with a cyclodextrin (CDX). The present development allows for an improvement in the physicochemical characteristics associated with the drug and directs the release of thymol into the skin in a controlled, specific and safe manner, resulting in a reduction in the dose, frequency of application and adverse effects, in addition to leading to a potentiation of the drug's effect. In this way, the composition enables the production of drugs or cosmetics for skin disorders that are effective and safe.
[0020] O documento de patente brasileiro BR1120160224051 refere-se a composições farmacêuticas inovadoras e úteis formuladas com um composto de ciclodextrina e um derivado de budesonida para o tratamento e/ou a prevenção de doença inflamatória pulmonar. A presente invenção também se refere a uma técnica analítica inovadora e útil para a detecção e a quantificação de ß-CD em solução. Mais especificamente, a presente invenção se refere ao uso de uma análise por RMN de 1H validada para a detecção e a quantificação de ciclodextrinas diretamente em formulações farmacêuticas sem nenhuma etapa de extração ou separação para formulações líquidas.[0020] Brazilian patent document BR1120160224051 refers to innovative and useful pharmaceutical compositions formulated with a cyclodextrin compound and a budesonide derivative for the treatment and/or prevention of pulmonary inflammatory disease. The present invention also relates to an innovative and useful analytical technique for the detection and quantification of ß-CD in solution. More specifically, the present invention relates to the use of a validated 1H NMR analysis for the detection and quantification of cyclodextrins directly in pharmaceutical formulations without any extraction or separation steps for liquid formulations.
[0021] O documento de patente brasileiro BRPI0116658 fornece uma solução aquosa transparente de uma quantidade suficiente de ebseleno e útil como uma injeção. Uma preparação com base aquosa ou solução aquosa compreendendo ebseleno e ciclodextrina. Uma injeção compreendendo a solução aquosa. Uma infusão gotejante intravenosa compreendendo a solução aquosa. Um processo para a produção de uma solução aquosa contendo ebseleno e ciclodextrina, que compreende a dissolução de ebseleno em um solvente orgânico miscível na água enquanto dissolve separadamente uma ciclodextrina em um solvente aquoso, misturando ambas as soluções, então secando a mistura, e misturando o produto seco resultante com um solvente aquoso. Uma preparação seca compreendendo ebseleno e ciclodextrina. Um processo para a produção de uma solução contendo ebseleno e ciclodextrina, que compreende a dissolução de ebseleno em um solvente orgânico miscível na água enquanto dissolve separadamente a ciclodextrina em um solvente aquoso, e mistura ambas as soluções.[0021] Brazilian patent document BRPI0116658 provides a clear aqueous solution of a sufficient amount of ebselene and useful as an injection. An aqueous-based preparation or aqueous solution comprising ebselene and cyclodextrin. An injection comprising the aqueous solution. An intravenous drip infusion comprising the aqueous solution. A process for producing an aqueous solution containing ebselene and cyclodextrin, which comprises dissolving ebselene in a water-miscible organic solvent while separately dissolving a cyclodextrin in an aqueous solvent, mixing both solutions, then drying the mixture, and mixing the resulting dry product with an aqueous solvent. A dry preparation comprising ebselene and cyclodextrin. A process for producing a solution containing ebselene and cyclodextrin, which comprises dissolving ebselene in a water-miscible organic solvent while separately dissolving the cyclodextrin in an aqueous solvent, and mixing both solutions.
[0022] O documento de patente uruguaio UY0001027113 refere-se a melhora da solubilidade da drospirenona pelo fornecimento de drospirenona como um complexo de inclusão formado entre a ciclodextrina e a drospirenona. Numa forma de realização específica da invenção, a ciclodextrina é beta-ciclodextrina. A invenção também fornece métodos para obter tal complexo de inclusão, e o uso do referido complexo de inclusão em composições farmacêuticas que são usadas como um medicamento no tratamento de sintomas associados à menopausa e na contracepção feminina.[0022] The Uruguayan patent document UY0001027113 refers to improving the solubility of drospirenone by providing drospirenone as an inclusion complex formed between cyclodextrin and drospirenone. In a specific embodiment of the invention, the cyclodextrin is beta-cyclodextrin. The invention also provides methods for obtaining such an inclusion complex, and the use of said inclusion complex in pharmaceutical compositions which are used as a medicine in the treatment of symptoms associated with menopause and in female contraception.
[0023] Diante do apresentado, ressalta-se que o desenvolvimento e aplicação da invenção aqui proposta neste documento de patente de invenção, intitulada COMPLEXO DE INCLUSÃO, PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM COMPLEXO DE INCLUSÃO NO TRATAMENTO DA LEISHMANIOSE, possui o parâmetro de novidade, pois até o presente momento nenhum trabalho científico ou técnico compreendido no estado da técnica possui a tecnologia de desenvolvimento, obtenção e aplicação semelhantes. Destaca-se ainda que a tecnologia proposta neste documento de patente de invenção apresenta também os outros critérios de patenteabilidade, como atividade inventiva e aplicação industrial, requisitos estes necessários para a concessão da patente requerida.[0023] In view of the foregoing, it is noteworthy that the development and application of the invention proposed herein in this invention patent document, entitled INCLUSION COMPLEX, PROCESS OF PREPARATION OF AN INCLUSION COMPLEX IN THE TREATMENT OF LEISHMANIASIS, has the parameter of novelty, since up to the present time, no scientific or technical work included in the state of the art has the same development, procurement and application technology. It is also noteworthy that the technology proposed in this invention patent document also presents the other criteria of patentability, such as inventive activity and industrial application, requirements that are necessary for the granting of the required patent.
[0024] Em relação às vantagens e diferenciais apresentados pelo dito COMPLEXO DE INCLUSÃO, PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM COMPLEXO DE INCLUSÃO NO TRATAMENTO DA LEISHMANIOSE pode-se destacar como mais relevantes:[0024] Regarding the advantages and differentials presented by the said INCLUSION COMPLEX, PREPARATION PROCESS OF AN INCLUSION COMPLEX IN THE TREATMENT OF LEISHMANIASIS, the most relevant can be highlighted:
[0025] O complexo de inclusão é produzido com polímero natural biocompatível, biodegradável, de baixo custo e atóxico;[0025] The inclusion complex is produced with natural biocompatible, biodegradable, low-cost and non-toxic polymer;
[0026] A β-ciclodextrina apresenta como característica diferencial a liberação controlada do fármaco, além de permitir melhora da biodisponibilidade.[0026] The β-cyclodextrin has as a differential feature the controlled release of the drug, in addition to allowing improved bioavailability.
[0027] O desenvolvimento de complexo de inclusão incorporando cafeato de isopentila representa uma alternativa inédita as formas farmacêuticas já desenvolvidas, apresentando maior eficiência terapêutica frente aos promastigotas da L. amazonensis e L. chagasi.[0027] The development of inclusion complex incorporating isopentyl caffeate represents an unprecedented alternative to the pharmaceutical forms already developed, presenting greater therapeutic efficiency against L. amazonensis and L. chagasi promastigotes.
