BR102019011166A2

BR102019011166A2 - PROCESS OF OBTAINING A SOLID LIPID NANOPARTICLE ENCAPSULATING PERYLIC ALCOHOL AND PRODUCT OBTAINED

Info

Publication number: BR102019011166A2
Application number: BR102019011166-6A
Authority: BR
Inventors: Patrícia Severino; Luciana Nalone Andrade; Ricardo Luiz Cavalcanti De Albuquerque Junior; Marco Vinícius Chaud; Cristiane Correa Bani; Mariana Cavendish; Salvana Priscylla Manso Costa; Thallysson Carvalho Barbosa; Eliana Maria Barbosa Souto
Original assignee: Instituto De Tecnologia E Pesquisa; Universidade Tiradentes; Universidade Federal De Sergipe; Universidade De Sorocaba
Priority date: 2019-05-30
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2020-12-08

Abstract

processo de obtenção de nanopartícula lipídica sólida encapsulando álcool perílico e produto obtido. a presente patente de invenção diz respeito a um inédito processo para obtenção de nanopartículas lipídicas solidas (nls), contendo álcool perílico (ap) para atividade antitumoral. a invenção aqui revelada se refere a um processo para obtenção de nls através de homogeneização a quente, por ser fácil preparação e baixo custo, utilizando o lipídio cetilpalmitato e o ap com o intuito de potencializar a atividade citotóxica e diminuição da sua volatilidade com aumento da biodisponibilidade, e favorecer a liberação controlada da formulação farmacêutica para atividade antitumoral. o processo e produto desenvolvidos se destinam preferencialmente à área de formulações farmacêuticas, mais especificamente aos agentes antitumorais, através da incorporação do ap em nls representado assim uma importante estratégia tecnológica para melhorar a eficácia deste fármaco, por serem estáveis em meios biológicos e produzidas com lipídios biocompatíveis, biodegradáveis e de custo acessível.process of obtaining a solid lipid nanoparticle encapsulating peryl alcohol and product obtained. the present invention patent concerns an unprecedented process for obtaining solid lipid nanoparticles (nls), containing peryl alcohol (ap) for antitumor activity. the invention disclosed here refers to a process for obtaining nls through hot homogenization, as it is easy to prepare and low cost, using cetyl palmitate lipid and ap in order to potentiate cytotoxic activity and decrease its volatility with increased bioavailability, and favor the controlled release of the pharmaceutical formulation for antitumor activity. the developed process and product are mainly intended for the pharmaceutical formulations area, more specifically for anti-tumor agents, through the incorporation of ap in nls, thus representing an important technological strategy to improve the effectiveness of this drug, as they are stable in biological media and produced with lipids biocompatible, biodegradable and affordable.

Description

PROCESS OF OBTAINING A SOLID LIPID NANOPARTICLE ENCAPSULATING PERYLIC ALCOHOL AND PRODUCT OBTAINED

SHORT PRESENTATION

[001] A presente patente de invenção (PI) diz respeito a um processo de obtenção de uma nanopartícula obtida a partir de lipídios, preferencialmente, cetilpalmitato. Além disso, foi incorporado o bioativo Álcool Perílico (AP). Assim, o dito pode ser categorizado como um produto farmacêutico e/ou farmacologicamente ativo tendo em vista que se trata de um processo de obtenção de nanopartículas preferencialmente utilizando o polímero de origem natural para aplicação tópica, oral, endovenosa visando atividade anticâncer.[001] The present invention patent (PI) concerns a process for obtaining a nanoparticle obtained from lipids, preferably cetylpalmitate. In addition, the bioactive Peryl Alcohol (AP) was incorporated. Thus, the said can be categorized as a pharmaceutical and / or pharmacologically active product considering that it is a process of obtaining nanoparticles preferably using the naturally occurring polymer for topical, oral, intravenous application aiming at anticancer activity.

[002] É importante frisar que a problemática ressaltada no estado da técnica está relacionada ao processo de tratamento de câncer, onde o produto proposto possibilita condições adequadas para tratamentos de vários tipos de canceres, principalmente, do tipo gliobastoma. Além disso, os excipientes utilizados para o desenvolvimento da formulação são biocompatíveis e biodegradáveis.[002] It is important to emphasize that the problem highlighted in the state of the art is related to the cancer treatment process, where the proposed product provides adequate conditions for the treatment of various types of cancer, mainly of the gliobastoma type. In addition, the excipients used for the development of the formulation are biocompatible and biodegradable.

[003] As nanopartículas surgem como um potencial alternativo na produção de medicamentos para câncer, por promoverem o direcionamento específico para o tecido lesado. Favorecendo menor efeito colateral e qualidade de vida aos pacientes. Assim, ressalta-se ainda como vantagem apresentada pela invenção a biocompatibilidade, baixa toxicidade e versatilidade das matérias primas empregadas, associado ao baixo custo e aplicação de processos/etapas simplificadas.[003] Nanoparticles appear as an alternative potential in the production of cancer drugs, as they promote specific targeting for the injured tissue. Favoring less side effect and quality of life for patients. Thus, the advantage presented by the invention also stands out for the biocompatibility, low toxicity and versatility of the raw materials used, associated with the low cost and application of simplified processes / steps.

[004] Comprovando o mérito da invenção proposta, ressalta-se que não há no mercado produtos similares, empregando AP em nanopartícula lipídica sólida.[004] Proving the merit of the proposed invention, it is emphasized that there are no similar products on the market, using AP in solid lipid nanoparticle.

APPLICATION FIELD

[005] A presente invenção refere-se ao desenvolvimento de uma forma farmacêutica nanoparticulada composta de uma nanopartícula lipídica para encapsulação de AP para aplicação direta nas áreas de farmácia, medicina, biomedicina, química e biotecnologia. Pode ainda ser categorizada como processo e produto com aplicação na área de oncologia, através da disponibilização de processo de obtenção das nanopartículas, tendo como público alvo indivíduos/pacientes acometidos de câncer.[005] The present invention relates to the development of a nanoparticulate pharmaceutical form composed of a lipid nanoparticle for AP encapsulation for direct application in the areas of pharmacy, medicine, biomedicine, chemistry and biotechnology. It can also be categorized as a process and product with application in the oncology area, through the availability of a process for obtaining nanoparticles, targeting individuals / patients with cancer.

