BR102018072046A2

BR102018072046A2 - processo de obtenção de enxertos ósseos bioativos por impressão 3d e produtos obtidos

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Publication number: BR102018072046A2
Application number: BR102018072046A
Authority: BR
Inventors: Candida Martins Rodrigues Ana; Alberto Fortulan Carlos; Dutra Zanotto Edgar; Trevelin Souza Marina; Camuri Crovace Murilo; Peitl Filho Oscar
Original assignee: Fundacao Univ Federal De Sao Carlos
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2020-05-05

Abstract

refere-se ao processo de produção de enxertos ósseos obtidos a partir da manufatura aditiva, especificamente impressão 3d, de uma composição em pó, desenvolvida para possibilitar a adaptação do equipamento para a fabricação de peças de biovidro f18 (4), ao invés de gesso, tradicionalmente utilizado. para tanto, o processo se inicia com a obtenção (e1-e7) do pó de biovidro f18 (4), seguida de sua mistura (e8) com os demais componentes (c2) dos enxertos: maltodextrina, acetato de magnésio, carboximetil-celulose, hidróxido de cálcio, fosfato de tricálcio-ß e fosfato dibásico de potássio; a mistura (m), após inserida (e9) na impressora 3d, passa por etapas de secagem (e10, e12 e e13), tanto no interior, quanto fora do equipamento, antes de suas etapas de queima (e15-e18), sendo os scaffolds obtidos (so); esses ainda podem ser infiltrados (e19-e24) com uma solução de colágeno e partículas de biovidro f18 (cb), a fim de aumentar ainda mais sua resistência mecânica. os scaffolds obtidos por meio do processo propostos, infiltrados (si) ou não (so) apresentam resistência e porosidade altas, quando comparados ao estado da técnica e podem ser aplicados em odontologia, ortopedia e medicina veterinária.

Description

PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ENXERTOS ÓSSEOS BIOATIVOS POR IMPRESSÃO 3D E PRODUTOS OBTIDOS

BREVE DESCRIÇÃO [001] Trata a presente solicitação de patente de invenção de um inédito “PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ENXERTOS ÓSSEOS BIOATIVOS POR IMPRESSÃO 3D E PRODUTOS OBTIDOS”, que se refere ao processo de produção de enxertos ósseos obtidos a partir da manufatura aditiva, especificamente impressão 3D, de uma composição em pó, desenvolvida para possibilitar a adaptação do equipamento para a fabricação de peças de biovidro F18, ao invés de gesso, tradicionalmente utilizado. A composição proposta é constituída por biovidro F18, maltodextrina, carboximetilcelulose (CMC), acetato de magnésio (Mg(CH3COO)2), hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) e/ou fosfato de tricálcio-β (β-TCP).

[002] Por meio do processo proposto, é possível a obtenção de scaffolds com geometrias complexas, arquitetura interna controlável e reprodutível, os quais podem ser aplicados em áreas como ortopedia e odontologia.

CAMPO DE APLICAÇÃO [003] A presente invenção pertence à seção de necessidades humanas, ao setor de ciência médica e veterinária; mais especificamente ao campo de artigos cirúrgicos, ao de materiais para próteses ou para revestimento de próteses, especialmente cerâmico ou vítreo, por descrever um processo de obtenção de enxertos ósseos a partir da manufatura aditiva de uma composição em pó, que possibilita a fabricação de peças de biovidro F18, ao invés de gesso.

CONVENCIMENTO [004] A manufatura aditiva surgiu nas últimas duas décadas como uma tecnologia promissora para a produção de enxertos ósseos (também conhecidos como “scaffolds”) customizados. Através dessa técnica, é possível produzir scaffolds com geometrias complexas e arquitetura interna controlável e reprodutível. Recentemente, diferentes tecnologias foram adaptadas para a utilização de vidros bioativos, devido às propriedades únicas desses materiais. Dentre as muitas técnicas de manufatura aditiva

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2/43 existentes, destaca-se a impressão 3D, que normalmente utiliza gesso em pó para a fabricação de peças e/ou protótipos.

[005] A presente invenção descreve composições específicas que possibilitam a adaptação do equipamento para a fabricação de peças de biovidro F18, ao invés de gesso. Essas composições permitem a fabricação em biovidro de peças porosas e/ou densas, com geometria complexa, que podem ser aplicadas na área da saúde, especialmente na odontologia e ortopedia.

[006] O osso possui uma alta capacidade regenerativa e na maioria das fraturas há a consolidação óssea sem a necessidade de intervenções invasivas, especialmente em indivíduos jovens. Todavia, defeitos ósseos acima de um tamanho crítico, como os observados depois da remoção de tumores, requerem intervenção cirúrgica e a introdução de um enxerto para que a regeneração ocorra de forma orquestrada. O tamanho do defeito crítico pode variar com o tipo do osso, idade, estado nutricional do indivíduo, etc. Enxertos ósseos também são frequentemente necessários no caso de neoplasia óssea, estabilização de segmentos da coluna espinhal e, de maneira mais geral, em cirurgias ortopédicas, maxilofaciais e craniofaciais.

[007] Atualmente, a melhor estratégia para o tratamento destas lesões é o uso de um procedimento chamado “transplante autólogo”, que envolve a remoção de uma pequena parte de um osso “doador” situado em um local de baixa solicitação mecânica no próprio paciente, tipicamente um local de fácil acesso como a crista do osso ilíaco, e o transplante até o local do defeito. Embora apenas uma pequena fração das células transplantadas com os segmentos desvascularizados do enxerto sobrevivam, elas contribuem de maneira decisiva para a regeneração óssea.

[008] O transplante do enxerto autógeno (do próprio paciente) possui o melhor resultado clínico uma vez que ele exibe compatibilidade com o osso hospedeiro e evita complicações relacionadas à transmissão de doenças ou resposta imune, como é o caso dos enxertos alógenos (provenientes de um doador) e xenógenos (provenientes de uma fonte animal). Contudo, seu uso é limitado pela pequena quantidade disponível para retirada e pela considerável necrose do local doador. Além disso, a retirada do enxerto autógeno está associada a até 20% das complicações pós-cirúrgicas, incluindo

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3/43 formação de hematomas, perda de sangue, lesão de nervos, formação de hérnia, infecção, lesão arterial, instabilidade pélvica, defeitos cosméticos e, algumas vezes, dor crônica no local doador.

[009] Por essas razões, enxertos produzidos a partir de materiais sintéticos que mimetizam a estrutura óssea, também conhecidos como scaffolds, estão sendo desenvolvidos com o intuito de estimular a regeneração óssea e de fornecer suporte para o novo tecido ósseo formado. Muitos materiais vêm sendo testados nas últimas duas décadas, de forma a suprir a necessidade de substituição dos enxertos autógenos e alógenos. Geralmente, eles se consistem de cerâmicas bioativas, vidros e vitrocerâmicas bioativos, polímeros naturais e sintéticos, ou ainda, compósitos desses. [010] Assim, os scaffolds são estruturas tridimensionais macroporosas que atuam como matrizes temporárias, proporcionando um ambiente e arquitetura específicos para o desenvolvimento e regeneração do tecido ósseo, eles devem favorecer a fixação, o crescimento e a diferenciação celular; para tanto, é, idealmente, desenvolvido para se degradar de forma lenta após a implantação no paciente, sendo substituído gradualmente pelo novo tecido formado.

[011] Para atuar de forma efetiva na regeneração óssea, um scaffold deve satisfazer alguns critérios, como: ser produzido a partir de um material com propriedades bioativas, como por exemplo, osteocondução e a osteoindução; ser reabsorvido à mesma taxa na qual o novo tecido ósseo é formado, a condição ideal é que o material desapareça gradativamente conforme o tecido seja regenerado; possuir uma estrutura altamente porosa (> 60%) e interconectada, com tamanho médio de poros maior do que 200 pm, os poros devem ser grandes o suficiente para permitir crescimento do tecido ósseo e sua vascularização, garantindo o fluxo de nutrientes e resíduos através da estrutura do scaffold; apresentar propriedades mecânicas adequadas, ou seja, o mais próximo possível do osso hospedeiro, uma vez que o estímulo mecânico do local lesionado potencializa a regeneração óssea e diminui o tempo de imobilização do local afetado; poder ser fabricado em formas complexas e irregulares, sendo o método de fabricação reprodutível, de modo a permitir a produção em escala da tecnologia desenvolvida.

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4/43 [012] Os vidros bioativos ou biovidros são considerados excelentes candidatos para a fabricação de scaffolds, pois apresentam alta bioatividade, assim como altos níveis de osteocondução e osteoindução. Além disso, dependendo da composição química, podem ser materiais angiogênicos (estimulando a formação de vasos sanguíneos) e bactericidas. Atualmente existem inúmeros tipos de vidros bioativos: os tradicionais silicatos, fosfatos e os boratos. O mais famoso entre eles é o Bioglass® 45S5 desenvolvido por Hench e de composição 24,4Na2O-26,9CaO-46,1SiO2-2,6P2O5 (% mol). Depois do surgimento dos vidros bioativos, também foram desenvolvidos vitrocerâmicas bioativas, as quais são obtidas através da cristalização controlada de vidros e apresentam a capacidade de manter suas propriedades bioativas, mesmo após a completa cristalização do vidro precursor.

[013] No que se refere à enxertia óssea, um grande número de produtos está comercialmente disponível, sendo a maior parte deles à base de fosfatos de cálcio como a Hidroxiapatita (HA), o fosfato de tricálcio (β-TCP) ou compósitos de HA/p-TCP, sendo os produtos à base de fosfato de cálcio encontrados nas mais diversas formas: grânulos, blocos, placas, tiras, e até esferas.

[014] O número de produtos à base de vidros bioativos é mais restrito, dada a dificuldade de fabricação de peças macroporosas com resistência mecânica suficiente para o manuseio. Os biovidros ainda são comercializados na forma de grânulos, sendo os mais conhecidos: o PerioGlas® (NovaBone Products), constituído por partículas na faixa 90-710 pm e pode ser utilizado para a regeneração do osso ao redor da raiz do dente ou reparar o osso maxilar ou mandíbula, para que implantes de titânio possam ser colocados posteriormente, foi o primeiro produto particulado à base do vidro Bioglass 45S5, lançado em 1993 e atualmente vendido em mais de 35 países; o NovaBone® (NovaBone Products) também é composto por partículas de Bioglass 45S5, com distribuição de tamanho de partículas similar ao PerioGlas®, utilizado em ortopedia, sendo, geralmente, misturado ao sangue do próprio paciente e, após sua coagulação, é colocado na região do defeito ósseo; o Biogran® (BIOMET 3i) também à base do Bioglass 45S5, porém com distribuição de tamanho de partículas inferior (300350 pm), é utilizado em defeitos ósseos do maxilar e, o BonAlive® (BonAlive

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Biomaterials) que foi aprovado para uso ortopédico em 2006 e é composto por partículas do vidro S53P4.

[015] Para a obtenção de scaffolds cerâmicos ou vitrocerâmicos é possível utilizar diversas rotas, que são frequentemente agrupadas em três categorias principais: i. o método da réplica; ii. o método de adição de agentes porogênicos e iii. o método de “direct-foaming”. Contudo, um grande problema reside na habilidade de fabricação de formas complexas e ao mesmo tempo macroporosas, um dos requisitos principais para a fabricação de scaffolds. Dentre todas as técnicas existentes, a única capaz de cumprir satisfatoriamente esse requisito é a manufatura aditiva.

[016] A manufatura aditiva pode ser definida como um processo de fabricação de componentes físicos 3D por meio da adição de material em forma de camadas planas sucessivas, utilizando informações obtidas diretamente do modelo geométrico gerado no sistema CAD (“Computer Aided Design”). O processo se inicia com o modelo 3D da peça no CAD, que é “fatiado” eletronicamente, obtendo-se curvas de níveis 2D que definirão, em cada camada, onde existe ou não material a ser adicionado. Essas camadas são então processadas sequencialmente, gerando a peça física através do empilhamento e aderência, iniciando-se na base e indo até o topo.

[017] A tecnologia de prototipagem rápida pode ser a maneira mais satisfatória para produzir scaffolds com geometria externa customizada e morfologia interna pré-definida e reprodutível. Por meio dessa técnica, é possível controlar não apenas a porosidade e a distribuição de tamanho de poros, mas também criar estruturas que maximizem o transporte de oxigênio e nutrientes através do scaffold. Além disso, os scaffolds podem ser projetados para apresentar características anisotrópicas de porosidade e resistência mecânica. Outra vantagem imediata da prototipagem rápida, seria a habilidade de produzir scaffolds customizados a partir de imagens de tomografia computadorizada.

