BR102017018636A2 - sistemas de biorreatores, método para realizar biorreação em sistema de biorreator e método de escalonamento de volume de trabalho de bioprocesso - Google Patents

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Abstract

um sistema de biorreator pode incluir (a) dois ou mais recipientes acoplados fluidicamente configurados para realizar coletivamente uma biorreação; (b) um ou mais caminhos fluídicos acoplando os dois ou mais recipientes um ao outro, onde os caminhos fluídicos são configurados para fornecer fluxo de meio de cultura entre os dois ou mais recipientes; (c) um ou mais dispositivos de transferência de fluido ao longo de pelo menos alguns do um ou mais caminhos fluídicos; e (d) um sistema de controle. o sistema de controle pode ser configurado para (i) ler ou receber valores de um ou mais parâmetros representando o meio de cultura em um ou mais dos recipientes, e (ii) usar os valores para determinar uma taxa de fluxo ajustada em pelo menos um dos caminhos fluídicos para manter valores substancialmente uniformes de um ou mais parâmetros no meio de cultura a partir de recipiente-a-recipiente entre os dois ou mais recipientes.

Description

(54) Título: SISTEMAS DE BIORREATORES, MÉTODO PARA REALIZAR BIORREAÇÃO EM SISTEMA DE BIORREATOR E MÉTODO DE ESCALONAMENTO DE VOLUME DE TRABALHO DE BIOPROCESSO (51) Int. Cl.: C12M 1/00; C12M 1/02; C12M 1/12; C12M 1/34; C12M 1/36 (30) Prioridade Unionista: 08/02/2017 US 15/427,613, 08/02/2017 US 15/427, 61330/08/2016 US 62/381,283 (73) Titular(es): FINESSE SOLUTIONS, INC (72) Inventor(es): BARBARA PALDUS; MARK D. SELKER (85) Data do Início da Fase Nacional:
30/08/2017 (57) Resumo: Um sistema de biorreator pode incluir (a) dois ou mais recipientes acoplados fluidicamente configurados para realizar coletivamente uma biorreação; (b) um ou mais caminhos fluídicos acoplando os dois ou mais recipientes um ao outro, onde os caminhos fluídicos são configurados para fornecer fluxo de meio de cultura entre os dois ou mais recipientes; (c) um ou mais dispositivos de transferência de fluido ao longo de pelo menos alguns do um ou mais caminhos fluídicos; e (d) um sistema de controle. O sistema de controle pode ser configurado para (i) ler ou receber valores de um ou mais parâmetros representando o meio de cultura em um ou mais dos recipientes, e (ii) usar os valores para determinar uma taxa de fluxo ajustada em pelo menos um dos caminhos fluídicos para manter valores substancialmente uniformes de um ou mais parâmetros no meio de cultura a partir de recipiente-a-recipiente entre os dois ou mais recipientes.
Figure BR102017018636A2_D0001
1/67
Figure BR102017018636A2_D0002
BIORREATOR COM MÚLTIPLOS RECIPIENTES ACOPLADOS xvQus(na/
FUNDAMENTOS [001] A ampliação de escala dos biorreatores ou a tentativa sistemática de aumentar o tamanho (volume) do biorreator enquanto mantém o título (rendimento de produto final) tem sido objeto de estudo quase o mesmo tempo que o biorreator moderno tem sido utilizado. O desenvolvimento típico de bioprocesso segue um caminho padrão de escala de laboratório onde o rastreio básico e a otimização de nível de base (por exemplo, meio) são realizados, ampliação de escala de planta piloto onde geralmente biorreatores maiores são utilizados e otimização adicional é realizada e, finalmente, escala de planta ou de produção onde maiores volumes são utilizados para tornar o produto final economicamente. O processo de ampliação de escala é muitas vezes necessário na produção à medida que as células são expandidas (seu número aumentou) , e são movidas para biorreatores sucessivamente maiores e maiores. Uma moderna (2014) preparação de semente de uso único ou preparação de processo na fabricação de bioprocessos é mostrado na Figura 1 {Escalabilidade Superior de biorreatores de uso único, Davy De Wilde, Thomas Dreher, Christian Zahnow, Ute Husemann, Gerhard Greller, Thorsten Adams e Christel Fenge, 23 de setembro de 2014, BioProcess International Magazine). O intervalo a partir de um frasco de 1 ml para um biorreator de tanque agitado de 1000L (STR) é um aumento de 106 em volume e muito além do intervalo linear ou constante para os parâmetros físicos em um único recipiente.
[002] Nos biorreatores de uso único, que são, por sua própria natureza, menores em volume do que suas contrapartes
Figure BR102017018636A2_D0003
2/67 de aço inoxidável (< 2.000L vs. < 50.000L +), o desejo de um caminho de aumento de escala claro e consistente ainda existe, como evidenciado pelo número contínuo de artigos publicados (por exemplo, Análise de Aumento de Escala para um Processo de Cultura Celular de CHO em Biorreatores de Grande Escala, Xing et al., Biotecnologia e Bioengenharia, volume 103, (4), p. 722, 4 de julho de 2009) e teses de alunos (Estudos comparativos sobre Métodos de Aumento de Escala de Biorreatores de Único Uso, Emily Stoker, Universidade Estadual de Utah, Ph.D. Tese 2011) dedicado a este assunto; ambas as referências aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Esta literatura destaca o fato que leis físicas fundamentais não permitem que a escala dos parâmetros de bioprocessos seja simples ou direta. Assim, os pesquisadores foram motivados a aplicar um grande escrutínio e atenção a como efetivamente aumentar escalda de um bioprocesso. Na verdade, essas questões têm motivado pesquisadores e trabalhadores no campo para analisar o aumento de escala por redução de escala (Oosterhuis, N.M.G., Aumento de Escala de Biorreators, Tese de doutorado, Delft University of Technology, Delft (1984), aqui incorporado por referência na sua totalidade).
