BR102018014764A2 - processo de obtenção de meso-fenilporfirina carboxi-substituída e uso como fotossensibilizador em terapia fotodinâmica - Google Patents

Abstract

processo de obtenção de meso-fenilporfirina carboxi-substituída e uso como fotossensibilizador em terapia fotodinâmica. a presente invenção refere-se ao composto porfirínico, meso-tetrakis[4-(3-carboxipropoxi)-3-metoxifenil]porfirina (tcmpp), uma meso-fenilporfirina carboxi-substituída sintética, aquossolúvel e ao processo de obtenção da mesma, que utiliza um aldeído precursor de baixo custo, tempo de reação reduzido, etapas de purificação simplificadas e eficazes. adicionalmente, a presente invenção refere-se ao uso da porfirina tcmpp como fotossensibilizador em terapia fotodinâmica para inativação microbiana, no tratamento fotodinâmico de lesões tumorais, dermatoses e também para diagnóstico fotodinâmico de lesões tumorais.

Description

“PROCESSO DE OBTENÇÃO DE V/ESYEIEMLI’ORIIRINA CARBOXISUBSTITUÍDA E USO COMO FOTOSSENSIBILIZADOR EM TERAPIA FOTODINÂMICA”

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção é relacionada com o campo da ciência da saúde, mais especificamente na área de Terapia Fotodinâmica (TFD) e refere-se a um composto porfirínico, obtido conforme processo aqui descrito, e seu uso como fotossensibilizador (FS) associado a fontes emissoras de luz aplicadas em Terapia Fotodinâmica (TFD) para inativação microbiana, tratamento de lesões tumorais, dermatoses e para diagnóstico fotodinâmico. Em particular a invenção refere-se a obtenção de uma /?/<?.w-tenilporfirina carboxi-substituí da sintética que é fotoativada por luz na região visível do espectro eletromagnético e seu uso.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [002] A Terapia Fotodinâmica (TFD) é um exemplo de fototerapia. A TFD emprega a exposição de um fotossensibilizador (FS) a luz e em presença de oxigênio (O₂) no tecido alvo, produzindo espécies reativas de oxigênio (EROs) que levam a morte celular seletiva. A TFD tem muitas aplicações possíveis na área da saúde, empregando diferentes fontes de luz coerentes como lasers, ou não coerentes como diodos emissores de luz (LED) e lâmpadas, para irradiar diversas classes de FS. A TFD é aplicada em diversas áreas da oncologia, oftalmologia (degeneração macular da retina), dermatologia (psoríase, acne) e odontologia (periodontite) (ANG, J. M. et al. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy, v. 19, p. 308344, 2017; KADISH, K. M.; SMITH, K. M.; GUILARD, R. The Handbook of Porphyrin. Science. World Scientific, 2011, v. 12; PANDEY, R. K., KESSEL, D., DOUGHERTY, T. J. Handbook of Photodynamic Therapy: updates on recent applications of porphyrin-based compounds. World Scientific, 2016; VAN STRATEN, D. et al. Cancers, v. 9, n. 2, p. 1-54, 2017).

[003] A TFD é muito investigada na inativação de diferentes micro-organismos (PACT - Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy), apresentando resultados promissores com diferentes classes de fotossensibilizadores. (PELOI, L. S. et al. Journal of Bioscience, v. 33, η. 2, p. 231-237, 2008; PELOI, L. S. et al. Experimental Parasitology, v. 128, p. 353-356, 2011; BASTOS, Μ. M. et al. Revista Virtual de Química, v. 4, n. 3, p. 257-267, 2012; COSTA, A. C. et al. Archives of Oral Biology, v. 56, n. 11, p. 1299-1305, 2011; GEROLA,

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A. P. et al. Photochemistry and Photobiology, v. 87, n. 4, p. 884-894, 2011; FONTANA, C. R. et al. PI 0805294-8 A2. 17 ago. 2010).

[004] Vários dos FS utilizados para aplicação clínica são baseados em estruturas tetrapirrólicas, similares a protoporfírina presente na hemoglobina. Porfirinas são compostos que possuem um macrociclo tetrapirrólico contendo 22 elétrons π, sendo que 18 desses elétrons contribuem para a extensa conjugação e aromaticidade. Esses derivados atuam como cofatores em sistemas biológicos, e realizam processos bioquímicos essenciais para seres vivos como: respiração celular; transporte e armazenamento de O₂; catálise de reações de oxidação; cadeia de transporte de elétrons, etc. Uma das classes de FS mais pesquisada em TFD é a dos derivados porfirínicos (DP). Estes compostos são considerados FS promissores para aplicação em TFD por apresentarem a algumas características tais como: baixa toxicidade na ausência de luz, foto-estabilidade, alta produção de oxigênio singlete e localização preferencial em tecidos com crescimento acelerado. (ASSIS, F. F. de et al. Dyes and Pigments, v. 98, η. 1, p. 153-159, 2013; ORMOND, A. B.; FREEMAN, H. S. Materiais, v. 6, n. 3, p. 817-840, 2013; KADISH, K. M.; SMITH, K. M.; GUILARD, R. The Handbook of Porphyrin Science. World Scientific, 2011, v. 12; PANDEY, R. K., KESSEL, D., DOUGHERTY, T. J. Handbook of Photodynamic Therapy: updates on recent applications of porphyrin-based compounds. World Scientific, 2016).