[018] Atualmente, existem inúmeros sistemas de manufatura aditiva disponíveis no mercado. Apesar de usarem diferentes tecnologias de adição de material, esses sistemas se baseiam no mesmo princípio de manufatura por camadas. Essas tecnologias podem ser classificadas em 3 grupos principais: i. baseados em líquidos,

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6/43 nos quais, a matéria-prima utilizada para fabricar a peça encontra-se no estado líquido antes de ser processada, trata-se de tecnologias que geralmente envolvem a polimerização de uma resina líquida por um laser UV, como por exemplo, a Estereolitografia (SL - “Stereo Litographyj, ou o jateamento de resina líquida por um cabeçote do tipo jato de tinta e posterior cura pela exposição a uma luz UV, como por exemplo, a Impressão a Jato de Tinta (IJP - “Ink Jet Printing”); ii. baseados em sólidos, onde material utilizado encontra-se no estado sólido, podendo estar na forma de filamento, lâmina ou outra qualquer, alguns dos processos fundem o material antes de sua deposição (por exemplo, Modelagem por Fusão e Deposição - FDM ou “Fused Deposition Modeling”), outros somente recortam uma lâmina do material adicionado (por exemplo, Manufatura Laminar de Objetos - LOM ou ainda “Laminated Object Manufacturing”); e, iii.baseados em pó, nesse caso, a matéria-prima está na forma de pó antes do processamento, pode-se utilizar laser para o seu processamento (por exemplo, Sinterização Seletiva a Laser - SLS ou “Selective Laser Sintering”) ou um ligante aplicado por um cabeçote tipo jato de tinta (por exemplo, Impressão Tridimensional - 3DP ou “3-Dimensional Printing”).

[019] A técnica de manufatura aditiva para a fabricação de scaffolds tem sido tradicionalmente aplicada em sistemas poliméricos. Na literatura existem scaffolds produzidos a partir de celulose, colágeno, polimetilmetacrilato (PMMA), poliácido lático (PLA), poliácido glicólico (PGA), policaprolactona (PCL), entre outros. Diferentes técnicas de prototipagem foram utilizadas como: Estereolitografia, Modelagem por fusão e deposição, Sinterização Seletiva a Laser e Impressão 3D.

[020] Para a manufatura direta de scaffolds cerâmicos, normalmente emprega-se uma das técnicas baseadas em pó (3DP ou SLS). Como matéria-prima geralmente são utilizados fosfatos de cálcio (principalmente a hidroxiapatita) na forma pura ou contendo aditivos poliméricos.

[021] No processo de fabricação via impressão 3D, o material é agregado por um aglutinante depositado por impressão tipo jato de tinta. Um rolo espalha e nivela o material e a cabeça de impressão deposita o aglutinante de acordo com a geometria 2D da camada sendo processada. O aglutinante em questão, é uma solução aquosa

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7/43 contendo um ou mais tipos de ligante. As peças fabricadas por essa técnica geralmente necessitam de três etapas de pós-processamento: retirada do pó de suporte (pó não reagido, existente no interior dos poros), termólise dos aditivos orgânicos de processamento e sinterização do material através de tratamentos térmicos controlados. Segundo diversos autores, essa é a tecnologia mais rápida de prototipagem até o momento. Além disso, não há desperdício de material, pois o pó solto (que não recebeu o líquido de impressão) pode ser reutilizado.

[022] Nas duas últimas décadas, muitos esforços têm sido direcionados para o aperfeiçoamento da impressão 3D e o processamento de pós cerâmicos. Desenvolvimentos recentes introduziram ligantes orgânicos em sistemas cerâmicos, tornando o processo de impressão 3D acessível e flexível.

[023] Ao contrário de pós cerâmicos (como por ex. o gesso, cimentos e alguns fosfatos) que são capazes de absorver e reagir com o líquido de impressão rapidamente, a natureza química do vidro leva a uma série de dificuldades relacionadas à retenção do líquido, tempo de secagem e resistência mecânica.

[024] Nesse contexto, a presente invenção descreve composições específicas, baseada numa mistura de pós, que possibilitou uma adaptação ao processo de impressão 3D, amplamente descrito, para que o vidro bioativo denominado “F18” pudesse ser utilizado como matéria-prima para a fabricação de scaffolds. Assim, as composições propostas são compreendidas por vidro bioativo F18, na forma de pó, maltodextrina, carboximetilcelulose (CMC), acetato de magnésio (Mg(CH3COO)2), hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) e/ou fosfato de tricálcio-β (β-TCP), também na forma de pós. As composições propostas, garantem boa fluidez da mistura de pós, impedindo a formação de trincas e/ou defeitos após o espalhamento da mistura pelo rolo sobre a mesa de construção sem a diminuição significativa da bioatividade do biovidro F18, possibilitando a obtenção de scaffolds com resistência mecânica à verde suficiente para que o pó de suporte possa ser removido com ar comprimido, sem que haja colapso da estrutura; com porosidade superior a 60% e resistência mecânica suficiente para o manuseio pelo médico ou dentista, após sua sinterização.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

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8/43 [025] No atual estado da técnica, estão presentes algumas anterioridades que descrevem a fabricação de enxertos ósseos e scaffolds. Algumas das anterioridades até descrevem produção por manufatura aditiva, no entanto, empregam técnicas de sinterização seletiva à laser, diferentemente da presente proposta que emprega impressão 3D. Outras anterioridades descrevem a obtenção de enxertos e de scaffolds a partir de materiais cerâmicos ou biovidro, no entanto, não utilizam composição em pó como matéria-prima, associada ao método de impressão 3D. Nesse sentido, nenhuma das anterioridades encontradas descreve processo de produção enxertos ósseos, aqui chamados scaffolds, a partir da impressão 3D, utilizando uma composição em pó constituída de biovidro F18, maltodextrina, carboximetilcelulose (CMC), acetato de magnésio (Mg(CH3COO)2), hidróxido de cálcio (Ca(OH)2) e/ou fosfato de tricálcio-β (βTCP), conforme o descrito no presente pedido de patente.

[026] A anterioridade US2015352247A1, intitulada Compositions and methods for regeneration of hard tissues descreve um método de regeneração óssea por meio de enxertos ósseos que inclui em sua composição biovidro. A invenção menciona que a obtenção dos enxertos se dá por fusão dos componentes, seguida de resfriamento para obtenção de grânulos. Dessa maneira, ainda que a anterioridade descreva composições para obtenção de enxertos ósseos, essas não são empregadas na forma de pós e não se utiliza técnicas de impressão 3D, o que a diferencia da proposta.

[027] A anterioridade US20170143831A1, intitulada In vivo live 3d printing of regenerative bone healing scaffolds for rapid fracture healing descreve o emprego de 'biotinta', compreendida, dentre outros componentes, de biosilicato, para a impressão 3D de scaffolds, a serem empregados na regeneração óssea. Diferentemente da proposta do presente pedido, a anterioridade descreve uma composição em suspensão, compreendida por biopolímeros e biosilicato, sendo empregada como matéria-prima em técnicas de impressão 3D de scaffolds. Assim, ainda que a anterioridade empregue a técnica de impressão 3D, a matéria-prima utilizada, além de diferente, por não apresentar em sua composição biovidro e sim biosilicato, também se apresenta em forma diferente, enquanto na anterioridade são empregadas suspensões, na proposta do presente pedido é empregada uma composição em pó.

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9/43 [028] A anterioridade US20120282573A1, intitulada Tooth scaffolds” descreve um scaffold em formato de dente artificial composto por hidroxiapatita e policaprolactona, contendo outros aditivos orgânicos. Os scaffolds são obtidos a partir de modelos em CAD que são transferidos para o sistema Bioplotter®, onde o equipamento Bioplotter® funde e distribui a composição, camada por camada, numa placa coletora, originando o scaffold. A anterioridade se difere da proposta do presente pedido, principalmente, por não empregar uma composição em pó.

[029] A anterioridade US20090155334A1, intitulada Implant for tissue engineering” descreve um método de produção de implantes porosos, consistindo na fabricação de uma pasta que é extrudada e, em seguida, sinterizada, diferentemente da presente proposta que utiliza uma composição em pó a ser empregada na técnica de impressão 3D.

[030] A anterioridade US20080103227A1, intitulada Porous material having hierarchical pore structure and preparation method thereof' descreve o emprego de uma técnica diferente de impressão 3D para a fabricação de scaffolds, onde é preparado um material com consistência de pasta que, em seguida, é depositado numa mesa de construção por dispositivo contendo uma seringa, diferentemente da presente proposta que utiliza uma composição em pó a ser empregada na técnica de impressão 3D.

[031] A anterioridade CN105435303A, intitulada Enhanced type bioactive glass scaffold and preparation method thereof relata o desenvolvimento de uma pasta extrudável a partir de vidro bioativo em pó, etanol absoluto e água deionizada, que após obtida, é adicionada à impressora 3D para impressão de scaffolds a temperaturas entre 10 e 60^oC. A principal diferença entre a anterioridade e a proposta do presente pedido, se dá em a presente proposta dispensar a preparação de uma pasta, empregando uma combinação em pó diretamente na impressão 3D.

[032] A anterioridade CN104108928B, intitulada Continuously introducing a liquid phase in the preparation of ceramic bone scaffold laser sintering method descreve um método de fabricação de scaffolds, que apesar de uma técnica de manufatura aditiva, emprega sinterização seletiva à laser (SLS), diferentemente da presente proposta que

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10/43 emprega impressão 3D e uma combinação em forma de pó como matéria-prima, para a produção de scaffolds.

[033] A anterioridade CN104001218A, intitulada Manufacturing method of antituberculous slow release artificial bone scaffold descreve uma técnica de impressão 3D para a fabricação de scaffolds, diferente da proposta descrita no presente pedido, uma vez que é preparada uma suspensão - ou barbotina - contendo o biovidro, e não se emprega uma composição em pó.

[034] A anterioridade US2005118236A1, intitulada Bioactive, resorbable scaffolds for tissue engineering descreve o uso de vidro bioativo para a fabricação de scaffolds, apesar disso, diferentemente da proposta do presente pedido de patente, o método descrito não envolve impressão 3D.

[035] A anterioridade CN105435303 A, intitulada Enhanced type bioactive glass scaffold and preparation method thereof' descreve um método de impressão 3D de scaffolds utilizando vidro bioativo; todavia, no método em questão é preparada uma barbotina contendo o vidro bioativo, ou seja, não utiliza o pó à seco, diferentemente da proposta do presente pedido.

[036] As anterioridades: CN106178101A intitulada Preparation method of porous bioactive glass ceramic scaffold, CN105330285A intitulada ZrÜ2-toughened bioactive ceramic powder material for 3D printing and preparation and application thereof' e CN105582571A intitulada Manufacturing method of high-strength bioactive porous scaffold, relatam métodos de fabricação do scaffold a partir de composições de biovidro, porém, que não são baseadas em pó ou mistura de pós.

[037] A anterioridade US2014212469A1, intitulada Surface functional bioactive glass scaffold for bone regeneration, descreve a obtenção de scaffolds em biovidro, obtidos por um método de impressão 3D que emprega uma suspensão contendo o vidro bioativo e outros aditivos e um aparato baseado em uma seringa.

[038] A anterioridade US2008103227A1, intitulada “Biological absorbable threedimensional printing strontium-contained mesoporous bioactive glass support and preparation method thereof' descreve a obtenção de scaffolds empregando biovidro em sua composição, no entanto, o método de preparação é diferente, uma vez que

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11/43 consiste na preparação de uma suspensão que será moldada, seca, sinterizada e moída para ser utilizada numa mistura com consistência pastosa que será extrudada e prototipada tridimensionalmente, diferentemente da proposta do presente pedido que emprega uma composição em pó na impressão 3D de scaffolds.

[039] A anterioridade CN106267374A, intitulada Biological absorbable threedimensional printing strontium-contained mesoporous bioactive glass support and preparation method thereof, descreve scaffolds obtidos por um método de impressão 3D, empregando um compósito compreendido por uma mistura de biovidro contendo estrôncio e um polímero, preferencialmente policaprolactona, diferentemente da proposta do presente pedido.

[040] A anterioridade CN106346777A, intitulada Method for improving sintering performance of polymer-ceramic bone scaffold, descreve scaffolds obtidos por meio de sinterização seletiva a laser (SLS - Selective Laser Sintering), também uma técnica de manufatura aditiva, no entanto, diferente da impressão 3D, empregada no presente pedido de patente.

