BR102019014520A2

BR102019014520A2 - processo de obtenção de composição liofilizada de nanopartículas a base de quitosana contendo bromelina, composição liofilizada de nanopartículas a base de quitosana contendo bromelina e uso no tratamento de feridas

Info

Publication number: BR102019014520A2
Application number: BR102019014520-0A
Authority: BR
Inventors: Janaína Artem Ataide; Laura De Oliveira Nascimento; Priscila Gava Mazzola; Danilo Costa Geraldes
Original assignee: Universidade Estadual De Campinas - Unicamp
Priority date: 2019-07-13
Filing date: 2019-07-13
Publication date: 2021-01-26
Also published as: WO2021007635A1

Abstract

A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de uma composição liofilizada de nanopartículas de quitosana contendo bromelina.
Dita composição revelou-se estável em relação à atividade enzimática utilizando pequenas moléculas, como açúcares ou aminoácidos como lioprotetores.
Adicionalmente, a presente invenção revela seu uso na preparação de um medicamento para tratar de feridas.

Description

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE COMPOSIÇÃO LIOFILIZADA DE NANOPARTÍCULAS A BASE DE QUITOSANA CONTENDO BROMELINA, COMPOSIÇÃO LIOFILIZADA DE NANOPARTÍCULAS A BASE DE QUITOSANA CONTENDO BROMELINA E USO NO TRATAMENTO DE FERIDAS

Campo da invenção:

[001] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de uma composição liofilizada de nanopartículas a base de quitosana contendo bromelina.

[002] Dita composição revelou-se estável em relação à atividade enzimática utilizando açúcares como lioprotetores.

[003] A composição referida não contém solventes orgânicos ou aditivos químicos, como conservantes, sendo obtida por processo verde e baseada em excipientes naturais e biocompatíveis.

[004] Adicionalmente, a presente invenção revela seu uso na preparação de um medicamento para tratar feridas.

Fundamentos da invenção:

[005] A bromelina, um complexo de substâncias extraídas principalmente do abacaxi (Ananas comosus L.), é reconhecida por suas propriedades anti-inflamatórias, antitrombóticas, fibrinolíticas, atividade antitumoral e efeito imunomodulatório. A partir do estudo de Seligman que mostrou, em 1962, sua ação como agente anti-inflamatório, vários estudos sustentam o uso de extratos de bromelina em diferentes condições (Seligman, 1962; Taussig e Batkin, 1988; Salas et al., 2008; Chobotova et al., 2010; Amid et al., 2011; Ferreira et al., 2011) . Em particular, alguns estudos têm demonstrado o potencial uso da bromelina em processos de cicatrização. Maurer (2001) demonstrou que essa enzima possui benefícios para a cicatrização de feridas, especificamente reduzindo edema, hematomas e dor. Em queimaduras, a bromelina age hidrolisando o tecido desvitalizado, tanto in vivo quanto in vitro, o que aumenta a capacidade de cicatrização.

[006] Feridas são formadas a partir do rompimento da integridade da pele, superfícies mucosas ou tecidos de órgãos (Young and McNaught, 2011), e embora as lesões na pele variem, elas possuem um mecanismo comum para reparo e cura. A cicatrização de feridas é um processo biológico regular no corpo humano, uma vez que a pele humana tem uma capacidade natural de promover a auto-regeneração após dano (Guo e DiPietro, 2010; Pereira e Bártolo, 2016), e quando desencadeado por uma lesão, este mecanismo compreende uma elaborada cascata de eventos fisiológicos projetados para finalmente curar a pele (Strondtbeck, 2001).

[007] O primeiro estágio, a hemostasia, ocorre imediatamente no momento da lesão e geralmente dura algumas horas. O segundo estágio, a inflamação, começa logo após a hemostasia e geralmente é concluída dentro das primeiras 24 a 72 horas após a lesão; no entanto, pode durar até 5-7 dias após lesão (Haas, 1995). Proliferação e reparação, a terceira fase, ocorre tipicamente 1 a 3 semanas após lesão. A quarta e última etapa, a remodelação, começa aproximadamente 3 semanas após a lesão e pode levar meses a vários anos para atingir a conclusão fisiológica.

[008] Em 1962, Winter concluiu que feridas hidratadas em leitões epitelizam a pele duas vezes mais rápido do que as feridas expostas ao ar (Winter, 1962). Desde então, muito se aprendeu sobre mecanismos de cura de feridas e fatores que os afetam (Cooper, 1990; Cuzzell e Stotts, 1990; Salas Campos et al., 2005; Winter and Scales, 1963). Atualmente, sabe-se que a cura é um processo complexo, que pode ser acelerado e melhorado pelo uso de técnicas, produtos e curativos (Cooper, 1990; Kumar et al., 2007).

[009] Curativos modernos foram desenvolvidos para facilitar o processo de cura ao invés de apenas cobrir o ferimento (Dhivya et al., 2015), e sua característica essencial é reter e criar um ambiente úmido ao redor da ferida para facilitar sua cicatrização (Boateng et al., 2008). A maioria dos tratamentos modernos são curativos interativos, pois interagem com a ferida para proporcionar um ambiente ótimo na interface do curativo (Sarabahi, 2012) . Estes curativos interativos incluem filme e espuma semipermeáveis, hidrofibras, hidrogéis, hidrocolóides e alginatos (Dhivya et al., 2015; Sarabahi, 2012) .

[010] Curativos bioativos ou biológicos também são curativos modernos e são produzidos a partir de biomateriais, que desempenham um papel importante no processo de cicatrização (Boateng et al., 2008; Dhivya et al., 2015) . Estes curativos são conhecidos pela sua biocompatibilidade, biodegradabilidade e natureza não-tóxica (Dhivya et al., 2015), e são derivados geralmente de tecidos naturais ou artificiais (Bartlett, 1981; Boateng et al., 2008; Dhivya et al., 2015). Em alguns casos, curativos bioativos podem ser incorporados com compostos ativos, como antimicrobianos e fatores de crescimento, melhorando o processo de cicatrização (Boateng et al., 2008; Dhivya et al., 2015) .

[011] Devido às características expostas acima, a bromelina tem aplicações potenciais nas indústrias cosmética, farmacêutica e de alimentos. No entanto, o uso de proteínas como ingrediente ativo em produtos farmacêuticos é um desafio, devido à sua instabilidade física e química.