TECHNICAL FUNDAMENTALS

[006] O câncer é uma palavra derivada do grego Karkínos, que significa caranguejo, utilizada pelo pai da medicina Hipocrates que viveu entre 460 e 377 a.C. Representa um conjunto de mais de 100 doenças, é definido como enfermidades complexas mutacional, proliferativo e de crescimento celular aberrante e descontrolado, onde células do mesmo ambiente, invadem os tecidos e órgãos vizinhos, podendo se estender para regiões distantes do organismo, acontecimento conhecido como metástase [INCA, 2018].[006] Cancer is a word derived from the Greek Karkínos, which means crab, used by the father of medicine Hippocrates who lived between 460 and 377 BC It represents a set of more than 100 diseases, it is defined as complex mutational, proliferative and growth diseases aberrant and uncontrolled cell, where cells from the same environment invade neighboring tissues and organs, and may extend to distant regions of the organism, an event known as metastasis [INCA, 2018].

[007] As opções terapêuticas atuais para o câncer incluem cirurgia, quimioterapia e radioterapia. O tratamento cirúrgico e a radioterapia são considerados tratamento local, e a quimioterapia como tratamento sistêmico, ambos podem ser usados isolados ou associados (ZHAO et al., 2018; HU et al., 2018; FOX et al., 2017; KRUKIEWICZ; ZAK 2016).[007] Current therapeutic options for cancer include surgery, chemotherapy and radiation therapy. Surgical treatment and radiation therapy are considered local treatment, and chemotherapy as systemic treatment, both can be used alone or in combination (ZHAO et al., 2018; HU et al., 2018; FOX et al., 2017; KRUKIEWICZ; ZAK 2016).

[008] A quimioterapia caracteriza-se pela utilização de drogas citotóxicas utilizadas no tratamento antitumoral (HERRERO; MERDADE, 2015; SHENG et al.,2018). Estas podem ser administradas de forma isoladas ou combinadas, para atuarem em diferentes fases da divisão celular, destruindo as células tumorais (INCA,2018).[008] Chemotherapy is characterized by the use of cytotoxic drugs used in antitumor treatment (HERRERO; MERDADE, 2015; SHENG et al., 2018). These can be administered alone or combined, to act in different phases of cell division, destroying tumor cells (INCA, 2018).

[009] O principal objetivo da quimioterapia é eliminar células neoplásicas sem danificar as células normais. Mas infelizmente não existe fármacos disponíveis com toxicidade controlada e que tragam os benefícios de não danificar células normais (MATOSO et al., 2015).[009] The main purpose of chemotherapy is to eliminate neoplastic cells without damaging normal cells. But unfortunately, there are no drugs available with controlled toxicity that bring the benefits of not damaging normal cells (MATOSO et al., 2015).

[0010] Diante de tal cenário, a descoberta de novos alvos moleculares e novas substâncias bioativas se faz necessário para um melhoramento no tratamento do câncer. (SUETH-SANTIAGO et al., 2015; SANGI, 2016).[0010] Faced with such a scenario, the discovery of new molecular targets and new bioactive substances is necessary for an improvement in the treatment of cancer. (SUETH-SANTIAGO et al., 2015; SANGI, 2016).

[0011] Os monoterpenos são os compostos mais explorados pela humanidade, seu uso está relacionado como principal componente dos óleos essenciais tornando valiosos nas indústrias de perfumaria, alimentícia, farmacêutica e agroquímicas (HABTEMARIAM, 2018; MARCHESE et al.,2017).[0011] Monoterpenes are the compounds most explored by mankind, their use is related as the main component of essential oils making them valuable in the perfumery, food, pharmaceutical and agrochemical industries (HABTEMARIAM, 2018; MARCHESE et al., 2017).

[0012] Os monoterpenos são encontrados nos óleos essenciais de plantas podendo ser divididos em três subgrupos: acídicos (mirceno, linalol, geraniol), monocíclicos (alfa-terpineol, terpinoleno) e bicíclicos (α-pineno, tujona, cânfora, fenchona). Em cada um desses subgrupos existe ainda outras classificações como: hidrocarbonetos insaturados (limoneno, álcoois, mentol), aldeídos ou cetona (mentona, carvona), lactonas e as tropolonas (γ-tujaplicina). O número de compostos terpênicos que são conhecidos excede a 8.000 como componentes descritos em óleos essenciais é considerado superior a 150 monoterpenos e 1000 sesquiterpenos (DHIFI et al., 2016; MARCHESE et al., 2017).[0012] Monoterpenes are found in essential oils of plants and can be divided into three subgroups: acidic (mircene, linalool, geraniol), monocyclic (alpha-terpineol, terpinolene) and bicyclic (α-pinene, thujone, camphor, fenchone). In each of these subgroups there are still other classifications such as: unsaturated hydrocarbons (limonene, alcohols, menthol), aldehydes or ketone (mentone, carvone), lactones and tropolones (γ-tujaplicin). The number of terpenic compounds that are known exceeds 8,000 as components described in essential oils is considered to be over 150 monoterpenes and 1000 sesquiterpenes (DHIFI et al., 2016; MARCHESE et al., 2017).

[0013] Dentre o monoterpenos, o AP apresenta na sua constituição p-mentânico, e é encontrado em várias frutas e vegetais como: sálvia, hortelã, noz-moscada, sementes de aipo, lavadas, hortelã-pimenta inibindo a proliferação celular induzindo assim a apoptose de vários tipos de células cancerosas [GARGIA-D-G., et al.- Na / K-ATPase as a target for anticancer drugs: studies with perillyl alcohol- Molecular Cancer, 2015].[0013] Among the monoterpenes, the AP presents in its p-mentanic constitution, and is found in various fruits and vegetables such as: sage, mint, nutmeg, celery seeds, washed, peppermint inhibiting cell proliferation thus inducing the apoptosis of various types of cancer cells [GARGIA-DG., et al.- Na / K-ATPase as a target for anticancer drugs: studies with perillyl alcohol- Molecular Cancer, 2015].