SUMÁRIO [003] Um aspecto da divulgação refere-se a um sistema de biorreator que pode ser caracterizado pelas seguintes características: (a) dois ou mais recipientes acoplados fluidicamente configurados para realizar coletivamente uma biorreação; (b) um ou mais caminhos fluídicos acoplando os dois ou mais recipientes um ao outro, onde os caminhos fluídicos são configurados para fornecer fluxo de meio de vnÚUSIító/
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3/67 cultura entre os dois ou mais recipientes durante a biorreação; (c) um ou mais dispositivos de transferência de fluido ao longo de pelo menos alguns do um ou mais caminhos fluidicos; e (d) um sistema de controle. Em várias modalidades, o sistema de controle é configurado para (i) ler ou receber valores de um ou mais parâmetros representando o meio de cultura em um ou mais dos recipientes durante a biorreação, (ii) usar os valores para determinar uma taxa de fluxo ajustada em pelo menos um dos caminhos fluidicos para manter valores substancialmente uniformes de um ou mais parâmetros no meio de cultura a partir de recipiente-arecipiente entre os dois ou mais recipientes, e (iii) controlar pelo menos um dos dispositivos de transferência de fluido para ajustar a taxa de fluido determinada em (ii) . Em certas modalidades, cada dos caminhos fluidicos é configurado para permitir o fluxo bidirecional do meio de cultura entre dois dos recipientes. Em certas modalidades, os dois ou mais recipientes são dispostos em circuito fechado. Em certas modalidades, os dois ou mais recipientes e um ou mais caminhos fluidicos fornecem o sistema de biorreator em uma configuração em estrela.
[004] Um aspecto relacionado da divulgação refere-se a um sistema de biorreator que pode ser caracterizado pelas seguintes características: (a) dois ou mais recipientes acoplados fluidicamente configurados para realizar coletivamente uma biorreação; (b) um ou mais caminhos fluidicos acoplando os dois ou mais recipientes um ao outro, onde os caminhos fluidicos são configurados para fornecer fluxo de meio de cultura entre os dois ou mais recipientes durante a biorreação; (c) um ou mais dispositivos de
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4/67 transferência de fluido ao longo de pelo menos alguns do um^V / ou mais caminhos fluídicos; e (d) um sistema de controle. Em muitas implementações, o sistema de controle é configurado para (i) ler ou receber valores de um ou mais parâmetros representando o meio de cultura em um ou mais dos recipientes durante a biorreação, e (ii) controlar um ou mais dispositivos de transferência de fluido para transferir o meio de cultura entre os dois ou mais recipientes, através de um ou mais caminhos fluídicos, de modo que o tempo necessário para trocar o meio de cultura nos dois ou mais recipientes é no máximo cerca de um décimo do tempo necessário para células nos recipientes dobrarem sob condições nos dois ou mais recipientes. Em certas modalidades, cada dos caminhos fluídicos é configurado para permitir fluxo bidirecionai de meio de cultura entre dois dos recipientes. Em certas modalidades, os dois ou mais recipientes são dispostos em circuito fechado. Em algumas implementações dos aspectos acima, um ou mais parâmetros incluem um parâmetro selecionado a partir do grupo consistindo de pH, temperatura, concentração de metabolito celular e concentração de oxigênio dissolvido do meio de cultura.
[005] O sistema de biorreator dos aspectos acima pode incluir pelo menos mais um recipiente fluidicamente acoplado para um total de três ou mais recipientes f luidicamente acoplados configurados para realizar coletivamente a biorreação. Em algumas implementações, o sistema de biorreator inclui cinco ou mais recipientes fluidicamente acoplados, incluindo os dois ou mais recipientes.
[006] Em qualquer uma das modalidades descritas, cada
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5/67 recipiente pode ter um volume de trabalho não superior a cerca de 500 litros, ou não superior a cerca de 100 litros, ou não superior a cerca de 50 litros. Em qualquer uma das modalidades descritas, a proporção de volume de trabalho total dos dois ou mais recipientes para o volume de trabalho do maior dos dois ou mais recipientes é pelo menos aproximadamente 3. Em algumas implementações, os dois ou mais recipientes incluem paredes de recipiente poliméricas.
[007] Em algumas implementações, um dos dois ou mais recipientes é um recipiente mestre e os outros são recipientes satélites. Em tais implementações, o recipiente mestre pode incluir um sistema de mistura configurado para agitar o meio de cultura. O sistema de mistura pode incluir um dispositivo, como um impulsor, um agitador orbital, um balancim de onda e um pistão. Em alguns desenhos, um ou mais dos recipientes satélites não incluem um sistema de mistura. Em algumas modalidades, o recipiente mestre inclui um ou mais sensores para o pH, temperatura, uma concentração de metabolito celular, e oxigênio dissolvido no meio de cultura. Em algumas modalidades, o recipiente mestre tem um volume de trabalho maior do que qualquer um dos recipientes satélites.
[008] Em alguns desenhos do sistema de biorreator, os dois ou mais recipientes são fornecidos em uma ou mais escalas e/ou células de carga para monitorar suas massas durante a biorreação. Em tais desenhos, o sistema de controle pode ser ainda configurado para: ler ou receber pelo menos uma saida da uma ou mais escalas e/ou células de carga, como pelo menos um dos valores de um ou mais parâmetros; e com base nas saídas das escalas e / ou células de carga, controlar um ou mais dos dispositivos de transferência de
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6/67 fluido para transferir o meio de cultura entre os dois ou mais recipientes de modo que um volume do meio de cultura nos dois mais recipientes seja controlado.
[009] Em certas modalidades, os caminhos fluídicos incluem tubos e conectores assépticos anexados aos dois ou mais recipientes. Em alguns casos, os caminhos fluídicos se anexam próximos dos fundos dos dois ou mais recipientes. Em alguns casos, pelo menos um dos dispositivos de transferência de fluido inclui uma bomba.
[0010] 0 sistema de controle pode ser configurado para manter determinados valores de parâmetros dentro de certos limites. Também pode ser configurado para manter os valores de parâmetros em um nível consistente de recipientea-recipiente. Em algumas implementações, o sistema de controle é configurado para ajustar as condições nos dois ou mais recipientes para garantir que o pH médio do meio de cultura nos dois ou mais recipientes não varie de um recipiente para outro em mais de cerca de 0,1. Em algumas implementações, o sistema de controle é configurado para ajustar as condições nos dois ou mais recipientes para garantir que as forças de cisalhamento experimentadas pelas células nos dois ou mais recipientes sejam substancialmente iguais de um recipiente para outro durante a biorreação. Em certas modalidades, o sistema de controle é configurado para ajustar as condições nos dois ou mais recipientes para garantir que as taxas de transferência de gás de meio de cultura nos dois ou mais recipientes sejam substancialmente iguais de um recipiente para outro durante a biorreação.
[0011] 0 sistema de biorreator também pode ser projetado de tal forma que a variância (ou desvio padrão) em
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7/67 um valor de parâmetro seja minimizada ou, pelo menos, mantida dentro de um limite definido em qualquer um dos recipientes. Por exemplo, os dois ou mais recipientes e o sistema de controle podem ser configurados de modo que o pH do meio de cultura dentro de qualquer dos recipientes tenha variância de no máximo cerca de 0,1 unidades de pH. Em certas modalidades, o sistema de controle é um controlador de proporcional-integral-derivada.
