BR102018072522A2 - APPLICATION OF SOPHOROLIPID FOR REDUCING THE CONTAMINATION OF MESOPHILE AEROBIC IN CHICKEN CUTS - Google Patents
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- A01N25/30—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators, characterised by their forms, or by their non-active ingredients or by their methods of application, e.g. seed treatment or sequential application; Substances for reducing the noxious effect of the active ingredients to organisms other than pests characterised by the surfactants
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Abstract
a invenção tem como objetivo a avaliação da atividade antibacteriana de soforolipídios, produzidos por espécie de candida, em aeróbios mesófilos em cortes de frango. o soforolipídio produzido foi liofilizado e os testes conduzidos em triplicada. o experimento consistiu na imersão de 100 g de peito de frango, cortado em quadrados de 2 cm e imersos em 500 ml de solução com diferentes concentrações de soforolipídios (500, 2.250 e 4.000 µg/ml em etanol 45% (v/v), em diferentes tempos de tratamentos (30, 60 e 90 minutos). foi utilizado como padrão, a imersão em água de torneira e tratamento com apenas etanol 45%, nos mesmos tempos indicados. os cortes de frango foram armazenados em sacos plásticos estéreis e as análises microbiológicas realizadas por contagem de unidades formadoras de colônias utilizando sistema petrifilm (3m). os resultados demonstraram que a utilização de soforolipídio no controle da população de mesófilos aeróbios foi eficaz. o aumento da concentração de soforolipídios reduziu o crescimento dos mesófilos em 10%, 41% e 72% com 500, 2.250 e 4.000 g/ml, respectivamente, demonstrando ser um eficiente sanitizante não tóxico. assim, a possibilidade de aplicação deste composto no processo de abate de aves para o controle de mesófilos pode ser de grande relevância.the invention aims to evaluate the antibacterial activity of soforolipids, produced by candida species, in mesophilic aerobes in chicken cuts. the soforolipid produced was lyophilized and the tests conducted in triplicate. the experiment consisted of immersing 100 g of chicken breast, cut into 2 cm squares and immersed in 500 ml of solution with different concentrations of soforolipids (500, 2,250 and 4,000 µg / ml in 45% (v / v) ethanol), at different treatment times (30, 60 and 90 minutes), immersion in tap water and treatment with only 45% ethanol was used as standard, at the same times indicated, the chicken cuts were stored in sterile plastic bags and the microbiological analyzes performed by counting colony-forming units using the petrifilm system (3m) .the results demonstrated that the use of soforolipid in controlling the aerobic mesophilic population was effective.The increase in the concentration of soforolipids reduced mesophilic growth by 10%, 41% and 72% with 500, 2,250 and 4,000 g / ml, respectively, proving to be an efficient non-toxic sanitizer, thus the possibility of applying this compound in the poultry slaughter process for control mesophiles can be of great relevance.
Description
APLICAÇÃO DE SOFOROLIPÍDIO PARA REDUÇÃO DE CONTAMINAÇÃO DE AERÓBIOS MESÓFILOS EM CORTES DE FRANGOAPPLICATION OF SOPHOROLIPID FOR REDUCING THE CONTAMINATION OF MESOPHY AEROBIC IN CHICKEN CUTS
Campo da InvençãoField of the Invention
[001] A presente invenção baseia-se na aplicação e avaliação dos soforolipídios produzidos por uma espécie de Candida, em cortes de frango para a redução da população microbiana de aeróbios mesófilos, que são os principais indicativos de contaminação na indústria de frango. A levedura utilizada não possui patogenicidade e os soforolipídios são metabólitos secundários que apresentam denominação GRAS (Generally Recognized As Safe), atestando sua segurança para saúde humana e animal. Além disso, o biossurfactante, soforolipídio, é reconhecido por suas atividades antimicrobianas, comprovadas em estudos recentes, o que os torna um agente potencial para utilização na indústria alimentícia, no combate de microrganismos deteriorantes e patogênicos, reduzindo as perdas industriais por contaminação e aumentando a produção.[001] The present invention is based on the application and evaluation of the soforolipids produced by a species of Candida, in chicken cuts to reduce the microbial population of mesophilic aerobes, which are the main indicators of contamination in the chicken industry. The yeast used has no pathogenicity and soforolipids are secondary metabolites that have the name GRAS (Generally Recognized As Safe), attesting to their safety for human and animal health. In addition, the biosurfactant, soforolipid, is recognized for its antimicrobial activities, proven in recent studies, which makes them a potential agent for use in the food industry, in combating deteriorating and pathogenic microorganisms, reducing industrial losses due to contamination and increasing the production.
[002] A aplicação desse biossurfactante produzido pela espécie de Candida é um antimicrobiano natural, e pode ser aplicado no combate de bactérias aeróbias mesófilos, encontrados em cortes de frango, para a redução do número de células viáveis destes microrganismos, os quais são indicativos de contaminação na carne de frango, objetivando uma maior shelf-life e uma melhor qualidade microbiológica. Assim a aplicação de soforolipídios é uma iniciativa inovadora que pode auxiliar na indicação e na redução da contaminação, que causa grandes perdas econômicas no setor avícola.[002] The application of this biosurfactant produced by the Candida species is a natural antimicrobial, and can be applied to combat aerobic mesophilic bacteria, found in chicken cuts, to reduce the number of viable cells of these microorganisms, which are indicative of contamination in chicken meat, aiming at a longer shelf-life and a better microbiological quality. Thus, the application of soforolipids is an innovative initiative that can assist in indicating and reducing contamination, which causes great economic losses in the poultry sector.
