BR102019006579A2 - Formulação farmacêutica e usos da mesma - Google Patents

Abstract

formulação farmacêutica e usos da mesma a presente invenção refere-se a uma formulação farmacêutica contendo óleo essencial de cymbopongon citratus e digluconato de clorexidina para auxiliar na prevenção de formação de biofilme bacteriano, bem como ser aplicada na prevenção de cárie e doença periodontal. a associação proposta permitirá o uso de enxaguatórios bucais por um período de tempo menor, o que poderá reduzir a incidência de efeitos indesejáveis. essa combinação reduziu significativamente não somente a contagem de microrganismos de importância patogênica como também a acidogenicidade dos biofilmes, sendo capaz de manter o ph estável e próximo à neutralidade.

Description

FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA E USOS DA MESMA CAMPO DA INVENÇÃO

[001] O presente pedido se insere no campo da Odontologia, mais precisamente na área de prevenção da formação de biofilme bacteriano e descreve uma formulação farmacêutica contendo óleo essencial de Cymbopongon citratus e digluconato de clorexidina, apresentando ação antimicrobiana para auxiliar na prevenção de formação de biofilme bacteriano.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A prevenção da formação de biofilme é um grande desafio para o controle de duas importantes doenças da cavidade bucal: a cárie e a doença periodontal. Particularmente, a cárie dentária constitui o maior problema de saúde bucal em muitos países industrializados, afetando 60-90% das crianças em idade escolar e a grande maioria dos adultos (World Health Organization, 2010).

[003] Considerando que o principal fator etiológico local da cárie dentária e da doença periodontal é a presença do biofilme dentário, que a remoção mecânica é muitas vezes deficiente em crianças e pacientes com problemas motores e que pacientes com a saúde comprometida podem ter seu estado agravado devido à presença de microorganismos na cavidade bucal, o uso de substâncias antimicrobianas pode auxiliar a controlar a patogenicidade da microflora oral, e a reverter o risco de cárie até que bons hábitos de higiene bucal sejam estabelecidos, o que é particularmente útil em crianças ou pacientes com dificuldades motoras (Pereira et al., 2010).

[004] Entre as substâncias antimicrobianas disponíveis para uso na cavidade bucal, destaca-se a clorexidina, que possui amplo espectro de ação e forte adsorção às superfícies bucais (Zanatta et al., 2007) . Entretanto, tem sido sugerido que a clordexidina possui ação limitada contra biofilmes maduros (Vitkov et al. , 2005; Zanatta et al. , 2007). Portanto, há a necessidade de se desenvolver produtos que potencializem a ação da clorexidina.

[005] Apesar de existir uma grande variedade de produtos disponíveis no mercado, a maioria deles não apresenta atividade antibiofilme testada contra biofilmes polimicrobianos maduros obtidos diretamente da saliva de voluntários. A tecnologia proposta dará ao clínico uma alternativa para potencializar a ação da clorexidina e permitir seu uso em um período de tempo menor, pois além do seu efeito limitado em biofilmes maduros, o uso prolongado dessa substância que oferece diversos efeitos colaterais indesejáveis. Assim, o uso dessa substância é limitado.

[006] Além disso, a grande maioria dos produtos possui álcool em sua formulação, inclusive aqueles que o fabricante informa não possuírem álcool (Rauber et al., 2014). O álcool é utilizado para estabilizar e dissolver os ingredientes ativos, proporcionar uma sensação refrescante, aumentar o prazo de validade e prevenir a contaminação por micro-organismos (Quirynen et al. , 2005) . Entretanto, a presença de álcool na formulação farmacêutica é desaconselhável em crianças, gestantes, lactantes, diabéticos, alcoólatras, pacientes com xerostomia, mucosite ou que estão sob radioterapia de cabeça e pescoço e pacientes imunocomprometidos.