[0012] Em certos sistemas de biorreator desta divulgação, o sistema de controle inclui um único circuito de controle que é configurado para controlar um recipiente mestre. Nesses casos, um dos dois ou mais recipientes é o recipiente mestre e os outros são recipientes satélites. O recipiente mestre pode ter um sistema de mistura configurado para agitar o meio de cultura.
[0013] Em várias modalidades, o sistema de biorreator e/ou um ou mais dos seus recipientes são configurados para operar em um modo de perfusão. De acordo com tais modalidades, pelo menos um dos dois ou mais recipientes acoplados fluidicamente inclui uma entrada fluídica e uma saída fluídica, e o sistema de biorreator é configurado para introduzir o meio de cultura no pelo menos um recipiente através da entrada fluídica, trocar o meio de cultura no recipiente enquanto mantendo as células biológicas nesse recipiente, e fluir o meio de cultura para fora da saída fluídica. Em algumas dessas modalidades de perfusão, a saída fluídica inclui um filtro configurado para evitar que as células biológicas, em pelo menos um recipiente, deixem o pelo menos um recipiente e a saída fluídica. Em algumas modalidades, um dos dois ou mais
Figure BR102017018636A2_D0009
8/67 recipientes é um recipiente mestre configurado para fornecer meios de cultura ao pelo menos um recipiente através da entrada fluídica para fornecer perfusão. Em algumas modalidades de perfusão, o sistema de controle e o recipiente mestre são juntos configurados para manter substancialmente valores definidos de concentração de oxigênio dissolvido, temperatura e pH no meio de cultura no recipiente mestre e no pelo menos um recipiente. Tal como acontece com algumas outras modalidades fornecendo recipientes mestres e satélites, o recipiente mestre pode incluir um sistema de mistura, enquanto o pelo menos um recipiente não inclui um sistema de mistura. Em algumas modalidades, um recipiente configurado para operar em modo de perfusão inclui um ou mais micro-transportadores, fibras ocas e / ou placas de adesão. Em algumas modalidades, dois ou mais recipientes são configurados para operar no modo de perfusão. Por exemplo, pelo menos dois dos dois ou mais recipientes fluidicamente acoplados incluem cada uma entrada fluídica e uma saída fluídica, e o sistema de biorreator é configurado para introduzir o meio de cultura nos pelo menos dois recipientes através da entrada fluídica, trocar o meio de cultura no recipiente enquanto mantendo as células biológicas nesse recipiente, e fluir o meio de cultura para fora da saída fluídica.
[0014] Outro aspecto da divulgação fornece métodos de realização de uma biorreação em um sistema de biorreator que podem ser caracterizados pelas seguintes operações: (i) dois ou mais recipientes acoplados fluidicamente configurados para realizar coletivamente uma biorreação;
(ii) um ou mais caminhos fluídicos acoplando os dois ou mais
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9/67 recipientes uns aos outros, onde o ou mais caminhos fluídicos são configurados para fornecer fluxo de meio de cultura entre os dois ou mais recipientes durante a biorreação; e (iii) um ou mais dispositivos de transferência de fluido ao longo de pelo menos alguns do um ou mais caminhos fluídicos, em que cada dos caminhos fluídicos é configurado para permitir o fluxo bidirecional do meio de cultura entre dois dos recipientes e / ou os dois ou mais recipientes são dispostos em circuito fechado. Os métodos podem ser caracterizados pelas seguintes operações: (a) ler ou receber valores de um ou mais parâmetros representando o meio de cultura em um ou mais dos recipientes durante a biorreação; (b) utilizar os valores para determinar uma taxa de fluxo ajustada em pelo menos um dos caminhos fluídicos para manter valores substancialmente uniformes de um ou mais parâmetros no meio de cultura a partir de recipiente-a-recipiente entre os dois ou mais recipientes e (c) controlar pelo menos um dos dispositivos de transferência de fluido para ajustar a taxa de fluido determinada em (b).
[0015] Em outro aspecto, a divulgação fornece métodos para realizar uma biorreação em um sistema de biorreator, incluindo: (i) dois ou mais recipientes fluidicamente acoplados configurados para realizar coletivamente a biorreação; (ii) um ou mais caminhos fluídicos acoplando os dois ou mais recipientes uns aos outros, onde um ou mais caminhos fluídicos são configurados para fornecer fluxo de meio de cultura entre os dois ou mais recipientes durante a biorreação; e (iii) um ou mais dispositivos de transferência de fluido ao longo de pelo menos alguns do um ou mais caminhos fluídicos, em que cada
10/67 %
Figure BR102017018636A2_D0011
õ/o/no^' dos caminhos fluidicos é configurado para permitir o fluxo bidirecional do meio de cultura entre dois dos recipientes e / ou os dois ou mais recipientes são dispostos em circuito fechado. Os métodos podem ser caracterizados pelas seguintes operações: (a) ler ou receber valores de um ou mais parâmetros representando o meio de cultura em um ou mais dos recipientes durante a biorreação, e (b) controlar um ou mais dispositivos de transferência de fluido para transferir o meio de cultura entre os dois ou mais recipientes, através de um ou mais caminhos fluidicos, de modo que o tempo necessário para trocar o meio de cultura nos dois ou mais recipientes é no máximo cerca de um décimo do tempo necessário para células nos recipientes dobrarem sob condições nos dois ou mais recipientes.
[0016] Nos aspectos de método acima, o sistema de biorreator pode incluir pelo menos mais um recipiente acoplado fluidicamente para um total de três ou mais recipientes acoplados fluidicamente configurados para realizar coletivamente a biorreação. Em algumas das implementações de método, o sistema de biorreator inclui quatro ou mais recipientes fluidicamente acoplados, incluindo os dois ou mais recipientes. Nos aspectos de método acima, um ou mais parâmetros incluem pH, temperatura, concentração de metabolito celular e/ou concentração de oxigênio dissolvido do meio de cultura.
[0017] Em certas modalidades, os métodos incluem ainda condições de ajuste nos dois ou mais recipientes para garantir que o pH médio do meio de cultura nos dois ou mais recipientes não varie de um recipiente para outro em mais de cerca de 0,1. Em certas modalidades, os métodos incluem ainda
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11/67 condições de ajuste nos dois ou mais recipientes par.. „ , assegurar que forças de cisaihamento experimentadas por células nos dois ou mais recipientes sejam substancialmente iguais de um recipiente para outro durante a biorreação. Em certas modalidades, os métodos incluem ainda condições de ajuste nos dois ou mais recipientes para assegurar que taxas de transferência de gás de meio de cultura nos dois ou mais recipientes sejam substancialmente iguais de um recipiente para outro durante a biorreação.