[003] Considerando que a indústria avícola apresenta perda econômica significativa devido a contaminações durante o processo de abate das aves, e as soluções encontradas atualmente para combater esse tipo de perdas não tem demonstrado segurança alimentar e eficácia, a busca por alternativas de descontaminação em carne de frango está sendo pesquisada, visando uma aplicação em escala industrial.[003] Considering that the poultry industry presents significant economic loss due to contamination during the process of slaughtering birds, and the solutions currently found to combat this type of loss have not demonstrated food security and effectiveness, the search for meat decontamination alternatives of chicken is being researched, aiming at an industrial scale application.
Petição 870190016627, de 19/02/2019, pág. 5/16Petition 870190016627, of 02/19/2019, p. 5/16
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Antecedentes da InvençãoBackground of the Invention
[004] De acordo com os Relatórios Anuais da Associação Brasileira de Proteína Animal, em 2018, o setor avícola no Brasil apresenta um grande impacto social e econômico no país, ocupando o primeiro lugar no ranking mundial de exportações de carne de frango, além de apresentar constantes índices de crescimento na produção mundial. Em contrapartida com esse cenário de crescimento econômico, encontra-se também um aumento no risco de contaminações e preocupação com a transmissão de patógenos, assim como a necessidade de um maior controle da qualidade higiênico e sanitário dos produtos.[004] According to the Annual Reports of the Brazilian Animal Protein Association, in 2018, the poultry sector in Brazil has a great social and economic impact in the country, occupying the first place in the world ranking of chicken meat exports, in addition to present constant growth rates in world production. In contrast to this scenario of economic growth, there is also an increase in the risk of contamination and concern with the transmission of pathogens, as well as the need for greater control of the hygienic and sanitary quality of products.
[005] Para Silva (1998), no livro Higiene Alimentar, os alimentos de origem animal, com destaque para as aves, são os maiores responsáveis pela disseminação de microrganismos causadores de toxinfecções alimentares. Os principais microrganismos encontrados em carne de frango são Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Escherichia coli enteropatôgenica e Staphylococcus aureus. A segurança e qualidade dos alimentos, como a carne in natura, pode ser estimada pela contagem de microrganismos indicadores, tais como microrganismos aeróbios mesófilos (AM), coliformes totais (CT), E. coli (EC) e microrganismos psicrotróficos (PC).[005] For Silva (1998), in the book Food Hygiene, foods of animal origin, with emphasis on birds, are the main responsible for the spread of microorganisms that cause food toxinfections. The main microorganisms found in chicken meat are Salmonella spp., Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, enteropathogenic Escherichia coli and Staphylococcus aureus. Food safety and quality, such as fresh meat, can be estimated by counting indicator microorganisms, such as aerobic mesophilic microorganisms (AM), total coliforms (CT), E. coli (EC) and psychrotrophic microorganisms (PC).
[006] A contagem de bactérias aeróbias mesófilas (AM) tem sido usada como indicador de qualidade, determinando se a limpeza, a desinfecção e o controle de temperaturas durante os processos industriais foram realizados de forma adequada, além de fornecer informações sobre a vida útil do produto. Níveis de contaminação por aeróbias mesófilos de 102 a 105 UFC/cm2 em carnes podem indicar condições higiênicas adequadas no abate, já contagens entre 105 e 106 UFC/cm2 podem significar início do processo de deterioração e comprometimento da vida de prateleira. Segundo Gill (1998), no livro The Microbiology of Meat and Poultry, e Franco (2002), no texto Microbiologia dos alimentos, com contagens iguais ou superiores a 107 UFC/cm2 limosidade já pode ser evidenciada.[006] The count of aerobic mesophilic bacteria (AM) has been used as a quality indicator, determining whether cleaning, disinfection and temperature control during industrial processes have been carried out properly, in addition to providing information on the useful life of product. Levels of contamination by aerobic mesophiles from 102 to 105 CFU / cm2 in meat can indicate adequate hygienic conditions at slaughter, whereas counts between 105 and 106 CFU / cm2 can mean the beginning of the deterioration process and compromise of the shelf life. According to Gill (1998), in the book The Microbiology of Meat and Poultry, and Franco (2002), in the text Microbiology of food, with counts equal to or greater than 107 CFU / cm2 limosity can already be evidenced.
Petição 870190016627, de 19/02/2019, pág. 6/16Petition 870190016627, of 02/19/2019, p. 6/16
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[007] Apesar da legislação atual não estabelecer limites para AM, as contagens podem sugerir se houve deficiência no processamento do abate. Pesquisas apontam que o uso de agentes sanitizantes na lavagem de carcaças de frango são capazes de reduzir os riscos de contaminação, contudo, a legislação brasileira atual permite somente a lavagem das carcaças com água clorada, sem a utilização de qualquer tipo de antimicrobiano, de acordo com a Resolução RDC n° 4, de 4 de Outubro de 2011 do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento.[007] Although the current legislation does not establish limits for AM, the counts can suggest if there was a deficiency in the processing of the slaughter. Research points out that the use of sanitizing agents in the washing of chicken carcasses is capable of reducing the risks of contamination, however, the current Brazilian legislation allows only the washing of carcasses with chlorinated water, without the use of any type of antimicrobial, according to with Resolution RDC No. 4, of October 4, 2011 from the Ministry of Agriculture, Livestock and Supply.