[005] Porém, os FS utilizados atualmente ainda apresentam algumas limitações tais como: tempo relativamente longo para ser excretado do corpo, o que leva a prolongada sensibilidade dos pacientes à luz após o tratamento; auto-agregação; e a necessidade de administração de concentrações altas para que o tratamento seja eficiente. Na tentativa de maximizar a utilização da TFD, estão sendo desenvolvidas várias pesquisas buscando sistemas fotossensibilizadores com melhores características. (ASSIS, F. F. de et al. Dyes and Pigments, v. 98, η. 1, p. 153-159, 2013; ORMOND, A. B.; FREEMAN, H. S. Materiais, v. 6, n. 3, p. 817-840, 2013; KADISH, K. M.; SMITH, K. M.; GUILARD, R. The Handbook of Porphyrin Science. World Scientific, 2011, v. 12; PANDEY, R. K., KESSEL, D., DOUGHERTY, T. J. Handbook of Photodynamic Therapy: updates on recent applications of porphyrin-based compounds. World Scientific, 2016; SENGE, Μ. O.; BRANDT, J. Photochemistry and Photobiology, v. 87, n. 6, p 1240-1296, 2011).

[006] A TFD geralmente utiliza radiação com comprimento de onda de 600 nm a 800 nm. Para tratamento de lesões superficiais é utilizado radiação com comprimentos de onda menores que 600 nm. (AGOSTINIS, P. et al. CA: A Cancer Journal for Clinicians, v. 61, n.

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4, p. 250-281, 2011; ORMOND, A. B.; FREEMAN, H. S. Materials, v. 6, n. 3, p. 817-840, 2013; EMILIO, C. R. et al. PI 0705591-9 A2. 27 set. 2010).

[007] O LED oferece várias vantagens para o uso clínico, pois é possível realizar a escolha de comprimento de onda de emissão desde do UV (350 nm) até o infravermelho próximo (1100 nm). Os principais fatores que favorecem o uso de LEDs em TFD são o custo inferior com relação as demais fontes de iluminações utilizadas atualmente e a versatilidade, já que podem ser fabricados em diferentes tamanhos e arranjos, são portáteis e adequados para irradiação de lesões superficiais, e ainda podem ser projetados para uso endoscópico. Por esses motivos os LEDs estão sendo utilizados em várias pesquisas em TFD. (BRANCALEON, L.; MOSELEY, H. Medical Science, v. 17, n. 3, p. 173-186, 2002; COSTA, A. C. et al. Archives of Oral Biology, v. 56, n. 11, p. 1299-1305, 2011; GEROLA, A. P. et al. Photochemistry and Photobiology, v. 87, n. 4, p. 884-894, 2011; FONTANA, C. R. et al.. PI 0805294-8 A2. 17 ago. 2010).

[008] A presente invenção tem como intuito propor um fotossensibilizador com características foto-físicas mais apropriadas, uma /7/c.w-fenilporfírina carboxi-substituí da, cujo processo de obtenção aqui descrito utiliza precursor de baixo custo, tempo de reação reduzido, etapas de purificação simplificadas e eficazes.

ESTADO DA TÉCNICA [009] O primeiro fármaco aprovado para uso em TFD foi o Photofrin®. Isso ocorreu no Canadá em 1993, quando o Canadian Health Coalition (CHC) aprovou seu uso para tratamento de câncer na bexiga. Posteriormente, o Photofrin® foi aprovado pelo órgão americano Food and Drug Administration (FDA), e também no Japão e na Europa para esse fim. (ETHIRAJAN, M. et al. Chemical Society Reviews, v. 40, p. 340-362, 2011; ORMOND, A. B.; FREEMAN, H. S. Materials, v. 6, n. 3, p. 817-840, 2013).

[010] A síntese do Photofrin® é realizada através da reação do Hematoporfirina (HpD) com uma mistura de ácido acético, acetato de sódio e ácido sulfúrico, e a mistura de mono-acetatos e di-acetatos de HpD é neutralizada com uma solução diluída de hidróxido de sódio. O Photofrin ® é isolado através de uma filtração em membrana. Porém, o fármaco consiste em uma mistura de monômeros, dímeros e oligômeros, o que diminui a eficiência da excitação do fármaco. Outro problema é uma prolongada sensibilidade dos pacientes à luz após o tratamento. (BYRNE, C. J.; MARSHALLSAY, L. V; WARD, A. D. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, v. 6, n. 1-2, p. 13-27, 1990).