[0018] Em certas modalidades de método, cada recipiente do sistema de biorreator tem um volume de trabalho não superior a cerca de 500 litros ou não superior a cerca de 50 litros. Em certas modalidades, a proporção de volume de trabalho total dos dois ou mais recipientes para o volume de trabalho do maior dos dois ou mais recipientes é de pelo menos aproximadamente 3.
[0019] Em certas modalidades de método, um dos dois ou mais recipientes é um recipiente mestre e os outros são recipientes satélites, onde o recipiente mestre inclui um sistema de mistura configurado para agitar o meio de cultura. Em algumas implementações, um ou mais dos recipientes satélites não inclui um sistema de mistura. Em algumas implementações, o recipiente mestre tem um volume de trabalho maior do que qualquer um dos recipientes satélites.
[0020] Em alguns dos aspectos do método desta divulgação, o método inclui ainda: ler ou receber pelo menos uma saida da uma ou mais escalas e/ou células de carga, nas quais os dois ou mais recipientes são fornecidos; e com base nas saídas das escalas e/ou células de carga, controlar um ou mais dos dispositivos de transferência de
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Figure BR102017018636A2_D0013
fluido para transferir o meio de cultura entre os dois ou mais recipientes de modo que um volume do mei nos dois mais recipientes seja controlado. Em certas modalidades, os caminhos fluidicos incluem tubos e conectores assépticos anexados aos dois ou mais recipientes. Em alguns casos, pelo menos um dos dispositivos de transferência de fluido inclui uma bomba.
[0021] Em alguns dos métodos descritos, pelo menos um dos dois ou mais recipientes acoplados fluidicamente inclui uma entrada fluidica e uma saida fluídica. Em tais casos, o método inclui ainda introduzir os meios de cultura ao pelo menos um recipiente através da entrada fluídica, fluir o meio de cultura sobre células biológicas enquanto são retidas no pelo menos um recipiente, e fluir o meio de cultura para fora da saída fluídica, para assim operar o pelo menos um recipiente em um modo de perfusão. Ao operar em modo de perfusão, um recipiente pode fazer uso de um filtro configurado para impedir que as células biológicas no, pelo menos um, recipiente deixem o pelo menos um recipiente e a saída fluídica. Alternativamente ou adicionalmente, um recipiente pode incluir ainda microtransportadores, fibras ocas e/ou placas de adesão para retenção de células. Em certas modalidades, um dos dois ou mais recipientes é um recipiente mestre configurado para fornecer meios de cultura ao pelo menos um recipiente através da entrada fluídica para fornecer perfusão. Nesses casos, um método pode manter substancialmente valores definidos de concentração de oxigênio dissolvido, temperatura e pH no meio de cultura no recipiente mestre e no pelo menos um recipiente.
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Figure BR102017018636A2_D0014
Figure BR102017018636A2_D0015
[0022] Outro aspecto desta divulgação refere-se a métodos de escalonamento de um volume de trabalho de bioprocesso a partir de um biorreator de pequena escala para o de um biorreator de grande escala. Em certas modalidades, tais métodos são caracterizados pelas seguintes operações: (a) determinar condições de processo para realizar o bioprocesso em um recipiente de teste tendo um volume de trabalho relativamente pequeno (por exemplo, não superior a cerca de 700 litros), onde as condições de processo incluem valores de teste de um ou mais parâmetros representando o meio de cultura no recipiente durante o bioprocesso; (b) projetar um sistema de biorreator incluindo um sistema de controle e dois ou mais recipientes de produção conectados fluidicamente, cada tendo um volume de trabalho não superior a cerca de 1,5 vezes o volume de trabalho do recipiente de teste, e a soma dos volumes de trabalho dos dois ou mais recipientes de produção sendo pelo menos aproximadamente 2 vezes maior do que o volume de trabalho do recipiente de teste; e (c) construir e/ou arranjar os dois ou mais recipientes de produção e o sistema de controle conforme especificado em (b) para produzir o biorreator de grande escala. Posteriormente, o bioprocesso pode ser realizado no biorreator de grande escala. O projeto do sistema de biorreator pode incluir projetar o sistema de controle para (i) ler ou receber valores de produção de um ou mais parâmetros representando o meio de cultura em um ou mais dos dois ou mais recipientes durante o bioprocesso, (ii) usar os valores de produção lidos ou recebidos para determinar uma taxa de fluxo ajustada do meio de cultura entre os dois ou mais recipientes de produção para manter valores de produção
Figure BR102017018636A2_D0016
14/67 &
CX co •c;
0,QlWXl^ substancialmente uniformes de um ou mais parâmetros no meio de cultura a partir de recipiente-a-recipiente entre os dois ou mais recipientes de produção durante o bioprocesso e (iii) controlar um dos dispositivos de transferência de fluido dispostos entre os dois ou mais recipientes de produção para ajustar a taxa de fluido conforme determinado em (ii) . Em certas modalidades, o sistema de biorreator é configurado para permitir o fluxo bidirecional do meio de cultura entre dois dos recipientes de produção e / ou os dois ou mais recipientes de produção são dispostos em circuito fechado.
[0023] Em certas modalidades, o sistema de biorreator inclui três ou mais recipientes de produção configurados para realizar coletivamente o bioprocesso. Em certas modalidades, o sistema de biorreator inclui quatro ou mais recipientes de produção configurados para realizar coletivamente o bioprocesso. Em certas modalidades, o sistema de biorreator inclui cinco ou mais recipientes de produção configurados para realizar coletivamente o bioprocesso. Em certas modalidades, o sistema de biorreator inclui seis ou mais recipientes de produção configurados para realizar coletivamente o bioprocesso. Em certas modalidades, cada recipiente de produção tem um volume de trabalho não superior a cerca de 500 litros. Em certas modalidades, a proporção de volume de trabalho total dos dois ou mais recipientes de produção para o volume de trabalho do maior dos dois ou mais recipientes de produção é de pelo menos aproximadamente 3.
[0024] O projeto do sistema de biorreator pode envolver projetar o sistema de controle para manter, durante o bioprocesso, os valores de produção de um ou mais
Figure BR102017018636A2_D0017
15/67 parâmetros para serem substancialmente iguais aos valores de teste de um ou mais parâmetros. Em algumas implementações, um ou mais parâmetros incluem pH, temperatura, concentração de metabolito celular ou concentração de oxigênio dissolvido no meio de cultura. Em algumas implementações, o método envolve projetar o sistema de controle para ajustar as condições nos dois ou mais recipientes de produção para garantir que o pH médio do meio de cultura nos dois ou mais recipientes de produção não varie de um recipiente para outro por mais de cerca de 0,1 unidades de pH.