[008] Dessa forma, estudos com o intuito de buscar inovação no desenvolvimento e aplicação de novos sanitizantes ou produtos similares, sem patogenicidade e com capacidade de reduzir a contaminação microbiológica, são fundamentais para atrair a atenção dos órgãos de regulamentação do Brasil sobre a necessidade, de mudanças e adesão de novos procedimentos para diminuição dos prejuízos na produção de frangos. Assim, pesquisas sobre novos agentes antimicrobianos naturais, tais como os soforolipídios, são de grande relevância para a tentativa de melhorias no produto, tanto na questão de redução da carga microbiológica e aumento da vida de prateleira, como também a redução dos custos de produção.[008] Thus, studies aiming to seek innovation in the development and application of new sanitizers or similar products, without pathogenicity and with the capacity to reduce microbiological contamination, are essential to attract the attention of Brazilian regulatory bodies about the need , changes and adherence to new procedures to reduce losses in chicken production. Thus, research on new natural antimicrobial agents, such as soforolipids, is of great relevance for trying to improve the product, both in terms of reducing the microbiological load and increasing the shelf life, as well as reducing production costs.
[009] Diversos estudos têm sido direcionados na busca de novos agentes sanitizantes e antimicrobianos, no entanto, no Brasil ainda não é permitida a utilização de qualquer adjunto ou composto descontaminante no processamento de abate das aves, sendo utilizado somente cloração da água de no máximo 1 ppm de cloro livre e a água de renovação dos resfriadores até 5 ppm, segundo a Portaria n° 210, de 10 de novembro de 1998, que trata de Regulamento Técnico da Inspeção Tecnológica e higiênico Sanitária de Carnes de Aves. Vários tipos de intervenções vêm sendo estudadas, especialmente no exterior, sendo alguns já aplicados na rotina dos abatedouros. Porém, todos esses tratamentos possuem vantagens e desvantagens.[009] Several studies have been directed in the search for new sanitizing and antimicrobial agents, however, in Brazil it is still not allowed to use any adjunct or decontaminating compound in the processing of poultry slaughter, being used only water chlorination of at most 1 ppm of free chlorine and the cooling water of the coolers up to 5 ppm, according to Ordinance No. 210, of November 10, 1998, which deals with the Technical Regulation of the Technological and Sanitary Inspection of Poultry Meat. Various types of interventions have been studied, especially abroad, with some already applied in the slaughterhouse routine. However, all of these treatments have advantages and disadvantages.
Petição 870190016627, de 19/02/2019, pág. 7/16Petition 870190016627, of 02/19/2019, p. 7/16
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[010] Algumas práticas descritas na literatura são o refile, lavagem de carcaças, rinsagem com água quente, pasteurização por vapor, cloro e derivados, ácidos orgânicos (lático, acético, cítrico, fumárico), sorbatos e benzoatos, fosfato trisódico (TSP), bactericidas (nisina), culturas starter (lactobacilli e lactococci), peróxido de hidrogênio, ozônio, pressão hidrostática, irradiação gama, eletricidade por campo pulsado, energia ultrassônica e luz Ultra-Violeta.[010] Some practices described in the literature are refining, carcass washing, hot water rinsing, pasteurization by steam, chlorine and derivatives, organic acids (lactic, acetic, citric, fumaric), sorbates and benzoates, trisodium phosphate (TSP) , bactericides (nisin), starter cultures (lactobacilli and lactococci), hydrogen peroxide, ozone, hydrostatic pressure, gamma irradiation, pulsed field electricity, ultrasonic energy and Ultra-Violet light.
[011] Nos Estados Unidos e na União Europeia, a utilização de produtos químicos em carcaças de aves ou de bovinos é permitida, tais como o hipoclorito de sódio, o ozônio e o ácido lático. A legislação americana permite o uso de concentrações superiores a 20 ppm de cloro na água comum e 50 ppm na água do chiller; soluções de até 5% de ácido lático para uso em carcaças de frango após o pré-resfriamento; e utilização de ozônio para todos os produtos de carne de frango. Já a comunidade europeia regulamenta o uso de solução de ácido láctico, de 2 a 5%, por pulverização ou nebulização; e níveis de cloração de até 5 ppm de cloro livre na água de refrigeração do chiller.[011] In the United States and the European Union, the use of chemicals in poultry or beef carcasses is permitted, such as sodium hypochlorite, ozone and lactic acid. American law allows the use of concentrations greater than 20 ppm of chlorine in ordinary water and 50 ppm in chiller water; solutions of up to 5% lactic acid for use in chicken carcasses after pre-cooling; and use of ozone for all chicken meat products. The European community, on the other hand, regulates the use of lactic acid solution, from 2 to 5%, by spraying or nebulization; and chlorination levels of up to 5 ppm of free chlorine in the chiller cooling water.