[012] Os processos as quais as proteínas são submetidas geram condições de estresse que podem levar à redução ou à perda da atividade biológica, ou até mesmo alterar seu potencial imunogênico (Sanchez-Ruiz e Makhatadze, 2001). Pereira et al. (2014) demonstraram que composições com bromelina, quando conservadas a 37 °C, perdiam quase toda sua atividade enzimática. Eles atribuíram este fato à auto-degradação (autólise ou autodigestão) da bromelina, pois 37 °C tem sido considerada a temperatura ótima para sua atividade proteolítica (Pereira et al., 2014).

[013] Nos últimos anos, o desenvolvimento de sistemas nanoparticulados biodegradáveis para a liberação de fármacos cresceu de modo significativo. Esses carreadores coloidais apresentam diversas vantagens, tais como possibilidade de proteção do ativo incorporado frente às degradações in vivo, relativa estabilidade nos fluidos biológicos e a capacidade de modulação da liberação do fármaco e, por isso, são considerados bastante promissores (Lemarchand et al., 2004; Le Droumaguet et al., 2012).

[014] Devido a suas características de adesividade, biocompatibilidade, biodegradabilidade e baixa toxicidade, a quitosana é um material atraente para diversos usos, principalmente na área farmacêutica. Este polissacarídeo é usado em sistemas de liberação modificada de fármacos de diversas classes terapêuticas, tais como antibióticos, antiinflamatórios, anti-hipertensivos, além de peptídeos e proteínas (Bernkop-Schnürch, 2000; Florea et al., 2006; Boonyo et al., 2007; Sandri et al., 2010) . A facilidade de adesão da quitosana, assim como seu caráter antifúngico, bacteriostático e sua permeabilidade ao oxigênio são propriedades muito atrativas para uso tópico (Argüelles, 2004; Jayakumar et al., 2011) .

[015] Sabe-se que o uso da quitosana para o tratamento de feridas e queimaduras tem sido estudado, com base em sua capacidade hemostática e seu efeito de aceleração no reparo de feridas com melhor efeito estético final.

[016] Baseado no exposto acima, estudos anteriores mostraram instabilidade da bromelina quando aplicada diretamente como composições tópicas, mesmo quando armazenada em baixas temperaturas (Lourenço et al., 2016; Pereira et al., 2014; Spir et al., 2015) . Logo, entende-se que essa enzima poderia se beneficiar da nanoestruturação baseada em quitosana para tais fins.

[017] Por motivos econômicos e de fabricação, um novo produto em uma composição líquida seria a alternativa mais simples, porém possíveis processos químicos, físicos e biológicos podem ocorrer de forma a prejudicar sua estabilidade e consequente desempenho.

[018] O processo de liofilização propicia composições sólidas sem aquecimento acima da temperatura ambiente, o que propicia a estabilidade das proteínas presentes. O estado sólido de baixa umidade evita ou diminui possíveis reações químicas, biológicas e stress mecânico, podendo resultar em composições estáveis durante o período de meses até anos sem perda do desempenho desejado.

[019] A presente invenção visou, portanto, encapsular a bromelina em nanopartículas de quitosana e liofilizar a composição a fim de aumentar a estabilidade enzimática, com o objetivo de produzir um medicamento para tratar feridas.

[020] Inesperadamente, foi revelado que o processo compreendendo o emprego de uma composição a base de nanopartículas de quitosana-bromelina contendo lioprotetores, e liofilizada manteve parâmetros de partícula estáveis, resultando em um uma composição com curto tempo de reconstituição em água e maior taxa de incorporação da bromelina quando comparada com a forma líquida.

Estado da técnica:

[021] Alguns documentos do estado da técnica se referem à ativos naturais para tratamento de feridas. Esses ativos conhecidos na literatura são a própolis, a Centella asiatica, a Punica granatum L, Rosmarinus officinalis L e Calendula officinalis, dentre outras. A bromelina, cujas propriedades também a tornam ideal para o tratamento de feridas, é extensamente revisada, Ataide et al. Natural actives for wound healing: a review. Phytotherapy Research, 2018.

[022] Ekambaram et al. (2017) descreve um sistema de distribuição combinada multifásica produzido por eletrofiação coaxial de diferentes polímeros biocompatíveis, com otimização da razão e especificidade dos polímeros para a função específica, usando bromelina como desbridante e ácido salviólico B como estimulador de angiogênese e reepitelização. O perfil in vitro de liberação ilustrou a liberação sustentada de protease desbridante e componente bioativo em tempo hábil. O produto fabricado mostrou potencial angiogênico através de migração de células endoteliais in vitro e aumento de novos capilares a partir do vaso sanguíneo existente em resposta a um ensaio de membrana corioalantóica de galinha in ovo. Com a fibra projetada também foi alcançada uma cicatrização acelerada de feridas in vivo no modelo de ferida de pele de rato de espessura total.

[023] Outros documentos remetem ao uso da bromelina associada à quitosana em nanopartículas.

[024] O artigo "BROMELAIN-IMMOBILIZED AND LACTOBIONIC ACID-MODIFIED CHITOSAN NANOPARTICLES FOR ENHANCED DRUG PENETRATION IN TUMOR TISSUES" (2018) trata do uso de uma quitosana modificada com ácido lactobiônico, o que modifica suas propriedades. A quitosana modificada foi então usada para produzir uma dispersão de nanopartículas contendo doxorubicina, que foram posteriormente revestidas com bromelina para aumentar sua capacidade de penetração tumoral após degradação da matriz extracelular do tumor. Nesse trabalho não foi estudada a estabilidade da composição. Já a presente invenção trata da resolução do problema da estabilidade da bromelina propondo uma composição em que as nanopartículas de quitosana-bromelina são secas por liofilização em presença de lioprotetorcomposição. Em adição, a presente invenção não trata de quitosana modificada quimicamente, o que diminui o custo de excipiente e mantém o apelo natural da composição.

[025] O documento CN 107475226 revela um complexo de bromelina com um polissacarídeo polianiônico (alginato, pectina, CMC, goma arábica ou goma xantana), podendo ser utilizado um polissacarídeo ou uma mistura. De acordo com o resumo da patente, os inventores complexam a bromelina com um polissacarídeo aniônico, aumentando assim sua estabilidade. Entretanto, o processo de secagem do complexo, seu tamanho médio e características não é detalhado. Diferentemente do exposto, a presente invenção faz uso de um polissacarídeo policatiônico (quitosana tem carga positiva), além de formar e caracterizar nanopartículas com bromelina.