[0025] Reconhecendo que um ou mais dos recipientes individuais podem ter um intervalo operacional, a realização do bioprocesso pode se desenrolar da seguinte forma: (d) realizar o bioprocesso em um primeiro volume de trabalho total de meio de cultura no biorreator de grande escala construído em (c) ; e (e) após (d) , realizar o bioprocesso em um segundo volume de trabalho total de meio de cultura que é maior do que o primeiro volume de trabalho total, mas ainda usa apenas dois ou mais recipientes de produção do biorreator de grande escala. Em uma variação, a realização do bioprocesso pode se desenrolar da seguinte forma: (d) realizar pelo menos uma parte do bioprocesso no biorreator de grande escala construído em (c); e (e) depois (d) , adicionar ou ativar mais um recipiente de produção adicional para o biorreator de grande escala e pelo menos parcialmente preencher um ou mais recipientes de produção adicionais com meio de cultura a partir de um ou mais outros recipientes de produção de biorreator de grande escala. Em outra variação, a realização do bioprocesso pode se desenrolar da seguinte forma: (d) realizar o bioprocesso no biorreator de grande
Figure BR102017018636A2_D0018
16/67 escala construído em (c); e (e) após (d) , remover um ou mais dos dois ou mais recipientes de produção contendo meio de cultura e células cultivadas no meio de cultura. Em algumas implementações, as células que foram cultivadas durante o bioprocesso são crescidas para o tratamento de um paciente.
[0026] Em algumas implementações, um dos recipientes de produção é um recipiente mestre e os outros são recipientes satélites, e o recipiente mestre inclui um sistema de mistura configurado para agitar o meio de cultura. Os recipientes satélites não precisam incluir um sistema de mistura. 0 recipiente mestre pode incluir um ou mais sensores para o pH, temperatura, uma concentração de metabolito celular e oxigênio dissolvido no meio de cultura. Normalmente, embora não necessariamente, o recipiente mestre tem um volume de trabalho maior que qualquer um dos recipientes satélites.
[0027] Outro aspecto desta divulgação refere-se a sistemas de biorreator projetados ou configurados para operar em um modo de perfusão. Alguns desses sistemas podem ser caracterizados pelas seguintes características: (a) dois ou mais recipientes fluidicamente acoplados configurados para realizar coletivamente uma biorreação, em que pelo menos um dos recipientes é um recipiente de perfusão tendo uma entrada fluídica, uma saída fluídica e um filtro ou outra estrutura de retenção celular configurada para impedir que células biológicas abandonem o recipiente de perfusão durante a biorreação; (b) um ou mais caminhos fluídicos acoplando os dois ou mais recipientes um ao outro, em que o ou mais caminhos fluídicos são configurados para fornecer fluxo de meio de cultura entre os dois ou mais recipientes
Figure BR102017018636A2_D0019
17/67 durante a biorreação; (c) um ou mais dispositivos de transferência de fluido (por exemplo, bombas) ao longo de pelo menos alguns do um ou mais caminhos fluidicos; e (d) um sistema de controle configurado para introduzir o meio de cultura para o recipiente de perfusão através da entrada fluídica, trocar o meio de cultura no recipiente enquanto mantendo as células biológicas nesse recipiente, e fluir o meio de cultura para fora da saída fluídica, para assim operar em um modo de perfusão. Exemplos de estruturas de retenção de células incluem, além de filtros, microtransportadores, fibras ocas e placas de adesão. Qualquer um destes pode ser disposto dentro de um recipiente de perfusão.
[0028] O sistema de controle também pode ser configurado para (i) ler ou receber valores de um ou mais parâmetros representando o meio de cultura em um ou mais dos recipientes durante a biorreação, (ii) usar os valores para determinar uma taxa de fluxo ajustada em pelo menos um dos caminhos fluidicos para manter valores substancialmente uniformes de um ou mais parâmetros no meio de cultura a partir de recipiente-a-recipiente entre os dois ou mais recipientes, e (iii) controlar pelo menos um dos dispositivos de transferência de fluido para ajustar a taxa de fluxo determinada em (ii).
[0029] Em algumas modalidades de perfusão, um dos dois ou mais recipientes é um recipiente mestre configurado para fornecer meios de cultura para o recipiente de perfusão através da entrada fluídica para fornecer perfusão. Em alguns casos, o sistema de controle e o recipiente mestre são juntos configurados para manter valores de concentração de oxigênio dissolvido, temperatura e pH no meio de cultura no recipiente
18/67 ã
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Γύ mestre e no recipiente de perfusão. 0 recipiente mestre pode .oC^sifiai
Figure BR102017018636A2_D0020
incluir um sistema de mistura, enquanto que, em alguns casos, o recipiente de perfusão não inclui nenhum sistema de mistura.
[0030] 0 sistema de biorreator não é limitado a modalidades tendo apenas um único recipiente de perfusão. Por exemplo, o sistema pode incluir um segundo recipiente de perfusão de recipientes fluidicamente acoplados incluindo a sua própria entrada fluídica, saída fluídica e estrutura de retenção de células configurada para evitar que as células biológicas se retirem durante a biorreação. Em alguns casos, o sistema emprega um segundo recipiente de perfusão que inicialmente é fluidamente desconectado dos dois ou mais recipientes conectados fluidicamente. No entanto, o segundo recipiente de perfusão inclui uma conexão fluídica suplementar para conexão ao sistema de biorreator após o sistema de biorreator ter operado no modo de perfusão.
[0031] Em algumas implementações, o sistema de biorreator é configurado para preencher pelo menos parcialmente o recipiente de perfusão com meio de cultura a partir de um ou mais outros recipientes durante a biorreação. Em algumas implementações, o recipiente de perfusão é configurado para ser removido a partir do sistema de biorreator, juntamente com o meio de cultura do recipiente de perfusão e células cultivadas no meio de cultura, antes da biorreação ser concluída.
[0032] Estas e outras características da divulgação serão descritas em mais detalhes abaixo com referência aos desenhos associados.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
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19/67 [0033] Figura 1. Preparação de aumento de escal técnica anterior de biorreatores de uso único a parti uma publicação de 2014.
[0034] Figura 2. Um tanque simples apresentando as equações diferenciais que descrevem a mistura.