[007] Portanto, há a necessidade de se desenvolver produtos de efetividade comprovada e com poucos efeitos colaterais. Assim, a presente invenção visa adicionar um óleo essencial à um enxaguatório bucal cuja formulação farmacêutica não exigirá a adição de flavorizantes ou de álcool. Ainda, sua eficácia foi testada utilizando biofilmes polimicrobianos obtidos a partir de um pool de microrganismos provenientes da saliva e utilizando um modelo de indução de cárie in vitro. Essas ações são importantes para o estabelecimento de programas preventivos focados nas populações mais suscetíveis, um conceito que vai de encontro com as diretrizes do Sistema Único de Saúde (SUS).

ESTADO DA TÉCNICA

[008] Alguns documentos do estado da técnica sugerem a utilização de Cymbopongon citratus como agente antimicrobiano ou opções de tratamento e prevenção de enfermidades relacionadas à saúde bucal, por exemplo:

[009] O documento WO2016076685 intitulado "PHARMACOLOGICAL COMPOSITION OF CITRONELLA (ESSENTIAL OIL) EXHIBITING AN ANTIBACTERIAL EFFECT ON THE JP2 CLONE OF AGGREGATIBACTER ACTINOMYCETEMCOMITANS" descreve uma composição farmacêutica contendo o óleo essencial de Cymbopongon citratus e sua atividade antibacteriana, porém com outras finalidades de uso e composição distinta.

[010] O documento CN101613249 intitulado "METHOD FOR SIMPLY PREPARING HIGH-PURITY BETA-ELEMENE" descreve um método de obtenção de extratos com alto teor de pureza de plantas tais como Cymbopongon citratus.

[011] O documento US6027716 intitulado "SYNERGISTIC HERBAL EXTRACTS" descreve uma composição farmacêutica a base de óleo de citronela para uso em higiene oral que apresenta atividade antibacteriana.

[012] Os documentos CN104958705 intitulado "TRADITIONAL CHINESE MEDICINE FOR TREATING ORAL ULCER", CN103463487 intitulado "PREPARATION METHOD OF OINTMENT FOR TREATING ORAL ULCER", e CN103405681 intitulado "PREPARATION METHOD OF LOZENGE FOR TREATING ORAL ULCER" descrevem composições farmacêuticas a base de óleo de citronela para uso contra úlceras na cavidade bucal.

[013] O documento CN105943903 intitulado "MEDICINE FOR TREATING TOOTHACHE CAUSED BY DENTAL CARIES' descreve uma composição para tratamento de dor de dente, também à base de óleo de citronela.

[014] O documento WO9844901 intitulado ANTIMICROBIAL AGENTS FOR ORAL HYGIENE PRODUCTS descreve composições farmacêuticas que apresentam como princípio ativo o óleo essencial de citronela e seu correspondente potencial antibacteriano, para tratamento de patologias e higiene oral.

[015] Já o documento JPH07316064 intitulado "SUPPRESSOR FOR CAUSATIVE OF PERIODONTAL DISEASE OR CARIES AND COMPOSITION FOR ORAL CAVITY AND FOOD CONTAINING THE SAME" descreve composição farmacêutica à base de óleo de citronela com uso específico para a supressão do desenvolvimento de placa dental, consequentemente para a prevenção de doenças como periodontite e cárie. Embora apresente princípio ativo e usos similares, sua composição e processo de obtenção diferem do desenvolvido na invenção sob análise.

[016] Assim, percebe-se que que embora os documentos acima citem o composto principal similar ao da presente invenção, e na mesma área de atuação, não propõem nem sugerem a formulação farmacêutica com as características, composições, nem seus usos, conforme proposto aqui. Tratam-se, portanto, de tecnologias distintas daquelas presentes na invenção e que, consequentemente, não prejudicam os critérios de novidade e atividade inventiva da mesma.