[026] Alguns documentos do estado da técnica descrevem ainda a obtenção de pós liofilizados de bromelina.

[027] No documento CN 1834239 é proposto um método para obtenção de pós liofilizados de bromelina. A enzima é extraída do abacaxi em etapas que envolvem filtração do suco da fruta, adsorção com óxido de zinco, ultrafiltração e liofilização. A inovação é relativa ao método de purificação alcançado pelo uso do óxido de zinco, e se destina à aplicação em possíveis composições orais. Entretanto, dados sobre a estabilidade, armazenamento e condições em que a liofilização é realizada não são divulgados, embora estes impactem a atividade enzimática do produto.

[028] Já na presente invenção, não há necessidade de purificação do extrato pois a bromelina é adquirida comercialmente em sua forma já purificada. Ademais, o produto consiste em uma composição farmacêutica de bromelina encapsulada em quitosana, apresentada como pó seco (liofilizado), estável em temperatura ambiente por mais de 90 dias em relação ao tamanho da partícula e atividade enzimática.

[029] Já o documento RU 2677232 refere-se a uma composição farmacêutica de bromelina encapsulada em gel de quitosana de baixo e/ou alto peso molecular, se apresentando na forma de macropartículas. A bromelina é imobilizada em solução tampão Tris-glicina 50 mM e pH 8,5-9,0, incubada e o precipitado resultante é lavado com tampão Tris-HCl 50 mM e pH 7,5. A invenção tem como destino o tratamento de feridas, proporcionando partículas macroscópicas de tamanhos variados. Entretanto, não apresenta dados acerca da caracterização físico-química das partículas ou mesmo sobre a estabilidade da composição ou das condições de liofilização. Adicionalmente, a composição possui pH final entre 8,5 e 9,0, inadequado para o uso na pele, de pH 5,5.

[030] A presente invenção se diferencia por se tratar de uma composição reprodutível de nanopartículas de quitosana de baixo peso molecular liofilizadas. Dados sobre a estabilidade da composição, assim como a caracterização das nanopartículas, são fornecidos e a mesma apresenta pH compatível com o da pele.

[031] Sabe-se também que a adição de lioprotetores, dentre eles, os açúcares, são abordados no estado da técnica. Em particular, o artigo "FREEZE-DRYING OF NANOPARTICLES: FORMULATION, PROCESS AND STORAGE CONSIDERATIONS" (2006) compila informações sobre a liofilização de nanopartículas. A maltose é mencionada para estabilização de vetores encapsulados com caprolactona, mas nenhuma referência é feita à sua atuação quanto à veiculação de proteínas.

[032] Portanto, nenhum documento descreve a liofilização das nanopartículas de bromelina em base de quitosana com adição de maltose como lioprotetor, nem oferece extensas e detalhadas descrições do processo capaz de torná-lo reprodutível e aumentar a estabilidade enzimática.

Breve descrição da invenção:

[033] A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de uma composição liofilizada de nanopartículas a base de quitosana contendo bromelina.

[034] Dita composição revelou-se estável em relação à atividade enzimática utilizando açúcares como lioprotetores.

[035] Adicionalmente, a presente invenção revela seu uso na preparação de um medicamento para tratar feridas.

[036] A composição obtida na forma de pó liofilizado de bromelina nanoestruturada pode ser usado como forma farmacêutica final ou ainda como ingrediente ativo farmacêutico incorporado em outro produto.

Breve descrição das figuras:

[037] Para obter uma completa visualização do objeto desta invenção, são apresentadas as figuras as quais se faz referência, conforme se segue:
Figura 1. Microscopia eletrônica de varredura (A) e de transmissão (B) das nanopartículas de quitosana-bromelina.
Figura 2. Espectros de Infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) da bromelina (preto), nanopartículas de quitosana (vermelho) e nanopartículas de quitosana-bromelina (verde).
Figura 3. Tamanho médio das nanopartículas (A), índice de polidispersão (B) e potencial zeta (C) durante estudo de estabilidade acelerada, em que Chi = nanopartículas de quitosana, Chi-brom = nanopartículas de quitosana-bromelina. Barras de erro representam desvio padrão de três medições.
Figura 4. Concentração de proteína (A) e atividade enzimática (B) na suspensão de nanopartículas de quitosana-bromelina durante estudo de estabilidade acelerada, em que Chi-brom = nanopartículas de quitosana-bromelina. Barras de erro representam desvio padrão de três medições.
Figura 5. Eficiência de encapsulação da bromelina nas nanopartículas de acordo com a concentração de proteínas (A) e atividade enzimática (B) , em que Gly = glicina, Malt = maltose. As barras de erro representam o desvio padrão das três medições.
Figura 6. Gráfico de pareto do planejamento fatorial relacionando as variáveis (inputs) estudadas em relação as respostas de tamanho médio das partículas (A) , índice de polidispersividade (B) , D10 (C) , D50 (D) , D90 (E) , potencial zeta (F) e eficiência de encapsulação em termos de proteínas (G) e atividade enzimática (H).
Figura 7. Gráficos do efeito principal do planejamento fatorial relacionando as variáveis (inputs) estudadas em relação as respostas de tamanho médio de partículas (A), índice de polidispersividade (B), D10 (C), D50 (D), D90 (D), potencial zeta (F) e eficiência de encapsulação em termos de proteínas (G) e atividade enzimática (H).
Figura 8. Microscopia eletrônica de varredura do pó liofilizado com glicina (A), maltose (B) e após reconstituição com glicina (C) e com maltose (D).
Figura 9. Microscopia eletrônica de transmissão das amostras liofilizadas após reconstituição contendo glicina (A) e maltose (B).
Figura 10. Tamanho médio das nanopartículas (A), índice de polidispersão (B) e potencial zeta (C) após reconstituição do liofilizado das nanopartículas de quitosana-bromelina durante o estudo de estabilidade, em que Gly = glicina, Malt = maltose. Barras de erro representam desvio padrão de três medições.
Figura 11. Concentração de proteína (A) e atividade enzimática (B) após reconstituição do liofilizado das nanopartículas de quitosana-bromelina durante o estudo de estabilidade, em que Gly = glicina, Malt = maltose. Barras de erro representam desvio padrão de três medições.
Figura 12. Gráfico da rampa de secagem utilizada durante o processo de liofilização da formulação.