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4/12 [Oil] Nas últimas décadas várias pesquisas estão sendo desenvolvidas buscando novos FS com propriedade melhores que o Photofrin®. O documento US 2009/0203757A1 relata a síntese de derivados porfirínicos, no qual os grupos carboxilas (COOH) de benzoporfirinas são esterificados com etileno glicol formando os respectivos ésteres (COOR), dessa forma os derivados obtidos possuem grupos ésteres (COOR) e carboxilas (COOH), entre outros, e apresentam propriedades para uso em Terapia Fotodinâmica. (STERNBERG, E. D. et al. US 2009/0203757 Al, 13 ago. 2009).

[012] O documento PI 0805294-8 A2 relata o uso de derivados porfirínicos e de clorinas que possuem propriedades favoráveis como FS, em combinação com fonte de luz à base de laser ou LED, nos comprimentos de onda da luz vermelha (630-670 nm) ou azul (460480 nm) para tratamento de onicomicose. (FONTANA, C. R. et al. PI 0805294-8 A2. 17 ago. 2010).

[013] O documento PI 0705591-9 A2 relata uma nova composição farmacêutica que contém MEALA e DPTA, que apresenta potencial para ser utilizado na TFD como fotossensibilizador, frente a iluminação com LED. O método utiliza a composição farmacêutica para tratamento de lesões tumorais e outras dermatoses. (EMILIO, C.R. et al. PI 0705591-9 A2. 27 set. 2010).

[014] Porfirinas meso- substituí das estão entre os FS mais investigados para aplicação em PACT, uma vez que várias pesquisas já mostraram que porfirinas meso-substituí das apresentam atividade fotodinâmica contra diferentes classes de micro-organismos. (BOMMER, J.; JORI, G. WO 03/026646 Al. 03 abr. 2003; ALVES, E. et al. BMC Microbiology, v. 9, n. 70, p. 1-13, 2009; CORMICK, Μ. P. et al. European Journal of Medicinal Chemistry, v. 44, p. 1592-1599, 2009; QUIROGA, E. D.; ALVAREZ, M. G.; DURANTINI, E. N. FEMS Immunology & Medical Microbiology, v. 60, p. 123-131, 2010; BASTOS, Μ. M. et al. S. Revista Virtual de Química, v. 4, n. 3, p. 257-267, 2012; SOBSEY, M. D.; GOLD, A; CASTEEL, M. J. WO 02/02153 Al. 10 jan. 2002).

[015] A patente WO 02/02153 Al relata métodos de inativação de micro-organismos utilizando /?/<?.w-porfirinas catiônica (TMPyP4) e aniônica (TPPS4). (SOBSEY, M. D.; GOLD, A.; CASTEEL, M. J. WO 02/02153 Al, 10 jan. 2002).

[016] O documento WO 03/026646 Al relata o uso da /?/<?.w-porfirina TMPyP4 e novas porfirinas com substituintes hidrofóbicos como FS para eliminação de bactérias patogênicas, Staphylococcus aureus e Escherichia coh. utilizando-se luz branca como fonte de luz. (BOMMER, J.; JORI, G. WO 03/026646 Al. 03 abr. 2003).

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5/12 [017] Há duas abordagens gerais para síntese de /?/<?.w-porfirinas: (1) por modificação de uma porfirina natural; ou (2) através de síntese total. Dentro da segunda abordagem, os métodos mais comumente utilizados na síntese total de porfirinas são: a) o método de AdlerLongo (tetramerização de mono-pirrólicos); (b) o método de Lindsey (Alder-Longo modificado); e (c) o método de Gonsalves. (ADLER, A. D. et al. Journal of Organic Chemistry, v. 32, n. 2, p. 476, 1967; LINDSEY, J. S. et al. Journal of Organic Chemistry, v. 52, n. 5, p. 827-836, 1987).

[018] Estes três métodos (a-c) partem do princípio comum que é a reação do pirrol com o respectivo aldeido, ambos em quantidades equimolares. Para os métodos (b) e (c) os rendimentos são da ordem de 30-40% e, em geral, destinam-se a síntese de /?/<?.w-porfirinas substituídas cuja rota não é adequada via Adler-Longo (a). Destaca-se que, no método (b) a principal desvantagem é a necessidade de alta diluição (10^-2 mol.L¹), ou seja, comparativamente, para o método de Adler-Longo, usando 39 mmol de aldeído seriam necessários 200 mL de solvente (ácido propiônico), mas, usando o método de Lindsey seriam necessários aproximadamente 4 L de solvente (e.g. clorofórmio) para alcançar a diluição de IO'² mol.L¹.

[019] A presente invenção descreve o processo de obtenção de uma mesofenilporfírina carboxi-substituída aquossolúvel, e seu uso como fotossensibilizador em TFD, utilizando iluminação na região do visível do espectro eletromagnético. A presente invenção difere dos documentos mencionados anteriormente por apresentar composto diferente aos já descritos. O processo de obtenção descrito utiliza um aldeído precursor de baixo custo e acessível, a vanilina, o principal componente da essência de baunilha. As reações utilizadas na forma aqui descritas (escala de bancada) podem ser executadas em escala multigramas, ou seja, os resultados obtidos em bancada permitem afirmar que o processo descrito é promissor para ser transposto em uma planta piloto, de forma a verificar a viabilidade técnica e econômica do processo/produto proposto.