SUMARIO DA INVENÇÃO

[017] A presente invenção tem por objetivo propor uma formulação farmacêutica contendo óleo essencial de Cymbopongon citratus e digluconato de clorexidina para auxiliar na prevenção de formação de biofilme bacteriano. A formulação proposta demonstra de forma inédita a potencialização do digluconato de clorexidina através da sua associação com o óleo essencial de Cymbopongon citratus. Adicionalmente, além de superar a ação limitada da clorexidina sobre biofilmes maduros, essa associação permitirá o uso de enxaguatórios bucais por um período de tempo menor, o que poderá reduzir a incidência de efeitos indesejáveis. Essa combinação reduziu significativamente não somente a contagem de microrganismos de importância patogênica como também a acidogenicidade dos biofilmes, sendo capaz de manter o pH estável e próximo à neutralidade. Por meio da adição do óleo essencial à formulação proposta, não será necessário o uso de flavorizantes nem de álcool.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[018] Para obter uma total e completa visualização do objetivo desta invenção, são apresentadas as figuras nas quais se faz referências, conforme segue.

[019] A FIG. 1 apresenta o gráfico da concentração (log UFC/mL) de bactérias anaeróbias acidúricas, estreptococos do grupo mutans e de bactérias anaeróbias totais presentes no biofilme (n= 12; média ± dp). "CHX": digluconato de clorexidina 0,12%; "Óleo essencial": óleo essencial de Cymbopogon citratus; "CHX + óleo essencial": digluconato de clorexidina associado com óleo essencial de C. citratus. As letras distintas demonstram diferenças estatísticas entre os grupos ANOVA, Tukey, p<0,05.

[020] A FIG. 2 apresenta o gráfico mostrando os valores de pH (média ± dp) nos diferentes dias de experimento de acordo com os tratamentos nos meios com sacarose (linhas tracejadas) e sem sacarose (linhas contínuas) (n=12). As letras maiúsculas e minúsculas distintas demonstram diferenças estatísticas entre os grupos para, respectivamente, os meios de cultura com e sem sacarose, independente do período de tempo (Teste de ANOVA + Tukey, p<0,05).

[021] A FIG. 3 apresenta o gráfico mostrando a variação do pH (ΔpH) nos diferentes dias de experimento de acordo com os tratamentos. CHX: tratamento com digluconato de clorexidina 1,2 μL/ml óleo essencial: tratamento com óleo essencial de C. citratus a 31,2 μL/ml; CHX + óleo essencial: associação do digluconato de clorexidina 1,2 μL/ml com o óleo essencial de C. citratus a 31,2 μL/ml.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[022] A presente invenção refere-se a uma formulação farmacêutica contendo óleo essencial de Cymbopongon citratus e digluconato de clorexidina, apresentando ação antimicrobiana para uso odontológico, principalmente para auxiliar na prevenção de formação de biofilme bacteriano. A Tabela 1 abaixo apresenta a forma preferida de concretização da presente invenção, de enxaguatório bucal expondo os componentes, funções e concentrações de cada um deles, entretanto, outras formas de concretização também podem ser utilizadas, como verniz, gel, espuma e dentifrício.

[023] Além do efeito antibacteriano do óleo essencial de Cymbopongon citratus em associação com o digluconato de clorexidina, o referido óleo também atua como flavorizante e não há adição de álcool como excipiente.

[024] Estudos iniciais demonstraram que o óleo essencial de Cymbopongon citratus apresenta atividade antimicrobiana contra um pool de microrganismos provenientes da saliva da ordem de microlitros por mililitro. Esses resultados são interessantes, pois a maioria dos estudos envolvendo cárie e doença periodontal utiliza somente biofilmes de espécie única provenientes de coleção, o que não reflete a virulência clínica desses micro-organismos.

Testes de Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Bactericida Mínima (CBM)

[025] A atividade antimicrobiana inicial do óleo essencial de C. citratrus foi determinada por meio da análise da concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) pela técnica de microdiluição em caldo. Para o teste de concentração inibitória mínima e concentração bactericida mínima, foram utilizados os seguintes microrganismos de referência: a) Colonizadores iniciais: Actinomyces naeslundii ATCC 19039, Streptococcus oralis ATCC 10557, Streptococcus parasanguinis ATCC 903, Streptococcus salivarius ATCC 7073 e Streptococcus mitis ATCC 00456 e b) bactérias de reconhecida cariogenicidade: Lactobacillus acidophilus ATCC 4356 e Streptococcus mutans ATCC 35668. Adicionalmente, um inóculo polimicrobiano obtido a partir da saliva de um voluntário que permaneceu 24 h sem escovar os dentes também foi utilizado.