Descrição detalhada da invenção:

[038] A presente invenção refere-se ao processo de obtenção de uma composição liofilizada a base de nanopartículas de quitosana contendo bromelina.

[039] Dita composição revelou-se estável em relação à atividade enzimática utilizando açúcares como lioprotetores.

[040] Adicionalmente, a presente invenção revela seu uso na preparação de um medicamento para tratar feridas.

[041] A composição obtida na forma de pó liofilizado de bromelina nanoestruturada pode ser usado como forma farmacêutica final ou ainda como ingrediente ativo farmacêutico incorporado em outro produto

[042] Mais particularmente, o referido processo compreende etapas as quais são descritas como se segue:

i. Produção das nanopartículas de quitosana-bromelina
ii. 2) Liofilização das nanopartículas de quitosana-bromelina .

[043] Cada uma das etapas é melhor descrita e definida a seguir:
i. Produção das nanopartículas de quitosana-bromelina

a) Adicionar por gotejamento uma solução de TPP na concentração de 0,5 mg/mL a uma solução de quitosana na concentração de 2,5mg/mL sob agitação até completa homogeneização;
b) Adicionar uma solução de bromelina na concentração de 10mg/mL sob agitação a solução obtida na etapa (a) até completa homogeneização;
c) Obter as nanopartículas de quitosana e bromelina;

ii. Liofilização das nanopartículas de quitosana-bromelina
d) Solubilizar o lioprotetor diretamente na solução de nanopartículas obtidas na etapa (c);
e) A mistura das nanopartículas com lioprotetor obtida na etapa (d) armazenadas em ultrafreezer a temperatura de -80 °C;
f) As nanopartículas congeladas a -80°C, obtidas na etapa (e) foram inseridas no liofilizador com a prateleira ambientada a -45°C e mantidas até atingir a mesma temperatura da prateleira;
g) As nanopartículas da etapa (f) seguem rampa de secagem aumentando-se 5°C da temperatura de -45 °C a +10 °C;
h) Obtenção da composição liofilizada de nanopartículas a base de quitosana contendo bromelina.

[044] Sendo que a proporção de quitosana, TPP, bromelina ser de 4:6:1(v/v). A agitação nas etapas (a) e (b) serem a 350rpm, e o tempo de duração etapa (b) ser de 40 min.

[045] No referido processo, o lioprotetor é selecionado dentre pequenas moléculas, como açúcares ou aminoácidos, maltose, glicina, preferencialmente maltose.

[046] Na etapa (g) a temperatura é alterada quando a temperatura da composição atinge a temperatura da prateleira. apenas avançando para a próxima etapa quando a temperatura da formulação atinge a temperatura da prateleira.

[047] As nanopartículas obtidas na etapa (c) de quitosana-bromelina apresentam diâmetro médio de 84,5 a 100,9 nm, um índice de polidispersão de 0,18 a 0,23, um potencial zeta de 21,9 a 27,1 mV e uma concentração de partículas na ordem de 1012 partículas/mL. Ainda na etapa c, a bromelina é encapsulada em nanopartículas de quitosana e apresenta uma eficácia de encapsulação de 83,4 a 97,8% da concentração de proteínas, o que corresponde a uma eficiência de encapsulação de 75,5 a 81,6% da atividade enzimática.

[048] Em uma modalidade da presente invenção na etapa (d) o lioprotetor está em uma concentração de 3% (m/v) em relação ao volume da solução de nanopartícula de quitosana-bromelina.

[049] No processo da presente invenção a composição apresenta uma temperatura de colapso que varia de -56°C a -28°C, preferivelmente acima de -40°C, com adição de maltose e glicina, respectivamente.

[050] Ainda é objeto da presente invenção uma composição liofilizada de nanopartículas a base de quitosana contendo bromelina liofilizada obtida pelo processo conforme processo definido anteriormente e que compreende 0,9% a 1,0% de bromelina, 0,9% a 1,0% de quitosana, 3% de lioprotetor.

[051] A referida composição compreende um lioprotetor selecionado dentre pequenas moléculas, podendo ser açúcares ou aminoácidos como maltose ou glicina, preferencialmente maltose.

[052] Adicionalmente a composição objeto da presente invenção compreende nanopartículas com diâmetro médio de 88,5 e 127,8 nm, um índice de polidispersão de 0,29 a 0,34, um potencial zeta de 20,0 a 23,2 mV.

[053] A composição obtida pelo processo está na forma de pó liofilizado, apresenta uma eficiência de encapsulação com maltose de 96,3% a 98,8%, o que equivale a uma atividade enzimática de 73,3 a 99,5%.

[054] Ainda é objeto da presente invenção o uso da composição obtida conforme definida no processo descrito no preparo de um medicamento para tratar feridas.

Exemplo de concretização: 1a etapa: Produção das nanopartículas de quitosana-bromelina Materiais

[055] Bromelina do caule de abacaxi, azocaseína, reagente de Bradford e quitosana de baixo peso molecular, preferencialmente 50,000-190,000 Da (baseado em viscosidade) sendo 75-85% deacetilada (número de catálogo 448869) foram adquiridos da Sigma-Aldrich® (St Louis, EUA). Todos os outros reagentes foram adquiridos em grau analítico. Sendo que a azocaseína é o reagente utilizado no teste de atividade enzimática e o reagente de Bradford é o reagente utilizado no teste de concentração de proteínas.

[056] A solução de bromelina foi preparada dissolvendo a bromelina em água destilada (10 mg/mL) e filtrando-a com membranas de 0,22 μm.

[057] A solução de quitosana foi preparada na seguinte proporção 2,5 mg/mL de quitosana em ácido acético 1%, pH 5,0, sendo posteriormente filtrada em membranas de 0,45um.

[058] A solução de TPP foi preparada na seguinte proporção 0,5 mg/mL em água ultrapura, posteriormente filtrada em membrana de 0,22um. Sendo que a solução de TPP está a 30% (m/m) em relação à quantidade total de quitosana.

[059] As nanopartículas foram produzidas pela técnica de reticulação iônica (Shu e Zhu, 2000), utilizando o tripolifosfato de sódio (TPP) como agente reticulante. Foi utilizada uma proporção de 30% (m/m) de TPP em relação a quantidade total de quitosana, e agitação de 350 rpm. A solução de bromelina (10 mg/mL em água) foi adicionada sob agitação de 350 rpm durante 40 minutos, após o gotejamento da solução de TPP na solução de quitosana. Imediatamente após a adição de TPP, 1 ml da solução de bromelina foi adicionada para produzir as nanopartículas de bromelina-quitosana ou 1 ml de água destilada para produzir nanopartículas de quitosana.