[020] Portanto, nenhum dos documentos do estado da técnica descrevem a mesofenilporfírina carboxi-substituída, nem o processo de obtenção da mesma tal como proposto pela presente invenção e nem seu uso com fotossensibilizador em TFD.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [021] A presente invenção descreve o processo de obtenção e o uso de um novo fotossensibilizador (FS), um derivado porfirínico sintético aquossolúvel, fotoativado por uma

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6/12 fonte emissora de luz na região visível do espectro eletromagnético para aplicação em Terapia Fotodinâmica (TFD).

[022] Mais particularmente a invenção refere-se ao preparo e ao uso como FS da porfirina wteso-tetrakis[4-(3-carboxipropoxi)-3-metoxifenil]porfirina (TCMPP) (6) conforme a Figura 1, que é fotoativada por diodo emissor de luz (LED) ou laser ou lâmpada na região visível do espectro eletromagnético. O processo de obtenção da /?/vw-fenilporfirina TCMPP (6) utiliza um precursor de baixo custo, quantidade de solvente e tempo de reação reduzidos, e etapas de purificação simplificadas e eficazes. A meso-fenilporfirina TCMPP (6) apresenta características foto-físicas adequadas para ser utilizada em TFD na inativação fotodinâmica de micro-organismos, e no diagnóstico e tratamento fotodinâmico de lesões tumorais e dermatoses.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [023] A Figura 1 apresenta a estrutura da /?/<?.w-tetrakis[4-(3-carboxipropoxi)-3metoxifenil]porfirina (TCMPP) (6) bem como as etapas reacionais (reagentes, condições) do processo de obtenção da mesma. Reagentes e condições: (A) K₂CO₃ anidro, 4-bromobutirato de etila, DMF anidro, 100-110 °C, 94%; (B) pirrol, ácido propiônico, O₂, refluxo, 13,4%; (C) solução KOH 0,5 mol L¹, THF, MeOH, temperatura ambiente até refluxo, 72 h; (D) solução HC1 0,5 mol L·¹, temperatura ambiente, 77,6% [024] A Figura 2 mostra os espectros de emissão de fluorescência de soluções da proteína BSA em pH 7,2 (tampão fosfato) (A e B) e pH 10,5 (tampão bicarbonate de sódio e hidróxido de sódio) (C e D) na presença da /?/vw-fenilporfirina TCMPP (6) irradiadas separadamente com os dispositivos de LED lilás e vermelho durante 30 minutos.

[025] A Figura 3 mostra os espectros de absorção eletrônica de soluções de ácido úrico (AU) em pH 7,2 (tampão fosfato) na presença da /?/vw-fenilporfirina TCMPP (6) irradiada com dispositivo de LED vermelho durante 870 minutos (A) e a variação da absorbância da solução em 292 nm versus o tempo de iluminação (B).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [026] Os reagentes e solventes utilizados foram PA. As análises cromatográficas em camada delgada (CCD) foram efetuadas utilizando-se placas cromatográficas comerciais de alumínio impregnadas de silica gel adsorvidas (Merck, silica gel 60 F₂₅₄, 0,2 mm) que foram reveladas sob luz ultravioleta (λ = 254 nm) ou iodo molecular. Todas as reações foram

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7/12 monitoradas por CCD e/ou UV-Vis. Na separação feita por cromatografia em coluna utilizouse silica gel 60 70-230 mesh ASTM Merck. Os solventes foram removidos em evaporador rotatório (rotoevaporador) operando à pressão reduzida (« 30-40 mmHg). Os espectros de absorção óptica no UV-Vis foram obtidos em um espectrofotômetro Cary 100 da Varian, os espectros de emissão de fluorescência foram obtidos em espectrofluorímetro Cary Elipse. Os espectros de RMN Ή foram obtidos em um espectrômetro da Bruker modelo Ascend, operando a 400,130 MHz para frequência do próton, e 100,613 MHz para o carbono. Obtevese os espectros utilizando-se tetrametilsilano (TMS) como padrão de referência interno, e clorofórmio (CDC1₃) e metanol deuterados (MeOD) como solventes. A constante de acoplamento (J) está expressa em Hz, e os deslocamentos químicos (δ) estão expressos em ppm, e para indicar a multiplicidade dos sinais foram adotadas as seguintes abreviações: s (simpleto), sl (simpleto largo), d (dubleto), dd (duplo dubleto), t (tripleto), q (quarteto) e qt (quintupleto).