[0028] Processo que compreende matérias primas versáteis, baixo custo e processo simplificado. As matérias primas utilizadas são compatíveis fisiologicamente[0028] Process comprising versatile raw materials, low cost and simplified process. The raw materials used are physiologically compatible
[0029] O processo de obtenção é prático, seguro, e, pode ser aplicado em escala industrial.[0029] The procurement process is practical, safe, and can be applied on an industrial scale.
[0030] O processo de obtenção é prático e seguro.[0030] The procurement process is practical and safe.
[0031] Após as vantagens apresentadas e para que o processo da invenção proposta nesse documento de patente possa ser mais bem compreendido e avaliado, a descrição dos desenhos será feita a seguir.[0031] After the advantages presented and so that the process of the invention proposed in this patent document can be better understood and evaluated, the description of the drawings will be made below.
[0032] A invenção será, a seguir, explicada em seus detalhes, sendo que, a título ilustrativo, são apresentados os seguintes desenhos.[0032] The invention will be explained in detail below, and, for illustrative purposes, the following drawings are presented.
[0033] Figura 1, revela de forma ilustrativa, o gráfico da atividade leishmanicida do cafeato de isopentila em promastigostas em L. amazonensis e L. chagasi.[0033] Figure 1, illustratively reveals the graph of the leishmanicidal activity of isopentyl caffeate in promastigotes in L. amazonensis and L. chagasi.
[0034] A Figura 2, revela de forma ilustrativa, o gráfico do efeito do cafeato no metabolismo mitocondrial de L. amazonensis e L. chagasi.[0034] Figure 2 shows, illustratively, the graph of the effect of caffeine on mitochondrial metabolism of L. amazonensis and L. chagasi.
[0035] A Figura 3, revela de forma ilustrativa, o gráfico da análise da integridade de membrana celular após tratamento de L. amazonensis e L. chagasi com o cafeato de isopentila.[0035] Figure 3 shows, illustratively, the graph of the analysis of cell membrane integrity after treatment of L. amazonensis and L. chagasi with isopentyl caffeine.
[0036] A Figura 4, revela de forma ilustrativa, o gráfico do efeito do cafeato sobre a despolarização mitocondrial de L. amazonensis e L. chagasi.[0036] Figure 4 shows, illustratively, the graph of the effect of caffeine on the mitochondrial depolarization of L. amazonensis and L. chagasi.
[0037] A Figura 5, revela de forma ilustrativa, o gráfico da análise da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) após tratamento de L. amazonensis e L. chagasi com o cafeato.[0037] Figure 5 shows, illustratively, the graph of the analysis of the production of reactive oxygen species (ROS) after treatment of L. amazonensis and L. chagasi with caffeine.
[0038] A Figura 6, revela de forma ilustrativa, o gráfico do efeito do composto cafeato sobre a morfologia de L. amazonensis.[0038] Figure 6 shows, illustratively, the graph of the effect of the caffeine compound on the morphology of L. amazonensis.
[0039] A Figura 7, revela de forma ilustrativa, o gráfico do efeito do composto cafeato sobre a morfologia de L. chagasi.[0039] Figure 7, illustratively reveals the graph of the effect of the caffeate compound on the morphology of L. chagasi.
[0040] A Figura 8, revela de forma ilustrativa a microscopia eletrônica de Varredura da Leishmania amazonensis após tratamento com cafeato de isopentila.[0040] Figure 8 illustratively reveals Scanning electron microscopy of Leishmania amazonensis after treatment with isopentyl caffeine.
[0041] A Figura 9, revela de forma ilustrativa a microscopia eletrônica de Varredura da L. chagasi após tratamento com cafeato de isopentila.[0041] Figure 9, illustratively reveals Scanning electron microscopy of L. chagasi after treatment with isopentyl caffeine.
[0042] A Figura 10, revela de forma ilustrativa, o gráfico do efeito dos compostos MF1 (MF001), MF2 (MF002) e MF3 (MF003) sobre a taxa de proliferação de L. amazonensis e L. chagasi.[0042] Figure 10 shows, illustratively, the graph of the effect of compounds MF1 (MF001), MF2 (MF002) and MF3 (MF003) on the proliferation rate of L. amazonensis and L. chagasi.
[0043] A Figura 11, revela de forma ilustrativa, o gráfico do efeito dos compostos CO1 (CO001), CO2 (CO002) e CO3 (CO003) sobre a taxa de proliferação de L. amazonensis e L. chagasi.[0043] Figure 11 shows, illustratively, the graph of the effect of compounds CO1 (CO001), CO2 (CO002) and CO3 (CO003) on the proliferation rate of L. amazonensis and L. chagasi.
[0044] A Figura 12, revela de forma ilustrativa, as curvas termoanalíticas do Cafeato de isopentila (CA001), Betaciclodextrina (BCD001), MF001, MA001, CO001, MF002, MA002, CO002, MF003, MA003, CO003.[0044] Figure 12 illustratively reveals the thermoanalytical curves of Isopentyl Caffeate (CA001), Betacyclodextrin (BCD001), MF001, MA001, CO001, MF002, MA002, CO002, MF003, MA003, CO003.
[0045] A Figura 13, revela de forma ilustrativa, termogramas (TG) do Cafeato de isopentila (CA001), Betaciclodextrina (BCD001), MF001, MA001, CO001, MF002, MA002, CO002, MF003, MA003, CO003.[0045] Figure 13 illustratively shows thermograms (TG) of Isopentyl Caffeate (CA001), Betacyclodextrin (BCD001), MF001, MA001, CO001, MF002, MA002, CO002, MF003, MA003, CO003.
[0046] A Figura 14, revela de forma ilustrativa, espectros de infravermelho do Cafeato de isopentila (CA001), Betaciclodextrina (BCD001), MF001, MA001, CO001, MF002, MA002, CO002, MF003, MA003, CO003.[0046] Figure 14 illustratively shows infrared spectra of Isopentyl Caffeate (CA001), Betacyclodextrin (BCD001), MF001, MA001, CO001, MF002, MA002, CO002, MF003, MA003, CO003.
[0047] A Figura 15, revela de forma ilustrativa, a estrutura molecular da β-ciclodextrina (A e B) e a docagem molecular do cafeato de isopentila na posição de menor valor absoluto de afinidade (kcal / mol) (C) e o diagrama de interações moleculares entre cafeato de isopentila e a β-ciclodextrina (D).[0047] Figure 15 illustratively reveals the molecular structure of β-cyclodextrin (A and B) and the molecular docking of isopentyl caffeine in the position of lowest absolute value of affinity (kcal / mol) (C) and the diagram of molecular interactions between isopentyl caffeine and β-cyclodextrin (D).
[0048] A Figura 16, revela de forma ilustrativa, micrografias de microscopia eletrônica de varredura das BCD001, MF001, CO001. (a) BCD001 x500, (b) BCD001 x5000, (c) CO001 x500, (d) CO001 x5000, (e) MF001 x500 e (f) MF001 x5000[0048] Figure 16, shows illustratively, scanning electron microscopy micrographs of BCD001, MF001, CO001. (a) BCD001 x500, (b) BCD001 x5000, (c) CO001 x500, (d) CO001 x5000, (e) MF001 x500 and (f) MF001 x5000
[0049] A Figura 17, revela de forma ilustrativa, o efeito do cafeato de isopentila e seus derivados CO1 (CO001), CO2 (CO002) e CO3 (CO003) em células THP1.[0049] Figure 17, illustratively reveals the effect of isopentyl caffeate and its derivatives CO1 (CO001), CO2 (CO002) and CO3 (CO003) in THP1 cells.