[060] Sendo que as proporções das soluções usadas na concretização da invenção, sem, no entanto, restringir a esta modalidade foram 4 mL de solução de quitosana + 6 mL de solução de TPP + 1 mL de solução de bromelina.

[061] As nanopartículas com e sem bromelina produzidas com diferentes tipos de quitosana foram fisicamente caracterizadas por DLS, potencial zeta e NTA.

A.Distribuição do tamanho, índice de polidispersividade e potencial zeta

[062] Foram avaliados o diâmetro médio e índice de polidispersividade (PDI) das nanopartículas usando o equipamento Zetasizer Nano ZS (Malvern, Reino Unido). O tamanho médio e o índice de polidispersividade foram determinados por dispersão de luz dinâmico (DLS), enquanto que o potencial zeta foi medido por microeletroforese de laser Doppler (Zetasizer Nano ZS, Malvern, Reino Unido).

[063] Todas as análises foram feitas em triplicata de leituras.

[064] Por meio de medidas de DLS, as nanopartículas de quitosana-bromelina mostraram um tamanho menor do que as nanopartículas de quitosana e uma redução no potencial zeta (Tabela 1).
Tabela 1. Distribuição de tamanho das nanopartículas de quitosana-bromelina. Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão de três medidas. DLS = dispersão de luz dinâmico; NTA = análise de rastreamento de nanopartículas; Z-ave = tamanho médio, D10 = percentil 10%; D50 = percentil 50%; D90 =percentil 90%.

B. Eficiência de encapsulação

[065] Para a determinação da eficiência de encapsulação, as nanopartículas foram ultracentrifugadas (Centrifuge 5810R, Eppendorf, Alemanha) a 4.000g por 10 minutos, utilizando dispositivos de ultrafiltração de 0,5 mL com membrana de 100 kDa (Amicon® Ultra 100k, Millipore, Alemanha) separando assim a bromelina que permaneceu livre da encapsulada. A concentração de proteínas totais e a atividade enzimática foram determinadas na solução inicial de bromelina e no filtrado (resultante da filtração descrita), e a eficiência foi calculada de acordo com a equação 1:

[066] A solução inicial de bromelina apresentou 2,0 ± 0,3 mg/mL de proteína total e 23,3 ± 1,6 U/mL. A concentração de proteína e atividade enzimática também foram determinadas na solução filtrada resultante (0,25 ± 0,01 mg/mL e 4,5 ± 0,6 U/mL, respectivamente) para o cálculo da eficiência de encapsulação, que foi de 87,0 ± 5,1% da proteína total, correspondente a 80,7 ± 1,1% da atividade enzimática da bromelina (Tabela 2).
Tabela 2. Concentração de proteínas totais, atividade enzimática e eficiência de encapsulação da bromelina

C. Microscopia eletrônica de varredura e de transmissão

[067] As características morfológicas das nanopartículas de quitosana-bromelina foram observadas utilizando microscópio eletrônico de varredura Leo 440i com detector de energia dispersiva de raios X 6070 (LEO Electron Microscopy, Inglaterra). Imagens de microscopia eletrônica de varredura foram obtidas usando uma tensão de aceleração de 15 kV. Antes da análise, as amostras foram secas a temperatura ambiente, sob vácuo, durante 24 horas e revestidas com ouro (92 A°) utilizando SC7620 Sputter Coater Polaron (VG Microtech, Inglaterra). As partículas também foram observadas em microscópio eletrônico de transmissão (TEM JEOL-1400 Plus, 120kV), sendo que as grades foram preparadas por contraste negativo.

[068] Na imagem de microscopia eletrônica de varredura (Figura 1A), as nanopartículas de quitosana-bromelina apresentaram formato esférico, superfície lisa e diâmetro de aproximadamente 1 μm, que foi maior que o tamanho obtido pelas medidas de DLS e NTA. Mostrando que mesmo um processo de secagem suave, em temperatura ambiente, pode levar à agregação de nanopartículas, levando à formação de micropartículas (Rampino et al., 2013) . Já na imagem de microscopia eletrônica de transmissão (Figura 1), as partículas continuam apresentando formato esférico com diâmetro menor do que 50nm, porém é possível notar a presença de aglomerados com várias partículas unidas com aproximadamente 100nm, o que é condizente com os resultados obtidos por DLS e NTA.

D. Espectroscopia no Infravermelho com transformada de Fourier

[069] Os espectros no infravermelho das nanopartículas de quitosana e de quitosana-bromelina, e da bromelina livre (Figura 2), foram obtidos em espectrofotômetro de infravermelho com transformada de Fourier (Shimadzu Scientific Instruments, Modelo 8300, Japão), operando de 4000 a 650 cm-1, com resolução de 4 cm-1. Todas as medidas foram realizadas em triplicata.

[070] No espectro da bromelina (preto) pode ser observado um pico a 3280 cm-1 que corresponde a ligação peptídica enzimática. Também é possível observar pico em 1634 cm-1 indicativo de grupo C=O, e a 1515 cm-1 indicativo de grupo N-H, que confirmam a presença de aminoácidos. O pico em 1236 cm-1 pode ser atribuído a ligação C-N, em amina alifática (Devakate et al., 2009; Soares et al., 2012; Ataide et al., 2017a; Ataide et al., 2017b).

[071] Os espectros das nanopartículas apresentam banda de absorção em torno de 3400 cm-1, equivalente a interação de hidrogênio e vibração O-H (Wu et al., 2005), com maior intensidade na nanopartícula de quitosana-bromelina quando comparado à nanopartícula de quitosana. Em ambos espectros também se observa um pico em torno de 7 95 cm-1, que pode ser atribuído a presença de vibrações relacionadas a ligação entre fósforo e oxigênio (P-O e P-O-P) (Knaul et al., 1999; Antoniou et al., 2015). Na nanopartícula de quitosana (vermelho) é possível observar o deslocamento dos picos de vibração C=O de amida II e N-H de amina I, que indica a interação entre os grupos amino da quitosana com os grupos fosfato do TPP (Knaul et al., 1999; Antoniou et al., 2015) . Comparando essa mesma região da nanopartícula de quitosana e da nanopartícula de quitosana-bromelina (verde), nota-se um aumento de intensidade de ambos picos, o que pode ser atribuído a presença de bromelina, uma vez que a bromelina também absorve na mesma frequência (Devakate et al., 2009; Soares et al., 2012). Além disso, mais uma vez é observado o deslocamento dos picos correspondentes ao grupo N-H, o que indica interação com o grupo amino.