[026] Culturas de 24 h em ágar BHI desses microrganismos foram utilizados para obtenção de uma suspensão em solução salina contendo 5 x 107 UFC/ml com o auxílio de um espectrofotômetro. As incubações foram realizadas a 37 °C nas seguintes condições: A. naeslundii em anaerobiose por 48 h; L. acidophilus em 5% CO2 por 48 h e Streptococcus spp. em 5% CO2 por 24 h (Brighenti et al., 2014).

[027] Como controle de crescimento, foi utilizado o diluente do óleo essencial (tween 80/água destilada estéril/meio de cultura na proporção 1:1:8 v/v/v). Para fins comparativos da atividade antimicrobiana, foi utilizado um produto comercial contendo digluconato de clorexidina 0,12% ("CHX").

[028] Os óleos essenciais foram diluídos em tween/meio de cultura na proporção 1:1:8 (v/v/v) . Para o teste com as cepas de referência, diluições seriadas de razão dois dos óleos essenciais e do digluconato de clorexidina foram obtidas de modo a serem testadas, respectivamente, concentrações entre 0,1 μΡ/ml e 100 μΡ/ml (v/v) e entre 0,0006 μΡ/ml e 0,6 μΡ/ml.

[029] Em seguida, as suspensões de microrganismos preparadas anteriormente e adicionadas aos poços de placas de 96 poços de forma a obter uma concentração final de 5 x 105 UFC/ml (CLSI, 2012). Os experimentos foram realizados em duplicata.

[030] Para o inóculo polimicrobiano, diluições seriadas de razão dois foram obtidas no caldo McBain com sacarose 1% de modo a serem testadas concentrações entre 0,1 μL/ml e 100 μL/ml (v/v) dos óleos essenciais e entre 0,0006 μL/ml e 0,6 μL/ml (v/v) do digluconato de clorexidina 0,12%. Um volume de 20 μL da saliva coletada foi adicionado em cada poço. Os experimentos foram realizados em duplicata.

[031] Após incubação das placas por 24 h a 37 °C, os poços foram submetidos a uma subcultura em ágar para avaliação da presença de crescimento bacteriano. A CIM foi determinada como a menor concentração capaz de inibir o crescimento e a CBM foi determinada como a menor concentração capaz de inibir 100% o crescimento microbiano.

[032] A média (±dp) da concentração de bactérias anaeróbias totais na saliva doada foi de 1,60 × 106 UFC/mL (± 3,06 × 105), de estreptococos do grupo mutans foi de 3,33 × 102 UFC/mL (± 4,06 × 101) e de bactérias anaeróbicas acidúricas foi de 1,96 × 104 UFC/mL (± 2,78 × 103).

[033] Tanto os óleos essenciais quanto a clorexidina apresentaram atividade antimicrobiana. Para as cepas de referência, os valores de CIM/CBM para o óleo de C. citratus variaram entre 0,20-1,56 μL/mL / 0,40-3,12 μL/mL. (Tabela 2).

[034] Considerando os resultados da CIM e CBM, o óleo essencial de C. citratus apresenta resultados efetivos contra cepas de referência potencialmente cariogênicas.

[035] Considerando o valor obtido da CIM do óleo essencial (3,12 μL/ml) e da CHX (0,080 μL/ml), as concentrações do óleo C. citratus e da CHX avaliadas no teste de carreamento foram de 6,24 μL/ml, 0,62 μL/ml e 0,06 μL/ml e 0,160 μL/ml, 0,016 μL/ml, 0,0001 μL/ml (v/v), respectivamente. Observa-se que as diferenças entre as concentrações testadas foram menores que 1 log (Tabela 3).