[041] Apesar do grande número de referências presentes no atual estado da técnica, nenhuma das anterioridades encontradas resolvem os problemas presentes no campo técnico, no que diz respeito à possibilitar o uso de uma composição em pó, ou seja, que dispense etapas de preparação de pastas ou suspensões, que permita a impressão 3D de scaffolds com geometrias complexas e arquitetura interna controlável e reprodutível, constituídos, dentre outros componentes, de biovidro F18 ao invés de gesso. A composição em pó proposta no presente pedido, ainda possibilita, por meio de sua associação à técnica de impressão 3D, a fabricação em biovidro de peças porosas e/ou densas, com geometria complexa, aplicáveis em odontologia e ortopedia, com elevada porosidade e resistência mecânica, um dos principais gargalos do atual estado da técnica.

OBJETIVO DA INVENÇÃO [042] A presente invenção tem como objetivo proporcionar peças a serem utilizadas como enxertos ósseos, produzidas em biovidro F18, apresentando estruturas densas

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12/43 e/ou porosas, com geometria complexa, a serem aplicadas em odontologia e ortopedia; sendo obtidas pela técnica de manufatura aditiva de impressão 3D.

DA INVENÇÃO [043] A presente invenção descreve um processo que se inicia com a obtenção do vidro F18 na forma de frita, para tanto, suas matérias-primas são misturadas em misturar do tipo “V”, por 12h, e colocadas em cadinho de cerâmica. O cadinho é colocado no interior de um forno elétrico, permanecendo em seu interior a 1350°C/1h, sob agitação de uma haste de platina. Em seguida, o vidro fundido é vertido em água, obtendo-se a frita. A frita é seca em estufa a 80°C por 24h, passando por dois processos de moagem. O primeiro processo de moagem ou pré-moagem é realizado em moinho de discos rotativos, reduzindo a frita a um tamanho de partícula inferior a 1 mm. Em seguida, o pó grosseiro de vidro F18 é moído em moinho de jato (Jet Mill), onde obtém-se uma distribuição de tamanho de partículas entre 3 e 400 pm. O pó de biovidro F18 (3-400pm) é então, misturado a outras matérias-primas em misturador do tipo “V” por 12h. A mistura de pós é então colocada na impressora 3D, onde os scaffolds são impressos camada-a-camada.

[044] Após secagem no interior do equipamento à temperatura ambiente, os scaffolds são retirados e secos novamente a 50°C por 24h, em estufa. O pó de suporte existente no interior dos poros é removido com ar comprimido. A queima dos scaffolds ocorre em 5 etapas, em forno elétrico. Na primeira etapa, os scaffolds são aquecidos a uma taxa de 1°C/min da temperatura ambiente até 290°C, permanecendo por 3h nessa temperatura, visando a pirólise da maltodextrina. Na segunda etapa, novo aquecimento a 1°C/min até 430°C, permanecendo 3h nessa temperatura, para a remoção de carboximetilcelulose. Na terceira etapa, novo aquecimento a uma taxa de 10°C/min até 870°C, permanecendo por 10 minutos nessa temperatura, visando à sinterização do biovidro F18. Na quarta etapa, os scaffolds são resfriados no interior do forno a uma taxa de 2°C/min até a temperatura ambiente. Os scaffolds obtidos podem eventualmente ser infiltrados com colágeno contendo partículas de biovidro F18 dispersas.

VANTAGENS DA INVENÇÃO

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13/43 [045] Em suma, a presente invenção apresenta como principais vantagens:

J Proporcionar um processo de obtenção de scaffolds que envolva apenas a mistura física dos componentes da matéria-prima, dispensando a preparação de uma suspensão ou barbotina e sua granulação em spray-dryer;

J Proporcionar um processo de obtenção de scaffolds onde os aditivos de processamento conferem boa fluidez à mistura utilizada como matéria-prima, impedindo a formação de trincas e/ou defeitos após o espalhamento da mistura pelo rolo sobre a mesa de construção, alta capacidade de retenção de líquido e alta resistência mecânica à verde;

J Proporcionar um processo de obtenção de scaffolds onde os aditivos também atuem como agentes porogênicos, conferindo porosidade adicional aos scaffolds, sendo a porosidade final alcançada, superior a 70%, após sinterização, maior do que a dos scaffolds convencionais;

J Proporcionar um processo de obtenção de scaffolds onde os aditivos permitam uma boa retenção do líquido depositado pela impressora, dispensando a necessidade de alteração do líquido de impressão do equipamento de impressão 3D;

J Proporcionar um processo de obtenção de scaffolds onde os scaffolds apresentem resistência mecânica à verde suficiente para que o pó de suporte possa ser removido com ar comprimido, sem que haja colapso de sua estrutura;

J Proporcionar um processo de obtenção de scaffolds onde os scaffolds, após sinterização, apresentem resistência mecânica suficiente para suportar o manuseio pelo médico ou dentista;

J Proporcionar um processo de obtenção de scaffolds onde outros tipos de vidros ou vitrocerâmicas podem ser utilizados, quando houver necessidade ou se quiser substituir o biovidro F18;

J Proporcionar um processo de obtenção de scaffolds que possibilite a infiltração dos scaffolds obtidos com colágeno e biovidro F18, a fim de aumentar ainda mais sua resistência mecânica;

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14/43 z Proporcionar um processo de obtenção de scaffolds que possibilite a infiltração dos scaffolds obtidos com diversos tipos de polímeros, que liberam partículas de biovidro durante sua dissolução;

z Proporcionar um processo de obtenção de scaffolds que permita a fabricação de scaffolds customizados, por meio de imagens de tomografia computadorizada ou de desenhos projetados em CAD;

z Proporcionar um processo que além de scaffolds, possibilite a fabricação de outras peças sólidas ou porosas de qualquer geometria;

z Proporcionar enxertos ósseos para aplicações em odontologia, como por exemplo, levantamento do seio maxilar e aumento ósseo vertical e horizontal, manutenção de alvéolo e enxertos periodontais;

z Proporcionar enxertos ósseos para aplicações em ortopedia mais especificamente, em cirurgias crânio-maxilo-faciais como cranioplastias e reconstruções de calota craniana, mentoplastias etc.;

z Proporcionar a fabricação enxertos ósseos para implantes orbitais (preenchimento da cavidade ocular);

z Proporcionar enxertos ósseos para aplicações que envolvam a reconstrução para consolidação de fraturas panfaciais, também, denominadas fraturas complexas da face, ou em aplicações onde uma regeneração óssea guiada é desejável tanto em procedimentos em odontologia, como em medicina e medicina veterinária.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [046] A invenção será descrita em uma realização preferencial, assim, para melhor entendimento serão feitas referências ao fluxograma e às figuras:

z Figura 1: Fluxograma do processo de obtenção dos scaffolds, utilizando impressão 3D;

z Figura 2: Scaffolds logo após impressão (a), após remoção de pó superficial (b) e após remoção de pó de suporte com ar comprimido (c);

z Figura 3: Perda de massa em função da temperatura para amostra retirada de scaffold obtido via impressão 3D;

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15/43

V Figura 4: Retração de área em função da temperatura para o material impresso e para o vidro F18. Taxa de aquecimento de 5°C/min;

v Figura 5: Curvas de DSC do vidro F18 e do material impresso, após remoção de orgânicos;

v Figura 6: Difratograma de raios-X do material impresso após sinterização;

v Figura 7: Micrografias do scaffold obtido por impressão 3D após a sinterização, embutido em resina epóxi sob vácuo;

V Figura 8: Corpos de prova utilizados no ensaio de compressão;

V Figura 9: Tensão de compressão em função da direção de impressão utilizada na fabricação dos scaffolds. Os valores representam a média e o desvio padrão de 5 amostras;

V Figura 10: Tensão máxima de compressão em função da porosidade para vários scaffolds produzidos a partir de vidros bioativos (GERHARDT e BOCCACCINI, 2010). Estrela em vermelho representa os valores de porosidade (77%) e resistência à compressão (~ 5 MPa) obtidos a partir do processo descrito no presente pedido;

V Figura 11: Discos impressos após secagem em estufa a 50°C/24h (a) e após o procedimento de queima (b);

V Figura 12: Discos impressos (após a queima) expostos à solução de SBF por períodos variando entre 6h e 7 dias;

V Figura 13: Micrografias da superfície de amostra impressa após exposição ao SBF por 6h. Em detalhe, cristais globulares de HCA;

V Figura 14: Micrografia da superfície de disco impresso após exposição ao SBF por 12h (a) e 24h (b);

V Figura 15: Micrografias da superfície de disco impresso após exposição ao SBF por 48h;

V Figura 16: Micrografias da superfície de disco impresso após exposição ao SBF por 7 dias;

V Figura 17: Imagens do processo de impressão 3D de scaffolds, barras e discos utilizando a composição C07/p-TCP (a-b). Scaffolds após a remoção do

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16/43 equipamento e secagem em estufa a 50°C/24h (c) e scaffolds após a remoção do pó de suporte do interior dos macroporos (d);

d Figura 18: Microscopia eletrônica de varredura de scaffold de composição C07/p-TCP à verde, após pós-processamento e secagem em estufa a 50°C/24h;

d Figura 19: Barras (a) e discos (b) de C07/p-TCP, após remoção do equipamento e secagem a 50°C/24h;

d Figura 20: Retração de área em função da temperatura para amostra de composição C07/p-TCP. Taxa de aquecimento de 5°C/min;

d Figura 21: Curvas de DSC do vidro F18, da formulação 7 e da formulação C07/p-TCP, após a pirólise de orgânicos. Taxa de aquecimento padrão de 10°C/min;

d Figura 22: Retração de área em função do tempo para amostra de composição

C07/p-TCP para a temperatura de 700°C. Taxa de aquecimento de 5°C/min; d Figura 23: Retração de área em função do tempo para amostra de composição

C07/p-TCP para a temperatura de 830°C. Taxa de aquecimento de 5°C/min; d Figura 24: Scaffolds de formulação C07/ β-TCP sinterizados a 700°C/30min; d Figura 25: Imagens obtidas por microscopia eletrônica de varredura de um scaffold de formulação C07/ β-TCP, sinterizado a 700°C/30min;

d Figura 26: Difractogramas do β-TCP e de um scaffold de composição C07/eTCP à verde e após sinterização a 700°C/30min;

d Figura 27: Discos de formulação C07/ β-TCP, sinterizados a 700°C/30min;

d Figura 28: Espectros de FTIR da superfície do disco da formulação C07/ β-TCP expostos à solução de SBF por tempos variando entre 6h e 48h;

d Figura 29: Superfície dos discos de formulação C07/ β-TCP após imersão em SBF por 6 h (a-b), 12 h (c-d), 24 h (e-f) e 48 h (g-h);

d Figura 30: Imagem de scaffold infiltrado com colágeno obtida por microscopia ótica (a-d) e eletrônica (e-f);

d Figura 31: Espectros de FTIR da superfície do discos de composição 7 infiltrados com colágeno e expostos à solução de SBF por tempos variando entre 6h e 48h;

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17/43 z Figura 32: Superfície dos discos de composição 7 infiltrados com colágeno após imersão em SBF por 6 h (a-b), 12 h (c-d), 24 h (e-f) e 48 h (g-h);

z Figura 33: Corpos de prova (scaffolds) preparados para o ensaio de compressão;

z Figura 34: Curvas típicas de tensão-deformação para scaffolds infiltrados com colágeno, obtidas após o ensaio de compressão;

z Figura 35: Imagem de scaffold após ensaio mecânico de compressão. Setas vermelhas indicam onde houve colapso da estrutura do scaffold;

z Figura 36: Comparação da tensão de compressão entre os scaffolds (impressos na direção horizontal) com e sem infiltração com colágeno. Os valores representam a média e o desvio padrão de 5 amostras;

z Figura 37: Tensão máxima de compressão em função da porosidade para vários scaffolds produzidos a partir de vidros bioativos (GERHARDT e BOCCACCINI, 2010). Estrela em vermelho representa os valores médios de porosidade (77%) e resistência à compressão (~ 19 MPa) dos scaffolds infiltrados com colágeno, descritos no presente pedido.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [047] O PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ENXERTOS ÓSSEOS BIOATIVOS POR IMPRESSÃO 3D (Fig. 1) se inicia com a obtenção do vidro F18 na forma de frita (V), para tanto, seus componentes (C1), em proporções de acordo com a tabela 1, são misturados (E1) em misturador do tipo “V”, por 12h, e colocados (E2) em cadinho de cerâmica, o qual é aquecido (E3) no interior de um forno elétrico à 1350°C, por 1h, sob agitação de uma haste de platina.