[0014] O AP demostrou-se citotóxico para uma grande variedade de células tumorais em linhagens humanas, se encontrando em fase clínica II em humanos, para o tratamento de glioblastomas [DA FONSECA-C-O., et al.- Perillyl alcohol: Dynamic interactions with the lipid bilayer and implications for long-term inhalational chemotherapy for gliomas, Surgical- Neurology International,2017].[0014] The AP has been shown to be cytotoxic to a wide variety of tumor cells in human lines, being in clinical stage II in humans, for the treatment of glioblastomas [DA FONSECA-CO., Et al.- Perillyl alcohol: Dynamic interactions with the lipid bilayer and implications for long-term inhalational chemotherapy for gliomas, Surgical-Neurology International, 2017].

[0015] Recentemente, Da Fonseca e colaboradores (2016) pesquisaram a interação do AP na membrana plasmática usando simulações dinâmica molecular. Participaram da avaliação 19 pacientes nas fases I/II de glioblastomas durante um período de 5 anos com administração intranasal do AP. Dessa forma, o AP penetra na membrana celular podendo exercer seus efeitos clínicos na bicamada lipídica da membrana celular, reduzindo assim a formação de redes tubulares através da inibição da isoprenilação pós-tradicionais de Ras. Concluindo que a administração intranasal do AP podem vir a contribuir para uma eficácia terapêutica na prevenção da progressão de glioblastomas.[0015] Recently, Da Fonseca and collaborators (2016) researched the interaction of AP in the plasma membrane using molecular dynamic simulations. Nineteen patients in phases I / II of glioblastomas participated in the evaluation during a period of 5 years with intranasal administration of the AP. Thus, the AP penetrates the cell membrane and can exert its clinical effects on the lipid bilayer of the cell membrane, thus reducing the formation of tubular networks through the inhibition of post-traditional isoprenylation of Ras. Concluding that the intranasal administration of the AP may contribute to a therapeutic efficacy in preventing the progression of glioblastomas.

[0016] Andrade et al., (2016), selecionaram o 8,9-epóxido perialdeído e AP para avaliar sua atividade antitumoral em tumores experimentais do sarcoma 180 em camundongos. Os animais que foram inoculados com o sarcoma 180, apresentaram uma taxa de inibição de crescimento de 38,4%, 58,7%, para o 8,9-epóxido perialdeído e 35,3%, 45,4% para o AP nas doses de 100 e 200 mg/kg/dia respectivamente, os dois exibiram atividade antitumoral nas duas doses, com maior taxa de inibição na dose de 200mg/kg/dia. Nenhum efeito toxicologicamente significativo foi encontrado em parâmetros hepáticos e renais analisados, as análises histopatológicas do fígado, baço e rins estavam sem alterações morfológicas. Com isso, os dados sugerem que o 8,9-epóxido perialdeído e o AP possui atividade antitumoral sem toxicidade sistêmica para os parâmetros testados in vivo no sarcoma 180.[0016] Andrade et al., (2016), selected 8,9-perialdehyde epoxide and AP to evaluate its antitumor activity in experimental sarcoma 180 tumors in mice. The animals that were inoculated with sarcoma 180, showed a growth inhibition rate of 38.4%, 58.7%, for 8,9-perialdehyde epoxide and 35.3%, 45.4% for AP in doses of 100 and 200 mg / kg / day respectively, both exhibited antitumor activity in both doses, with a higher rate of inhibition in the dose of 200mg / kg / day. No toxicologically significant effects were found in the hepatic and renal parameters analyzed, the histopathological analyzes of the liver, spleen and kidneys were without morphological changes. Thus, the data suggest that 8,9-perialdehyde epoxide and AP have antitumor activity without systemic toxicity for the parameters tested in vivo in sarcoma 180.

[0017] Dessa maneira o AP mostrou ser uma substância promissora com atividades antitumorais in vitro e in vivo. Todavia há uma necessidade do desenvolvimento farmacotécnico de um veículo capaz de carrear esse ativo lipofílico para melhorar suas características voláteis. Sendo assim, ainda não existe relatos na literatura de um veículo farmacêutico para encapsular o AP, todavia a nanotecnologia apresenta-se como veículo promissor para o bioativo melhorando assim sua biodisponibilidade.[0017] In this way, the AP proved to be a promising substance with antitumor activities in vitro and in vivo. However, there is a need for the pharmacotechnical development of a vehicle capable of carrying this lipophilic asset to improve its volatile characteristics. Therefore, there are still no reports in the literature of a pharmaceutical vehicle to encapsulate the AP, however, nanotechnology presents itself as a promising vehicle for the bioactive, thus improving its bioavailability.

[0018] Os carreadores empregados nas NLS são lipídios sintéticos e/ou naturais, com propriedades distintas de acordo com suas características químicas. Estes carreadores apresentam, atualmente boa empregabilidade enquanto excipientes farmacêuticos para atuarem como moduladores de liberação controlada de fármacos.[0018] The carriers used in the NLS are synthetic and / or natural lipids, with different properties according to their chemical characteristics. These carriers currently have good employability as pharmaceutical excipients to act as modulators of controlled drug release.

[0019] As produções das NLS podem ser por vários métodos descritos na literatura como homogeneização a alta pressão a quente e a frio, ultrassom, emulsificação/evaporação de solvente, secagem por aspersão [LI- Q., et al.- A review of the structure, preparation, and application of NLCs, PBPs, and OLNs-Nanomaterials, 2017].[0019] The NLS productions can be by various methods described in the literature such as high pressure hot and cold homogenization, ultrasound, solvent emulsification / evaporation, spray drying [LI-Q., et al.- A review of the structure, preparation, and application of NLCs, PBPs, and OLNs-Nanomaterials, 2017].