Avaliação da capacidade do óleo essencial de C. citratus e de sua associação com clorexidina em interferir na dinâmica da maturação de biofilmes polimicrobianos

[036] Os biofilmes cresceram em lamínulas de vidro (0 13 mm; n=12/grupo) posicionados verticalmente para criar um modelo de adesão ativa (Exterkate et al., 2010).

[037] Para o crescimento dos biofilmes, foi utilizado um modelo de fartura-miséria desenvolvido por van de Sande et al. (2011) com modificações. As lamínulas foram transferidas para placas de 24 poços contendo uma mistura de 0,4 ml do inóculo polimicrobiano (saliva) e 1,8 mL do meio de cultura McBain suplementado com 0,5% de sacarose. Após 6 h de incubação, os biofilmes foram tratados e as lamínulas foram transferidas para o meio McBain sem sacarose por 18 h.

[038] Os tratamentos foram realizados a cada troca de meio de cultura (2x/dia) . Para os tratamentos, as lamínulas foram lavadas por imersão em solução salina 0,9% e imersas em 1,8 mL da solução de tratamento por 1 min. As seguintes soluções de tratamento foram utilizadas: a) Óleo essencial de C. citratus 10x CIM, b) Digluconato de clorexidina 16x CIM, c) Associação do óleo essencial de C. citratus 10x CIM e digluconato de clorexidina 16x CIM ("CHX"); d) Meio McBain sem sacarose (controle negativo).

[039] Após três dias, os biofilmes foram analisados quanto a sua composição microbiológica. Os biofilmes foram dispersos em 2 mL de solução salina 0,9% utilizando ultrassom por 10 s (Cuba de ultrassom 42 kHz). Para a incubação, as amostras foram semeadas em ágar sangue (Exterkate et al.8, 2010), ágar MSBS (Gold et al.11, 1973), e ágar BHI pH 4,7 (Azevedo et al.3, 2014), para isolamento, respectivamente, de bactérias anaeróbias totais, estreptococos do grupo mutans, e bactérias anaeróbias acidúricas, de acordo com a metodologia previamente descrita. Os resultados foram expressos em log UFC/ml.

[040] A acidogenicidade do biofilme foi analisada por meio da aferição do pH após cada troca de meio de cultura, utilizando um eletrodo especifico acoplado a um analisador de íons. A variação no pH (ΔpH) para cada tratamento em cada dia analisado foi calculada de acordo com a seguinte fórmula:
ΔpH = pHsem sacarose — pHcom sacarose .

[041] A média (±dp) da concentração de bactérias anaeróbias totais na saliva doada foi de 5,10 × 106 UFC/mL (± 3,30 × 105) de estreptococos do grupo mutans foi de 3,20 × 104 UFC/mL (± 4,71 × 103) e de bactérias anaeróbicas acidúricas foi de 1,96 × 105 UFC/mL (± 2,78 × 104).

[042] Houve diferença estatisticamente significante entre todos os tratamentos para bactérias anaeróbias acidúricas e bactérias anaeróbias totais (p<0,0001). O grupo que apresentou a menor concentração de bactérias anaeróbias acidúricas e bactérias anaeróbias totais foi o que associou o óleo essencial de C. citratus com a clorexidina. Para estreptococos do grupo mutans, não houve diferenças estatisticamente significantes entre a clorexidina e a associação da clorexidina com o óleo essencial de C. citratus (p=0,5797) (FIG. 1).

[043] Observou-se uma interação significativa entre os fatores tempo e tratamento foi observada para a acidogenicidade dos biofilmes (p<0,0001). Considerando todos os dias do experimento, houve diferenças estatisticamente significantes na acidogenicidade dos biofilmes no meio de cultura sem sacarose para todos os tratamentos (p<0,0001), exceto entre os grupos controle e óleo essencial de C. citratus (p=0,9663). Diferenças estatisticamente significantes entre todos os tratamentos também foram encontradas para a acidogenicidade dos biofilmes em meio de cultura com sacarose (p<0,0001) durante todos os dias analisados. A associação do óleo essencial de C. citratus com a clorexidina foi o tratamento que apresentou os maiores valores de pH do meio de cultura, independente da suplementação ou não com sacarose. Ainda, apenas esse grupo foi capaz de elevar o pH do meio de cultura com sacarose acima do pH 5,5 (FIG. 2).