E. Estudos de estabilidade

[072] Para o estudo de estabilidade das nanopartículas foram preparadas solução de bromelina 10 mg/mL, e soluções de nanopartículas de quitosana e de quitosana-bromelina. As 3 soluções foram acondicionadas em frascos de vidro e armazenadas em 4 condições: ambiente claro (27±2°C, com exposição a luz), ambiente escuro (27±2°C, protegido da luz), geladeira (5±2°C) e estufa (45±2°C). Para o teste de estabilidade preliminar, as amostras foram avaliadas durante 15 dias seguidos, a partir do dia 0 (que foram preparadas e acondicionadas). O teste de estabilidade acelerada foi feito em sequência, nas mesmas condições, avaliando as amostras nos dias 30, 45, 60, 90, 120, 150 e 180 (Anvisa, 2005).

[073] Durante o estudo preliminar de estabilidade, parâmetros gerais, como valor de pH e características macroscópicas foram avaliados. A suspensão de nanopartículas de quitosana e quitosana-bromelina não apresentou alterações macroscópicas e de pH. Assim, as amostras continuaram no estudo de estabilidade acelerado. Após 7 dias de estudo (Figura 3), as nanopartículas de quitosana-bromelina apresentaram um aumento significativo (p <0,05, teste T de Student) no diâmetro médio em todas as condições estudadas, acompanhado também de aumento significativo do índice de polidispersão e diminuição do potencial zeta. O aumento no tamanho de partícula é regularmente atribuído à aglomeração de partículas, que pode ser induzida pela adsorção de moléculas ativas nas nanopartículas (Magenheim e Benita, 1991; Abdelwahed et al., 2006).

[074] A concentração de proteína e atividade enzimática também foram determinadas durante o estudo de estabilidade acelerada. As nanopartículas de quitosana não apresentaram concentração proteica significativa e nem atividade enzimática em nenhum tempo ou condição estudada. As nanopartículas de quitosana-bromelina mostraram uma diminuição na concentração de proteína e atividade enzimática (Figura 4) ao longo do tempo, onde a atividade enzimática diminuiu significativamente (p <0,05, teste T de Student) após 7 dias. Essa diminuição foi ligeiramente menos pronunciada quando as amostras foram armazenadas em baixas temperaturas (Figura 4), de acordo com resultados reportados por outros estudos que utilizaram a bromelina (Pereira et al., 2014; Spir et al., 2015; Lourenço et al., 2016) . Diante desses resultados, as nanopartículas de quitosana-bromelina são instáveis quando armazenadas em forma líquida, e, portanto, a liofilização é um processo importante para aumentar a preservação do tamanho das partículas para armazenamento a longo prazo (Fonte et al., 2016; Almalik et al., 2017) e da atividade enzimática da bromelina (Arakawa et al., 2001).

2a etapa: Liofilização das nanopartículas de quitosana- bromelina A. Avaliação da adição de lioprotetores e temperatura de colapso

[075] Trealose, maltose e glicina foram escolhidas como possíveis lioprotetores, devido a suas temperaturas de colapso quando em sozinhos em solução, sendo que a temperatura de colapso foi de -24,3°, -25,1° e -12,7°, respectivamente. Posteriormente, foram dissolvidas na suspensão de nanopartículas de quitosana-bromelina na concentração de 3% (m/v), para avaliar seu efeito na temperatura de colapso das suspensões de nanopartículas de quitosana-bromelina. A temperatura de colapso das nanopartículas de quitosana-bromelina com e sem lioprotetores foi determinada por um microscópio acoplado a um módulo de liofilização, Lyostat 2, modelo FDCS 196 (Linkam Instruments, Surrey, Reino Unido), equipado com sistema de congelamento de nitrogênio líquido (LNP94/2) e controlador de temperatura programável (TMS94, Linkam). As nanopartículas de quitosana-bromelina apresentaram uma temperatura de colapso de -56°C, que diminuiu para -49,3°C, -34,8°C e -28,0°C com adição de trealose, maltose e glicina, respectivamente.

[076] Apesar dos dois açúcares (maltose e trealose) terem temperaturas de colapso próximas quando sozinhos (Tabela 3), foi inesperado o fato de resultarem em soluções com temperaturas de colapso tão diferentes, quando em conjunto com a dispersão de nanopartículas.
Tabela 3 Temperatura de colapso dos possíveis lioprotetores em solução isolados e em nanopartículas.

[077] Em geral, o processo de liofilização abaixo de -40°C não é aconselhável (Carpenter et al., 1997; Tattini Jr et al., 2006) e, assim, a maltose e a glicina foram avaliadas no planejamento fatorial como lioprotetores, uma vez que permitem que a liofilização se inicie a -40°C.

B. Planejamento experimental do processo de liofilização

[078] Para otimizar a composição liofilizada, dos pontos experimentais, apenas com as nanopartículas foi realizado um planejamento fatorial 23 com duplicata de quitosana-bromelina. As variáveis (inputs) avaliadas foram o tipo de lioprotetor (glicina ou maltose), a concentração de lioprotetor (3 ou 5%, m/v) e o próprio processo de liofilização (antes e após o processo). As amostras foram submetidas ao congelamento rápido com nitrogênio líquido e liofilizadas no Lyostar 3 Freeze-Drier (SP Scientific, USA). A secagem primária foi realizada aumentando-se 5°C da temperatura de -45°C a 10°C (Figura 12), esperando para que a temperatura dos vials atingisse a temperatura das prateleiras. Depois de secas as amostras foram reconstituídas com água destilada para o mesmo volume inicial e foram físico-quimicamente caracterizadas por dispersão de luz dinãmico e eficiência de encapsulação, que foram utilizados como respostas do planejamento fatorial. Os produtos liofilizados foram submetidos a análise termogravimétrica (TGA-50M, Shimadzu, Japão) a fim de se determinar a umidade residual. As amostras de nanopartículas secas foram precisamente pesadas (cerca de 10 mg) e foram então aquecidas a 10 °C/min de 25 °C até 300 °C, sob atmosfera de nitrogênio com um fluxo de vazão de 50 mL/min. A umidade residual foi determinada por perda de peso estável (%) a temperatura de cerca de 100°C (Sylvester et al., 2018).