Obtenção do 4-(4-formil-2-metóxifenóxi)butanoato de etila (2):

[027] Primeiro, foi efetuada a reação de alquilação do grupo fenólico da vanilina (4hidróxi-3-metóxibenzadeído) (1) utilizando-se o 4-bromobutirato de etila em meio básico fornecendo o aldeído 4-(4-formil-2-metóxifenóxi)butanoato de etila (2), o precursor da meso porfirina (6) de interesse. Para a Etapa (A) (Figura 1), em um balão de fundo redondo equipado com um condensador de refluxo foram adicionados !V,lV-dimetilformamida (DMF) e quantidades equimolares de vanilina (4-hidróxi-3-metoxibenzaldeído) (1) e carbonato de potássio anidro (K₂CO₃). A mistura foi mantida sob agitação magnética a uma temperatura entre 100 °C e 110 °C durante 15 minutos. Ao final desse tempo adicionou-se quantidade equimolar de 4-bromobutirato de etila [Br(CH₂)3COOCH₂CH3]. A mistura foi mantida sob agitação e aquecimento por um tempo de 20 minutos a 40 minutos.

[028] Ao final deste tempo a mistura reacional foi resfriada até temperatura ambiente, transferida para um funil de separação e a fase orgânica (etérea) foi lavada com H₂O destilada. Separou-se a fase etérea, secou-se com sulfato de sódio anidro (Na₂SO₄), filtrou-se e removeu-se o solvente em rotoevaporador. O produto bruto (2) foi analisado por CCD utilizando-se como eluente uma mistura de acetato de etila (AcOEt):éter de petróleo 1:3 (v/v). A placa foi revelada e não observou-se a presença de material de partida (vanilina). Obteve-se o aldeído (2) (94%) como um sólido incolor. O aldeído (2) foi caracterizado por

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8/12 espectroscopia de RMN 'H e utilizado na etapa seguinte sem a necessidade de posterior purificação.

[029] Visando um processo de transposição (bancada para planta-piloto), para esta etapa [Etapa (A), Figura 1] efetuou-se as seguintes modificações em relação ao descrito no estado da técnica:

(a) O uso de quantidades equimolares do aldeído (1) e do reagente alquilante (4bromobutirato de etila);

(b) A faixa de temperatura utilizada possibilitou a redução do tempo de reação de 20 h para de 50 minutos a 70 minutos, preferivelmente 60 minutos;

(c) Ao final da reação, na etapa de isolamento, efetuou-se a remoção completa do solvente (DMF) utilizando apenas água destilada, não havendo a necessidade de uso de aquecimento e de sistema de alto vácuo.

Obtenção da mrw-tetrakis[4-(etoxi-4-oxobutoxi)-3-inetoxifeiiil]porfiriiia (TEMPP) (4):

[030] A partir do aldeído 4-(4-formil-2-metóxifenóxi)butanoato de etila (2), sintetizado, deu-se início a síntese da porfirina TCEMPP (4). Para a Etapa (B) (Figura 1), em um balão de fundo redondo equipado com um condensador de refluxo foram misturados ácido propiônico e o 4-(4-formil-2-metoxifenóxi)butanoato de etila (2), e a mistura reacional, em atmosfera aberta, foi levada a refluxo. A essa solução foi adicionado uma quantidade equimolar de pirrol, e a solução foi mantida sob agitação magnética e refluxo por um tempo de 20 minutos a 40 minutos preferivelmente 30 minutos. Durante a reação ocorre a formação do porfirinogênio (3) que, no método de Adler-Longo, é oxidado in situ pelo oxigênio presente no meio reacional levando a formação da porfirina TCEMPP (4).

[031] Ao final deste tempo removeu-se o ácido propiônico sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia em coluna utilizando-se como eluente uma mistura de diclorometano (CFFCb^álcool etílico (EtOH) 97:3 (v/v). Removeu-se o solvente em rotoevaporador e obteve-se a porfirina TCEMPP (4) (13,6%) como um sólido de coloração púrpura.

[032] Caracterizações espectroscópicas da /«e.so-tetrakis[4-(etoxi-4-oxobutoxi)-3inetoxifenil]porfirina (TEMPP) (4):

(a) UV-Vis [(CH₂C1₂) (nm) (ε (10⁴L mol¹ cm¹)]: 424 (35,9), 518 (1,88), 556 (1,16), 593 (0,61), 651 (0,68).

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9/12 (b) RMN Ή (400,13 MHz, CDC1₃): δ 8,90 (s, 8 H); 7,78 (si, 8 H); 7,74 (d, J= 8, 8 H); 7,26 (dd, J= 8,16, 8,16, 4 H); 4,37 (t, 8 H); 4,23 (q, 8 H); 3,96 (s, 12 H); 2,72 (t, 8 H); 2,37 (qt, 8 H); 1,34 (t, 12 H); -2,75 (s, 2H, NH).

(c) RMN ¹³C (100,613 MHz, CDC1₃): 173,37 (C=O); 148,20 (C); 147,54 (C); 135,08 (C); 131,00 (CH); 127,44 (CH); 119,86 (C); 118,78 (CH); 111,29 (CH); 68,17 (CH₂); 60,54 (CH₂); 56,19 (CH₃); 30,96 (CH₂); 24,80 (CH₂); 14,32 (CH₃) (d) Análise elementar calculado para C₇₂H78N₄Oi6 C 68,88 H 6,26 N 4,46 O 20,39; Encontrado C 68,08 H 6,14 N, 4,36 O 21,42.