[0035] Figura 3. Uma abstração matemática de uma arquitetura em estrela para mistura de vários tanques.
[0036] Figura 4. Dois modelos matemáticos bidirecionais adicionais de arranjos de tanques para potenciais sistemas de mistura.
[0037] Figura 5. Dois modelos matemáticos unidirecionais de arranjos de tanques para potenciais sistemas de mistura.
[0038] Figura 6. Dois recipientes escravos (ou satélites) conectados a um recipiente mestre com bombas e conectores assépticos. Esta Figura mostra a configuração básica para múltiplos tanques usados em um processo de aumento de escala ou aumento de escala.
[0039] Figura 7. Esta Figura mostra um processo típico de crescimento celular de animais dividido em fases. Também mostra o tempo de duplicação.
[0040] Figura 8. Esta Figura mostra uma representação física da arquitetura em estrela para n expansão de recipiente.
[0041] Figura 9. Um sistema de expansão de múltiplos tanques equipado para fornecer modalidades para aplicações de medicina personalizadas.
DESCRIÇÃO [0042] Alguns detalhes dos processos de ampliação de escala e as complicações experimentadas pelos trabalhadores
20/67 /hs-_sQ£ <X7
CL
Rub y' 17 cS neste campo são descritos em, por exemplo, Similaridade 5 , Fisiológica e Ampliação de Escala de Biorreator, Votruba et al., Microbiologia de Folia, vol 37 (5), p. 331, 1992, Frasco de Agitação, para Fermentador·. O Que Aprendemos, Humphrey, Progresso de Biotecnologia, vol. 14, p. 3, 1998, e Convivendo com Heterogeneidades em Biorreatores, Lara et al. , Biotecnologia Molecular, vol. 24, p. 355, 2006, cada um aqui incorporado por referência na sua totalidade. Tem sido sugerido por muitos autores e resumido por Ju (Estratégias de ampliação de escala melhoradas de biorreatores,
Engenharia de Bioprocesso vol. 8, p. 49, 1992 toda a informação aqui incorporada) que a fim de eficazmente aumenta escala de um bioprocesso as seguintes características de processo seriam mantidas como constante:
1. Geometria do reator;
2. 0 coeficiente de transferência de oxigênio volumétrico kra (m/s m2/m3) ;
3. Cisalhamento máximo experimentado por células (kg / m2s) ;
4. Entrada de energia por unidade de volume de líquido P (kW) /V (m3) ;
5. Taxa de fluxo de gás volumétrica por unidade de volume de líquido Q (m3/s)/V(m3)
6. Velocidade de gás superficial v (m/s)
7. Tempo (s) de mistura . Número de Reynolds de Impulsor Rei = densidade de fluido x velocidade de impulsor (velocidade de ponta de impulsor de densidade)2 / viscosidade cinemática (quantidade adimensional)
9. Fator de impulso (cm3/s)
21/67 £ Q_ [0043] O item 1 refere-se à forma real e proporção de aspecto (altura versus largura) do biorreator. Isso tem um grande efeito sobre o funcionamento do biorreator e até o ponto em que ele pode ser parcialmente preenchido (por exemplo: o alcance operacional do biorreator no volume de preenchimento ou o intervalo operacional) . Parâmetros adicionais relacionados à forma e ao tamanho do biorreator são os desenhos do impulsor e a proporção de seus diâmetros para o diâmetro do biorreator. O item 2 refere-se à taxa em que o oxigênio pode ser transferido para o meio - tipicamente a partir de oxigênio ou ar aspirado. Em geral, há uma compensação entre tornar as bolhas menores (aumento da área de superfície para a proporção de volume com tamanho reduzido devido à sua forma esférica) e espuma que ocorre a partir da tensão superficial da alta densidade de bolhas de ruptura. O item 3 e o item 4 estão relacionados à força de cisalhamento que realmente irá danificar uma célula. As células de mamíferos são muito mais suscetíveis a esse tipo de dano que as células bacterianas. As forças de cisalhamento são induzidas por muitas coisas incluindo a tensão superficial de um rebentamento de bolhas ou de um vórtice formado na ponta do impulsor (Cultura de Célula Animal em Biorreatores Agitados: Observações na ampliação de escala, Y. Christi, Bioquímica de Processo, vol 28., 0. 511, 1992). Os itens 5 e 6, como o item 2, estão relacionados à capacidade de transferir gás para dentro ou para fora do meio. Item 7, tempo de mistura, refere-se ao tempo que leva um biorreator para atingir um grau estabelecido de uniformidade na concentração de um ou mais analitos ou densidade celular monitorados. 0 grau estabelecido pode diferir na literatura, vf\ÓU5»7 /α/ %
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Figure BR102017018636A2_D0022
22/67 mas uma definição típica é que a concentração difere em menos de 10% em qualquer ponto do biorreator. O tempo de mistura também pode ser definido como o tempo necessário para que um parâmetro (ou um rastreador) seja distribuído de forma homogênea dentro do biorreator ao nível requerido para um processo bem-sucedido. (Modelação de tempos de mistura para biorreatores de agitação. 3. Tempo de mistura para caldos gaseificados, D. Cascaval et al, Chem. Ind. Vol. 56 (12), p 506, 2002), aqui incorporado por referência na sua totalidade. Salvo indicação em contrário aqui, esta última definição será usada aqui. Item 8, o número do Reynolds de impulsor é inversamente relacionado ao tempo de mistura do biorreator. De um modo geral, quanto maior número de Reynolds, maior a turbulência, mas menor o tempo de mistura. O custo para menores tempos de mistura é maior; Essa é outra compensação que deve ser equilibrada para o sistema exato em estudo. 0 item 9, aparentemente menos utilizado na literatura, é o fator de momento e é relacionado tanto à transferência de massa e cisalhamento no biorreator.
[0044] 0 número de parâmetros de processo e a combinação de parâmetros de processo a partir da lista acima que se deseja manter constantes durante escalonamento mudam com base em um grande número de considerações. Essas considerações incluem, mas provavelmente não estão limitadas a: linha celular escolhida, o tipo ou produto que está sendo produzido, o rendimento exigido do produto, o tipo de biorreator utilizado, os detalhes do processo implementado e o grau de aumento de escala desejado. Pode ser extraído da breve revisão da literatura acima mencionada que aumento de escala não é geralmente um processo simples e ocupou o tempo
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23/67 e os esforços de muitos trabalhadores qualificados no campo do bioprocessamento por muitos anos.