[0050] A Figura 18, revela o comparativo dos perfis de dissolução do cafeato de isopentila, da beta-ciclodextrina e dos complexos de inclusão.[0050] Figure 18, shows the comparison of dissolution profiles of isopentyl caffeate, beta-cyclodextrin and inclusion complexes.
[0051] O objeto principal deste pedido de patente de invenção é descrever com detalhes o processo e o produto relacionado ao COMPLEXO DE INCLUSÃO, PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM COMPLEXO DE INCLUSÃO NO TRATAMENTO DA LEISHMANIOS.[0051] The main object of this patent application is to describe in detail the process and the product related to the INCLUSION COMPLEX, PROCESS OF PREPARATION OF AN INCLUSION COMPLEX IN THE TREATMENT OF LEISHMANIOS.
[0052] Assim, mais especificamente, a invenção aqui revelada se refere a um processo de obtenção de um complexo de inclusão incorporando um composto fenólico inédito, cafeato de isopentila, para aplicação no tratamento da leishmaniose.[0052] Thus, more specifically, the invention disclosed herein refers to a process for obtaining an inclusion complex incorporating an unprecedented phenolic compound, isopentyl caffeate, for application in the treatment of leishmaniasis.
[0053] Assim, o dito processo pode ser categorizado como um produto farmacêutico e/ou farmacologicamente ativo tendo em vista que se trata de um processo de obtenção de bioproduto utilizando polímero de origem natural para tratamento da leishmaniose.[0053] Thus, said process can be categorized as a pharmaceutical and/or pharmacologically active product, considering that it is a process of obtaining a bioproduct using polymer of natural origin for the treatment of leishmaniasis.
[0054] Os tratamentos atuais disponíveis comercialmente para o tratamento da leishmaniose apresentam efeitos colaterais elevados, quimiorresistência pelo parasito, e elevada toxicidade. Desta forma, os pesquisadores buscam formulações e princípios ativos mais eficientes para tratamento desses pacientes, buscando melhora da qualidade de vida.[0054] Current commercially available treatments for the treatment of leishmaniasis have high side effects, chemoresistance by the parasite, and high toxicity. Thus, researchers are looking for more efficient formulations and active ingredients for the treatment of these patients, seeking to improve their quality of life.
[0055] O uso de bioativos oriundos da flora surgem como uma potencial alternativa na produção de novos medicamentos. Ressalta o emprego da nanotecnologia que permite uma entrega direcionada e melhora da biodisponibilidade, reduzindo os efeitos colaterais.[0055] The use of bioactives from the flora emerge as a potential alternative in the production of new drugs. Emphasizes the use of nanotechnology that allows targeted delivery and improved bioavailability, reducing side effects.
[0056] Dentro do contexto apresentado, e, para que o processo desenvolvido e produto obtido, objeto de proteção desse pedido de patente, possam ser compreendidos e avaliados de forma mais clara e objetiva, sua descrição detalhada será feita a seguir.[0056] Within the context presented, and, so that the developed process and the product obtained, object of protection of this patent application, can be understood and evaluated more clearly and objectively, its detailed description will be made below.
[0057] Nesta seção serão revelados todos os detalhes do processo de desenvolvimento do dito COMPLEXO DE INCLUSÃO, PROCESSO DE PREPARAÇÃO DE UM COMPLEXO DE INCLUSÃO NO TRATAMENTO DA LEISHMANIOSE, cujo intuito é o de descrever suficiente e clara, todas as etapas que envolvem o processo de obtenção, e dessa forma, embasar a suficiência descritiva desta invenção.[0057] In this section, all the details of the development process of said INCLUSION COMPLEX will be revealed, PROCESS OF PREPARATION OF AN INCLUSION COMPLEX IN THE TREATMENT OF LEISHMANIASIS, whose purpose is to describe, sufficiently and clearly, all the steps involved in the process of obtaining, and thus, support the descriptive adequacy of this invention.
[0058] O dito complexo de inclusão de cafeato de isopentila compreende a inclusão do cafeato de isopentila na cavidade da β-ciclodextrina por possuírem propriedades complexantes capazes de promoverem o aumento da solubilidade, dissolução e biodisponibilidade de fármacos poucos solúveis, como o caso do cafeato de isopentila. As proporções molares empregadas foram β-ciclodextrina:cafeato de isopentila 1:0,25 (454 mg:25 mg); 1:1 (454 mg: 100 mg) e 1:2 (454 mg:200 mg) conforme tabela abaixo:
Tabela 1 - Proporções utilizadas para obtenção dos complexos de inclusão e suas respectivas siglas.
Table 1 - Proportions used to obtain inclusion complexes and their respective acronyms.
[0059] A síntese do cafeato de isopentila consiste em dissolver o ácido cafeico (0,5 g, 2,77 mmol) em álcool isoamílico (20 mL), e adicionar 0,5 mL de H2SO4 a 96% (v/v). A mistura reacional foi submetida a refluxo durante 3 h. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a solução foi diluída com 100 mL de acetato de etila e lavada com solução de NaHCO3 a 5% (p/v) até pH neutro. A camada foi lavada com água destilada e seca sobre Na2SO4 anidro, e o solvente foi removido sob vácuo. Cafeato de isopentila (339 mg, 49% de rendimento) foi obtido por cromatografia em coluna de sílica gel (1:1 acetato de etila/hexano) (STEVERDING et al., 2016).][0059] The synthesis of isopentyl caffeate consists of dissolving caffeic acid (0.5 g, 2.77 mmol) in isoamyl alcohol (20 mL), and adding 0.5 mL of H2SO4 96% (v/v) . The reaction mixture was refluxed for 3 h. After cooling to room temperature, the solution was diluted with 100 ml of ethyl acetate and washed with 5% NaHCO3 solution (w/v) until neutral pH. The layer was washed with distilled water and dried over anhydrous Na2SO4, and the solvent was removed under vacuum. Isopentyl caffeine (339 mg, 49% yield) was obtained by silica gel column chromatography (1:1 ethyl acetate/hexane) (STEVERDING et al., 2016).]
[0060] A partir da elucidação do mecanismo de ação do cafeato de isopentila e seu efeito sobre a proliferação da L. amazonensis e L. chagasi, deu-se seguinte com a obtenção dos complexos de inclusão. A mistura física (MF) foi obtida com objetivo de realizar as devidas comparações entre os componentes e os complexos de inclusão formados. Para a MF foram pesados 100 mg de cafeato de isopentila (CA) com massa molar (MM) igual a 1134,984 g e 454 mg de β-CD (BCD) com MM = 250,290 g na razão molar de 1:1. Para fins de avaliação de melhores proporções, foram preparadas também amostras nas proporções 1:0,25 e 1:2. Esse método consistiu na simples mistura mecânica em gral com auxílio de pistilo sem adição de solvente.[0060] From the elucidation of the mechanism of action of isopentyl caffeine and its effect on the proliferation of L. amazonensis and L. chagasi, the following was achieved with the obtainment of inclusion complexes. The physical mixture (MF) was obtained in order to make the necessary comparisons between the components and the inclusion complexes formed. For MF, 100 mg of isopentyl caffeate (CA) with a molar mass (MM) equal to 1134.984 g and 454 mg of β-CD (BCD) with MM = 250.290 g in a molar ratio of 1:1 were weighed. For the purpose of evaluating better proportions, samples were also prepared in proportions 1:0.25 and 1:2. This method consisted of a simple mechanical mixing in a mortar with the aid of a pistil without the addition of solvent.