[033] Visando um processo de transposição (bancada para planta-piloto), para esta etapa [Etapa (B), Figura 1] efetuou-se uma redução de cerca de 32% no volume de ácido propiônico utilizado.

Obtenção da wteso-tetrakis[4-(3-carboxipropoxi)-3-metoxifenil]porfirina (TCMPP) (6):

[034] Para obtenção da /?/<?.w-fenilporfirina carboxi-substituí da aquossolúvel TCMPP (6) [Etapa (C), Figura 1], em um balão de fundo redondo equipado com um condensador de refluxo foram misturados tetraidrofurano (THF), metanol (MeOH), TCEMPP (4) (1 eq.) e solução de hidróxido de potássio 0,5 mol L ¹ (KOH) (4 eq.). A solução foi mantida sob agitação magnética à temperatura ambiente por pelo menos 48 horas, e depois por um tempo de 22 horas a 26 horas, preferivelmente 24 horas, sob agitação magnética e refluxo. Após a saponificação completa da porfirina (4), a mistura reacional contendo a porfirina (5) foi acidificada com solução de ácido clorídrico 0,5 mol L ¹ (HC1) para a formação da /?/<?.w-fenilporfirina carboxi-substituída aquossolúvel TCMPP (6).

[035] Os solventes foram removidos em rotoevaporador, e o resíduo foi dissolvido em diclorometano (CH₂C1₂). E a fase orgânica foi lavada com de H₂O destilada. Separou-se a fase orgânica, secou-se com sulfato de sódio anidro (Na₂SO₄), filtrou-se e removeu-se o solvente em rotoevaporador. Obteve-se a porfirina TCMPP (6) (77,6%) como um sólido de coloração púrpura.

[036] Caracterização espectroscópica da wteso-tetrakis[4-(3-carboxipropoxi)-3metoxifeniljporfirina (TCMPP) (6):

(a ) UV-Vis (tampão pH 7,2) [λ^ (nm) (ε 10⁴ L mol¹ cm¹)]: 422 (3,11), 670 (0,39);

(b) UV-Vis (tampão pH 10,5) [λ^ (nm) (ε 10⁴L mol¹ cm¹)]: 419 (5,84), 523 (0,38), 565 (0,33), 650(0,19).

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10/12 [037] Visando um processo de transposição (bancada para plata-piloto), para esta etapa [Etapa (C), Figura 1] efetuou-se as seguintes modificações em relação ao descrito no estado da técnica:

(a) O uso de da porfima (4) e do hidróxido de potássio na proporção de 1:4,4, ao invés de 1:413, evitando assim o uso de excesso de HC1 na etapa de acidificação, possibilitando o isolamento da TCMPP (6) de modo mais rápido e eficaz (maior rendimento).

[038] A presente invenção também apresenta o uso da wteso-fenilporfirina aquossolúvel (6) fotoativada por fonte emissora de luz na região visível do espectro eletromagnético para aplicação em TFD. Para desenvolvimento da invenção as soluções da meso-fenilporfirina (6) foram preparadas em concentrações na faixa de 1,0 pmol L ¹ a 100,0 pmol L¹, sendo preferível a faixa de 1,0 pmol L ¹ a 30,0 pmol L·¹. As soluções foram irradiadas com os dispositivos de LED, durante o tempo total de até 15 horas, sendo observados efeitos fotodinâmicos com tempo de irradiação a partir de 10 minutos.

[039] Como exemplo não limitante da invenção é analisada a foto-oxidação da proteína albumina de soro bovino (BSA) utilizando como FS a /7/vw-porfirina TCMPP (6) e, como fonte de luz, dispositivos de LED no comprimento da luz lilás (faixa de emissão de 400 nm a 450 nm) e vermelho (faixa de emissão de 590 nm a 660 nm). A eficiência fotodinâmica dos sistemas é testada com base nos valores das constantes de foto-oxidação da proteína BSA. A foto-oxidação dessa proteína leva a degradação de seus aminoácidos, diminuindo a intensidade de fluorescência de BSA. Assim, esse exemplo permite avaliar a capacidade dos compostos fotossensibilizadores em gerar espécies reativas de oxigênio (EROs) e, portanto, sua eficiência fotodinâmica.