[0020] O método de preparação de NLS por homogeneização a quente é realizada em duas etapas. A primeira etapa é a aquosa, onde é formada pelo tensoativo escolhido solubilizado em agitação magnética. A segunda etapa chamada de oleosa consiste em dissolver o princípio ativo no lipídio fundido, seguindo-se sua dispersão por agitação mecânica em uma solução aquosa. Posteriormente, forma-se uma "pré-emulsão”, que em seguida é aquecida entre 70 e 90°C resultando em uma nanoemulsão, essa é resfriada solidificando o lipídio dando origem as NLS.[0020] The method of preparing NLS by hot homogenization is carried out in two stages. The first step is the aqueous one, where it is formed by the chosen surfactant solubilized in magnetic stirring. The second step called oily consists of dissolving the active ingredient in the melted lipid, followed by its dispersion by mechanical stirring in an aqueous solution. Subsequently, a "pre-emulsion” is formed, which is then heated between 70 and 90 ° C resulting in a nanoemulsion, which is cooled by solidifying the lipid giving rise to NLS.

[0021] Mesmo com grande disponibilidade de recursos e tecnologias no mercado ainda há necessidade de aperfeiçoamento e melhorias no âmbito do tratamento do câncer empregando nanotecnologia, pois é necessário torná-los mais acessíveis à população dando preferência ao uso de tecnologia, eficientes e que sejam de fácil reprodução.[0021] Even with great availability of resources and technologies on the market, there is still a need for improvement and improvements in the scope of cancer treatment using nanotechnology, as it is necessary to make them more accessible to the population, giving preference to the use of technology, efficient and that are easy to reproduce.

SPECIALIZED TECHNICAL LITERATURE

[0022] A literatura técnica especializada revela alguns documentos de patentes que fazem referência ao processo de produção de nanopartículas poliméricas contendo o composto AP pelo método de emulsificação-evaporação do solvente e as nanopartículas (BR1020150244088). A presente invenção compreende o processo de produção de nanopartículas poliméricas contendo AP, revestidas com o polímero poli (ácido-lático)-polietilenoglicol (PLA-PEG), pelo método de emulsificação-evaporação do solvente como forma alternativa para carreamento do fármaco. Este processo de invenção propicia o desenvolvimento de nanopartículas com controle do tamanho e elevada capacidade de encapsulação do AP, além de uma melhora das propriedades físico-químicas, elevando a solubilidade do fármaco, estabilidade em meios fisiológicos e cinética de liberação sustentada e direcionável aos locais de ação desejados. Além disso, as nanopartículas poliméricas contendo Ap apresentam-se como um eficaz modelo de nanocarreadores para quimioterápicos, por possuírem uma superfície funcional para células cancerígenas e um sistema que permite aumentar o tempo de meia vida do fármaco. Neste contexto, a presente invenção tem como objetivo elevar a biodisponibilidade e direcionamento in vivo do AP, melhorando a farmacocinética e a biodistribuição do fármaco, para aplicação na terapia de tratamento de câncer.[0022] The specialized technical literature reveals some patent documents that make reference to the production process of polymeric nanoparticles containing the compound AP by the solvent emulsification-evaporation method and the nanoparticles (BR1020150244088). The present invention comprises the process of producing polymeric nanoparticles containing AP, coated with the poly (lactic acid) -polyethylene glycol (PLA-PEG) polymer, by the solvent emulsification-evaporation method as an alternative way of carrying the drug. This process of invention provides the development of nanoparticles with control of the size and high capacity of encapsulation of the AP, in addition to an improvement of the physicochemical properties, increasing the solubility of the drug, stability in physiological media and sustained release kinetics and directed to the places desired action plans. In addition, polymeric nanoparticles containing Ap present themselves as an effective model of nanocarriers for chemotherapeutic drugs, as they have a functional surface for cancer cells and a system that allows to increase the drug's half-life. In this context, the present invention aims to increase the bioavailability and in vivo targeting of AP, improving the pharmacokinetics and biodistribution of the drug, for application in cancer treatment therapy.

[0023] O documento BR 1020150244088 refere-se ao processo de produção de nanopartículas poliméricas contendo o composto AP pelo método de emulsificação-evaporação do solvente e as nanopartículas, que compreende o processo de produção de nanopartículas poliméricas contendo AP revestidas com o polímero poli (ácido-lático)-polietilenoglicol (PLA-PEG), pelo método de emulsificação-evaporação do solvente como forma alternativa para carreamento do fármaco. Este processo de invenção propicia o desenvolvimento de nanopartículas com controle do tamanho e elevada capacidade de encapsulação do Ap, além de uma melhora das propriedades físico-químicas, elevando a solubilidade do fármaco, estabilidade em meios fisiológicos e cinética de liberação sustentada e direcionável aos locais de ação desejados. Além disso, as nanopartículas poliméricas contendo AP apresentam-se como um eficaz modelo de nanocarreadores para quimioterápicos, por possuírem uma superfície funcional para células cancerígenas e um sistema que permite aumentar o tempo de meia vida do fármaco. Neste contexto, a presente invenção tem como objetivo elevar a biodisponibilidade e direcionamento in vivo do AP, melhorando a farmacocinética e a biodistribuição do fármaco, para aplicação na terapia de tratamento de câncer.[0023] The document BR 1020150244088 refers to the process of producing polymeric nanoparticles containing the AP compound by the solvent emulsification-evaporation method and the nanoparticles, which comprises the process of producing polymeric nanoparticles containing AP coated with the poly polymer ( lactic acid) -polyethylene glycol (PLA-PEG), by the emulsification-evaporation method of the solvent as an alternative way to carry the drug. This process of invention provides the development of nanoparticles with control of the size and high capacity of encapsulation of the Ap, in addition to an improvement of the physicochemical properties, increasing the solubility of the drug, stability in physiological media and sustained release kinetics and directed to the places desired action plans. In addition, polymeric nanoparticles containing AP present themselves as an effective model of nanocarriers for chemotherapeutic drugs, as they have a functional surface for cancer cells and a system that allows to increase the drug's half-life. In this context, the present invention aims to increase the bioavailability and in vivo targeting of AP, improving the pharmacokinetics and biodistribution of the drug, for application in cancer treatment therapy.