Componente (C1)	Quantidade em % - mol	Quantidade em % - peso
SiO2	46-52	43-52
Na2O	5-10	4-9,5
K2O	15-32	20,5-32
MgO	0,5-2,5	0,5-2,5
CaO	15-20	15-20
Au	0,1-3,5	0,1-3,5

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18/43

Ag	0,1-3,5	0,1-3,5
B2O3	1,5-4	1,5-4
P2O5	1,5-3	1-6
ZnO	0,1-3,5	0,1-3,5
SrO	0,1-3,5	0,1-3,5

Tabela 1: Componentes presentes no vidro F18, descrito no pedido de patente

BR102013020961-9 A2 [048] Em seguida, o vidro fundido (2) é vertido (E4) em água filtrada (A), obtendo-se a frita (V), que é seca (E5) em estufa à 80°C por 24h, passando por dois processos de moagem: o primeiro processo de moagem (E6) é realizado em moinho de discos rotativos, reduzindo a frita a um tamanho de partícula inferior a 1 mm; em seguida, o pó grosseiro de vidro F18 (3) é moído (E7) em moinho de jato Jet Mill, onde obtém-se uma distribuição de tamanho de partículas entre 3 e 400 pm. O pó de biovidro F18 (4) com granulometria entre 3-400pm, é então, misturado (E8) aos demais componentes (C2), em proporções de acordo com a tabela 2 e com características de acordo com a tabela 3, em misturador do tipo “V” por 12h. A mistura de pós (M) é então colocada (E9) na impressora 3D, onde os scaffolds (S) são impressos camada-a-camada.

Componente (C2)	Composição
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
Maltodextrina (% peso)	22	12	22	12	20	20	10	10	10	-	-
Acetato de Magnésio (% peso)	-	-	3	3	-	-	-	-	-	-	-
Carboximetil-celulose (% peso)	-	-	-	-	5	10	15	10	15	-	-
Hidróxido de Cálcio (% peso)	-	-	-	-	-	-	10	5	-	-	-
Fosfato de Tricálcio-β (% peso)	-	-	-	-	-	-	-	-	10	-	25
Fosfato dibásico de Potássio (% peso)	-	-	-	-	-	-	-	-	-	25	-

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Fosfato dibásico de Sódio (% peso)	-	-	-	-	-	-	-	-	25	25	50
Biovidro F18 (% peso)	78	88	75	85	75	70	65	75	65	50	50

Tabela 2: Formulações desenvolvidas para obtenção de scaffolds via impressão 3D

Material	D10 (pm)	D médio (pm)	D90 (pm)	Densidade (g/cm3)
Gesso (ZP130)	10	30	80	2,3
F18	10	43	85	2,6
Maltodextrina	20	70	130	0,5
Acetato de Mg	0,5	40	115	1,45
CMC	25	155	350	0,75
Ca(OH)2	1,5	25	55	2,2
β-TCP	-	20	-	3,14
Na2HPO4	-	25	-	1,7
K2HPO4	-	35	-	2,44

Tabela 3: Características dos materiais utilizados na formulação de pós para impressão 3D [049] Após secagem (E10) no interior do equipamento, por 24 horas, à temperatura ambiente, os scaffolds (S) são retirados (E11) dele e, também pelo período de 24h, são secos (E12) à temperatura ambiente por mais 24 horas, depois disso, são secos em estufa (E13) à 50°C por 24h; então, o pó de suporte existente no interior dos poros dos scaffolds (S) é removido com ar comprimido (E14). Em seguida, se iniciam as etapas de queima dos scaffolds (S), em 5 etapas e em forno elétrico. Na primeira (E15), os scaffolds (S) são aquecidos a uma taxa de 1°C/min da temperatura ambiente até 290°C, permanecendo por 3h nesta temperatura, visando a pirólise da maltodextrina. [050] Na segunda (E16), novo aquecimento à 1°C/min até 430°C, permanecendo 3h nesta temperatura, para a remoção de carboximetilcelulose. Na terceira (E17), novo aquecimento a uma taxa de 10°C/min até 870°C, permanecendo por 10 minutos nesta

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20/43 temperatura, visando a sinterização do biovidro F18. Na quarta (E18), os scaffolds (SO) são resfriados no interior do forno a uma taxa de 2°C/min até a temperatura ambiente. [051] Os scaffolds obtidos (SO) podem eventualmente ser infiltrados com uma solução de colágeno contendo partículas de biovidro F18 dispersas (CB). Para tanto, é preparada (E20) uma solução com colágeno hidrolisado (CL) e água filtrada (A), na proporção 1g/mL que é homogeneizada (E21) em agitador magnético a uma temperatura de 60°C; à solução (SC) é adicionado 2,5 g de vidro F18 em pó (1), sendo então, submetida à agitação (E22) por mais 30 minutos. Então, os scaffolds (SO) são infiltrados (E23) na solução (CB), por 5 minutos sob vácuo, no interior de um kitassato. [052] Em seguida, o excesso do gel de colágeno (CB) é removido (E24), por jateamento de ar comprimido, e o scaffolds infiltrados (SI) são secos (E25), à temperatura ambiente, por 72h.

[053] Foram realizados diversos testes com os enxertos ósseos bioativos obtidos por meio de impressão 3D. A seguir, os testes que corroboram com as vantagens descritas para a presente invenção são apresentados e, posteriormente, comentados. Calorimetria Exploratória Diferencial (DSC) [054] A técnica foi empregada na caracterização das matérias-primas e do material impresso. As medidas foram realizadas no calorímetro diferencial de varredura DSC 404 (NETZSCH), em atmosfera ambiente. Foram utilizados cadinhos de platina e taxa de aquecimento de 10°C/min, da temperatura ambiente até 1280°C.

Dilatometria Ótica (DO) [055] A dilatometria ótica permite acompanhar o comportamento de amostras sólidas e pós compactados em função da temperatura, mediante uma câmera acoplada a um forno tubular e um programa de análise de imagens. Uma lâmpada projeta luz sobre a amostra, e sua sombra é captada pela câmera. Durante o aquecimento é registrada a variação da altura e da área da sombra projetada pela amostra. A técnica permite a determinação da temperatura de início de sinterização, bem como sua evolução. Permite também a determinação de outras temperaturas características dos materiais como temperatura de deformação, formação de esfera e/ou meia esfera e fluência.

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21/43 [056] Pode-se também determinar o ângulo de molhamento da amostra em um determinado substrato.

[057] Para a realização dos experimentos, utilizou-se o dilatômetro ótico MISURA HSM ODHT (Expert System Solutions), conjuntamente com um software analisador de imagens. Esse equipamento é frequentemente chamado de “microscópio de aquecimento” na literatura, todavia, através dessa técnica é possível avaliar apenas variações dimensionais macroscópicas.

[058] Para determinar as melhores condições de sinterização dos scaffolds (temperatura e taxa de aquecimento), foi impressa uma pequena barra sólida de 80 x 3 x 3 mm. Após secagem e remoção do pó da superfície da barra, esta foi tratada termicamente para a pirólise dos aditivos orgânicos. O tratamento térmico foi realizado em forno elétrico e consistiu no aquecimento à 1°C/min da temperatura ambiente até 290°C, permanecendo nesta temperatura por 3h. Em seguida, novo aquecimento à 1°C/min até 430°C, permanecendo por mais 3h nesta temperatura. Finalmente, a barra foi resfriada até a temperatura ambiente a uma taxa de 2°C/min. A partir da barra, foram cortadas amostras de 3,5 x 3 x 3 mm, que foram então ensaiadas no dilatômetro ótico.

Difração de Raios-X (DRX) [059] A caracterização das fases cristalinas resultantes dos testes de sinterização foi realizada empregando-se a técnica de difração de raios-X. O equipamento utilizado foi o difratômetro Rigaku (Ultima IV). Os espectros de difração foram obtidos na faixa de 2Θ de 10° a 90°, e modo contínuo a 0,67°/min. As amostras foram previamente moídas em almofariz de ágata.

Microscopia Ótica [060] A técnica foi utilizada para observação dos scaffolds produzidos por impressão 3D, tanto à verde quanto após a queima. Utilizou-se tanto o microscópio ótico DMRX (LEICA) quanto o estereomicroscópio MZ75 (LEICA), ambos com câmera digital DFC 490 (LEICA) acoplada.

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

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22/43 [061] A técnica de microscopia eletrônica de varredura foi utilizada em observações microestruturais de amostras obtidas nos testes de impressão 3D, após a sinterização e após os testes de bioatividade. Para isso, foram utilizados os equipamentos FEG Philips (XL-30) e o FEI (PHENOMTM). As amostras foram recobertas com ouro por 90 segundos.

[062] Para a determinação da porosidade presente dos scaffolds, eles foram embutidos com resina epóxi (EpoxyCure® - BUEHLER) sob vácuo. Em seguida as amostras embutidas foram cortadas e desbastadas com lixas de carbeto de silício números 400, 600, 800, 1000 e 1200. Após o desbaste, a superfície foi polida com uma solução de óxido de cério. Entre cada etapa de desbaste e após o polimento, as amostras foram colocadas em água e permaneceram em limpador ultrassônico por 1 minuto. A amostra polida também foi recoberta com ouro por 90 segundos antes da análise por MEV. A medida da espessura da parede dos scaffolds, do tamanho médio de poros e da porosidade foi realizada com o auxílio do software Image-J.

Manufatura Aditiva via Impressão 3D (3DP) [063] Os testes de manufatura aditiva via impressão 3D foram realizados no equipamento Z310 (Z-corporation). Foi utilizada uma espessura de camada de 0,1 mm. [064] Outros parâmetros de processamento como velocidade do rolo e quantidade de líquido impresso também foram mantidos constantes. Foram impressas placas com e sem furo, barrinhas de 80 x 3 x 3 mm, pastilhas de 12 mm de diâmetro por 3 mm de espessura e scaffolds, nas posições horizontal, vertical e com 45° de inclinação em relação ao plano XY.

Ensaio de bioatividade in vitro [065] Os testes de bioatividade in vitro dão informações sobre a cinética de formação de hidroxicarbonato apatita (HCA) na superfície dos materiais em estudo. São testes preliminares e seletivos realizados anteriormente aos testes in vivo. Os testes consistem na exposição do material em uma solução acelular denominada “Simulated Body Fluid’ (SBF-K9), desenvolvida por Kokubo (KOKUBO e KUSHITANI, 1990), a solução simula as condições dos fluídos corpóreos, contendo os íons presentes em

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23/43 concentrações muito próximas às encontradas no plasma sanguíneo humano, como indicado na tabela 4, a seguir:

Íon	Na⁺	K⁺	Mg²⁺	Ca²⁺	Cl^-	(HCO3)^-	(HPO4)^2-	(SO4)^2-
Plasma Humano	142.0	5.0	1.5	2.5	147.8	4.2	1.0	0.5
SBF-K9	142.0	5.0	1.5	2.5	103.0	27.0	1.0	0.5

Tabela 4: Concentração de íons (mM) na solução SBF-K9 e no plasma sanguíneo humano.

[066] A preparação da solução SBF-K9 para os testes de bioatividade é um processo bem delicado e deve seguir uma sequência rigorosa, caso contrário, pode haver a precipitação de sais na solução, o que a torna inutilizável.

[067] A preparação da solução se dá da seguinte maneira: i. lavar todos os frascos e utensílios utilizados em solução 1N de HCl, detergente neutro e água deionizada, nessa ordem; ii. secar os utensílios em estufa; iii. colocar 500 ml de água deionizada em béquer de 1L e cobrir com vidro de relógio; iv. manter a água do béquer sob constante agitação através de um agitador magnético e adicionar os reagentes na água, um a um e na ordem apresentada na Tabela 5 (a seguir), um novo reagente só pode ser adicionado após a completa dissolução do reagente anterior; v. ajustar a temperatura da solução contida no béquer à 36,5°C; vi. ajustar o pH da solução para 7,25 através da adição da solução HCl 1N, em seguida, retirar o eletrodo do pH, adicionando à solução a água deionizada empregada na sua lavagem; vii. após o resfriamento da solução até a temperatura ambiente, transferir a solução do béquer para um balão volumétrico de 1 L; viii. adicionar ao balão volumétrico a água utilizada na lavagem do béquer; ix. ajustar o volume total da solução para um litro, adicionandose água deionizada; x. transferir a solução para um frasco de polietileno ou polipropileno e armazená-la em refrigerador entre 5 e 10°C. Caso alguma substância precipite na solução durante seu armazenamento, a solução deve ser descartada.

Ordem	Reagentes	Quantidade (g) para 1 L de solução
1	NaCl	7,996

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24/43

2	NaHCOe	0,35
3	KCl	0,224
4	K2HPO4.3H2O	0,228
5	MgCl2.6H2O	0,305
6	HCl 1N	40 ml (aproximadamente 90% da quantidade total de HCl a ser adicionada)
7	CaCl2	0,278
8	Na2SO4	0,071
9	NH2C(CH2OH)3	6,057
	Fabela 5: Reagentes utilizados na preparação da solução SBF-K9.