[040] Soluções contendo de 1 pmol L¹ a 30,0 pmol L¹ de fl/vw-fenilporfirina TCMPP (6) e de 1 pmol L¹ a 5,0 pmol L·¹ da proteína BSA foram preparadas em pH 7,2 (tampão PBS), e pH 10,5 (tampão NaHCCh/NaOH). Essas soluções foram irradiadas por 30 a 120 minutos com dispositivos de LED. A cada 5 minutos de iluminação, a foto-oxidação foi acompanhada por meio da variação da intensidade de emissão em 360 nm. Foi utilizado comprimento de onda de excitação (X_exc) de 279 nm. Os testes foram realizados em triplicata. Como mostrado na Figura 2 houve a redução na fluorescência da proteína BSA, que se deve a foto-oxidação desta, nos experimentos realizados nos pHs 7,2 e 10,5 e com os dois dispositivos de LED, lilás e vermelho. A Tabela 1 apresenta os valores das constantes de fotooxidação (k_f) determinados para os sistemas analisados.

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Tabela 1 - Valores das constantes de foto-oxidação da proteína BS A (k_f) na presença da /?/c.w-fenilporfirina TCMPP (6) irradiada separadamente com dispositivos de LED lilás e vermelho durante 30 minutos.

pH 7,2 pH 10,5 k_f(10⁴ s') LED lilás ⁵>⁸⁴ ± °>⁰² 7,63 ± 0,03 k_f(10'⁴ s¹) LED vermelho ₀,85 ± 0,04 1,40 ± 0,02 [041] A eficiência fotodinâmica também foi avaliada utilizando ácido úrico (AU) como dosímetro químico, o AU é um excelente sequestrador de ’O₂, assim pode ser utilizado como sonda para determinação do rendimento quântico de formação do oxigênio singlete (φ_Δ ’O₂). (FISCHER, F. et al. Clinica Chimica Acta. v. 274, η. 1, p. 89-104, 1998; RABELLO, B. R. et al. Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry, v. 238, n. 15, p. 5362, 2012).

[042] Foram preparadas soluções contendo de 40 pmol L ¹ a 60,0 pmol L·¹ de AU, em três concentrações diferentes de meso-fenilporfirina TCMPP (6) na faixa de 5 pmol L ¹ a 40 pmol L·¹ em pH 7,2, tampão PBS (fosfato-salino) e em pH 10,5 (tampão NaHCO₃/NaOH). Essas soluções foram irradiadas com dispositivo com dois LED lilás; e outras soluções com as mesmas concentrações foram irradiadas com dispositivo com um LED vermelho. A reação de foto-oxidação foi acompanhada pelo decaimento da banda de absorção do AU, em 292 nm, para determinação da constante de velocidade, ki. Posteriormente, usando a benzoporfirina BPDMA® como padrão, determinou-se o rendimento quântico de formação do oxigênio singlete (Φδ’Ο₂) da meso-fenilporfirina TCMPP (6). Como é possível visualizar pela Figura 3, houve uma redução na banda de absorção do AU em 292 nm, que se deve a foto-oxidação do AU pelo de oxigênio singlete, gerado pelo sistema meso-fenilporfirina TCMPP (6)/LED. A Tabela 2 apresenta os valores de rendimento quântico de oxigênio singlete, Φδ’Ο₂.

Tabela 2 - Valores de rendimento quântico de oxigênio singlete (φ_Δ ’O₂) da mesofenilporfmna TCMPP (6) quando irradiada separadamente com os dispositivos de LED lilás e vermelho durante 870 minutos.

pH	| LED	1 Φδ'Ο2
7,2	Lilás	0,57
Vermelho	0,08
10,5	Lilás	2,35
Vermelho	0,09

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12/12 [043] A eficiência fotodinâmica do composto foi comprovada pelos testes de fotooxidação da proteína BSA e de ácido úrico (AU). Os resultados evidenciam que a mesofenilporfmna TCMPP (6) pode ser aplicada em Terapia Fotodinâmica, já que verificou-se que a irradiação do /7/vw-fenilporfirina TCMPP (6) causa a geração de espécies reativas que provocam foto-oxidação de biomoléculas levando ao efeito fotodinâmico desejado.

[044] Além destes exemplos a mrvu-tetrakis|4-(3-carboxipropoxi)-3metoxifeniljporfirina (TCMPP) (6) pode ser utilizada em Terapia Fotodinâmica para inativação microbiana, no tratamento fotodinâmico de lesões tumorais, dermatoses e também para diagnóstico fotodinâmico de lesões tumorais, podendo estar ou não associada com outras técnicas convencionais. O fotossensibilizador /«e.so-tetrakis[4-(3-carboxipropoxi)-3metoxifeniljporfirina (TCMPP) (6) é fotoativado por radiação na região visível do espectro eletromagnético podendo ser utilizado para irradiação: lâmpadas, LEDs ou lasers.