[044] Os valores mais baixos de variação do pH (ΔpH) foram obtidos com os biofilmes tratados com a associação do óleo essencial de C. citratus e clorexidina a partir do segundo dia de experimento (FIG. 3).

[045] Pela análise dos resultados obtidos, a presente invenção demonstrou de forma inédita a potencialização de um produto comercial a base de digluconato de clorexidina através da sua associação com o óleo essencial de Cymbopogon citratus. Observa-se que além de melhorar a ação da clorexidina sobre os biofilmes maduros, essa associação é capaz de diminuir a composição microbiológica, a acidogenicidade e a viabilidade de biofilmes polimicrobianos, permitindo assim, o uso de enxaguatórios bucais por um período de tempo menor, o que poderá reduzir a incidência de efeitos indesejáveis.

[046] A formulação farmacêutica desenvolvida na presente invenção poderá ser aplicada na prevenção de cárie e doença periodontal. Além disso, não há no mercado um enxaguatório bucal que potencialize a ação do digluconato de clorexidina através da combinação com óleo essencial. Os resultados obtidos com o exaguatório foram promissores, com a redução significativa do biofilme e com a manutenção do pH neutro.

[047] A tecnologia desenvolvida permite prevenir a formação de biofilme dentário patogênico na presença de um alto desafio cariogênico. Além disso, o enxaguatório proposto é indicado principalmente para pacientes de alto risco refratários ao controle mecânico do biofilme dentário. Por não possuir álcool em sua composição, pode ser utilizado por crianças, gestantes, lactantes, diabéticos, pacientes com xerostomia, pacientes com mucosite ou que estão sob radioterapia de cabeça e pescoço, pacientes imunocomprometidos, entre outros.

[048] Embora a invenção tenha sido amplamente descrita, é óbvio para aqueles versados na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas visando aprimoramento do projeto sem que as referidas alterações não estejam cobertas pelo escopo da invenção.

Claims (16)

1. Formulação farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender:

   • - de 0,03 a 10% do princípio ativo;
   • - 0,05 a 2% de um antibacteriano;
   • - de 60 a 80% de veículo;
   • - de 10 a 20% de veículo/umectante;
   • - de 0,5 a 3% de solubilizante;
   • - de 0,5 a 3% de tensoativo;
   • - de 0,05 a 0,5% de aromatizador/flavorizante;
   • - de 0,1 a 0,5% de conservante;
   • - de 0,02 a 0,2% de tampão 1;
   • - de 0,01 a 0,2% de tampão 2;
   • - de 0,001 a 0,005% de corante;
   • - de 0,05 a 0,1% de edulcorante; e
   • - de 0,1 a 1,0% de formador de filme.
2. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o princípio ativo compreender o óleo essencial de Cymbopongon citratus.
3. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o antibacteriano compreender o digluconato de clorexidina.
4. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o veículo ser água destilada.
5. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o umectante ser a glicerina.
6. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o solubilizante ser o óleo de mamona hidrogenado.
7. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o tensoativo ser a cocoamidopropilbetaína.
8. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o aromatizador/flavorizante ser principalmente menta e hortelã.
9. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o conservante ser o metilparabeno.
10. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o tampão 1 ser o Fosfato monobásico de sódio monohidratado e o tampão 2 ser o Fosfato dibásico de sódio anidro.
11. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o corante ser principalmente azul e verde.
12. Formulação, de acordo com a reivindicação 1,caracterizada pelo fato de o edulcorante ser a sacarina.
13. Formulação, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de o formador de filme ser polivinilpirrolidona.
14. Formulação farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de ser preferencialmente um enxaguatório bucal, e opcionalmente verniz, gel, espuma e dentifrício.
15. Uso da formulação farmacêutica conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de ser para auxiliar na prevenção de formação de biofilme bacteriano.
16. Uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de ser ainda para a prevenção de caries e doença periodontal.

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