[068] Para a realização dos testes, foram preparados 5 litros de solução. A solução foi colocada em um galão de polietileno de alta densidade (PEAD) e armazenada em uma Incubadora B.O.D (CT-705 - Cientec) com temperatura constante de 7°C.

[069] Para o teste de bioatividade, foram impressos discos de 12 mm de diâmetro por 3 mm de espessura. Após a pirólise dos aditivos orgânicos, foram feitos dois entalhes em lados opostos ao longo da circunferência dos discos, os quais serviram de guia para amarrar um fio de polipropileno de 0,10 mm. Os discos foram limpos em álcool isopropílico absoluto (QHEMIS - P.A.), permanecendo em limpador ultrassônico por 1 minuto. Após a secagem, os discos foram amarrados e suspensos no interior de pequenos frascos de polipropileno com excelente vedação contendo a solução SBFK9. A vedação correta é importante, pois evita a evaporação da solução e mudanças na sua concentração. A razão entre a área superficial das pastilhas e o volume da solução SBF (SA/V) foi padronizada em 0,1 cm^-1, pois um aumento desta razão leva a um aumento excessivo da velocidade das reações devido ao aumento do pH da solução durante a reação (KOKUBO e KUSHITANI, 1990).

[070] Os frascos contendo os discos suspensos e a solução SBF-K9 foram então colocados em banho-maria a uma temperatura de 36,7°C (a mesma do corpo humano), onde permaneceram por tempos variando entre 6h e 7 dias. A solução de SBF foi trocada após 6h, 12h, 24h, 48h, 4 dias e 7 dias, pois estas pastilhas apresentam alta porosidade, ou seja, alta área superficial. O banho-maria Nova Técnica modelo CT 269

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25/43 apresenta controle rigoroso de temperatura (controlador Gefran 500), em que a variação de temperatura é de somente ± 0,1°C.

Análise de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR) [071] Após a exposição ao SBF-K9, as amostras foram retiradas dos respectivos frascos e mergulhadas em álcool isopropílico para a paralisação das reações. Elas foram analisadas em ambos os lados paralelos através de Espectroscopia de Infravermelho por Transformada de Fourier (FTIR). Através dessa técnica, foi possível analisar a cinética de formação da HCA no material fabricado via impressão 3D. O equipamento utilizado foi o espectrofotômetro Spectrum GX (PERKIN ELMER), modo reflectância difusa, com resolução de 4 cm^-1 e varredura de 4000 a 400 cm^-1.

Ensaios de Compressão [072] Para os ensaios de compressão, cinco scaffolds impressos em cada direção de processamento (horizontal, vertical e à 45° em relação ao plano XY) tiveram as faces paralelas coladas com resina epóxi em discos de alumínio com 32 mm de diâmetro e

2,5 mm de espessura. Os ensaios foram realizados na máquina de ensaios universal Instron (modelo 4467), com célula de carga de 50N e velocidade de ensaio de 0,5 mm/min. A aquisição de dados foi configurada para ser iniciada a uma tensão de compressão de 0,05 MPa.

[073] A seguir, são apresentados os resultados obtidos nas análises e testes feitos para definição dos parâmetros de processamento e dos enxertos obtidos a partir do processo descrito, com a composição 7, cujos componentes foram descritos na tabela 2.

[074] Anteriormente aos testes de impressão 3D, foi realizado o projeto em CAD dos scaffolds a serem processados, o desenho foi realizado com o auxílio do software Solid Edge (Siemens PLM Software). Como pode ser observado na Figura 2, os scaffolds consistem de blocos macroporosos com 22 mm de altura e 10 mm de lado, com poros interconectados de 2 mm de lado e espessura de parede de 1 mm. O design foi pensado para a obtenção de amostras adequadas para os ensaios de compressão, onde a altura da amostra precisa ser pelo menos duas vezes maior do que o lado (ou diâmetro, no caso de amostras cilíndricas). Na literatura, existem poucos estudos que

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26/43 avaliaram a resistência mecânica à compressão de scaffolds vitrocerâmicos. Em nenhum destes estudos foram analisadas propriedades mecânicas de scaffolds possuindo o grau de complexidade geométrica proposto neste trabalho.

[075] Após a preparação da mistura de pós de composição 7 (Tabela 2), a câmara de armazenagem de pó (powder bed) e câmara de impressão (part bed) da impressora 3D foram preenchidos. Durante os testes, a espessura da camada impressa foi fixada em 0,1 mm. A velocidade do rolo, assim como a quantidade de líquido impressa, também foi mantida constante.

[076] Após secagem no interior do equipamento, os scaffolds foram removidos, secos em temperatura ambiente fora do equipamento e novamente, foram secos, agora em estufa à 50°C por 24h, e submetidos à etapa de pós-processamento. Na Figura 2, os scaffolds podem ser observados após a secagem em estufa (Fig. 2a), após remoção do pó superficial com auxílio de pincel (Fig. 2b) e após a remoção do pó de suporte com jateamento de ar comprimido (Fig. 2c).

[077] Além de tornar possível a fabricação de formas complexas, uma das grandes vantagens da manufatura aditiva é a possibilidade de fabricar scaffolds em diferentes posições ou orientações. Na tentativa de eliminar o empenamento durante a secagem, scaffolds também foram processados verticalmente (direção perpendicular ao plano XY) e com uma inclinação de 45° (em relação ao plano XY). Utilizando o método de manufatura aditiva, é possível fabricar scaffolds anisotrópicos, com resistência mecânica variável de acordo com a direção de processamento (SACHLOS e CZERNUSZKA, 2003). Dessa forma, além de minimizar o efeito de empenamento durante a secagem, a fabricação de scaffolds em diferentes direções foi realizada com o intuito de avaliar se há algum efeito de anisotropia em relação à resistência mecânica à compressão.

[078] Para definir a melhor estratégia de queima, os aditivos de processamento (maltodextrina, CMC e Ca(OH)2) foram submetidos à analises termogravimétricas. A perda de massa da maltodextrina inicia-se à aproximadamente 150°C, perdurando até a temperatura de 550°C. A taxa de perda máxima (ponto de inflexão da curva) ocorre na temperatura de 290°C. A carboximetilcelulose (CMC) começa a se decompor na

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27/43 temperatura de 100°C, atingindo o máximo na temperatura de 430°C. O hidróxido de cálcio apresenta uma temperatura de decomposição mais alta, iniciando-se à 400°C e persistindo até a temperatura de 700°C. A faixa de temperatura onde ocorre a decomposição do hidróxido de cálcio é bem conhecida e os valores obtidos no ensaio de ATG são compatíveis com dados encontrados na literatura.

[079] Um pequeno pedaço de um scaffold foi removido e também analisado por ATG. [080] Na Figura 3, é possível notar dois eventos principais de perda de massa. O primeiro, de 100 a 400°C, corresponde à decomposição simultânea da maltodextrina e da CMC; já o segundo, na faixa de 400 à 700°C, corresponde à decomposição do hidróxido de cálcio. Para a decomposição do Ca(OH)2, seria necessário um patamar a uma temperatura superior à 500°C, como mostra a análise de ATG. Todavia, um patamar em temperaturas próximas ou superiores à Tg do vidro (~ 480°C) poderia promover a sua nucleação e, consequentemente, diminuir sua sinterabilidade. Assim sendo, a decomposição do Ca(OH)2 deve ocorrer posteriormente, durante a sinterização do vidro F18.

[081] Devido à grande quantidade de aditivos de processamento presente na mistura (~ 40% em peso), optou-se pela utilização de uma baixa taxa de aquecimento (1°C/min), para evitar o colapso da estrutura do scaffold. Após a pirólise dos aditivos orgânicos, foram cortadas amostras de 3,5 x 3 x 3 mm. Essas amostras foram analisadas em dilatômetro ótico, a uma taxa de aquecimento de 5°C/min até a temperatura de 1000°C. [082] De acordo com o gráfico de retração de área em função da temperatura (Fig. 4), o material impresso passa por dois estágios de retração. No primeiro estágio há uma retração de 8%, que se inicia por volta de 550°C e persiste até aproximadamente 675°C. No segundo estágio também há uma retração adicional, que ocorre entre 850°C e 870°C. A partir de 950°C, a amostra flui totalmente até a formação de meia-esfera.

[083] O vidro F18 quando submetido às mesmas condições de ensaio, apresenta uma retração de área de mais de 30% antes de fluir completamente, conforme pode ser observado na Figura 4. O vidro F18 sinteriza até praticamente atingir a densidade máxima, ou seja, atinge uma densidade relativa próxima de 1. É importante notar também que, o processo de sinterização do material impresso inicia-se a uma próxima

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28/43 da temperatura de início ou “onset” de sinterização do vidro F18 puro (524°C e 508°C, respectivamente). Entretanto, o primeiro estágio de densificação ocorre a uma taxa mais lenta, ou seja, a variação da retração com a temperatura é mais suave.

[084] Uma amostra da barra impressa também foi ensaiada em DSC, após a remoção dos aditivos de processamento. Como pode ser observado na Figura 5, a Tg da amostra impressa é próxima do valor obtido para o vidro F18 (Tg ~ 480°C). Enquanto que a cristalização do vidro F18, antes do processo de mistura e impressão, é praticamente imperceptível, a amostra impressa apresenta dois picos de cristalização (Tc1 e Tc2) intensos. Esses dois picos ocorrem aproximadamente na mesma faixa de temperatura onde há os dois eventos de retração linear, revelados pelo ensaio em dilatômetro ótico (Fig. 5).

[085] É possível que a cristalização do vidro F18 esteja relacionada à saturação da retração nos dois casos. De acordo com Prado et al. (2008), a formação de uma camada cristalizada na superfície das partículas vítreas, mesmo que esta possua apenas alguns micrômetros de espessura, é suficiente para interromper o processo de fluxo viscoso. A temperatura de onset do pico de fusão (Tm - Fig. 5) coincide com a temperatura onde ocorre o amolecimento da amostra (~ 950°C).

[086] As curvas de DSC e retração em função da temperatura do vidro F18 indicam que ele possui baixa tendência à cristalização. Dessa forma, a cristalização do vidro F18 impresso pode estar relacionada a uma reação entre o óxido de cálcio residual e o vidro F18.

[087] A amostra sinterizada foi moída em almofariz de ágata e analisado por difração de raios-X (DRX). No espectro obtido (Fig. 6), foram identificadas fases cristalinas ricas em cálcio como o silicato de cálcio (Ca2SiO4 - ICDD 86-401 PDF#2) e o silicato de cálcio e magnésio (CaMg(SiO3)2 - ICDD 2-657 PDF#2). Além dessas duas fases, o óxido de silício (SiO2 - ICDD 86-1563 PDF#2) também foi identificado. No espectro, percebe-se a presença de pelo menos mais uma fase cristalina não identificada. A presença do halo característico de fases amorfas entre 25° e 35° confirma que o vidro F18 não cristalizou completamente durante o processo de sinterização. A análise por DRX não indicou a presença de hidróxido de cálcio ou de óxido de cálcio residual.

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29/43 [088] Uma vez definidas as melhores condições (taxa de aquecimento de temperatura) para a pirólise dos aditivos de processamento, novos ensaios foram realizados em dilatômetro ótico. Para isso, foram utilizadas as amostras de 3,5 x 3 x 3 mm cortadas a partir da barra impressa. Inicialmente, foram testadas diferentes taxas de aquecimento, de 430°C (temperatura para pirólise da CMC) até o amolecimento total da amostra, que ocorre entre 950°C e 1000°C. Esses testes foram realizados com objetivo de encontrar a taxa de aquecimento ideal para a sinterização do material impresso.

[089] Após a queima, todos os scaffolds apresentaram resistência mecânica ao manuseio considerada satisfatória. A espessura da parede e o tamanho dos macroporos foram determinados através de análise de imagens obtidas em estereomicroscópio (medidas realizadas com o auxílio do software Image-J).

[090] A técnica de impressão 3D apresenta limitação em relação ao tamanho de poros: quando os poros são inferiores a 1 mm, é difícil remover o pó de suporte do interior de scaffolds, caso apresentem uma geometria complexa. As limitações em relação à espessura da parede e ao tamanho dos poros, dificulta a obtenção de scaffolds com macroporosidade superior a 60%. Desse ponto de vista, a utilização dos aditivos orgânicos de processamento (maltodextrina e CMC) com DTP grosseira é benéfica, pois eles atuam como agentes porogênicos durante a queima do scaffold, aumentando a sua porosidade total.