[0061] O complexo de inclusão por malaxagem (MA) foi preparado conforme a descrição da mistura física, com posterior adição de 400 µL de água destilada para obtenção de uma pasta. O complexo co-evaporado (CO) foi preparado por meio de adição de 8 mL de água destilada a um almofariz contendo 100 mg de cafeato de isopentila e 454 mg de betaciclodextrina, em razão molar de 1:1. A mistura foi submetida à uma agitação magnética constante de 400 rpm, durante 36 horas e após, mantida por 24h em temperatura ambiente para completa evaporação da água. A amostra foi macerada com auxílio de gral e pistilo e após transferida para o dessecador para remoção de toda umidade. Para fins de avaliação de melhores proporções, foram preparadas também amostras 1:0,25 e 1:2 para malaxagem e co-evaporado. Todas as amostras foram acondicionadas em recipientes hermeticamente fechados e armazenadas em dessecador sob temperatura ambiente.[0061] The inclusion complex by kneading (MA) was prepared as described in the physical mixture, with subsequent addition of 400 µL of distilled water to obtain a paste. The co-evaporated (CO) complex was prepared by adding 8 ml of distilled water to a mortar containing 100 mg of isopentyl caffeine and 454 mg of betacyclodextrin, in a molar ratio of 1:1. The mixture was subjected to constant magnetic stirring at 400 rpm for 36 hours and then kept for 24 hours at room temperature for complete evaporation of water. The sample was macerated with the aid of a grate and pistil and then transferred to the desiccator to remove all moisture. For the purpose of evaluating better proportions, samples 1:0.25 and 1:2 were also prepared for kneading and co-evaporation. All samples were placed in hermetically sealed containers and stored in a desiccator at room temperature.
[0062] O ensaio foi realizado através do cultivo dos parasitos em meio Schneider suplementado com 10 % SFB, na presença de diferentes concentrações do cafeato. As células foram cultivadas por 96 h a 26 °C e estimadas diariamente (células totais e células móveis) por contagem em câmara de Neubauer (MARINHO et al., 2014). Os valores de IC50 foram calculados após 72 h de cultivo, através da regressão linear do número de promastigotas viáveis versus o log da concentração do cafeato utilizando-se o software GraphPad Prism 4.0.[0062] The test was carried out by culturing the parasites in Schneider medium supplemented with 10% FCS, in the presence of different concentrations of caffeine. Cells were cultured for 96 h at 26 °C and estimated daily (total cells and mobile cells) by counting in a Neubauer chamber (MARINHO et al., 2014). IC50 values were calculated after 72 h of cultivation by linear regression of the number of viable promastigotes versus log caffeine concentration using GraphPad Prism 4.0 software.
[0063] A atividade antimicrobiana é avaliada pela determinação da menor quantidade da substância necessária para inibir o crescimento do microrganismo (IC50). Na avaliação da atividade anti-leishmania do cafeato de isopentila em promastigotas da Leishmania chagasi (visceral) e Leishmania amazonensis (cutânea) identificou-se resultado promissor para ambas, sendo o resultado de IC50 de 0.39 µg/mL para L. amazonensis e 0.43 µg/mL para L. chagasi.[0063] The antimicrobial activity is evaluated by determining the smallest amount of the substance needed to inhibit the growth of the microorganism (IC50). In evaluating the anti-leishmanial activity of isopentyl caffeine in Leishmania chagasi (visceral) and Leishmania amazonensis (cutaneous) promastigotes, a promising result was identified for both, with an IC50 result of 0.39 µg/mL for L. amazonensis and 0.43 µg /mL for L. chagasi.
[0064] Um ensaio de dose-resposta usando o cafeato de isopentila não demonstrou uma diminuição nas atividades da desidrogenase mitocondrial para a concentração ½×IC50 em ambas as formas da leishmania. Nas doses IC50 e 2×IC50 , o cafeato reduziu o pool de desidrogenase mitocondrial em ambas as formas da Leishmania evidenciado pela diferença significativa em relação ao controle.[0064] A dose-response trial using isopentyl caffeine did not demonstrate a decrease in mitochondrial dehydrogenase activities to ½×IC50 concentration in both forms of leishmania. At the IC50 and 2×IC50 doses, caffeine reduced the mitochondrial dehydrogenase pool in both forms of Leishmania, evidenced by the significant difference in relation to the control.
[0065] A análise quantitativa sugere que os promastigotas tratados com o cafeato de isopentila afetou a integridade da membrana plasmática, uma vez que a permeabilidade da membrana plasmática foi aumentada em ambas as formas promastigotas de maneira significativa e dependente da dose.[0065] Quantitative analysis suggests that promastigotes treated with isopentyl caffeate affected plasma membrane integrity, since plasma membrane permeability was increased in both promastigote forms significantly and dose-dependently.
[0066] A incubação com fluoróforo Rodamina 123 (R123) revelou uma importante despolarização mitocondrial de promastigotas tratados com cafeato em concentrações de IC50 e 2×IC50 , e uma dissipação quase completa do potencial da membrana organela para ambas as formas promastigotas com o cafeato em 2×IC50 . Para uma comparação adequada, os parasitos também foram incubados com o inibidor clássico da função mitocondrial, FCCP (carbonil cianeto trifluorometoxi fenilhidrazona), um desacoplador padrão de protonóforo que dissipa o gradiente eletroquímico de H+ mitocondrial.[0066] Incubation with fluorophore Rhodamine 123 (R123) revealed an important mitochondrial depolarization of caffeine-treated promastigotes at concentrations of IC50 and 2×IC50 , and an almost complete dissipation of the membrane organelle potential for both promastigote forms with caffeine in 2×IC50 . For proper comparison, the parasites were also incubated with the classic inhibitor of mitochondrial function, FCCP (carbonyl cyanide trifluoromethoxy phenylhydrazone), a standard protonophore uncoupler that dissipates the electrochemical gradient of mitochondrial H+.
[0067] A capacidade do cafeato para induzir estresse oxidativo foi investigada usando a sonda H2DCFDA. As formas promastigotas de L. amazonensis e L. chagasi expostas ao cafeato mostraram um aumento significativo e dependente da concentração na produção de ROS. Na dose de IC50 , o cafeato de isopentila aumentou a produção de EROs em 39,0% frente a L. amazonensis e 42,9% frente a L. chagasi.[0067] The capacity of caffeine to induce oxidative stress was investigated using the H2DCFDA probe. The promastigote forms of L. amazonensis and L. chagasi exposed to caffeine showed a significant and concentration-dependent increase in ROS production. At the IC50 dose, isopentyl caffeine increased the production of ROS by 39.0% against L. amazonensis and 42.9% against L. chagasi.