[0024] O documento C10107262-5 descreve uma composição a base de monoterpenos, com efeito quimiopreventivo e quimioterápico em neoplasias malignas de seres humanos e animais, na inibição do crescimento de células tumorais e no controle de metástases de tumores primários e método específico de utilização da composição, em seres humanos e animais. Especificamente o monoterpeno é o AP e os seus metabólitos, que são: o ácido perílico e o ácido dihidroperílico. Refere-se também à utilização dos monoterpenos na inibição do crescimento de células e no controle de metástases de tumores primários, caracterizada pelo fato de serem aplicados in vitro e in vivo em linhagens celulares de glioma C6, U87 e A172, e células de explante de glioblastoma de seres humanos.[0024] Document C10107262-5 describes a composition based on monoterpenes, with chemopreventive and chemotherapeutic effect in malignant neoplasms of humans and animals, in inhibiting the growth of tumor cells and in controlling metastasis of primary tumors and specific method of use composition, in humans and animals. Specifically, the monoterpene is AP and its metabolites, which are: perilic acid and dihydroperilic acid. It also refers to the use of monoterpenes to inhibit cell growth and to control metastasis of primary tumors, characterized by the fact that they are applied in vitro and in vivo to cell lines of glioma C6, U87 and A172, and explant cells of glioblastoma of humans.

[0025] O pedido de patente PI01072625 apresenta uma composição farmacêutica inalatória a base de monoterpenos com efeito quimiopreventivo e quimioterápico em neoplasias malignas de seres humanos e animais bem como na inibição do crescimento de células tumorais e o método específico de aplicação da composição quimiopreventiva em seres humanos e animais portadores de neoplasias malignas. Especificamente o monoterpeno é o AP e os seus metabólitos, que são: o ácido perílico e o ácido dihidroperílico. Refere-se também à utilização dos monoterpenos na inibição do crescimento de células e no controle de metástases de tumores primários, caracterizada pelo fato de serem aplicados in vitro e in vivo em células de glioma C6 e U87.[0025] Patent application PI01072625 presents an inhalation pharmaceutical composition based on monoterpenes with chemopreventive and chemotherapeutic effect in malignant neoplasms of humans and animals as well as in inhibiting the growth of tumor cells and the specific method of applying the chemopreventive composition in beings humans and animals with malignant neoplasms. Specifically, the monoterpene is AP and its metabolites, which are: perilic acid and dihydroperilic acid. It also refers to the use of monoterpenes to inhibit cell growth and to control metastasis of primary tumors, characterized by the fact that they are applied in vitro and in vivo to C6 and U87 glioma cells.

ADVANTAGES OF THE INVENTION In relation to the advantages and differentials presented by said PROCESS OF OBTAINING A SOLID LIPID NANOPARTICLE ENCAPSULATING PERYLIC ALCOHOL AND PRODUCT OBTAINED, the following can be highlighted as the most relevant:

[0023] As NLS são estáveis em meios biológicos e produzidas com lipídios biocompatíveis, biodegradáveis, baixo custo e atóxicas;[0023] NLS are stable in biological media and produced with biocompatible, biodegradable, low cost and non-toxic lipids;

[0024] As NLS apresentam como característica diferencial a liberação controlada do fármaco, além de permitir direcionamento específico no tecido tumoral.[0024] NLS's differential feature is controlled drug release, in addition to allowing specific targeting in tumor tissue.

[0025] O desenvolvimento da NLS encapsulando AP representa uma alternativa as formas farmacêuticas já existentes no mercado e com maior eficiência terapêutica e menor efeitos indesejáveis.[0025] The development of NLS encapsulating AP represents an alternative to the pharmaceutical forms already on the market and with greater therapeutic efficiency and less undesirable effects.

[0026] Processo que compreende matérias primas versáteis, baixo custo e processo simplificado. As matérias primas utilizadas são compatíveis fisiologicamente[0026] Process comprising versatile raw materials, low cost and simplified process. The raw materials used are physiologically compatible

[0027] O processo de obtenção é prático, seguro, e, pode ser aplicado em escala industrial.[0027] The procurement process is practical, safe, and can be applied on an industrial scale.

[0028] O processo de obtenção é prático e seguro.[0028] The procurement process is practical and safe.

[0029] Após as vantagens apresentadas e para que o processo da invenção proposta nesse documento de patente possa ser mais bem compreendido e avaliado, a descrição dos desenhos será feita a seguir.[0029] After the advantages presented and so that the process of the invention proposed in that patent document can be better understood and evaluated, the description of the drawings will be made below.

DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

[0030] A invenção será, a seguir, explicada em seus detalhes, sendo que, a título ilustrativo, são apresentados os seguintes desenhos.[0030] The invention will be explained in detail below, and the following drawings are presented for illustrative purposes.

[0031] A Figura 1, revela de forma ilustrativa, o gráfico de análise termogravimétrica das NLS e das NLS encapsulando AP.[0031] Figure 1 shows, in an illustrative way, the graph of thermogravimetric analysis of the NLS and the NLS encapsulating AP.

[0032] A Figura 2, revela de forma ilustrativa, o gráfico de análise termo analítica das NLS e das NLS encapsulando AP.[0032] Figure 2 shows, in an illustrative way, the graph of term analytical analysis of the NLS and the NLS encapsulating AP.

[0033] A Figura 3, revela de forma ilustrativa, o gráfico de espalhamento de raio X a baixo ângulo das NLS e das NLS encapsulando AP.[0033] Figure 3 shows, in an illustrative way, the low angle X-ray scatter plot of the NLS and NLS encapsulating AP.

[0034] A Figura 4, revela de forma ilustrativa, a microscopia eletrônica de transmissão das NLS e das NLS encapsulando AP.[0034] Figure 4 shows, in an illustrative way, the transmission electron microscopy of the NLS and the NLS encapsulating AP.

[0035] A Figura 5, revela de forma ilustrativa, o gráfico comparativo com os resultados do estudo in vitro do perfil de liberação do fármaco incorporado às NLS.[0035] Figure 5 shows, in an illustrative way, the comparative graph with the results of the in vitro study of the drug release profile incorporated into the NLS.