[012] Apesar de o uso desses sanitizantes na indústria de carne de aves estar regulamentado, poucos estudos são realizados a respeito dos efeitos do seu uso sobre as características de qualidade da carne. Sabe-se que a exposição prolongada ao gás ozônio em concentrações mínimas de 1 ppm pode provocar dores de cabeça e irritação no sistema respiratório humano, segundo a National Research Council (NRC, 1995). De acordo com Toldrá (2009), no texto Safety of meat and processed meat, em relação ao uso de ácidos orgânicos, uma potencial desvantagem é a possível descoloração temporária ou permanente da carne de frango, dependendo da concentração, da duração e da temperatura de aplicação.[012] Although the use of these sanitizers in the poultry meat industry is regulated, few studies are conducted regarding the effects of their use on meat quality characteristics. It is known that prolonged exposure to ozone gas in concentrations as low as 1 ppm can cause headaches and irritation in the human respiratory system, according to the National Research Council (NRC, 1995). According to Toldrá (2009), in the text Safety of meat and processed meat, in relation to the use of organic acids, a potential disadvantage is the possible temporary or permanent discoloration of chicken meat, depending on the concentration, duration and temperature of application.
Petição 870190016627, de 19/02/2019, pág. 8/16Petition 870190016627, of 02/19/2019, p. 8/16
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[013] Para Morshedy e Sallam (2009), no artigo Improving the microbial quality and shelf life of chicken carcasses by trisodium phosphate and lactic dipping, o uso de TSP apresenta eficiência específica para bactérias da família Enterobacteriaceae e pouco efeito para outras bactérias psicotróficas, havendo a necessidade de utilização de vários agentes para uma redução mais eficiente dos microrganismos da superfície das carcaças.[013] For Morshedy and Sallam (2009), in the article Improving the microbial quality and shelf life of chicken carcasses by trisodium phosphate and lactic dipping, the use of TSP has specific efficiency for bacteria of the Enterobacteriaceae family and little effect for other psychotrophic bacteria, with the need to use several agents for a more efficient reduction of microorganisms on the surface of the carcasses.
[014] Dentre os sanitizantes mencionados, o cloro é um dos agentes mais utilizados nos processos de descontaminação de carcaças, tendo seu efeito comprovado em diversas pesquisas. Em contrapartida, a utilização de hipoclorito de sódio é limitada quando a carne se destina à exportação para União Europeia (UE), pois este mercado tolera a utilização de cloro a no máximo 5 ppm devido a possibilidade da oxidação do cloro produzir agentes cancerígenos. Segundo Russel (2007), em Chlorine: Still the Most Popular Sanitizer in the Poultry Industry, do mesmo modo, a utilização da lavagem das carcaças com água ativada eletroquimicamente ou água eletrolisada é limitada, pois possui alta concentração de ácido hipocloroso.[014] Among the mentioned sanitizers, chlorine is one of the most used agents in the decontamination processes of carcasses, having its effect proven in several researches. In contrast, the use of sodium hypochlorite is limited when the meat is intended for export to the European Union (EU), as this market tolerates the use of chlorine at a maximum of 5 ppm due to the possibility of chlorine oxidation to produce carcinogens. According to Russel (2007), in Chlorine: Still the Most Popular Sanitizer in the Poultry Industry, likewise, the use of washing carcasses with electrochemically activated water or electrolyzed water is limited, as it has a high concentration of hypochlorous acid.
[015] De acordo com Ashby e Solaiman (2010), no artigo The influence of increasing media methanol concentration on sophorolipid biosynthesis from glycerol-based feedstocks, os soforolipídios são biossurfactantes compostos por um dissacarídeo de soforose unidos a uma cadeia de ácido graxo. Para Makkar, Cameotra e Banat (2011), no artigo Advances in utilization of renewable substrates for biosurfactant production, e Nitschke e Pastore (2002), no artigo Biossurfactantes: Propriedades e aplicações, os soforoliídeos possuem inúmeras vantagens frente aos compostos sintéticos, como biodegradabilidade e natureza ecológica, baixa toxicidade, alta seletividade devido a presença de grupos funcionais específicos e eficiência de operação em condições ambientais extremas de temperatura, pH e salinidade, o que os torna adequados para uma ampla gama de aplicações industriais.[015] According to Ashby and Solaiman (2010), in the article The influence of increasing media methanol concentration on sophorolipid biosynthesis from glycerol-based feedstocks, soforolipids are biosurfactants composed of a disaccharide of sophorosis attached to a fatty acid chain. For Makkar, Cameotra and Banat (2011), in the article Advances in use of renewable substrates for biosurfactant production, and Nitschke and Pastore (2002), in the article Biosurfactants: Properties and applications, soforoliides have numerous advantages over synthetic compounds, such as biodegradability and ecological nature, low toxicity, high selectivity due to the presence of specific functional groups and operating efficiency under extreme environmental conditions of temperature, pH and salinity, which makes them suitable for a wide range of industrial applications.
Petição 870190016627, de 19/02/2019, pág. 9/16Petition 870190016627, of 02/19/2019, p. 9/16
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[016] As propriedades antimicrobianas dos soforolipídios estão intimamente relacionadas com sua estrutura química formada, que podem ser divididas em dois grupos principais, as formas acídicas e lactônicas. Apesar de uma melhor ação das formas lactônicas, os soforolipídios são eficazes como agente bactericida independentemente de seu conteúdo acídico/lactônico, capaz de induzir a morte de células planctônicas e biofilmes, sendo comparável aos antimicrobianos convencionais.[016] The antimicrobial properties of soforolipids are closely related to their chemical structure, which can be divided into two main groups, acidic and lactonic forms. Despite a better action of lactonic forms, soforolipids are effective as a bactericidal agent regardless of their acidic / lactonic content, capable of inducing the death of planktonic cells and biofilms, being comparable to conventional antimicrobials.