[0068] A morfologia celular foi observada para identificação do efeito do cafeato de isopentila na estrutura das células parasitárias. Sob microscopia de luz, células não tratadas de L. amazonensis e tratadas com ½ IC50 mantiveram suas características normais, como a forma alongada típica e flagelo longo. As formas promastigotas quando tratados com IC50 de cafeato de isopentila evidenciaram discretas alterações em sua forma e quando tratadas com 2xIC50 mostraram diferentes tipos de alterações morfológicas, onde as células exibiram uma resposta de encolhimento/arredondamento e também redução ou perda aparente do flagelo.[0068] The cell morphology was observed to identify the effect of isopentyl caffeine on the structure of parasitic cells. Under light microscopy, untreated L. amazonensis cells and those treated with ½ IC50 maintained their normal characteristics, such as the typical elongated shape and long flagellum. The promastigote forms when treated with IC50 of isopentyl caffeate showed slight changes in their shape and when treated with 2xIC50 showed different types of morphological changes, where the cells exhibited a shrinking/rounding response and also reduction or apparent loss of the flagellum.
[0069] Células não tratadas de L. chagasi também foram analisadas quanto à sua morfologia. L. chagasi foram tratadas com ½ IC50 e mantiveram suas características normais, como a forma alongada típica e flagelo longo. As formas promastigotas quando tratados com IC50 de cafeato de isopentila evidenciaram discretas alterações em sua forma e quando tratadas com 2xIC50 mostraram diferentes tipos de alterações morfológicas, onde as células exibiram uma resposta de encolhimento/arredondamento e também redução ou perda aparente do flagelo porém, alterações estas menos expressivas em relação à forma L. amazonensis.[0069] Untreated L. chagasi cells were also analyzed for their morphology. L. chagasi were treated with ½ IC50 and maintained their normal characteristics, such as the typical elongated shape and long flagellum. The promastigote forms when treated with IC50 of isopentyl caffeate showed slight changes in their shape and when treated with 2xIC50 showed different types of morphological changes, where the cells exhibited a shrinking/rounding response and also reduction or apparent loss of the flagellum, however, changes these are less expressive compared to the L. amazonensis form.
[0070] Ao realizar comparativo da ação anti-leishmania das formulações utilizadas, sugere-se uma sensibilidade maior do cafeato de isopentila complexado à forma L. amazonensis quando comparado a forma L. chagasi. Sugere-se ainda que os complexos de inclusão são formas promissoras para o desenvolvimento de uma nova proposta terapêutica para a leishmaniose.[0070] When comparing the anti-leishmanial action of the formulations used, it is suggested a greater sensitivity of complexed isopentyl caffeine to the form L. amazonensis when compared to the form L. chagasi. It is also suggested that inclusion complexes are promising ways to develop a new therapeutic proposal for leishmaniasis.
[0071] As análises ultraestruturais de L. amazonensis e de L. chagasi foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura após os parasitas terem sido tratados por 72 h com os valores de IC50 e 2xIC50 do cafeato de isopentila. A análise dos resultados de L. amazonensis e L. chagasi mostraram que os parasitas não tratados mantiveram suas características sem alteração, como superfície celular estável e regular, forma típica de promastigota alongada e um flagelo alongado. O tratamento de L. amazonensis com os valores de IC50 e 2xIC50 do cafeato levou a alterações morfológicas, como arredondamento do corpo celular do parasita, encurtamento do flagelo e lesões na membrana plasmática, além de promover agregação celular. Além disso, o tratamento com2xIC50 também resultou em saliências e reentrâncias na membrana plasmática.[0071] The ultrastructural analyzes of L. amazonensis and L. chagasi were evaluated by scanning electron microscopy after the parasites had been treated for 72 h with the values of IC50 and 2xIC50 of isopentyl caffeine. The analysis of the results of L. amazonensis and L. chagasi showed that the untreated parasites maintained their characteristics unaltered, such as stable and regular cell surface, typical elongated promastigote shape and an elongated flagellum. The treatment of L. amazonensis with caffeine IC50 and 2xIC50 values led to morphological changes, such as rounding of the parasite cell body, shortening of the flagellum and lesions in the plasma membrane, in addition to promoting cell aggregation. Furthermore, treatment with 2xIC50 also resulted in bulges and indentations in the plasma membrane.
[0072] A mesma análise realizada com L. chagasi mostrou que o tratamento de promastigotas com os valores de IC50 e 2xIC50 promoveu alterações semelhantes, como arredondamento do corpo celular do parasita, perda ou encurtamento completo do flagelo, lesões na membrana e agregação celular. Além disso, o tratamento com 2xIC50 também resultou na descontinuidade da membrana plasmática.[0072] The same analysis performed with L. chagasi showed that the treatment of promastigotes with IC50 and 2xIC50 values promoted similar changes, such as rounding of the parasite cell body, loss or complete shortening of the flagellum, membrane damage and cell aggregation. Furthermore, treatment with 2xIC50 also resulted in plasma membrane discontinuity.
[0073] Os resultados de viabilidade celular mostraram que as diferentes concentrações do cafeato de isopentila apresentaram citotoxicidade reduzida no tempo de 48 h, excetuando a concentração de 40 µm.[0073] The results of cell viability showed that the different concentrations of isopentyl caffeate showed reduced cytotoxicity at the time of 48 h, except for the concentration of 40 µm.
[0074] Os resultados obtidos demonstraram que o cafeato apresentou citotoxicidade com melhor resposta na viabilidade celular (p < 0,05) nas concentrações empregadas até 30 µM.[0074] The results obtained showed that the cafeate showed cytotoxicity with a better response in cell viability (p < 0.05) at concentrations used up to 30 µM.
[0075] O valor do IC50 obtido para as células THP-1 foi utilizado para o cálculo do índice de seletividade. O IS foi calculado pela razão entre o valor de IC50 da célula THP1 obtidos após 4 h de tratamento com cada inibidor, e os valores da IC50 obtidos para a forma promastigotas de L. amazonensis e L. chagasi. Razões com valores iguais ou maiores de 10 para cada inibidor foram considerados satisfatórios. Assim, observa-se que para ambas as espécies o cafeato de isopentila é um composto ativo contra os parasitos e não causam danos à viabilidade das células de mamíferos.[0075] The IC50 value obtained for THP-1 cells was used to calculate the selectivity index. The IS was calculated by the ratio between the IC50 value of the THP1 cell obtained after 4 h of treatment with each inhibitor, and the IC50 values obtained for the promastigotes form of L. amazonensis and L. chagasi. Ratios with values equal to or greater than 10 for each inhibitor were considered satisfactory. Thus, it is observed that for both species, isopentyl caffeate is an active compound against parasites and does not damage the viability of mammalian cells.
[0076] A partir destas análises, pode-se inferir que o composto cafeato de isopentila provoca a apoptose celular do parasito. A apoptose celular é caracterizada como autodestruição e temporalmente definida sem indução de respostas inflamatórias. A morte celular controlada leva a uma diminuição das respostas inflamatória e imunológica.[0076] From these analyses, it can be inferred that the compound isopentyl caffeate causes cellular apoptosis of the parasite. Cellular apoptosis is characterized as self-destruction and temporally defined without induction of inflammatory responses. Controlled cell death leads to a decrease in inflammatory and immune responses.