[0036] A Figura 6 representa o efeito das NLS-AP, na avaliação da viabilidade de fibroblastos humanos L929 determinadas pelo ensaio de MTT depois de 24 horas de incubação. O controle negativo foi tratado com o veículo usado para diluir a droga (DMSO 5%). Os dados correspondem à média ± E.P.M. de quatro experimentos independentes.[0036] Figure 6 represents the effect of NLS-AP, in the evaluation of the viability of human L929 fibroblasts determined by the MTT assay after 24 hours of incubation. The negative control was treated with the vehicle used to dilute the drug (DMSO 5%). The data correspond to the mean ± E.P.M. of four independent experiments.

SUMMARY OF THE INVENTION

[0037] O objeto principal deste pedido de patente de invenção é descrever com detalhes o processo e o produto relacionado ao PROCESSO DE OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULA LIPÍDICA SÓLIDA ENCAPSULANDO ÁLCOOL PERÍLICO E PRODUTO OBTIDO.[0037] The main object of this patent application is to describe in detail the process and the product related to the PROCESS OF OBTAINING A SOLID LIPID NANOPARTICLE ENCAPSULATING PERYLIC ALCOHOL AND OBTAINED PRODUCT.

[0038] Assim, mais especificamente, a invenção aqui revelada se refere a um processo de obtenção de uma nanopartícula lipídica sólida encapsulando Álcool Perílico para aplicação no tratamento do câncer.[0038] Thus, more specifically, the invention disclosed herein refers to a process of obtaining a solid lipid nanoparticle encapsulating Peryl Alcohol for application in the treatment of cancer.

[0039] Assim, o dito processo pode ser categorizado como um produto farmacêutico e/ou farmacologicamente ativo tendo em vista que se trata de um processo de obtenção de bioproduto utilizando lipídio de origem natural para tratamento de câncer.[0039] Thus, said process can be categorized as a pharmaceutical and / or pharmacologically active product considering that it is a process of obtaining a bioproduct using lipid of natural origin for cancer treatment.

[0040] O tratamento de câncer por quimioterapia de forma geral, causa efeitos colaterais exacerbados, tempo de internação prolongada e complicações secundárias com isso estimulam pesquisadores a buscarem formulações e princípios ativos mais eficientes para tratamento desses pacientes, buscando melhora da qualidade de vida.[0040] The treatment of cancer by chemotherapy in general, causes exacerbated side effects, prolonged hospital stay and secondary complications, thereby encouraging researchers to seek more efficient formulations and active principles for the treatment of these patients, seeking to improve the quality of life.

[0041] O uso de bioativos oriundos da flora surgem como um potencial alternativo na produção de novos medicamentos. Ressalta o emprego da nanotecnologia que permite um direcionamento específico do ativo fazendo que haja somente no tecido tumoral, reduzindo os efeitos colaterais.[0041] The use of bioactives from flora emerges as an alternative potential in the production of new medicines. It emphasizes the use of nanotechnology that allows a specific targeting of the asset, making it only in the tumor tissue, reducing side effects.

[0042] Dentro do contexto apresentado, e, para que o processo desenvolvido e produto obtido, objeto de proteção desse pedido de patente, possam ser compreendidos e avaliados de forma mais clara e objetiva, sua descrição detalhada será feita a seguir.[0042] Within the context presented, and, so that the process developed and product obtained, object of protection of this patent application, can be understood and evaluated in a more clear and objective way, its detailed description will be made below.

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

[0043] Nesta seção serão revelados todos os detalhes do processo de desenvolvimento do dito PROCESSO DE OBTENÇÃO DE NANOPARTÍCULA LIPÍDICA SÓLIDA ENCAPSULANDO ÁLCOOL PERÍLICO E PRODUTO OBTIDO, cujo intuito é o de descrever suficiente e clara, todas as etapas que envolvem o processo de obtenção, e dessa forma, embasar a suficiência descritiva desta invenção.[0043] In this section, all the details of the development process of said PROCESS OF OBTAINING A SOLID LIPID NANOPARTICLE ENCAPSULATING PERYLIC ALCOHOL AND OBTAINED PRODUCT, whose purpose is to describe sufficiently and clearly, all the steps that involve the process of obtaining, will be revealed. and thus, support the descriptive sufficiency of this invention.

[0044] As nanopartículas lipídicas sólidas da invenção compreendem: de 0,10 a 0,50 % de tensoativo, preferencialmente Poloxamer® 407, mais especificamente de 0,25%; de 0,10 a 0,50 % de lipídio, preferencialmente cetilpalmitato, mais especificamente de 0,25%; de 0,010% a 0,05% de fármaco, preferencialmente Álcool Perílico e/ou monoterpenos derivados de plantas, mais especificamente 0,025% e água Ultra-pura em quantidade suficiente para.[0044] The solid lipid nanoparticles of the invention comprise: from 0.10 to 0.50% of surfactant, preferably Poloxamer® 407, more specifically 0.25%; from 0.10 to 0.50% of lipid, preferably cetylpalmitate, more specifically from 0.25%; from 0.010% to 0.05% of drug, preferably Peryl Alcohol and / or monoterpenes derived from plants, more specifically 0.025% and Ultra-pure water in sufficient quantity to.

[0045] Para desenvolvimento do dito processo de obtenção de micropartículas lipídicas sólidas encapsulando AP por Ultra-homogenização, bem como as micropartículas obtidas, as seguintes etapas de 1 a 3 devem ser consideradas:[0045] For the development of said process of obtaining solid lipid microparticles encapsulating AP by Ultra-homogenization, as well as the microparticles obtained, the following steps 1 to 3 must be considered:

Step 1 → Preparation of the solid lipid nanoparticle

[0046] Para o desenvolvimento das NLS foi empregada uma fase aquosa e uma fase oleosa. A fase aquosa foi constituída por 0,02g a 0,08g de tensoativo, preferencialmente 0,05g, mais especificamente Poloxamer® 407 e de 10 a 50 mL água destilada, preferencialmente 20 mL. O tensoativo foi solubilizado em água empregando agitação magnética por 24 h à temperatura ambiente a 25°C. Na fase oleosa foi solubilizado de 0,02g a 0,08g de cetilpalmitato, preferencialmente 0,05g e 0,003g a 0,006 g de fármaco, preferencialmente 0,005g de Álcool Perílico e/ou monoterpenos derivados de plantas, em 2 a 6 mL de etanol, preferencialmente 4 mL. Ambas as fases foram aquecidas, separadamente, em banho maria na temperatura de 70°C.[0046] For the development of NLS an aqueous phase and an oil phase were used. The aqueous phase consisted of 0.02 g to 0.08 g of surfactant, preferably 0.05 g, more specifically Poloxamer® 407 and 10 to 50 ml distilled water, preferably 20 ml. The surfactant was solubilized in water using magnetic stirring for 24 h at room temperature at 25 ° C. In the oily phase, 0.02g to 0.08g of cetylpalmitate, preferably 0.05g and 0.003g to 0.006g of drug, preferably 0.005g of Peryl Alcohol and / or monoterpenes derived from plants, were solubilized in 2 to 6 mL of ethanol, preferably 4 ml. Both phases were heated separately in a water bath at a temperature of 70 ° C.