[017] Os soforolipídios não apresentam citotoxicidade e seus produtos são considerados aceitos e aprovados pela FDA (Food and Drug Administration), comprovando sua segurança para a saúde humana e animal. Atualmente, são os biossurfactantes mais aplicados na indústria e seus produtos são disponíveis em nível comercial.[017] Soforolipids do not present cytotoxicity and their products are considered accepted and approved by the FDA (Food and Drug Administration), proving their safety for human and animal health. Currently, they are the most applied biosurfactants in the industry and their products are available on a commercial level.
[018] Diversos resultados na literatura mostram seu grande potencial como agente antimicrobiano alternativo no combate de microrganismos patogênicos. Já foram comprovadas ações para bactérias de extrema importância no controle higiênico sanitário das indústrias de alimentos, tanto Gram-positivas como Gram-negativas, como Staphyloccocus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Listeria Monocytogenes, Escherichia coli, Salmonela spp. e Salmonela typhimurium, entre outras.[018] Several results in the literature show its great potential as an alternative antimicrobial agent in the fight against pathogenic microorganisms. Actions for extremely important bacteria in the sanitary hygienic control of the food industries, both Gram-positive and Gram-negative, such as Staphyloccocus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Listeria Monocytogenes, Escherichia coli, Salmonela spp. and Salmonela typhimurium, among others.
[019] As atividades antimicrobianas dos soforolipídios envolvem mecanismos de desestabilização e alteração da permeação da membrana celular, o que leva a ruptura e extravasamento do conteúdo celular.[019] The antimicrobial activities of soforolipids involve mechanisms of destabilization and alteration of cell membrane permeation, which leads to rupture and leakage of cell content.
[020] Considerando a importância do desenvolvimento de novas estratégias e agentes para o controle de microrganismos deteriorantes e patogênicos, os soforolipídios podem ser vistos como os biossurfactantes mais vantajosos nesta perspectiva. Apesar dessa potencial ação bem elucidada, a ação desse composto em produtos alimentares de origem animal nunca foi testada.[020] Considering the importance of developing new strategies and agents for the control of deteriorating and pathogenic microorganisms, soforolipids can be seen as the most advantageous biosurfactants in this perspective. Despite this well-elucidated potential action, the action of this compound in food products of animal origin has never been tested.
Petição 870190016627, de 19/02/2019, pág. 10/16Petition 870190016627, of 02/19/2019, p. 10/16
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[021] Dessa forma, a presente invenção tem como objetivo avaliar, de forma pioneira, a ação do soforolipídio “in vivo”, na população de aeróbios mesófilos totais presentes na carne de peito de frango, utilizando esses microrganismos como indicadores de qualidade de processo e vida útil do produto.[021] Thus, the present invention aims to evaluate, in a pioneering way, the action of soforolipid “in vivo”, in the population of total mesophilic aerobes present in chicken breast meat, using these microorganisms as indicators of process quality and product life.
[022] Diante do exposto, a utilização desse biossurfactante, na redução de contaminação microbiológica em carne de frango é extremamente promissora para as indústrias avícolas do Brasil, visto a importância do controle microbiológico, não apenas para a saúde pública, mas também para os órgãos de regulamentação, promovendo a adoção de novas metodologias, afim de diminuir prejuízos no setor avícola.[022] In view of the above, the use of this biosurfactant to reduce microbiological contamination in chicken meat is extremely promising for the poultry industries in Brazil, given the importance of microbiological control, not only for public health, but also for the organs regulations, promoting the adoption of new methodologies, in order to reduce losses in the poultry sector.
[023] A patente CN 105191941, “Biocide solution containing sophorolipids and Its Application”, descreve a aplicação de uma solução de soforolípidios como biocida para as bactérias Escherichia coli, Salmonella e Listeria. Os autores obtiveram resultados eficazes, porém não foi realizado em mesófilos e nem diretamente na carne de frango.[023] The patent CN 105191941, "Biocide solution containing sophorolipids and Its Application", describes the application of a solution of soforolipids as a biocide for the bacteria Escherichia coli, Salmonella and Listeria. The authors obtained effective results, but it was not carried out on mesophiles or directly on chicken meat.
[024] A patente BR 10 2012 023115-8, “Obtenção de um biossurfactante produzido por Candida guilliermondii”, descreve apenas a produção de biossurfactantes por Candida guilliermondii em um meio constituído por óleo vegetal residual de fritura, resíduo da cana-de-açúcar e resíduos de refinaria de milho. Trata-se de outro microrganismo, diferente meio de produção e não descreve nenhuma aplicação para a indústria avícola.[024] The patent BR 10 2012 023115-8, “Obtaining a biosurfactant produced by Candida guilliermondii”, describes only the production of biosurfactants by Candida guilliermondii in a medium consisting of residual vegetable oil from frying, sugar cane residue and corn refinery waste. It is another microorganism, different means of production and does not describe any application for the poultry industry.