[0045]
Para que o processo mantenha um rendimento consistente e seja clinicamente e economicamente viável, as células / processos devem minimizar, ou na pior das hipóteses manter, a heterogeneidade do biorreator dos parâmetros acima (e, por vezes, parâmetros relacionados) durante o processo de aumento de escala. Conforme mencionado acima, isso é até o momento um desafio significativo mesmo para os especialistas desta arte. Isso geralmente resulta em menor título ou densidade celular para o fim de uma preparação de sementes do que para os biorreatores de pequena escala no laboratório. Idealmente, então, um sistema pelo qual o volume pode ser ampliado sem alterar a escala do biorreator produzirá resultados ótimos e permitirá mudanças diretas de P & D através da produção. Isso contrasta com a ampliação e a redução de escala hoje, onde a maior parte do trabalho de otimização é realizada para combinar o título e a produtividade de pequenos recipientes de vidro (< 15L) nos volumes de produção previstos (biocompare.com/EditorialArticles/165203-Scaling-Up-Your-Cell-cultures-toBioreactors/), e onde inconsistências de escalabilidade ainda estão sendo observadas tanto em título como em qualidade de produto como resultado dos diferentes volumes de biorreator [J. Li, G. Zhang, et al. Desafios do modelo de redução de escala para biorreatores descartáveis: estudos de caso sobre crescimento e impactos de qualidade de produto, Tecnologias de Uso Único, Leesburg, VA, 18 a 21 de outubro de 2015 (incorporado aqui como referência na sua totalidade) ou infors-ht.com
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24/67 /Index.php/en/applications/scale-up]. Da mesma forma, o desempenho de novos biorreatores de grande escala é sempre comparado ao funcionamento do mesmo processo em um recipiente de vidro (Nota de Aplicação de Pall: USD2926, Cultivo de Células de CHO no Sistema de Biorreator de Tanque Agitado de Uso Único Allegro ™ STR 200, aqui incorporado por referência em sua totalidade ou biopharminternational.com/evaluation-single-use-bioreactorfed-batch-production-monoclona1-antibody).
[0046] As modalidades aqui descritas abordam muitos desses desafios. O projeto do biorreator convencional atual (por exemplo, agitado) neste momento pode, praticamente falando, permitir a escalabilidade / intervalo operacional de até um fator de 5 [Arquivo de dados da GE Healthcare Life Sciences 29-0929-25 AA Sistemas de biorreator de culturas celulares XDR Xcellerex ™(incorporado aqui por referência na sua totalidade) ou emdmillipore.com/US/en/mobius-singleuse-manufacturing/mobius-single-use-bioreactors/mobiusbioreactors/fCyb.qB.lTkAAAFEF9sMfopc,nav ou bioprocessintl.com /umpstreamprocessing/fermentation/single-use-processiong-formicrobiai-fermentations/]. Conforme mencionado acima, a terminologia frequentemente usada na indústria de bioprocessamento é intervalo operacional ou a relação entre o volume de trabalho máximo e o volume de trabalho mínimo. Por exemplo, um biorreator de uso único, projetado corretamente, podería escalar de 130 L para 650L com um intervalo operacional de 5:1. 0 objetivo para o desenho do intervalo operacional é que dentro desta escala, muitos dos critérios mencionados acima podem ser considerados
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25/67 conservados ou similares o suficiente densidades celulares, viabilidades celulares, e títulos sejam iguais; especificamente, para um biorreator com um intervalo operacional de 5:1 em qualquer volume a partir de 20% a 100% do volume de trabalho (volume máximo utilizável), pode-se considerar as propriedades do biorreator muito semelhantes. No entanto, se for desejado aumentar a escala após o volume máximo, até o momento, um novo biorreator maior seria necessário para aumentar o número total de células ou o título. Conforme discutido anteriormente, um biorreator maior geralmente não pode ser tratado como tendo as mesmas 9 quantidades acima mencionadas, criando assim o problema discutido acima. Por exemplo, o tempo de mistura não é preservado em um biorreator de 2000L entre a operação de volume total e de meio volume (Resumo de Aumento de Escala ou Sub Validação de Thermo Fischer 2000L SUB, página guia 41/42, aqui incorporado por referência) . Note que quando micro-transportadores ou outros mecanismos de suspensão são introduzidos em um biorreator, o problema de aumento de escala é significativamente mais difícil (bioprocessintl.com/manufacturing/antibody-nonantibody/considerations-in-scale-up-of-viral-vaccineproduction-320990 /) . Além disso, com certos tipos de células sensíveis ao cisalhamento, como as células estaminais, o aumento de escala é primordial para produzir o produto celular.
[0047] Um método para contornar esse problema é executar simultaneamente múltiplos, ou N, biorreatores do mesmo tamanho para ampliar o volume. No entanto, muitas vezes é considerado uma maneira insatisfatória ou mesmo
26/67
Figure BR102017018636A2_D0026
«XÚUSifíij/ % Λ , '-σ processados C7V r Z or inaceitável de aumentar escala, uma vez que cada biorreator ' *3d é independente e pode ter condições ligeiramente diferentes e deve ser configurado de forma independente. Isso significa que cada biorreator é controlado separadamente (por exemplo, cada um tem seu próprio conjunto de controladores de circuito de PID) e, portanto, os lotes de cada biorreator são considerados independentes, ou seja, diferentes de uma perspectiva de rendimento, rastreabilidade, qualidade e comportamento geral. Além disso, para eventualmente utilizar os produtos dos N biorreatores como um lote, os conteúdos devem ser combinados ou agrupados antes de serem jusante (por exemplo: filtração, cromatografia, inativação de vírus). Grupos de qualidade e / ou órgãos reguladores muitas vezes se opõem ao agrupamento, pois isso cria uma falta de rastreabilidade para a origem de quaisquer problemas (por exemplo: contaminação, menor rendimento ou eficácia, etc.). Dado esses fatos, o conceito de executar N recipientes de biorreatores independentes (menores) é muitas vezes evitado para aumento de escala em favor de um biorreator muito maior.
[0048] Certas modalidades desta divulgação fornecem uma forma de contornar, ou pelo menos mitigar significativamente os problemas de aumento de escala acima mencionados, introduzindo o acoplamento entre N biorreatores; aqui acoplamento significa a transferência física dos conteúdos (células e sobrenadantes) entre os biorreatores. Isso pode ser visto como uma extensão para um conjunto muito conhecido de problemas em matemática chamado problemas de mistura. Se um acopla um conjunto de N biorreatores juntos trocando conteúdos fluidos entre eles,
27/67
Figure BR102017018636A2_D0027
Figure BR102017018636A2_D0028
WÔUS,/,'3/ t? % £ F/S <λθ Ta
Cl A &
de modo a permitir que o conteúdo de todos os N biorreatores seja considerado homogêneo (e, portanto, idêntico), temos, para todos os propósitos, um lote. Isso permite que vários biorreatores sejam utilizados para criar um lote sem agrupamento enquanto ignorando os problemas de aumento de escala e sem a necessidade de escrutínio de um grupo de qualidade ou regulamentar.