[091] Para a realização da análise da porosidade e da microestrutura da parede, cortou-se um pequeno pedaço do scaffold, que foi embutido sob vácuo em resina epóxi de baixa viscosidade. Após o desbaste e polimento, a amostra foi recoberta com ouro e analisada em MEV-FEG. Como pode ser observado nas figuras 7a-b, a parede do scaffold é composta por uma rede de poros interconectados. Análises de imagens do scaffold embutido em resina revelaram que suas paredes possuem porosidade por volta de 45 ± 5 %. Somada à macroporosidade (~ 32%), os scaffolds apresentam uma porosidade total de aproximadamente 77 ± 5%. Esse valor de porosidade é considerado satisfatório para a aplicação da proposta e superior aos valores encontrados na literatura para scaffolds produzidos via manufatura aditiva.

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30/43 [092] A parede do scaffold apresenta microestrutura complexa, composta por “ilhas” de vidro residual (Fig. 7 c-d) envoltas por regiões cristalizadas. A existência de vidro residual é confirmada pelo difratograma de raios-X apresentado na Figura 6. A região cristalina é composta por cristais aciculares (Fig. 7 e-f).

[093] Para os ensaios de resistência mecânica à compressão, os scaffolds sinterizados foram colados com resina epóxi em discos de alumínio, com 32 mm de diâmetro e 2,5 mm de espessura (Fig. 8). Como é observado na Figura 9, os valores de resistência mecânica à compressão dos scaffolds impressos na direção horizontal e à 45° em relação ao plano XY são similares, de 5 ± 2 MPa e 5 ± 1 MPa, respectivamente. A resistência dos scaffolds impressos na posição vertical apresentaram um valor médio superior, de cerca de 10 MPa; todavia, o desvio padrão também é alto, de 6 MPa.

[094] Assim sendo, não houve diferença significativa entre as diferentes direções de impressão em termos de resistência mecânica à compressão.

[095] Embora a alta porosidade e a presença de poros grandes favoreçam o crescimento do tecido ósseo no interior do scaffold, essas características resultam na diminuição de sua resistência mecânica. Como o osso está continuamente sob solicitação, as propriedades mecânicas do scaffold devem ser similares ao do osso onde este será implantado, de forma que a mobilização do local lesionado possa ocorrer o mais cedo possível (AGRAWAL, 2001 e LEONG et al., 2003). O scaffold deve conferir estabilidade mecânica à região onde o material foi colocado durante o período em que o novo tecido ósseo é formado, uma vez que o processo de regeneração depende não apenas do estimulo biológico, mas, também do estímulo mecânico. A imobilização do osso por meio de pinos, placas e dispositivos intramedulares é indesejável devido ao fenômeno conhecido como “stress-shielding”. Os dispositivos metálicos de imobilização possuem um módulo elástico muito superior ao do osso cortical. Isso faz com que o metal suporte a maior parte da carga durante o movimento, causando a reabsorção óssea da região que deixa de receber o estímulo mecânico.

[096] Alguns dados experimentais da literatura mostram que a relação entre a porosidade do scaffold e a tensão de compressão na ruptura segue um comportamento linear decrescente (GERHARDT e BOCCACCINI, 2010). Para os diferentes tipos de

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31/43 scaffolds testados, um aumento de 10% na porosidade provoca uma queda na tensão de compressão da ordem de 2 a 15 MPa (Fig. 10). Geralmente, a resistência mecânica à compressão de scaffolds vitrocerâmicos produzidos pelo método da réplica (“polymer sponge method”), com porosidade superior a 90%, situa-se abaixo de 1 MPa. A relação linear deixa de valer para porosidades acima de 90%, onde tensões de compressão muito baixas provocam o colapso da estrutura do scaffold.

[097] Utilizando as técnicas de manufatura aditiva, é possível fabricar scaffolds mais resistentes. O grande problema reside na porosidade total alcançável, geralmente inferior a 60%. Kolan et al. (2011) por exemplo, usaram o método de sinterização seletiva a laser indireta (Indirect Selective Laser Sintering) para fabricar scaffolds a partir do vidro 13-93. Para uma porosidade de aproximadamente 50%, os autores obtiveram scaffolds com resistência à compressão de 20 MPa. Já para uma porosidade de 63%, a porosidade máxima atingida, a resistência dos scaffolds foi reduzida para 6 MPa.

[098] Wu et al. (2011) utilizaram uma técnica de impressão 3D para fabricar scaffolds a partir de um vidro bioativo mesoporoso (15CaO-5P2O5-80SiO2, % mol). Os autores conseguiram scaffolds com uma porosidade de 60,4% e resistência mecânica à compressão de 16 ± 2 MPa. O scaffold vitrocerâmico mais resistente reportado na literatura até o momento foi produzido pelo método de robocasting. Utilizando este método, Fu et al. (2011) produziram scaffolds do vidro 6P53B com resistência mecânica à compressão de 136 ± 22 MPa, valor comparável à resistência mecânica do osso cortical humano (100 - 150 MPa). Entretanto, a porosidade total obtida foi baixa, de apenas 60%. A maioria dos trabalhos encontrados na literatura consideram esse valor de porosidade insuficiente para garantir que o scaffold seja totalmente preenchido pelo tecido ósseo e, posteriormente, reabsorvido após a implantação.

[099] A grande variação encontrada na literatura para os valores de tensão de compressão máxima ocorre devido aos diferentes métodos de fabricação empregados, que levam a diferentes tamanhos, geometrias e distribuição de tamanho de poros.

[100] Além disso, depende também da geometria e da espessura da parede do scaffold, assim como do formato da amostra utilizada no ensaio de compressão. O

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32/43 valor médio de aproximadamente 5 MPa para a resistência mecânica à compressão dos scaffolds descritos no presente pedido, está dentro da faixa de resistência mecânica observada para o osso trabecular (0,2 - 12 MPa).

[101] Embora a combinação entre resistência mecânica e porosidade (5 MPa e 77%, respectivamente) obtida nos scaffolds descritos no presente pedido, seja superior aos valores normalmente encontrados na literatura (ponto vermelho em destaque - Fig.

10), a utilização destes scaffolds ainda estaria limitada a regiões do corpo humano que são submetidas a baixos níveis de solicitação mecânica, como os ossos do crânio e da face.

[102] A alta bioatividade do vidro F18 já foi comprovada em outros estudos in vitro e in vivo (SOUZA, 2012; GABAI-ARMELIN et al, 2015). Contudo, o material impresso também contém Ca(OH)2 (composição 07), além do vidro F18. O vidro F18 possivelmente reage com CaO residual, cristalizando durante o processo de sinterização, dessa forma, o efeito da cristalização desse vidro na bioatividade foi avaliado pelo teste in vitro. Para isso, foram impressos discos de 12 mm de diâmetro por 3 mm de espessura (Fig. 11 - a). Após o pós-processamento e secagem em estufa à 50°C/24h, os discos foram submetidos ao mesmo procedimento de queima empregado no caso dos scaffolds.

[103] Em seguida, foram feitos dois entalhes nas laterais de cada disco para a fixação do fio de nylon. Os discos foram então suspensos dentro dos frascos contendo a solução de SBF (Simulated Body Fluid) e colocados em banho termoestático à 36,7°C.

[104] Como as pastilhas são porosas e apresentam alta área superficial, a solução de SBF foi trocada após 6h, 24h, 48h, 3 dias e 4 dias. Ravagnani (2003) mostrou que quando a razão área superficial/volume de solução é alta (> 1), a formação de HCA é atrasada ou até mesmo inibida. Isso ocorre porque uma alta área superficial provoca um grande aumento do pH local; quando o pH é igual ou superior a 9, não há formação de HCA. É por esse motivo que se realiza a troca periódica da solução de SBF durante testes de bioatividade in vitro com scaffolds porosos. Esse procedimento foi adotado em vários estudos (BLAKER et al., 2003; CHEN et al., 2006; REZWAN et al., 2006).

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33/43 [105] Após a exposição ao SBF, os discos foram mergulhados em álcool isopropílico por 1 minuto e secos à temperatura ambiente. Em seguida, foram analisados por FTIR e microscopia eletrônica de varredura. Os espectros de FTIR obtidos são apresentados na Figura 12. O modo vibracional natural da superfície não reagida (0h de exposição ao SBF) é alterado em função do tempo de exposição à solução de SBF.

[106] Após 6h, já pode ser observada a formação de uma camada rica em sílica gel. A existência da camada rica em SiO2 é confirmada pelo duplo pico de estiramento da ligação Si-O-Si à 1250 e 1095 cm^-1, assim como o estreitamento do pico correspondente à ligação Si-O-Si a 470 cm^-1. O pico da ligação Si-O presente no espectro dos materiais não reagidos em 930 cm^-1, desaparece devido ao processo de repolimerização.

[107] Para o tempo de exposição ao SBF de 6h já é possível observar também que a camada rica em fosfato de cálcio (CaP) amorfo começa a precipitar. A precipitação de CaP amorfo é caracterizada por um pico largo à 560 cm^-1. Apesar do FTIR não detectar a presença de HCA com 6h de exposição, a análise por MEV mostrou que houve a formação de cristais de HCA em pontos isolados na superfície da amostra (Fig. 13). Os cristais de HCA são facilmente identificados, pois apresentam morfologia globular típica.

[108] O pico largo à 560 cm^-1 (Fig. 12) se torna mais definido conforme o tempo de reação aumenta, sendo posteriormente dividido em dois modos, à 602 e 560 cm^-1, relativos à ligação P-O e que são característicos da HCA. A divisão em dois picos indica que o CaP amorfo está começando a cristalizar, formando a HCA.

[109] Simultaneamente, a formação da HCA cristalina na superfície das amostras produz um pico relativo ao estiramento da ligação P-O à 1050 cm^-1. O surgimento do segundo pico ocorre após 48h de exposição ao SBF. A partir de 48h, os picos relativos à HCA passam a dominar completamente o espectro. Apesar do espectro das amostras expostas ao SBF por 12h e 24h também não indicarem a presença da HCA, as micrografias mostram que a quantidade de HCA formada da superfície dos discos impressos aumenta gradualmente (Fig. 14), principalmente no interior e ao redor de poros ou outros defeitos superficiais.

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34/43 [110] Após 48h de exposição, a superfície dos discos impressos é completamente coberta por cristais de HCA (Fig. 15). Os cristais de forma globular crescem ainda mais com o tempo de exposição ao SBF (Fig. 16). A análise por microscopia eletrônica mostra que a formação da HCA na superfície das partículas é um processo gradual e heterogêneo. A nucleação e crescimento de cristais de HCA ocorre inicialmente a partir de sítios preferenciais como poros e outros defeitos superficiais. A análise por FTIR só é capaz de detectar a cristalização de HCA depois que a maior parte da área da superfície da amostra foi coberta por cristais de HCA.

[111] De acordo com Souza (2012), a superfície do vidro F18 sólido é totalmente coberta por uma camada de HCA após apenas 12h de exposição à solução de SBF.

[112] Os testes de bioatividade in vitro indicam que a cristalização do vidro F18 durante a sinterização diminui sua bioatividade. Todavia, a formação de HCA não é inibida; com apenas 6h de exposição à solução de SBF, surgem cristais isolados de HCA na superfície do material sinterizado.

[113] A seguir, são apresentados os resultados obtidos nas análises e testes realizados com os enxertos obtidos a partir do processo descrito utilizando-se a composição 9 como matéria-prima, cujos componentes foram descritos na tabela 2.

[114] Na composição 09 (ou C07/p-TCP) o Ca(OH)2 foi substituído por β-TCP, um fosfato de cálcio conhecido por sua maior solubilidade e bioatividade em relação à hidroxiapatita (HA). Esse material é muito estudado e vendido como enxerto ósseo por diversas empresas. O β-TCP também é vendido como reagente químico para a fabricação de cimentos bioativos. Em contato com água, o β-TCP sofre uma reação de hidratação, formando uma fase similar à hidroxiapatita, conhecida como PHA ou hidroxiapatita precipitada (REZWAN, 2006):

e-Ca3(PO4)2 + H2O Ca9(PO4)5(HPO4)(OH) [115] Além do vidro F18, a composição 09 também contém maltodextrina e carboximetilcelulose (CMC). Após a preparação de grande quantidade da mistura de pós (~ 500g) de composição 09, a câmara de armazenagem de pó (powder bed) e câmara de impressão (part bed) da impressora 3D foram parcialmente preenchidos. Durante os testes, a espessura da camada impressa foi fixada em 0,1 mm. A

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35/43 velocidade do rolo, assim como a quantidade de líquido impressa (resolução ou binder saturation), também foram mantidos constantes. Como pode ser observado na Figura 17 a - b, a mistura apresentou boa fluidez e não houve falhas de preenchimento durante o processo de impressão de scaffolds, barras e discos, sendo os scaffolds impressos na direção horizontal.