[079] Todos os liofilizados tinham bom aspecto e não apresentaram encolhimento. As nanopartículas com glicina e maltose foram imediatamente reconstituídas depois da adição de água e as soluções resultantes eram límpidas. Sem o lioprotetor, no entanto, a ressuspensão demorou mais de 20 segundos e as soluções ficaram levemente turvas, mesmo depois de agitadas em vórtex. Os pós liofilizados foram analisados por análise termogravimétrica para se determinar a umidade residual. As composições com glicina em concentração de 3% e 5% apresentaram 4,1% e 3,2% de perda de massa, respectivamente, enquanto as composições com maltose apresentaram 5,6% e 3,8%. composiçãoOs liofilizados foram reconstituídos em água destilada para se analisar as características físicas das partículas por dispersão de luz dinâmico (Tabela 4) e a eficiência de encapsulação (Figura 5), que foram considerados outputs para o planejamento fatorial. Depois da liofilização, a glicina em concentração de 3% (m/v) conseguiu manter o índice de polidispersividade dentro dos valores desejáveis, porém o potencial zeta decaiu. Por outro lado, a maltose apresentou comportamento oposto, aumentando o índice de polidispersividade e demonstrando pouco efeito no potencial zeta.
Tabela 4. Tamanho das nanopartículas, PDI e potencial zeta antes e depois do processo de liofilização (planejamento experimental). Os resultados são apresentados como média ± desvio padrão de duas composições, medidas três vezes cada. Z-ave = tamanho médio das partículas, PDI = índice de polidispersividade, controle=nanopartícula sem lioprotetor.

[080] A eficiência de encapsulação antes do processo de liofilização aumentou em termos de concentração de proteínas depois da adição de glicina e maltose, enquanto a eficiência de encapsulação em termos de atividade enzimática diminuiu depois da adição de glicina e aumentou depois da adição de maltose (Figura 5) . Depois da liofilização, foi possível observar um pequeno aumento na eficiência de encapsulação de proteínas para todas as amostras. A eficiência de encapsulação em termos de atividade enzimática também aumentou em todas as composições.

[081] As respostas (outputs) (tamanho médio das partículas, PDI, D10, D50, D90, potencial zeta e eficiência de encapsulação) foram estatisticamente analisados utilizando-se diagramas de pareto (Figura 6), e os efeitos principais das variáveis nas respostas também foram analisados (Figura 7) . Os lioprotetores significativamente interferem em quase todas as respostas, excluindo-se potencial zeta e eficiência de encapsulação em termos de atividade enzimática. A glicina aumentou o tamanho médio das partículas aumentando os percentuais de distribuição D10, D50, D90, no entanto ela também diminuiu o índice de polidispersão, indicando uma distribuição de tamanho mais estreita. Por outro lado, a maltose diminuiu o tamanho médio das nanopartículas e aumentou o índice de polidispersão. A concentração dos lioprotetores foi uma importante variável observado para o PDI, D10 e encapsulação de proteínas, sendo que baixas concentrações (3%, m/v) diminuem oPDI, aumentando o D10 e a encapsulação de proteínas.

[082] Excluindo-se a encapsulação de proteínas, a liofilização afeta significativamente todas as respostas. O processo aumentou o tamanho médio das partículas através do aumento do percentil de distribuição, também aumentando a polidispersão e a encapsulação de atividade enzimática. O potencial zeta diminuiu com o processo de liofilização, o que poderia causar algum problema na estabilidade das nanopartículas, que deve ser estudada. Considerando todos os efeitos, as composições com glicina ou maltose a concentração de 3% (m/v) parecem ter potencial para melhor estabilizar as nanopartículas de quitosana-bromelina.

C. Produção e caracterização das nanopartículas liofilizadas

[083] Com base no planejamento fatorial, constatou-se que as composições contendo 3% (m/v) de glicina e maltose como lioprotetores foram as mais promissoras para estabilização das nanopartículas de quitosana-bromelina. Sendo assim, um novo lote de amostras com esses excipientes foi produzido e liofilizado seguindo os parâmetros antes determinados. Imediatamente após o término do processo de liofilização, as amostras foram caracterizadas e submetidas a estudo de estabilidade. Para esse estudo, as amostras secas foram mantidas nos vials de liofilização vedados com filme plástico e armazenadas em temperatura ambiente (25°± 2°) e em geladeira (5° ± 2°) protegidas da luz.

[084] As amostras foram caracterizadas quanto ao tamanho médio, índice de polidispersão e potencial zeta, antes e imediatamente após a liofilização (Tabela 5). A adição de glicina aumentou o tamanho médio das nanopartículas e o potencial zeta e diminuiu o índice de polidispersão quando comparado com as nanopartículas sem adição de lioprotetores. Por outro lado, a adição de maltose apresenta efeito contrário, diminuindo o tamanho médio e o potencial zeta e aumentando o índice de polidispersão. Conforme observado no planejamento experimental, após o processo de liofilização o tamanho médio das nanopartículas e o PDI aumentaram, enquanto que o potencial zeta diminuiu. A eficiência de encapsulação em todos os casos aumentou após o processo de liofilização.
Tabela 5. Tamanho das nanopartículas, PDI e potencial zeta antes e depois do processo de liofilização. Os resultados apresentados como média ± desvio padrão de duas composições, medidas três vezes cada. Z-ave = tamanho médio das partículas, PDI = índice de polidispersividade, EE Ptn = eficiência de encapsulação proteínas totais, EE Ativ = eficiência de encapsulação atividade enzimática.

[085] Após o término do processo de liofilização, a morfologia das amostras foi avaliada por microscopia eletrônica de varredura (Figura 8) na forma seca (Figura 8A e *B) e após reconstituição (Figura 8C e 8D). Devido a limitação do equipamento, as amostras após reconstituição apresentam pequenos pontos, não sendo possível determinar adequadamente o limite das nanopartículas.

[086] As amostras reconstituídas também foram analisadas em microscópio eletrônico de transmissão (Figura 9) . Nessas imagens é possível notar que ambas partículas possuem formato esférico, sendo que as partículas liofilizadas com glicina apresentam maior diâmetro médio e uma distribuição de tamanho mais homogênea quando comparada com a composição contendo maltose. No entanto, a composição com maltose preservou mais as características da suspensão inicial de nanopartículas de quitosana-bromelina, ou seja, presença de aglomerados de aproximadamente 100nm composto por várias partículas menores.