[0077] Foucher et al., 2013, identificou em seu estudo vários marcadores apoptóticos em parasitos de L. donovani, porém não evidenciou a morte celular do parasito. Desta forma, leva-se a entender que o mecanismo de morte celular dos parasitos do gênero Leishmania ainda não se encontra completamente elucidado, fazendo-se necessário a investigação de cada composto pesquisado.[0077] Foucher et al., 2013, identified in their study several apoptotic markers in L. donovani parasites, but did not evidence the cell death of the parasite. In this way, it is possible to understand that the cell death mechanism of the Leishmania genus parasites is not yet completely elucidated, making it necessary to investigate each investigated compound.
[0078] A expressão de marcadores apoptóticos em tripanossomatídeos é desencadeada em resposta a diversos estímulos como mudanças de temperatura, produção de espécies reativas de oxigênio, inanição, uso de antimicrobianos, mutações em genes regulados pelo ciclo celular, bem como antiparasitários, dentre estes a mitelfosina, antimoniais e pentamidina. Estes fármacos induzem a expressão de marcadores apoptóticos em Leishmania spp., (MARINHO et al., 2014).[0078] The expression of apoptotic markers in trypanosomatids is triggered in response to various stimuli such as temperature changes, production of reactive oxygen species, starvation, use of antimicrobials, mutations in genes regulated by the cell cycle, as well as antiparasitic, among these the mitelphosin, antimonials and pentamidine. These drugs induce the expression of apoptotic markers in Leishmania spp., (MARINHO et al., 2014).
[0079] Teste de solubilidade com diferentes solventes (álcool etílico absoluto, metanol e água destilada) foi realizado em temperatura ambiente de 25 °C conforme Farmacopeia Brasileira, 2010. Uma quantidade de 500 mg do fármaco foi adicionada em 10 mL do solvente e agitada magneticamente (KASVI, modelo K40 – 1820HI) por 60 min e observada a solubilidade.[0079] Solubility test with different solvents (absolute ethyl alcohol, methanol and distilled water) was carried out at a room temperature of 25 °C according to Brazilian Pharmacopoeia, 2010. An amount of 500 mg of the drug was added in 10 mL of the solvent and stirred magnetically (KASVI, model K40 – 1820HI) for 60 min and observed the solubility.
[0080] Para as soluções alcóolicas o cafeato de isopentila mostrou-se facilmente solúvel. Em se tratando da água destilada, o resultado mostrou a não solubilização do fármaco corroborando seu caráter hidrofóbico. Estes resultados fornecem informações importantes do comportamento do cafeato de isopentila, o que possibilitou a escolha de um polímero com uma porcentagem maior de água em sua constituição para obtenção dos complexos.[0080] For alcoholic solutions, isopentyl caffeate proved to be easily soluble. In the case of distilled water, the result showed the non-solubilization of the drug, confirming its hydrophobic character. These results provide important information on the behavior of isopentyl caffeine, which enabled the choice of a polymer with a higher percentage of water in its constitution to obtain the complexes.
[0081] O cafeato de isopentila, a β-ciclodextrina e o complexo de inclusão cafeato de isopentila-β-ciclodextrina foram caracterizadas do ponto de vista da análises térmicas (TG e DSC), Espectroscopia de absorção na Região do Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e citotoxicidade.[0081] The isopentyl caffeate, the β-cyclodextrin and the isopentyl caffeate-β-cyclodextrin inclusion complex were characterized from the point of view of thermal analysis (TG and DSC), absorption spectroscopy in the Infrared region with Fourier transform (FTIR), Scanning Electron Microscopy (SEM) and cytotoxicity.
[0082] As Curvas termoanalíticas foram realizadas das amostras puras, CA001 e BCD001, e das formulações MF001, MF002, MF003, MA001, MA002, MA003, CO001, CO002 e CO003.[0082] Thermoanalytical curves were performed from pure samples, CA001 and BCD001, and from formulations MF001, MF002, MF003, MA001, MA002, MA003, CO001, CO002 and CO003.
[0083] A curva DSC do cafeato de isopentila mostrou um evento endotérmico na faixa de temperatura entre 125,24 e 130,01 °C. A curva da β-CD mostrou dois eventos endotérmicos na faixa compreendida entre 47,8 - 123,45 °C e 275 - 353 °C, corroborando com (ANDRADE et al., 2017). Pode-se inferir que o primeiro evento endotérmico está relacionado à perda da água da β-CD e o segundo evento relacionado à fusão da β-CD com posterior decomposição da matéria (GUO et al., 2011).[0083] The DSC curve of isopentyl caffeate showed an endothermic event in the temperature range between 125.24 and 130.01 °C. The β-CD curve showed two endothermic events in the range between 47.8 - 123.45 °C and 275 - 353 °C, corroborating with (ANDRADE et al., 2017). It can be inferred that the first endothermic event is related to the loss of water from the β-CD and the second event is related to the fusion of β-CD with subsequent decomposition of matter (GUO et al., 2011).
[0084] As curvas analisadas MF001, MA001 e CO001 pode-se identificar que não ocorreu um ancoramento significativo, uma vez que o evento endotérmico da β-CD não apresentou alteração significativa entre a faixa de 300 °C e 350° C.[0084] The analyzed curves MF001, MA001 and CO001 it can be identified that a significant anchorage did not occur, since the endothermic event of β-CD did not show significant change between the range of 300 °C and 350°C.
[0085] As curvas de DSC de MF002, MA002 e CO002 evidenciam o ponto de fusão do cafeato de isopentila, bem como o ponto de fusão da betaciclodextrina, podendo associar que o ancoramento ocorreu de forma significativa em todas as amostras.[0085] The DSC curves of MF002, MA002 and CO002 show the melting point of isopentyl caffeine, as well as the melting point of betacyclodextrin, which may associate that anchoring occurred significantly in all samples.
[0086] As demais curvas DSC analisadas MF003, MA003 e CO003 pode-se identificar que a β-CD ancorou o cafeato de isopentila em sua composição, sendo significativo o ancoramento no método de co-evaporação (CO003). Através da curva de DSC realizada para verificação da faixa de fusão do cafeato de isopentila na razão de 10 °C.min-1 , pode-se evidenciar um pico endotérmico na faixa de temperatura entre 125,24 °C e 130,01 °C, que se repete nas demais amostras, podendo relacionar ao processo de ancoramento do fármaco. Essa interação entre o cafeato de isopentila e a betaciclodextrina no complexo co-evaporado podem ser confirmadas nas análises de FTIR.[0086] The other analyzed DSC curves MF003, MA003 and CO003 it can be identified that the β-CD anchored the isopentyl caffeine in its composition, being significant the anchoring in the co-evaporation method (CO003). Through the DSC curve performed to verify the melting range of isopentyl caffeine at the rate of 10 °C.min-1 , an endothermic peak can be seen in the temperature range between 125.24 °C and 130.01 °C , which is repeated in the other samples, and may be related to the drug anchoring process. This interaction between isopentyl caffeate and betacyclodextrin in the co-evaporated complex can be confirmed in FTIR analyses.