[025] A patente BR 11 2012 007570-5, “Emprego de soforolipídeos e seus derivados em combinação com pesticidas como adjuvante/aditivo para a proteção de plantas e para o âmbito industrial noncrop”, refere-se ao emprego de soforolipídios como adjuvantes em combinação com pesticidas como aditivo e formulação para produção de plantas e para o âmbito industrial noncrop. Portanto, é um processo para uso em plantas e não utiliza microrganismos contaminantes da carne de frango, apenas em plantas.[025] The patent BR 11 2012 007570-5, “Use of soforolipids and their derivatives in combination with pesticides as an adjuvant / additive for plant protection and for the noncrop industrial scope”, refers to the use of soforolipids as adjuvants in combination with pesticides as an additive and formulation for plant production and for the noncrop industry. Therefore, it is a process for use in plants and does not use contaminating microorganisms from chicken meat, only in plants.
Petição 870190016627, de 19/02/2019, pág. 11/16Petition 870190016627, of 02/19/2019, p. 11/16
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[026] A patente US 20130142855, “Modified sophorolipids combinations as antimicrobial agentes”, descreve a utilização de soforolipídios e seus derivados como agente antimicrobiano. Não descreve a produção para aplicação em carne de frango ou patógenos da área avícola.[026] US patent 20130142855, "Modified sophorolipids combinations as antimicrobial agents", describes the use of soforolipids and their derivatives as an antimicrobial agent. It does not describe production for application on chicken meat or pathogens in the poultry area.
[027] A patente US 20150094273 e WO 2004044216, “Pharmaceutical composition comprising sophorolipid in combination with an antibiotic e Antimicrobial properties of various forms of sophorolipids”, descreve a caracterização estrutural dos soforolipídios e o sinergismo farmacêutico de antibióticos com soforolipídios para acentuar a transferência da substância pela membrana. São patentes de caracterização das estruturas para aplicação como agente antimicrobiano na área da saúde. Não são patentes direcionadas para a área de contaminação na indústria avícola, não descrevem nenhuma informação sobre a ação dos soforolipídios contra os mesófilos aqui estudados, que são os principais indicadores da qualidade do processo da indústria avícola.[027] US patent 20150094273 and WO 2004044216, “Pharmaceutical composition comprising sophorolipid in combination with an antibiotic and Antimicrobial properties of various forms of sophorolipids”, describes the structural characterization of soforolipids and the pharmaceutical synergism of antibiotics with soforolipids to enhance the transfer of soforolipids substance through the membrane. They are patents for the characterization of structures for application as an antimicrobial agent in the health field. They are not patents directed to the area of contamination in the poultry industry, they do not describe any information about the action of the soforolipids against the mesophiles studied here, which are the main indicators of the quality of the poultry industry process.
[028] A patente CN 105191941, “Bactericide solution containing sophorolipid and application thereof”, descreve uma solução bactericida contendo soforolipídeos para bactérias Escherichia coli, Salmonellas e Listeria. Demonstrando que essa solução bactericida é de fácil preparação e demonstrou ser um bom bactericida para essas cepas. Essa patente não faz uso para a indústria avícola, não descreve nenhuma informação sobre a ação dos soforolipídios contra os mesófilos aqui estudados, que são os principais indicadores da qualidade do processo da indústria avícola.[028] The patent CN 105191941, “Bactericide solution containing sophorolipid and application thereof”, describes a bactericidal solution containing soforolipids for Escherichia coli, Salmonellas and Listeria bacteria. Demonstrating that this bactericidal solution is easy to prepare and proved to be a good bactericide for these strains. This patent does not make use for the poultry industry, it does not describe any information about the action of the soforolipids against the mesophiles studied here, which are the main indicators of the quality of the poultry industry process.
[029] Considerando a ampla busca no estado da técnica sobre a aplicação de soforolipídios como agente sanitizante na indústria avícola, conclui-se que não foram encontradas patentes sobre aplicação de soforolipídios em carne de frango. Sendo assim, essa invenção propõe uma nova perspectiva na redução de contaminantes microbianos na carne de frango, aumentando a qualidade do produto bem como o rendimento da produção industrial.[029] Considering the wide search in the state of the art on the application of soforolipids as a sanitizing agent in the poultry industry, it is concluded that no patents on the application of soforolipids in chicken meat were found. Thus, this invention proposes a new perspective in the reduction of microbial contaminants in chicken meat, increasing the quality of the product as well as the yield of industrial production.
Petição 870190016627, de 19/02/2019, pág. 12/16Petition 870190016627, of 02/19/2019, p. 12/16
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Sumário da InvençãoSummary of the Invention
[030] A presente invenção descreve a aplicação e avaliação dos soforolipídios produzidos por uma espécie de Candida, em cortes de frango para a redução da população microbiana de aeróbios mesófilos, que são os principais indicativos de contaminação na indústria de frango.[030] The present invention describes the application and evaluation of soforolipids produced by a Candida species, in chicken cuts to reduce the microbial population of mesophilic aerobes, which are the main indicators of contamination in the chicken industry.
Descrição Detalhada da InvençãoDetailed Description of the Invention
[031] As etapas da invenção foram a produção e extração do soforolipídio de uma espécie de Candida; aplicação de diferentes concentrações de soforolipídio em teste de imersão com pedaços de peito de frango e análise microbiológica da influência na população de aeróbios mesófilos por sistema Petrifilm.[031] The steps of the invention were the production and extraction of the soforolipid from a species of Candida; application of different concentrations of soforolipid in an immersion test with pieces of chicken breast and microbiological analysis of the influence on the population of mesophilic aerobes by the Petrifilm system.