[116] Após secagem no interior do equipamento (temperatura ambiente por 24h), os scaffolds foram removidos, secos novamente em estufa à 50°C por 24h, e submetidos à etapa de pós-processamento. Na Figura 17, podem ser observados os scaffolds após a secagem em estufa e remoção do pó superficial com auxílio de pincel (Fig. 17 - c), e após a remoção do pó de suporte com jateamento de ar comprimido (Fig. 17 - d).

[117] Na Figura 18, são apresentadas micrografias de MEV do scaffold (superfície paralela ao plano XY em relação à mesa de construção) à verde, após a secagem em estufa à 50°C/24h. É possível observar nessa figura que as partículas de vidro F18 (partículas maiores e de coloração clara, Fig. 18 - d) estão envolvidas por uma matriz de coloração mais escura, formada pela solubilização da maltodextrina e do CMC. As partículas menores são do pó de β-TCP, que apresenta uma distribuição de tamanho de partículas mais fina.

[118] Para os testes de sinterização e de bioatividade in vitro, também foram impressas barras (80 x 3 x 3 mm) e discos (12 mm de diâmetro por 3 mm de espessura). As barras e os discos à verde, obtidos após secagem em estufa à 50°C/24h, são apresentados na Figura 19.

[119] Para determinar as melhores condições de sinterização do scaffold, a barra sólida de 80 x 3 x 3 mm impressa foi utilizada. Após a secagem em estufa (50°C/24h), a barra foi submetida a um tratamento térmico para eliminação dos aditivos orgânicos. As melhores condições para a pirólise da maltodextrina e da CMC foram determinadas através de análises termogravimétricas.

[120] Devido à grande quantidade de aditivos de processamento presente na mistura (~ 40% em peso), optou-se pela utilização de uma baixa taxa de aquecimento (1°C/min) para evitar o colapso da estrutura. Após a pirólise dos aditivos orgânicos, foram

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36/43 cortadas amostras de 3,5 x 3 x 3 mm. Essas amostras foram analisadas em dilatômetro ótico, a uma taxa de aquecimento de 5°C/min até a temperatura de 860°C.

[121] De acordo com o gráfico de retração de área em função da temperatura (Fig. 20), o material impresso passa por dois estágios de retração. No primeiro estágio há uma retração de 20%, que se inicia por volta de 500°C (apenas 20°C acima da Tg do vidro F18) e persiste até aproximadamente 650°C. O segundo estágio de retração inicia-se na temperatura de 775°C, persistindo até a temperatura de 860°C; a partir dessa temperatura a amostra flui completamente.

[122] Uma amostra da barra impressa também foi ensaiada em DSC, após a remoção dos aditivos de processamento. Como pode ser observado na Figura 21, a Tg da amostra de formulação C07/p-TCP é próxima do valor obtido para o vidro F18 (Tg ~ 480°C). Enquanto que o vidro F18 não apresenta pico de cristalização, a formulação C07/p-TCP apresenta um pico largo de cristalização, com máximo na temperatura de 700°C. Entretanto, esse pico de cristalização é bem menos intenso quando comparado ao pico de cristalização da formulação 7, que possui Ca(OH)2 em sua composição. A substituição de Ca(OH)2 por β-TCP na formulação 7 diminui, portanto, sua tendência à cristalização. Isso explica a melhor sinterabilidade da formulação C07/e-TCP, que atinge uma retração de 20%, enquanto que a formulação 7 (contendo Ca(OH)2) atinge uma retração de apenas 10%, quando aquecidos a uma taxa de 5°C/min.

[123] Posteriormente, uma nova amostra foi sinterizada à 5°C/min até a temperatura de 700°C, permanecendo nesta temperatura até a saturação total da retração de área. A temperatura de 700°C situa-se após endpoint do primeiro evento de retração de área (seta azul - Fig. 20). O objetivo dessa medida foi observar se a retração total atingida pode ser maximizada através de um tratamento térmico isotérmico nessa temperatura.

[124] A curva de retração de área em função do tempo para esse tratamento térmico é apresentada na Figura 22. Nesse gráfico, a expansão da amostra é mais visível (a partir de 10 min., até 40 min. ou ~ 500°C); essa expansão está relacionada ao alto coeficiente de expansão térmica do vidro F18, já que esse apresenta óxido de potássio em sua composição. A retração da amostra atinge a saturação antes de alcançar a

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37/43 temperatura de 700°C; não há densificação adicional com o tratamento térmico isotérmico nesta temperatura.

[125] No teste seguinte, uma amostra foi sinterizada à 5°C/min até 830°C, temperatura correspondente ao ponto de inflexão do segundo evento de retração (seta vermelha Fig. 20). Em seguida, a amostra foi submetida a um tratamento térmico isotérmico à 830°C. Conforme pode ser observado na Figura 23, o segundo evento de retração de área atinge a saturação apenas após 30 min. de tratamento térmico na temperatura de 830°C. A retração de área alcançada após o segundo estágio (50%) é bem superior ao verificado para a amostra sinterizada à 700°C (20%). A partir de 130 min. de tratamento térmico, a amostra volta a apresentar expansão volumétrica. Durante esse ensaio, a amostra fluiu parcialmente, perdendo sua forma geométrica original. Como os scaffolds apresentam estrutura macroporosa e complexa, optou-se pela sinterização desses na temperatura de 700°C por 30 minutos. É necessário ressaltar que a substituição de Ca(OH)2 por β-TCP na formulação 7 culminou em três efeitos altamente desejáveis: i. diminuição da tendência à cristalização do sistema, como pode ser observado nas curvas de DSC - Figura 21); ii. diminuição da temperatura ótima de sinterização, passando de 870°C na composição 7 para 700°C na composição C07/ β-TCP; iii. aumento da retração máxima alcançável em 10%, passando de 10% na composição 7 para 20% na composição C07/ β-TCP.

[126] Os scaffolds impressos e pós-processados foram então posicionados sobre uma placa de mulita (3Al2Oe-2SiO2) e colocados no interior do forno. Devido à liberação de gases como CO e CO2 provenientes da pirólise dos aditivos orgânicos, a queima ocorreu no interior de uma capela. Na Figura 24, são apresentadas imagens de scaffolds de formulação C07/ β-TCP, sinterizados conforme o procedimento descrito anteriormente. Nota-se que eles apresentam coloração levemente acinzentada. Inicialmente, presumiu-se que isso ocorreu devido à pirólise incompleta de orgânicos. Contudo, um tratamento térmico realizado à 700°C por 24h não promoveu nenhuma alteração de cor.

[127] Como é mostrado nas micrografias (Fig. 25), a parede do scaffold apresenta alta porosidade, com poros interconectados. A porosidade presente em sua parede, apesar

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38/43 de diminuir sua resistência mecânica, pode favorecer a adesão e penetração de osteoblastos in vivo. Consequentemente, uma maior área superficial exposta à fluídos corpóreos resulta no aumento da taxa de reabsorção do scaffold in vivo.

[128] Um scaffold sinterizado à 700°C por 30 min. foi moído em almofariz de ágata e analisado por DRX. No espectro obtido (Fig. 26), não foi identificada a fase β-TCP (Ca3(PO4)2, 9-169/PDF#2). Os picos relativos à fase β-TCP estão presentes no scaffold à verde, porém não aparecem no scaffold após a sinterização. Provavelmente, uma ou mais fases cristalinas foram geradas como produto da reação do β-TCP com vidro F18. Essa hipótese é válida, uma vez que sabemos que a fase β-TCP não sofre nenhum tipo de transformação polimórfica abaixo da temperatura de 1125°C. No espectro obtido para o scaffold sinterizado, também foi observado um halo característico de fases amorfas, indicando a presença de vidro F18 residual.

[129] Como já descrito anteriormente, a composição C07^-TCP também foi utilizada na impressão 3D de discos de 12 mm de diâmetro por 3 mm de espessura. Esses discos apresentam dimensões adequada para a realização do teste de bioatividade in vitro em SBF. O mesmo procedimento utilizado para a queima dos scaffolds, foi empregado no caso dos discos. Na Figura 27, são apresentadas imagens dos discos obtidos após o processo de sinterização à 700°C por 30 minutos. Os discos foram amarrados com fio de nylon e expostos à solução de SBF por tempos variando entre 6 e 48h. Após a exposição ao SBF, os discos foram mergulhados em álcool isopropílico anidro e secados ao ar por 10 minutos. Em seguida, foram analisados por FTIR e MEV.

[130] Assim como no caso dos scaffolds, os discos apresentaram coloração cinza.

[131] Na Figura 28, é possível observar o espectro relativo ao disco de formulação C07^-TCP sem exposição ao SBF (0h). Podem ser observados dois picos relativos à ligação Si-O-Si (470 cm^-1 e 1095 cm^-1) e um pico à 925 cm^-1, relativo a oxigênios nãoponteantes (ligação Si-O). Além disso, um pico em 560 cm^-1 relativo à ligação P-O pode ser notado, indicando a presença de um fosfato. Esse fosfato surge possivelmente como produto da reação entre o β-TCP e o vidro F18. E não se trata do β-TCP, já que esta fase não foi identificada na análise de DRX (Fig. 26).

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39/43 [132] Com apenas 6h de exposição ao SBF, já é possível observar dois pequenos picos à 560 cm^-1 e 602 cm^-1, relativos à ligação P-O (Fig. 28). Esses dois picos indicam a presença de fosfato de cálcio na forma cristalina (HCA). De fato, as imagens obtidas em MEV mostram que após 6h, a superfície dos discos está repleta de pequenos cristais de HCA (Fig. 29 a - b), o que afasta a possibilidade de que esses dois picos estejam relacionados a algum outro tipo de fosfato pré-existente. O pico a 1095 cm^-1, relativo ao estiramento da ligação Si-O-Si, indica a presença de sílica gel. Contudo, o pico a 470 cm^-1 relativo à ligação Si-O-Si é bem pequeno, demonstrando que a camada de HCA formada cobre praticamente toda a camada de sílica gel precursora.

[133] Os espectros da superfície dos discos após 12 e 24h de exposição ao SBF são bem parecidos; em ambos os casos, o pico a 470 cm^-1 relativo à ligação Si-O-Si desapareceu por completo (Fig. 28). Os picos a 560 cm^-1 e 602 cm^-1, relativos à ligação P-O, possuem intensidade ligeiramente superior ao observado na amostra com 6h de exposição. As imagens de MEV também são similares; em ambos os casos a superfície do material está inteiramente recoberta por cristais de HCA (12h de exposição ao SBF, Fig. 29 c - d e 24h de exposição ao SBF, Fig. 29 e - f).

[134] Após 48h de exposição ao SBF, os picos relativos à HCA (560 cm^-1, 602 cm^-1 e 1050 cm^-1) dominam o espectro de FTIR por completo (Fig. 28). O que é confirmado pela imagem obtida por microscopia eletrônica de varredura (Fig. 29), onde é possível observar grandes cristais globulares de HCA sobre toda a superfície do material.

[135] Como já mencionado, o recobrimento completo da superfície por uma camada de HCA na formulação 7 se dá apenas após 48h de exposição ao SBF, embora cristais de HCA distribuídos heterogeneamente na superfície tenham sido observados antes disso. Portanto, é possível afirmar que a substituição do Ca(OH)2 por β-TCP resultou em um aumento considerável da bioatividade do material impresso.

[136] De forma a maximizar a resistência mecânica dos scaffolds, eles foram infiltrados com colágeno hidrolisado. Um trabalho realizado por um dos inventores em colaboração com a Universidade de Erlangen-Nuremberg e publicado em 2013, demonstrou que a infiltração de scaffolds de vidro F18 (obtidos pelo método da réplica) com colágeno promove um aumento significativo da resistência à compressão. Além de

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40/43 contribuir para o melhoramento das propriedades mecânicas, a presença do colágeno não alterou de forma significativa a bioatividade do vidro F18. A composição 07 foi escolhida apenas como prova de conceito, ou seja, scaffolds de composição 09 (ou qualquer outra composição) também poderiam ter sido utilizados.

[137] Os scaffolds foram infiltrados com uma solução concentrada de colágeno (1g/mL) e sob vácuo, com o objetivo de se preencher efetivamente os poros presentes na estrutura do scaffold, mantendo, contudo, os macroporos abertos. Assim sendo, um aumento efetivo da resistência mecânica à compressão é esperado.

[138] É possível observar na Figura 30 (a-d) que, após a secagem ao ar, os poros foram preenchidos com sucesso. Os macroporos permaneceram abertos devido ao jateamento com ar comprido, após o procedimento de infiltração com colágeno. O total preenchimento dos poros foi confirmado por microscopia eletrônica de varredura (Fig. 30 e - f). É possível observar na Figura 30-e, que a camada de colágeno apresenta trincas; além disso, “ilhas” de vidro F18 cristalizado permaneceram expostas (regiões mais claras, Fig. 30 - f).