[087] As amostras apresentaram umidade residual de 3.5% e 4.4% para as amostras com glicina e maltose respectivamente, que foram menores que os valores encontrados durante o planejamento, mas ainda superior ao limite recomendado de 2% (Abdelwahed et al., 2006; Sylvester et al., 2018) . Após 90 dias de estudo de estabilidade, a umidade residual das amostras com glicina aumentou para 6.2% e 7.6% quando armazenada em temperatura ambiente e em geladeira, respectivamente. Já as amostras de maltose apresentaram uma redução na umidade residual, que ficou em 2.4% e 1.8% quando armazenadas em temperatura ambiente e geladeira, respectivamente.

[088] Nos dias 0, 30, 60 e 90, as amostras acondicionadas em temperatura ambiente e em geladeira foram reconstituídas com o mesmo volume inicial (3mL de água MilliQ) e foram acompanhadas quanto ao tamanho médio, índice de polidispersão e potencial zeta (Figura 10), e concentração de proteínas e atividade enzimática (Figura 11) . Apesar de apresentar o maior índice de polidispersão no início do estudo de estabilidade, a composição de nanopartículas de quitosana-bromelina contendo maltose mantiveram os parâmetros de partícula estáveis durante todo o período de estudo (Figura 10), sendo que a composição armazenada em geladeira (5° ± 2°) apresentou os resultados mais estáveis. Por sua vez, as composições com glicina não foram estáveis, chegando a um PDI de 1.0 quando armazenadas em temperatura ambiente (25° ± 2°).

[089] Quanto aos parâmetros relacionados a estabilidade da bromelina (atividade enzimática e proteínas totais), foi possível notar que a concentração de proteínas e atividade enzimática não apresentou alterações significativas no início e no final do estudo de estabilidade (dias 1 e 90), Figura 11.

Claims

Processo de obtenção de uma composição liofilizada de nanopartículas a base de quitosana contendo bromelina, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas:
- i. Produção das nanopartículas de quitosana-bromelina
- ii. Liofilização das nanopartículas de quitosana-bromelina.
Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas e subetapas:
i. Produção das nanopartículas de quitosana-bromelina
- a) Adicionar por gotejamento uma solução de TPP na concentração de 0,5 mg/mL a uma solução de quitosana na concentração de 2,5mg/mL sob agitação até completa homogeneização;
- b) Adicionar uma solução de bromelina na concentração de 10mg/mL sob agitação a solução obtida na etapa (a) até completa homogeneização;
- c) Obter as nanopartículas de quitosana e bromelina;
ii. Liofilização das nanopartículas de quitosana-bromelina
d) Solubilizar o lioprotetor diretamente na solução de nanopartículas obtidas na etapa (c);
e) A mitura das nanopartículas com lioprotetor obtida na etapa (d) armazenadas em ultrafreezer a temperatura de -80 °C;
f) As nanopartículas congeladas a -80°C, obtidas na etapa (e) foram inseridas no liofilizador com a prateleira ambientada a -45°C e mantidas até atingir a mesma temperatura da prateleira;
g) As nanopartículas da etapa (f) seguem rampa de secagem aumentando-se 5°C da temperatura de -45 °C a +10 °C;
h) Obtenção da composição liofilizada de nanopartículas a base de quitosana contendo bromelina.
Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2 caracterizado pela proporção de quitosana, TPP, bromelina ser de 4:6:1(v/v).
Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2 caracterizado pela agitação nas etapas (a) e (b) serem a 350rpm.
Processo de acordo com as reivindicações 1 e 4 caracterizado pela etapa (b) ter tempo de duração de 40 min.
Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato do lioprotetor ser selecionado dentre pequenas moléculas, como açúcares ou aminoácidos, maltose, glicina, preferencialmente maltose.
Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de na etapa (g) a temperatura ser alterada quando a temperatura da composição atinge a temperatura da prateleira.
Processo de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que na etapa (c) as nanopartículas de quitosana-bromelina apresentam diâmetro médio de 84,5 a 100,9 nm, um índice de polidispersão de 0,18 a 0,23, um potencial zeta de 21,9 a 27,1 mV e uma concentração de partículas na ordem de 1012 partículas/mL.
Processo, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de que adicionalmente na etapa c, a bromelina é encapsulada em nanopartículas de quitosana e apresenta uma eficácia de encapsulação de 83,4 a 97,8% da concentração de proteínas, o que corresponde a uma eficiência de encapsulação de 75,5 a 81,6% da atividade enzimática.
Processo, de acordo com a reivindicações 1 e 2, caracterizado pelo fato de na etapa (d) o lioprotetor estar em uma concentração de 3% (m/v) em relação ao volume da solução de nanopartícula de quitosana-bromelina.
Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que apresenta uma temperatura de colapso que varia de -56°C a -28°C, preferivelmente acima de -40°C, com adição de maltose e glicina, respectivamente.
Composição liofilizada de nanopartículas a base de quitosana contendo bromelina liofilizada obtida pelo processo conforme processo definido nas reivindicações 1 a 11, caracterizada por compreender 0,9% a 1,0% de bromelina, 0,9% a 1,0% de quitosana, 3% de lioprotetor.
Composição de acordo com a reivindicação 12 caracterizada pelo fato do lioprotetor ser selecionado dentre pequenas moléculas, podendo ser açúcares ou aminoácidos como maltose ou glicina, preferencialmente maltose.
Composição de acordo com a reivindicação 12 caracterizada pelo fato de compreender nanopartículas com diâmetro médio de 88,5 e 127,8 nm, , um índice de polidispersão de 0,29 a 0,34, um potencial zeta de 20,0 a 23,2 mV.
Composição de acordo com a reivindicação 12 caracterizada pelo fato de que está na forma de pó liofilizado.
Composição de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que apresenta uma eficiência de encapsulação com maltose de 96,3% a 98,8%, o que equivale a uma atividade enzimática de 73,3 a 99,5%.
Uso da composição obtida conforme definida nas reivindicações de 1 a 11, caracterizada por ser no preparo de um medicamento para tratar feridas.
Uso da composição obtida conforme definida nas reivindicações de 12 a 16, caracterizada por ser no preparo de um medicamento para tratar feridas.