Step 2 → Ultra-homogenization

[0047] A fase oleosa deve ser vertida sobre a fase aquosa, a qual deve compreender o emulsificante, sob a mesma temperatura. Destaca-se que a fase aquosa compreende tensoativo, e, a fase oleosa compreende o éster e lipídio[0047] The oil phase must be poured over the aqueous phase, which must comprise the emulsifier, under the same temperature. It is noteworthy that the aqueous phase comprises surfactant, and the oil phase comprises the ester and lipid

[0048] A mistura deve ser homogeneizada com Ultra-agitação com velocidade 18.000 a 22.000 rpm, durante um intervalo de tempo que varia de 5 a 10 minutos, preferencialmente 8 minutos.[0048] The mixture must be homogenized with Ultra-agitation with speed 18.000 to 22.000 rpm, during a time interval that varies from 5 to 10 minutes, preferably 8 minutes.

Step 3 → Cooling the mixture

[0049] Em seguida, a mistura foi resfriada em banho de gelo até temperatura ambiente e filtrada em filtro do tipo Millipore® com tamanho de poro de 0,22 μm, e, logo após deve congelar as nanopartículas a uma temperatura de -18°C até solidificação e liofilizar durante um intervalo de tempo que varia de 72 a 96 horas.[0049] Then, the mixture was cooled in an ice bath to room temperature and filtered through a Millipore® type filter with a pore size of 0.22 μm, and, soon after, the nanoparticles should be frozen at a temperature of -18 ° C until solidification and lyophilize over a period of time ranging from 72 to 96 hours.

Physico-chemical and biological characterization

[0050] As NLS e NLS encapsulando AP foram caracterizadas do ponto de vista da analises térmicas (TG e DSC), microscopia eletrônica de transmissão, espalhamento de raio X a baixo ângulo, perfil de liberação e citotoxicidade.[0050] The NLS and NLS encapsulating AP were characterized from the point of view of thermal analysis (TG and DSC), transmission electron microscopy, low angle X-ray scattering, release profile and cytotoxicity.

Thermal analysis (TG and DSC)

[0051] As técnicas de caracterização realizadas através das análises térmicas são empregadas para acompanhar uma propriedade física específica de cada analise. A termogravimetria (TG) é uma técnica que acompanha a perda ou ganho de massa em função do tempo ou temperatura, determinando a estabilidade térmica da amostra. Com isso, reúne informações termo analíticas, como percentual de massa perdida, tipo de decomposição do material analisado e estágios de decomposição. Na análise de calorimetria exploratória diferencial (DSC), é usada para medir a alteração de energia em função da mudança de temperatura, sendo possível realizar as análises estruturais das NLS, essas analises são feitas por aparecimento ou desaparecimento de picos endotérmicos e exotérmicos.[0051] The characterization techniques performed through thermal analysis are used to monitor a specific physical property of each analysis. Thermogravimetry (TG) is a technique that accompanies the loss or gain of mass as a function of time or temperature, determining the thermal stability of the sample. With this, it gathers term analytical information, such as percentage of lost mass, type of decomposition of the analyzed material and stages of decomposition. In the differential exploratory calorimetry (DSC) analysis, it is used to measure the energy change as a function of the temperature change, being possible to carry out the structural analyzes of the NLS, these analyzes are made by the appearance or disappearance of endothermic and exothermic peaks.

Transmission electronic microscopy

[0052] A MET é muito utilizada para analises morfológicas, com objetivo de obter imagens diretas das nanopartículas. A técnica consiste de um feixe de elétrons que é emitido em direção à amostra interagindo enquanto a atravessa o objeto.[0052] MET is widely used for morphological analysis, in order to obtain direct images of the nanoparticles. The technique consists of an electron beam that is emitted towards the sample interacting as it passes through the object.

[0053] As análises das NLS sem o ativo apresentaram formas esféricas e lisa. As NLS-AP exibiram formas esféricas e com relativa homogeneidade de tamanho com superfície lisa, foram observados também pontos enegrecidos, sugerindo a encapsulação do ativo nas NLS. A partir de análise MET observou-se o diâmetro próximos a 200 nm das partículas.[0053] The analysis of NLS without the active showed spherical and smooth forms. The NLS-AP exhibited spherical shapes and relatively homogeneous in size with a smooth surface, blackened spots were also observed, suggesting the encapsulation of the asset in the NLS. From MET analysis it was observed the diameter close to 200 nm of the particles.

X-ray scattering at low angle

[0054] O espalhamento de raio X a baixo ângulo podem fornecer informações importantes fornecem informações importantes quanto à sua organização molecular.[0054] X-ray scattering at low angle can provide important information provide important information regarding its molecular organization.

[0055] O uso do SAXS objetivou um melhor entendimento da organização estrutural dos lipídios que formam o núcleo das NLS. Figura 3 mostra a curva de intensidade de espalhamento, em função do vetor q de espalhamento, para a amostra NLS and NLS-AP. Ambas as formulações sugerem um perfil típico para nanopartículas unilamelares devido a presença de somente um pico. NLS-AP descreveu um pequeno deslocamento, sugerindo a diminuição do tamanho das nanopartículas.[0055] The use of SAXS aimed at a better understanding of the structural organization of the lipids that form the nucleus of NLS. Figure 3 shows the scattering intensity curve, as a function of the scattering vector q, for the sample NLS and NLS-AP. Both formulations suggest a typical profile for unilamellar nanoparticles due to the presence of only one peak. NLS-AP described a small displacement, suggesting a decrease in the size of the nanoparticles.