[139] A presença de uma camada espessa de colágeno impede o contato do vidro F18 com a solução de SBF e a subsequente liberação de íons que levam à formação de hidroxicarbonato apatita (HCA) na superfície do vidro. Apesar do colágeno hidrolisado apresentar alta solubilidade em meio aquoso, a formação da HCA na superfície do material poderia ser retardada até que todo o colágeno fosse dissolvido. A formação de HCA na superfície do vidro é importante, pois está relacionada à osteocondução (JONES et al. 2007); quanto mais rápida é a formação da HCA, maior é o potencial osteocondutor. A liberação de íons para fora da interface material/tecido também é importante, pois o potencial osteoindutor dos vidros bioativos depende da absorção destes íons pelas células osteoprogenitoras (HENCH e POLAK, 2002).

[140] Para acelerar a liberação de íons e a formação da HCA, foi adicionado ao colágeno dissolvido, 2,5g de vidro F18 em pó (tamanho médio de partículas de 5 pm).

[141] Assim, conforme o colágeno é dissolvido, partículas de vidro F18 são expostas, permitindo a liberação de íons que precede a formação de HCA. Esse procedimento ainda não foi explorado na literatura; a infiltração de scaffolds com um polímero

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41/43 reabsorvível contendo partículas de biovidro F18 (4) é, portanto, uma proposta original e inovadora.

[142] Para o teste de bioatividade in vitro, os discos impressos foram infiltrados com a solução de colágeno contendo partículas de vidro F18 (CB) e secos à temperatura ambiente por 48h. Após a exposição ao SBF, os discos foram mergulhados em álcool isopropílico por 1 minuto e mais uma vez secos à temperatura ambiente. Em seguida, foram analisados por FTIR e microscopia eletrônica de varredura.

[143] Os espectros de FTIR obtidos são apresentados na Figura 31. O modo vibracional natural da superfície não reagida (0h de exposição ao SBF) é alterado em função do tempo de exposição à solução de SBF. Após 6h, já pode ser observada a formação de uma camada rica em sílica gel. A existência da camada rica em SiO2 é confirmada pelo duplo pico de estiramento da ligação Si-O-Si à 1250 e 1095 cm^-1, assim como o estreitamento do pico correspondente à ligação Si-O-Si a 470 cm^-1 (Fig. 31). A secagem da camada de sílica gel, após a retirada da amostra da solução, leva à formação de trincas (Fig. 32 a - b). Além disso, dois pequenos picos à 560 e 602 cm-1, relativos à ligação P-O, indicam a presença de cristais de HCA; na Figura 32 a - b, é possível observar a presença de cristais sub-micrométricos de HCA espalhados heterogeneamente sobre a camada amorfa de sílica gel. De acordo com o teste de bioatividade apresentado anteriormente (onde apenas o scaffold sinterizado - e, portanto, sem polímero - foi exposto à solução de SBF), o segundo pico a 602 cm-1 relativo à ligação P-O surge apenas após 48h de exposição ao SBF.

[144] Após 12h de exposição, a superfície do material já está inteiramente coberta por pequenos cristais de HCA de hábito cristalino globular (Fig. 32 c - d). Esses cristais aumentam de tamanho com 24h de exposição (Fig. 32 e - f), e apesar de sua presença, a sílica gel, presente sob a fina camada de HCA, ainda pode ser detectada após 12 e 24h de exposição (pico relativo à ligação Si-O-Si, a 470 cm^-1 - Fig. 31). Após 48h, apenas os picos relativos à HCA podem ser visualizados no espectro de infravermelho (Fig. 31); nesse caso, uma espessa camada de HCA se forma na superfície do material (Fig. 32 g - h).

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42/43 [145] Para os ensaios de resistência à compressão, os scaffolds de composição 07 impressos na direção horizontal foram infiltrados sob vácuo com a solução de colágeno contendo partículas de vidro F18. Para a preparação dos corpos de prova, os scaffolds sinterizados foram colados com resida epóxi em discos de alumínio, com 32 mm de diâmetro e 2,5 mm de espessura (Fig. 33).

[146] No total, foram ensaiados 5 scaffolds; utilizou-se uma célula de carga de 50N e velocidade de ensaio de 0,5 mm/min. A aquisição de dados foi configurada para ser iniciada a uma tensão de compressão de 0,05 MPa. A área da seção reta dos scaffolds é de aproximadamente 0,54 cm², devido a sua geometria complexa, a carga aplicada não é distribuída homogeneamente sobre a área total da seção transversal, mas na verdade suportada por 16 pequenos pilares. O cálculo da área da seção transversal desses pilares foi realizado utilizando-se o software Image-J. Para isso, foi feita uma imagem da face (direção perpendicular à direção de aplicação da carga) de um scaffold em estereomicroscópio. A área da seção reta de cada pilar é de aproximadamente 0,008 cm², o que dá uma área total de 0,128 cm². A somatória da área de seção reta dos 16 pilares foi considerada a mesma para todos os scaffolds.

[147] Na Figura 34, são apresentadas algumas curvas de tensão de compressão em função da deformação para os scaffolds impressos na direção horizontal. Algumas das curvas de tensão-deformação são irregulares, com quedas súbitas na tensão. Isso ocorre devido à fratura de pequenos pilares do scaffold, em pontos onde há concentração de tensão. As amostras atingiram valores máximos de tensão variando entre 12 e 29 MPa.

[148] Após a tensão máxima ser atingida, ocorre o colapso da estrutura do scaffold, havendo uma queda abrupta na tensão. A fratura do scaffold ocorre nos pequenos pilares de sustentação, como pode ser observado na Figura 35. Com a continuidade do ensaio, a amostra é reduzida à pó, com a tensão tendendo à zero (Fig. 36).

[149] Os scaffolds impressos na direção horizontal e infiltrados com colágeno apresentaram uma resistência mecânica à compressão média de 19 ± 7 MPa. Conforme mencionado anteriormente, sem a presença do colágeno, os scaffolds impressos na direção horizontal apresentam uma resistência à compressão de

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43/43 aproximadamente 5 ± 2 MPa, ou seja, os scaffolds infiltrados com colágeno apresentaram uma resistência mecânica quase quatro vezes superior.

[150] A combinação de porosidade total (77%) e resistência mecânica à compressão (~ 19 MPa) é muito superior aos valores encontrados na literatura para outros scaffolds produzidos a partir de vidros bioativos (Fig. 37). A grande variação encontrada na literatura para os valores de tensão de compressão máxima ocorre devido aos diferentes métodos de fabricação empregados, que levam a diferentes tamanhos, geometrias e distribuição de tamanho de poros. Além disso, depende também da geometria e da espessura da parede do scaffold, assim como do formato da amostra utilizada no ensaio de compressão. A resistência mecânica desses scaffolds é inclusive superior à resistência mecânica observada para o osso trabecular (0,2 - 12 MPa).

[151] A partir do exposto, observa-se que o PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ENXERTOS ÓSSEOS BIOATIVOS POR IMPRESSÃO 3D E PRODUTOS OBTIDOS resolvem problemas presentes no atual estado da técnica de maneira inovadora e com aplicabilidade industrial, sendo, portanto, merecedores do privilégio de patente de invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ENXERTOS ÓSSEOS BIOATIVOS POR IMPRESSÃO 3D caracterizado por se iniciar com a obtenção do vidro F18 na forma de frita (V), para tanto, seus componentes (C1): SiÜ2 (43-52% em peso), Na2Ü (4-9,5% em peso), K2O (20,5-32% em peso), MgO (0,5-2,5% em peso), CaO (15-20% em peso), Au (0,1-3,5% em peso), Ag (0,1-3,5% em peso), B2O3 (1,5-4% em peso), P2O5 (1-6% em peso), ZnO (0,1-3,5% em peso) e SrO (0,13,5% em peso) são misturados (E1) em misturador do tipo “V”, por 12h, e colocados (E2) em cadinho de cerâmica, o qual é aquecido (E3) no interior de um forno elétrico, a 1350°C por 1h, sob agitação de uma haste de platina; o vidro fundido (2) é vertido (E4) em água (A), obtendo-se a frita (V), que é seca (E5) em estufa a 80°C por 24h, passando por dois processos de moagem: o primeiro processo de moagem (E6) é realizado em moinho de discos rotativos, reduzindo-a a um tamanho de partícula inferior a 1 mm; em seguida, o pó grosseiro de vidro F18 (3) é moído (E7) em moinho de jato, onde obtém-se uma distribuição de tamanho de partículas entre 3 e 400 pm; o pó de biovidro F18 (4) com granulometria entre 3-400pm, é então, misturado (E8), numa proporção de 50-88% em peso, aos demais componentes (C2): maltodextrina (até 22% em peso), acetato de magnésio (até 3% em peso), carboximetil-celulose (até 15% em peso), hidróxido de cálcio (até 10% em peso), fosfato de tricálcio-β (até 25% em peso), fosfato dibásico de potássio (até 25% em peso) e fosfato dibásico de sódio (até 50% em peso) em misturador do tipo “V” por 12h; a mistura de pós (M) é então colocada (E9) na impressora 3D, onde os scaffolds (S) são impressos camada-a-camada; após secagem (E10) no interior do equipamento à temperatura ambiente, por 24h, os scaffolds (S) são retirados (E11) dele e, também pelo período de 24h, são secos (E12) à temperatura ambiente por mais 24h, depois disso, são secos em estufa (E13) à 50^oC por 24h; então, o pó de suporte existente no interior dos poros dos scaffolds (S) é removido com ar comprimido (E14); em seguida, se iniciam as etapas de queima, em 5 etapas e em forno elétrico: na primeira (E15), o aquecimento se dá a uma taxa de

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1°C/min da temperatura ambiente até 290°C, permanecendo por 3h nesta temperatura; na segunda (E16), novo aquecimento à 1°C/min até 430°C, permanecendo 3h nesta temperatura; na terceira (E17), novo aquecimento a uma taxa de 10°C/min até 870°C, permanecendo por 10 minutos nesta temperatura; na quarta (E18), os scaffolds obtidos (SO) são resfriados no interior do forno a uma taxa de 2°C/min até a temperatura ambiente.

2. PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ENXERTOS ÓSSEOS BIOATIVOS POR IMPRESSÃO 3D, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelos scaffolds obtidos (SO) poderem, eventualmente, ser infiltrados (E19 - E24) com colágeno contendo partículas de biovidro F18 dispersas (CB).
3. PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ENXERTOS ÓSSEOS BIOATIVOS POR IMPRESSÃO 3D, de acordo com a reivindicação 2, a infiltração dos scaffolds obtidos (SO) ser caracterizada pela preparação (E19) de uma solução com colágeno hidrolisado (CL) e água (A), na proporção 1g/mL, que é homogeneizada (E20) em agitador magnético a uma temperatura de 60°C, e tem a ela adicionado 2,5 g de vidro F18 em pó (4); em seguida, é submetida à agitação (E21) por mais 30 minutos; para, então, os scaffolds obtidos (SO) serem infiltrados (E22) na solução (CB), por 5 minutos sob vácuo, no interior de um kitassato; em seguida, o excesso do gel de colágeno (CB) é removido (E23), por jateamento de ar comprimido e os scaffolds infiltrados (SI) são secos (E24), à temperatura ambiente, por 72h, estando prontos.
4. ENXERTOS ÓSSEOS BIOATIVOS, obtidos de acordo com a reivindicação 1, onde a composição em pó empregada como sua matéria-prima seja caracterizada por ser constituída de: pó de biovidro F18 (4) numa proporção entre 50 e 88% em peso; maltodextrina numa proporção de até 22% em peso; acetato de magnésio numa proporção de até 3% em peso; carboximetil-celulose numa proporção de até 15% em peso; hidróxido de cálcio numa proporção de até 10% em peso; fosfato de tricálcio-β numa proporção de até 25% em peso; fosfato dibásico de potássio numa proporção de até 25% em peso; fosfato dibásico de sódio numa proporção de até 50% em peso.

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5. ENXERTOS ÓSSEOS BIOATIVOS, de acordo com a reivindicação 4, caracterizados por serem constituídos, majoritariamente, de: pó de biovidro F18 (4), numa proporção de 65% em peso e hidróxido de cálcio numa proporção de 10% em peso.
6. ENXERTOS ÓSSEOS BIOATIVOS, de acordo com a reivindicação 4, caracterizados por serem constituídos, majoritariamente, de: pó de biovidro F18 (4), numa proporção de 65% em peso; fosfato de tricálcio-β numa proporção de 10% em peso; fosfato dibásico de sódio numa proporção de até 25% em peso.