[032] ETAPA A - A produção do soforolipídio (FIG 1) foi realizada por uma levedura do gênero Candida em meio de fermentação inicial contendo em (gL1): glicose, 77,5; ácido oleico, 75; extrato de levedura 2,5. Seguido de adições de 20 gL-1 de ácido oleico a cada 48h e porção única de 90 gL-1 de glicose quando a biomassa atingiu seu máximo (estimado por leitura λ= 600 nm). A Candida foi cultivada em biorreator de bancada (5L) com volume operacional de 3,5L, pH controlado em 3,5, 450 rpm, 30 °C por 288h. O cultivo foi centrifugado e do sobrenadante obtido a fração do soforolipídio. O processo de extração do biossurfactante consistiu na lavagem da biomassa com acetato de etila (3x), rotaevaporação e extração com solução metanol:água (4:1) e hexano. Após a obtenção da fração do soforolipídio, o mesmo foi liofilizado.[032] STEP A - Soforolipid production (FIG 1) was carried out by a yeast of the genus Candida in an initial fermentation medium containing in (gL 1 ): glucose, 77.5; oleic acid, 75; yeast extract 2.5. Followed by additions of 20 gL -1 of oleic acid every 48 hours and a single portion of 90 gL -1 of glucose when the biomass reached its maximum (estimated by reading λ = 600 nm). Candida was grown in a bench-top bioreactor (5L) with an operating volume of 3.5L, pH controlled at 3.5, 450 rpm, 30 ° C for 288h. The culture was centrifuged and the supernatant obtained the soforolipid fraction. The extraction process of the biosurfactant consisted of washing the biomass with ethyl acetate (3x), rotary evaporation and extraction with methanol: water (4: 1) and hexane solution. After obtaining the soforolipid fraction, it was lyophilized.
[033] ETAPA B- Consistiu na aplicação dos soforolipídios produzidos para testar a sua possível ação antibacteriana na população de mesófilos aeróbios totais da carne de frango (FIG 2). Previamente foi realizado teste de solubilidade do soforolipídio, sendo o composto solúvel em solução contendo >45% de etanol em água (v/v). Os tratamentos testados foram: A - Controle com água clorada de torneira, B - Etanol 45%, C, D e E - 500, 2.250 e 4.000 pg/ml de soforolipídio, respectivamente.[033] STEP B- It consisted of the application of soforolipids produced to test their possible antibacterial action in the total aerobic mesophilic population of chicken meat (FIG 2). The soforolipid solubility test was previously performed, the compound being soluble in solution containing> 45% ethanol in water (v / v). The tested treatments were: A - Control with chlorinated tap water, B - Ethanol 45%, C, D and E - 500, 2,250 and 4,000 pg / ml of soforolipid, respectively.
Petição 870190016627, de 19/02/2019, pág. 13/16Petition 870190016627, of 02/19/2019, p. 13/16
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[034] Foram preparadas soluções estoque para cada tratamento em 45% etanol (v/v) e colocadas em banho de ultrassom por 20 minutos. O teste consistiu na imersão de 100 g da carne de peito de frango, cortadas em quadrados de 2cm x 2cm, em frascos de Erlenmeyers de 1000 mL contendo 500 mL das soluções com os diferentes tratamentos. Foi analisado também o efeito de diferentes tempos de tratamentos (30, 60 e 90 minutos), sendo todas as análises realizadas em triplicata. Ao final de cada tempo de tratamento, as amostras de frango eram coletadas em sacos plásticos estéreis e mantidas sob refrigeração até a análise microbiológica.[034] Stock solutions were prepared for each treatment in 45% ethanol (v / v) and placed in an ultrasound bath for 20 minutes. The test consisted of immersing 100 g of chicken breast meat, cut into 2 cm x 2 cm squares, in 1000 ml Erlenmeyer flasks containing 500 ml of the solutions with the different treatments. The effect of different treatment times (30, 60 and 90 minutes) was also analyzed, with all analyzes performed in triplicate. At the end of each treatment period, chicken samples were collected in sterile plastic bags and kept refrigerated until microbiological analysis.
[035] ETAPA C - Análises microbiológicas para determinação de aeróbios mesófilos foram realizadas (FIG 3). De cada tratamento foram removidos assepticamente e pesados 25 g da carne de peito de frango e acondicionados em sacos de polietileno estéreis contendo 225 mL de água peptonada tamponada a 1% e estéril. Estas amostras foram homogeneizadas em aparelho stomacher por três minutos, sendo este conteúdo equivalente à diluição 10-1. As diluições subsequentes foram realizadas em solução salina 0,85%, estéril. Para a cálculo de aeróbios mesófilos do peito de frango, 1 mL das diluições 104 e 10-6 foram semeadas em placas Petrifilm™C (3M®), com incubação a 35 °C por 48 horas. Todas as contagens obtidas foram convertidas em logaritmo decimal (Log10) e expressas em Log UFC/ 25g.[035] STEP C - Microbiological analyzes to determine mesophilic aerobes were performed (FIG 3). From each treatment, 25 g of chicken breast meat were aseptically removed and weighed and placed in sterile polyethylene bags containing 225 mL of sterile 1% buffered water. These samples were homogenized in a stomacher for three minutes, this content being equivalent to the 10 -1 dilution. Subsequent dilutions were performed in sterile 0.85% saline. For the calculation of chicken breast mesophilic aerobes, 1 mL of the 10 4 and 10 -6 dilutions were seeded in Petrifilm ™ C (3M®) plates, with incubation at 35 ° C for 48 hours. All counts obtained were converted to decimal logarithm (Log10) and expressed in Log UFC / 25g.