Claims (6)

1. REIVINDICAÇÕES

   1) “PROCESSO DE OBTENÇÃO DE A/ESYAIEM LPORFIRINA CARBOXI-

   SUBSTITUÍDA”, caracterizado por utilizar um aldeído precursor de baixo custo e acessível, vanilina, no processo de obtenção do composto /?/vw-tetrakis[4-(3-carboxipropoxi)-3metoxifenil]porfirina (TCMPP) (6) compreendendo as etapas de:

   A) Obtenção do 4-(4-formil-2-metóxifenóxi)butanoato de etila (2);

   B) Obtenção da /?/<?.w-tetrakis[4-(etoxi-4-oxobutoxi)-3-metoxifenil]porfirina (TCEMPP) (4);

   C) Obtenção da /?/<?.w-tetrakis[4-(3-carboxipropoxi)-3-metoxifenil]porfirina (TCMPP) (6).
2. 2) “PROCESSO DE OBTENÇÃO DE V/ESYEEEXIEPOREI RIXA CARBOXI-

   SUBSTITUÍDA”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela Etapa (A) compreendendo as subetapas:

   A. 1) Misturar !V,lV-dimetilformamida (DMF) e quantidades equimolares de vanilina (4-hidróxi-3-metoxibenzaldeído) (1) e carbonato de potássio anidro (K₂CO₃);

   A.2) Manter a mistura sob agitação magnética a uma temperatura entre 100 °C e 110 °C durante 15 minutos;

   A.3) Adicionar uma quantidade equimolar do 4-bromobutirato de etila [Br(CH2)3COOCH₂CH₃], e manter a mistura sob agitação e aquecimento por um tempo de 20 minutos a 40 minutos;

   A.4) Resfriar a mistura reacional até temperatura ambiente;

   A.5) Transferir para um funil de separação e lavar a fase orgânica (etérea) com H₂O destilada;

   A. 6) Separar a fase orgânica, secar, filtrar, remover o solvente em rotoevaporador, obter o composto 4-(4-formil-2-metóxifenóxi)butanoato de etila (2) como um sólido incolor.
3. 3) “PROCESSO DE OBTENÇÃO DE V/ESYEEEXIEPOREI RIXA CARBOXISUBSTITUÍDA”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela Etapa (B) compreendendo as subetapas:

   B. l) Misturar o ácido propiônico e o 4-(4-formil-2-metoxifenóxi)butanoato de etila (2), e aquecer até refluxo;

   B.2) Adicionar uma quantidade equimolar de pirrol e manter sob agitação magnética e refluxo por um tempo de 20 minutos a 40 minutos, preferencialmente 30 minutos;

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   B.3) Remover o ácido propiônico sob pressão reduzida;

   B.4) Purificar o resíduo obtido por cromatografia em coluna utilizando-se como eluente uma mistura de diclorometano (CH₂C1₂): álcool etílico (EtOH) 97:3 (v/v);

   B. 5) Remover o solvente em rotoevaporador e obter a /?/<?.w-tetrakis[4-(etoxi-4oxobutoxi)-3-metoxifenil]porfirina (TCEMPP) (4) como um sólido púrpura.
4. 4) “PROCESSO DE OBTENÇÃO DE Λ/ΕΛϊλΙΕΜ LPORFI RINA CARBOXISUBSTITUÍDA”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela Etapa (C) compreendendo as subetapas:

   C.l) Misturar tetraidrofurano (THF), metanol (MeOH), /?/<?.w-tetrakis[4-(etoxi-4oxobutoxi)-3-metoxifenil]porfirina TCEMPP (4) (1 eq.) e solução de hidróxido de potássio 0,5 mol L·¹ (KOH) (4 eq.);

   C.2) Manter a solução sob agitação magnética à temperatura ambiente por pelo menos 48 horas₂ e depois por um tempo de 22 horas a 26 horas, preferencialmente 24 horas, sob agitação magnética e refluxo;

   C. 3) Acidificar a mistura reacional adicionando-se uma solução de ácido clorídrico 0,5 mol L ¹ (HC1) para a formação da /?/<?.w-fénilporfírina carboxi-substituída aquossolúvel TCMPP (6);

   C.4) Remover os solventes em rotoevaporador e dissolver o resíduo em diclorometano (CH₂C1₂);

   C.5) Lavar a fase orgânica com de H₂O destilada;

   C.6) Separar a fase orgânica, secar, filtrar, remover o solvente em rotoevaporador, obter a /?/<?.w-tetrakis[4-(3-carboxipropoxi)-3-metoxifenil]porfirina (TCMPP) (6) como um sólido púrpura.
5. 5) “MKW-FENILPORFIRINA CARBOXI-SUBSTITUÍDA”, caracterizada por ser uma /?/<?.w-fenilporfirina carboxi-substituída sintética, aquossolúvel, denominada /?/<?.w-tetrakis[4(3-carboxipropoxi)-3-metoxifenil]porfirina (TCMPP) (6) com estrutura:

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6. 6) “USO DE MEAO-FENILPORFIRINA CARBOXI-SUBSTITUÍDA COMO FOTOSSENSIBILIZADOR EM TERAPIA FOTODINÂMICA”, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por empregar a /77e.sO-tetrakis[4-(3-carboxipropoxi)-3metoxifenil]porfirina (TCMPP) (6) como fotossensibilizador em Terapia Fotodinâmica para inativação microbiana, no tratamento fotodinâmico de lesões tumorais, dermatoses e também para diagnóstico fotodinâmico de lesões tumorais.