[0087] Foram obtidos também termogramas de amostras referentes ao estudo de formação dos complexos de inclusão: polímero e bioativo, bem como o complexo de inclusão obtido por co-evaporação, malaxagem e por mistura física. Com relação às curvas de TG do polímero original (BCD001), foram observadas diferentes regiões mostrando duas etapas de perda de massa, sendo atribuídas na primeira faixa de 40 – 150 °C à liberação de água, seguida da volatilização do polímero 350 – 500 °C. Os referidos resultados corroboram com dados da literatura (GAO et al., 2012; BRASKAR et al., 2004). O bioativo cafeato de isopentila (CA001) apresenta um único estágio de decomposição térmica entre 200 - 400 °C. Nas curvas referentes às amostras MF001, MF002, MF003, MA001, MA002, MA003, CO001, CO002 e CO003, pode-se observar comportamento semelhante entre ambas, porém diferentes das curvas dos componentes isolados.[0087] Thermograms were also obtained from samples referring to the study of the formation of inclusion complexes: polymer and bioactive, as well as the inclusion complex obtained by co-evaporation, kneading and physical mixing. Regarding the TG curves of the original polymer (BCD001), different regions were observed showing two stages of mass loss, being attributed in the first range of 40 - 150 °C to water release, followed by the volatilization of the polymer 350 - 500 ° Ç. These results corroborate literature data (GAO et al., 2012; BRASKAR et al., 2004). The bioactive isopentyl caffeate (CA001) has a single stage of thermal decomposition between 200 - 400 °C. In the curves referring to samples MF001, MF002, MF003, MA001, MA002, MA003, CO001, CO002 and CO003, a similar behavior can be observed between them, but different from the curves of the isolated components.
[0088] Pelas curvas do termograma pode-se inferir que a decomposição dos complexos ocorre em temperaturas mais baixas quando comparado ao composto isolado (CA001) e, aparentemente, mais etapas de decomposição foram registradas, na medida em que os picos dos eventos pareceram desdobrados. Estas diferenças sugerem fortemente que a formação de complexos de inclusão, pois estes se comportam como espécies distintas das originais, ou seja, a presença de novos eventos sinaliza a existência de espécies químicas adicionais.[0088] From the thermogram curves it can be inferred that the decomposition of the complexes occurs at lower temperatures when compared to the isolated compound (CA001) and, apparently, more decomposition steps were recorded, as the peaks of the events seemed to unfold . These differences strongly suggest that the formation of inclusion complexes, as they behave like different species from the original ones, that is, the presence of new events signals the existence of additional chemical species.
[0089] No espectro do cafeato de isopentila aparece uma deformação axial assimétrica de intensidade forte em 3500 cm-1 e uma simétrica de intensidade média em 3252 cm-1 , referente ao à ligação de C-H do composto aromático. Característica marcante do éster é a banda referente a C=O entre 1750 – 1735 cm-1, e as bandas de estiramento C-O que aparecem entre 1300 cm-1 e 1000 cm-1 (PAIVA et al., 2010; ARAÚJO et al., 2016).[0089] In the spectrum of isopentyl caffeate appears an asymmetric axial deformation of strong intensity in 3500 cm-1 and a symmetrical one of medium intensity in 3252 cm-1, referring to the binding of C-H of the aromatic compound. A remarkable characteristic of the ester is the band referring to C=O between 1750 – 1735 cm-1, and the CO stretching bands that appear between 1300 cm-1 and 1000 cm-1 (PAIVA et al., 2010; ARAÚJO et al. , 2016).
[0090] No espectro da β-ciclodextrina aparece uma banda forte, larga (3820 cm-1 – 2996 cm-1 ), resultante do grupo funcional O-H, podendo identificar a perda de água da betaciclodextrina com respectiva quebra de ligação de hidrogênio para posterior inclusão do cafeato de isopentila. Em 2890 cm-1 , referente à C-H de estrutura cíclica. E bandas de estiramento C-O que aparecem entre 1153 cm-1 e 1000 cm-1 e C=C com intensidade usualmente de fraca a média entre 1675 – 1645 cm-1 (PAIVA et al., 2010; ANDRADE et al., 2017).[0090] In the spectrum of β-cyclodextrin appears a strong, broad band (3820 cm-1 – 2996 cm-1 ), resulting from the functional group OH, which can identify the loss of water from the betacyclodextrin with its respective breakage of hydrogen bonding for later inclusion of isopentyl caffeate. At 2890 cm-1 , referring to the cyclic structure C-H. And CO stretch bands appearing between 1153 cm-1 and 1000 cm-1 and C=C with usually weak to medium intensity between 1675 – 1645 cm-1 (PAIVA et al., 2010; ANDRADE et al., 2017) .
[0091] Sugere que os espectros das MF001, MA001 e CO001 e MF002, MA002 e CO003 não apresentaram uma interação significativa, uma vez que as bandas da betaciclodextrina se manifestaram de modo semelhante praticamente nas seis amostras.[0091] It suggests that the spectra of MF001, MA001 and CO001 and MF002, MA002 and CO003 did not show a significant interaction, since the betacyclodextrin bands were manifested in a similar way practically in the six samples.
[0092] Sugere-se que os espectros das MF003, MA003 e CO002 se manifestam como uma somatória dos espectros do cafeato de isopentila puro e da β-CD, indicando que houve interação significativa entre o composto puro e a betaciclodextrina, evidenciando também que as diferentes proporções utilizadas para os diferentes métodos alteram de forma significativa os espectros.[0092] It is suggested that the spectra of MF003, MA003 and CO002 are manifested as a summation of the spectra of pure isopentyl caffeate and β-CD, indicating that there was a significant interaction between the pure compound and betacyclodextrin, also showing that the different proportions used for the different methods significantly alter the spectra.
[0093] A melhor posição de ligação e afinidades de ancoragem, moléculas de interação, tipo de interação e distância de geometria (Å) são avaliados na docagem molecular. Quando a distância entre a superfície do fármaco e do receptor diminui outras propriedades moleculares, como polarizabilidade e hidrofobicidade, se tornam preponderantes (HOLTJE et al., 2003).[0093] The best binding position and anchoring affinities, interaction molecules, interaction type and geometry distance (Å) are evaluated in molecular docking. When the distance between the drug and receptor surface decreases, other molecular properties, such as polarizability and hydrophobicity, become predominant (HOLTJE et al., 2003).