[036] No presente experimento, totalizaram-se 45 amostras, sendo os tratamentos: controle (apenas água), etanol 45%, soforolipídio 500 pg/mL, soforolipídio 2.250 pg/mL e soforolipídio 4.000 pg/mL. Cada tratamento foi avaliado em três diferentes tempos: 30, 60 e 90 minutos. Para o experimento foi utilizado o delineamento estatístico fatorial e a variável resposta observada foi a contagem de aeróbios mesófilos em logw (UFC/25g) (Tabela 1).[036] In the present experiment, there were 45 samples, with the following treatments: control (water only), 45% ethanol, 500 pg / mL soforolipid, 2,250 pg / mL soforolipid and 4,000 pg / mL soforolipid. Each treatment was evaluated at three different times: 30, 60 and 90 minutes. For the experiment, a factorial design was used and the response variable observed was the count of mesophilic aerobes in log w (UFC / 25g) (Table 1).
[038] De acordo com os testes de Shapiro-Wilk e Bartlett a 5% de significância, os resíduos podem ser considerados normais (p-valor = 0,5655) e há homogeneidade de variância (p-valor=0,7052), respectivamente. A análise de variância mostrou que o efeito dos tratamentos foi significativo.[038] According to the Shapiro-Wilk and Bartlett tests at 5% significance, the residuals can be considered normal (p-value = 0.5655) and there is homogeneity of variance (p-value = 0.7052), respectively. The analysis of variance showed that the effect of the treatments was significant.
Petição 870190016627, de 19/02/2019, pág. 14/16Petition 870190016627, of 02/19/2019, p. 14/16
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[039] O tempo e a interação entre tempo e tratamento não apresentaram efeito significativo (p>0,05), mostrando que os tempos 30, 60 e 90 minutos não apresentaram diferenças entre si. Sugerindo a utilização de 30 minutos para a redução da contaminação.[039] The time and the interaction between time and treatment did not show any significant effect (p> 0.05), showing that the times 30, 60 and 90 minutes did not differ between them. Suggesting the use of 30 minutes to reduce contamination.
[040] Em relação aos tratamentos testados, todos diferiram entre si ao nível de significância de 5% (Tabela 1). O aumento da concentração de soforolipídeos reduziu o crescimento dos mesófilos comparado ao controle em 10%, 41% e 72% com 500, 2250 e 4000 g/mL respectivamente, demonstrando ser um eficiente sanitizante não tóxico. Os resultados indicaram que o tempo de 30 minutos foi suficiente e o tratamento com a concentração de 4.000 g/mL soforolipídio foi o mais eficaz apresentando uma redução de 72% de UFC de mesófilos aeróbios, mostrando uma significativa redução quando comparada ao tratamento com água (controle), que é a única técnica utilizada na indústria.[040] Regarding the treatments tested, all differed at the 5% significance level (Table 1). The increase in the concentration of soforolipids reduced the growth of mesophiles compared to the control by 10%, 41% and 72% with 500, 2250 and 4000 g / mL respectively, proving to be an efficient non-toxic sanitizer. The results indicated that the time of 30 minutes was sufficient and the treatment with the concentration of 4,000 g / mL soforolipid was the most effective, presenting a 72% reduction in CFU of aerobic mesophiles, showing a significant reduction when compared to the treatment with water ( control), which is the only technique used in the industry.
Legenda das FigurasFigures Legend
[041] Figura 1 Produção do soforolipídio em biorreator.[041] Figure 1 Production of soforolipid in a bioreactor.
[042] Figura 2 Preparo dos cortes de frango em tamanhos uniformes[042] Figure 2 Preparation of chicken cuts in uniform sizes
[043] Figura 3 Imersão dos pedaços de frango nos diferentes tratamentos testados.[043] Figure 3 Immersion of the chicken pieces in the different treatments tested.
[044] Figura 4 Análise da atividade de soforolipídio em aeróbios mesófilos por sistema Petrifilm.[044] Figure 4 Analysis of soforolipid activity in mesophilic aerobes by the Petrifilm system.
[045] Figura 5 Resultados dos tratamentos: A- Controle; B- Etanol 45%; C- 500 qg/mL; 2.250 qg/mL; 4.000 qg/mL[045] Figure 5 Results of treatments: A- Control; B- 45% Ethanol; C- 500 qg / ml; 2,250 qg / ml; 4,000 qg / mL
[046] Tabela 1: Aeróbios mesófilos log10 (UFC/25g) em amostras de peito de frango tratadas com diferentes concentrações de soforolipídios.[046] Table 1: Log 10 mesophilic aerobes (UFC / 25g) in chicken breast samples treated with different concentrations of soforolipids.
Petição 870190016627, de 19/02/2019, pág. 15/16Petition 870190016627, of 02/19/2019, p. 15/16
12/1212/12
Letras iguais não diferiram entre si no Teste de Tukey (p<0,05).Same letters did not differ from each other in the Tukey test (p <0.05).
Claims (4)
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| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] | ||
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| B06A | Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette] |