Release profile

[0056] Experimentos de liberação in vitro baseados em simulação foram realizados para determinar o comportamento de liberação do AP através da matriz de partículas. Os resultados obtidos, estão expressos em porcentagem do AP liberado, versus tempo como representados.[0056] Simulation-based in vitro release experiments were performed to determine the release behavior of the AP through the particle matrix. The results obtained are expressed as a percentage of the released PA, versus time as represented.

[0057] Aproximadamente 30% de AP foi liberado da matriz das NLS próximos de 8 horas, o que se encaixa no modelo cinético de Korsmeyer-peppas com valor de (R2 = 1,0).[0057] Approximately 30% of AP was released from the NLS matrix close to 8 hours, which fits the Korsmeyer-peppas kinetic model with a value of (R2 = 1.0).

[0058] Esta liberação exibiu perfil de liberação cinética prolongada. Por se tratar de uma molécula hidrofóbica o AP tendem a ficar solubilizado no núcleo oleoso das NLS, aumentando assim o tempo de liberação.[0058] This release exhibited an extended kinetic release profile. Because it is a hydrophobic molecule, the AP tends to be solubilized in the oil nucleus of the NLS, thus increasing the release time.

Cytotoxicity

[0059] A linha celular L929 de fibroblastos é uma linha celular normal, utilizada para diferentes estudos experimentais, principalmente quando se estuda a biocompatibilidade do material, visando sua possível citotoxicidade.[0059] The L929 fibroblast cell line is a normal cell line, used for different experimental studies, especially when studying the biocompatibility of the material, aiming at its possible cytotoxicity.

[0060] Para avaliar a possível toxicidade, as NLS-AP foram testadas em linhas celulares de fibroblastos L929. Os resultados mostraram que as NLS-AP apresentaram valores de 100% de células viáveis, NLS 100% e o AP isolado, 97% de células vivas. Todas as amostras não apresentaram citotoxicidade significativa (> 80% de viabilidade) contra células L929 de fibroblastos. Dessa forma, a formulação de NLS-AP são biocompatíveis, não apresentando citotoxicidade frente as células de fibroblastos L929.[0060] To assess possible toxicity, NLS-AP were tested on L929 fibroblast cell lines. The results showed that the NLS-AP showed values of 100% viable cells, 100% NLS and the isolated AP, 97% live cells. All samples did not show significant cytotoxicity (> 80% viability) against L929 fibroblast cells. Thus, the formulation of NLS-AP are biocompatible, showing no cytotoxicity against L929 fibroblast cells.

Claims

PROCESS OF OBTAINING A SOLID LIPID NANOPARTICLE ENCAPSULATING PERYLIC ALCOHOL AND OBTAINED PRODUCT, characterized by obtaining a solid lipid nanoparticle using the ultra-homogenization technique with the use of cetylpalmitate lipid and Poloxamer® surfactant, encapsulating the drug (preferably 1) ), (2) and (3).

SOLID LIPID NANOPARTICLES 'according to claim 1, characterized by comprising 0.10 to 0.50% surfactant, preferably Poloxamer® 407, more specifically 0.25%; from 0.10 to 0.50% of lipid, preferably cetylpalmitate, more specifically from 0.25%; from 0.010% to 0.05% of drug, preferably Peryl Alcohol, more specifically 0.025% and Ultra-pure water in sufficient quantity to.

SOLID LIPID NANOPARTICLES FOR ENCAPSULATION OF PERYLAL ALCOHOL FOR ANTITUMORAL ACTIVITY, according to claim 2, characterized in that the drug used is Peryl Alcohol and monoterpenes derived from plants.

PROCESS OF OBTAINING SOLID LIPID NANOPARTICLES, according to claims 1 to 3, characterized in that Peryl Alcohol can be replaced by any substance of the monoterpene family.

PROCEDURE FOR OBTAINING, according to claim 1, characterized in that step 1 involves the aqueous phase with 0.02 g to 0.08 g of surfactant, preferably 0.05 g, more specifically Poloxamer® 407 and 10 to 50 ml distilled water , preferably 20 mL, then the surfactant was solubilized in water using magnetic stirring for 24 h at room temperature at 25 ° C, soon after, the oily phase started, solubilizing from 0.02g to 0.08g of cetylpalmitate, preferably 0 , 05g and 0.003g 0.006g of drug, preferably 0.005g of Peryl Alcohol and / or monoterpenes derived from plants, in 2 to 6 ml of ethanol, preferably 4 ml, afterwards, both phases were heated separately in a water bath in the temperature of 70 ° C.

PROCEDURE FOR OBTAINING, according to claims 1 and 5, characterized in that step 2, heat both phases separately in a water bath, then pour the oil phase into the aqueous phase and homogenized with Ultra-agitation, with a speed of 15,000 at 22,000 rpm for a time interval ranging from 5 to 10 minutes, preferably 8 minutes.

PROCEDURE FOR OBTAINING, according to claims 1, 5 and 6, characterized in that step 3, cool the mixture in an ice bath and filtered through a Millipore® filter with a pore size of 0.45 μm followed by 0.22 μm, and immediately after freezing the nanoparticles at a temperature of -18 ° C until solidification and freeze drying for a period of time ranging from 72 to 96 hours.

PRODUCT, obtained by the process, according to claims 1 to 7, characterized by being a pharmaceutical and / or pharmacologically active product, more specifically a nanoparticle produced by the ultra-homogenization technique with the use of lipid, preferably cetyl palmitate.

PRODUCT, obtained by the process, according to claims 1 to 8, characterized by being a pharmaceutical and / or pharmacologically active product, more specifically solid lipid microparticles that encapsulate the drug Peryl Alcohol applied preferentially for antitumor activity.

PRODUCT, obtained by the process, according to claims 1 to 9, characterized by being a pharmaceutical and / or pharmacologically active product, more specifically solid lipid microparticles that encapsulate the drug Peryl Alcohol that are ready for application after the completion of the steps (1 ), (2) and (3).