[0094] De acordo com a docagem molecular os grupos que realizam ligações de hidrogênio são os grupo OH e =O presentes no cafeato de isopentila. Essas ligações de hidrogênio estabelecidas nos disponibiliza informações necessárias para o compreendimento de quais grupos do cafeato permenecem expostos fora da estrutura da β-ciclodextrina. Os grupos -O- e CH3 permanecem expostos enquanto o restante da estrutura do cafeato de isopentila se acopla à estrutura interna da β-ciclodextrina. Os resultados obtidos através da docagem molecular contribuem e são suportados pelos resultado obtidos através da Espectroscopia de Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR). De acordo com os espectros de infravermelho é notável um aumento da intensidade dos grupos –O– e CH3 nos comprimentos de onda 1200 e 1390 cm-1 respectivamente.[0094] According to molecular docking the groups that carry out hydrogen bonds are the OH and =O groups present in isopentyl caffeine. These established hydrogen bonds provide us with information necessary to understand which groups of the cafeate remain exposed outside the β-cyclodextrin structure. The -O- and CH3 groups remain exposed while the remainder of the isopentyl caffeine structure couples to the internal structure of β-cyclodextrin. The results obtained through molecular docking contribute and are supported by the results obtained through Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR). According to the infrared spectra, an increase in the intensity of the –O– and CH3 groups at wavelengths 1200 and 1390 cm-1 respectively is noticeable.
[0095] Por fim, a docagem molecular permitiu avaliar a capacidade de ancoragem de diferentes quantidades de cafeato de isopentila na estrutura da β-ciclodextrina. De acordo com as 10 diferentes possibilidades de acoplamento, apenas uma estrutura de cafeato de isopentila é estável na estrutura da β-ciclodextrina, corroborando com a razão molar de 1:1 utilizada e definida para estudos posteriores.[0095] Finally, the molecular docking allowed to evaluate the anchoring capacity of different amounts of isopentyl caffeine in the structure of β-cyclodextrin. According to the 10 different coupling possibilities, only one isopentyl caffeate structure is stable in the β-cyclodextrin structure, corroborating the 1:1 molar ratio used and defined for further studies.
[0096] A morfologia da superfície da betaciclodextrina pura apresenta partículas cristalinas de tamanho irregular e na forma de paralelogramos monoclínicos, com superfície e contorno bem definidos. Carvalho e Pinto (2014) obtiveram micrografias da BCD semelhantes ao presente estudo.[0096] The surface morphology of pure betacyclodextrin presents crystalline particles of irregular size and in the form of monoclinic parallelograms, with well-defined surface and contour. Carvalho and Pinto (2014) obtained micrographs of the BCD similar to the present study.
[0097] Por sua vez, o complexo de inclusão obtido pelo método co-evaporado, apresentaram mudanças significativas na forma e no tamanho das partículas, resultando em aglomerados que sugerem uma modificação do cristal e do pó, sugerindo assim formação de complexos. Esse resultado confirma os resultados de DRX obtidos anteriormente, na qual a formação de um novo perfil de difração foi acompanhada pela diminuição no grau de cristalinidade com tendência para amorfização, indicando complexação.[0097] In turn, the inclusion complex obtained by the co-evaporated method, showed significant changes in the shape and size of particles, resulting in agglomerates that suggest a modification of the crystal and powder, thus suggesting complex formation. This result confirms the XRD results obtained previously, in which the formation of a new diffraction profile was accompanied by a decrease in the degree of crystallinity with a tendency to amorphization, indicating complexation.
[0098] A linha celular THP-1 de macrófagos é uma linha celular normal, utilizada para diferentes estudos experimentais, principalmente quando se estuda a biocompatibilidade do material, visando sua possível citotoxicidade.[0098] The THP-1 macrophage cell line is a normal cell line, used for different experimental studies, especially when studying the biocompatibility of the material, aiming at its possible cytotoxicity.
[0099] Para avaliar a possível toxicidade, o complexo de inclusão de cafeato de isopentila foram testadas em linhas celulares de monócitos THP-1. Os resultados de viabilidade celular mostraram que o cafeato de isopentila e seus complexos em todas as concentrações diferentes apresentaram citotoxicidade em cultura de macrófagos no tempo de 24 h, e redução de citotoxicidade no tempo de 48 h. Os resultados obtidos demonstraram que o cafeato nas concentrações 20, 30 e 40 µM apresentaram citotoxicidade, com redução ao empregar a betaciclodextrina para formação do complexo, com melhor resposta na viabilidade celular (p < 0,05).[0099] To assess possible toxicity, isopentyl caffeine inclusion complex were tested on THP-1 monocyte cell lines. Cell viability results showed that isopentyl caffeate and its complexes at all different concentrations showed cytotoxicity in macrophage culture within 24 h, and reduced cytotoxicity within 48 h. The results obtained showed that caffeine at
[00100] A quantidade de cafeato de isopentila ancorada foi determinada através da diferença de concentração da solução antes e após a impregnação, analisadas com o uso de espectroscopia de absorção na região do UV-Vis. Para isso será utilizado equação de reta obtida a partir da média de três curvas analíticas. As curvas foram construídas utilizando soluções nas concentrações compreendidas entre 3.10-3 μg.mL-1 e 5. 10-2 μg.mL-1 de padrão de cafeato de isopentila em solução de metanol.[00100] The amount of isopentyl caffeate anchored was determined by the difference in concentration of the solution before and after impregnation, analyzed using absorption spectroscopy in the UV-Vis region. For this, a straight equation obtained from the average of three analytical curves will be used. The curves were constructed using solutions at concentrations between 3.10-3 μg.mL-1 and 5. 10-2 μg.mL-1 of isopentyl caffeine standard in methanol solution.
[00101] O perfil de liberação do cafeato de isopentila, a partir da complexação e mistura física, foi avaliado após a determinação da concentração do fármaco no meio de dissolução. Os resultados obtidos, expressos em porcentagem de fármaco liberado versus tempo, pode-se identificar que o emprego da beta-ciclodextrina possibilitou o aumento do percentual de fármaco dissolvido no meio em relação ao fármaco puro, atingindo aproximadamente 90% de liberação nos 30 minutos iniciais.[00101] The release profile of isopentyl caffeine, from the complexation and physical mixture, was evaluated after determining the concentration of the drug in the dissolution medium. The results obtained, expressed in percentage of drug released versus time, it can be identified that the use of beta-cyclodextrin allowed an increase in the percentage of drug dissolved in the medium in relation to the pure drug, reaching approximately 90% release in the initial 30 minutes .
[00102] A formulação de mistura física e o cafeato de isopentila puro apresentaram baixo perfis de dissolução, sem promover aumento considerável da liberação do fármaco. A liberação do fármaco, a partir de complexação com beta-ciclodextrina, pode ser afetada por diversos fatores, tais como: aumento da hidrofilia, estado físico do fármaco, massa molar do polímero, proporção do polímero presente na formulação, entre outros (LIU & WANG et al., 2007; BAZZO et al., 2012).[00102] The physical mixture formulation and pure isopentyl caffeate showed low dissolution profiles, without promoting considerable increase in drug release. The drug release, from complexation with beta-cyclodextrin, can be affected by several factors, such as: increased hydrophilicity, drug physical state, polymer molar mass, proportion of polymer present in the formulation, among others (LIU & WANG et al., 2007; BAZZO et al., 2012).
[00103] O emprego de polímeros com carreadores hidrofílicos, a exemplo da beta-ciclodextrina, é uma estratégia que é amplamente utilizada para melhorar a solubilidade de fármacos pouco solúveis (MODI;TAIADE, 2006).[00103] The use of polymers with hydrophilic carriers, such as beta-cyclodextrin, is a strategy that is widely used to improve the solubility of poorly soluble drugs (MODI; TAIADE, 2006).
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