[0049] Voltando à questão do acoplamento dos biorreatores, analisaremos a maquinaria matemática da mistura entre tanques. Como uma introdução ao conceito de mistura em tanques, começaremos com um problema simples e comum - uma única mistura de analito (por exemplo, salmoura ou sal). 0 problema mais básico geralmente tem um tanque parcialmente preenchido com um analito (por exemplo, sal) dissolvido em água. Problemas típicos requerem uma solução para uma equação diferencial normal (ODE) e calculam quanto tempo demora para que o sistema atinja o equilíbrio. O problema típico também requer que se calcule a eventual concentração de equilíbrio do analito para um determinado fluxo de entrada a uma taxa e concentração indicadas de analito em água com concentrações e volume iniciais dados.
[0050] A Figura 2 mostra um tanque de mistura com uma situação semelhante à descrita acima. Assumir:
S(t) é a quantidade de sal no tempo t;
V(t) é o volume da solução no tanque no tempo t;
Fin é a taxa de fluxo em que a solução flui para dentro do tanque;
FOut é a taxa de fluxo em que a mistura flui para fora do tanque;
Cin é a concentração de sai na solução que flui para o
Figure BR102017018636A2_D0029
28/67 tanque;
COut é a concentração de sal na solução fluindo para fora do tanque;
Rin é a taxa a qual o sal é vertido para dentro do tanque
Equaçãol : R = FinRm x Cin
Rout é a taxa a qual o sal é vertido para fora do tanque
Equação 2: ROut = FoutRout x Cout
Dados esses pressupostos, podemos definir:
Equação 3: Cout(t) = S(t) / V(t)
Equação 4: dS(t) / dt = a taxa de mudança de sal no tanque como Rin -Rout
Isso pode ser redeclarado como:
Equação 5: dS(t) / dt = Fm x Cm - FOut x S(t) / V(t)
Esta é uma forma padrão de equação diferencial ordinária (ODE) de tipo
Equação 7: dS / dt + pS = q
A solução para essa ODE é:
f dt + C onde μ(ί) = [0051] Portanto, podemos resolver a concentração de sal, S(t), no tanque em qualquer momento, t, dado as condições iniciais e as taxas de fluxo. O ponto do exemplo acima é simplesmente dar uma visão de como um usa equações diferenciais padrão para resolver esse tipo de problema. Agora, a discussão irá recorrer ao sistema e às matemáticas que descrevem em detalhes certas modalidades descritas aqui.
[0052] O termo recipiente será usado como termo genérico descrevendo um contentor liquido que pode significar um tanque ou um biorreator. Os tanques serão passivos ou contentores de mistura, enquanto os biorreatores
29/67 ,F
G_
RuD serão recipientes com o potencial de controlar ativamente os IL,$ parâmetros de interesse para o bioprocessamento. Considere o arranjo mostrado na Figura 3 tomado de Problemas de Mistura com Muitos Tanques, A. Slavik, Associação Matemática de América, p.806, 2013 (aqui incorporado por referência na sua totalidade). Esta Figura mostra um arranjo de tanques no que é referido como uma configuração em estrela, que possui um recipiente central e três ou mais outros recipientes diretamente conectados fluidicamente ao recipiente central.
A configuração em estrela é uma configuração possível, mas de modo algum a única configuração que permite a mistura entre os recipientes. Na Figura 3, os tanques são rotulados como Τι... T8. Este sistema acoplado é um arranjo que retrata de forma mais realista como os tanques ou biorreatores podem ser conectados em rede para escalabilidade. Se alguém resolve rigorosamente e inequivocamente os fluxos de misturas de uma substância (por exemplo, sal) que flui entre tanques acoplados, também pode resolver rigorosamente as misturas de células e/ou meios (sobrenadante geral) que se movem entre os biorreatores. Isso significa que também é possível criar modelos para prever quais taxas de fluxo a partir de condições iniciais resultarão em uma solução estacionária e homogênea. Muitos dos casos de interesse foram resumidos no documento acima mencionado. 0 artigo fornece um conjunto geral de equações que descrevem o problema da mistura em tanques múltiplos acoplados e permitem soluções. Essas equações são a extensão geral do problema de mistura de tanque único que apresentamos acima. O sal é usado especificamente no papel de Slavik, mas qualquer substância uniformemente mista pode ser substituída pelo sal. As
Figure BR102017018636A2_D0030
30/67 £
a.
ri Rut) equações 9 e 10 abaixo a partir de Slavik usam uma notação ligeiramente diferente do nosso exemplo simplificado:
Figure BR102017018636A2_D0031
Figure BR102017018636A2_D0032
V é o volume
Ti tanque central é rotulado como tanque 1
T2 ... Tn são os (n-1) tanques ligados ao tanque 1
Xi(t) é a quantidade de sal no tanque I, (Ti), em qualquer dado momento t [0053] A equação 9 descreve a alteração da quantidade do aditivo (sal) como uma função de tempo no tanque central (tanque 1), enquanto a equação 10 descreve a alteração na concentração de sal como uma função do tempo em qualquer tanque Ti que não é o tanque central. Para um determinado conjunto de condições iniciais, a quantidade de sal em cada tanque no tempo 0 pode ser resolvida e os detalhes são elaborados no papel de Slavik. Como mencionado anteriormente, uma vez que as soluções matemáticas para qualquer mistura podem ser resolvidas, esta solução também descreverá com precisão os conteúdos de um biorreator.
[0054] Considerando a configuração da estrela na
Figura 3, pode-se ver que os N recipientes (por exemplo, oito ou mais) podem ser acoplados, onde N é limitado apenas por considerações práticas (problema geométrico e espacial, distâncias, custo) . Como a Figura 3 é uma idealização matemática do problema físico, muitas considerações para a aplicação da maquinaria matemática acima mencionada aos biorreatores não foram especificamente abordadas.
[0055] A Figura 4 mostra mais duas representações matemáticas de arranjos de tanques que podem ser usados para
Figure BR102017018636A2_D0033
31/67 mistura. 0 número de referência 4-100 é uma cadeia linea;
com movimentação de fluido bidirecional em cada tanque, enquanto que 4-101 é uma configuração de anel que também emprega mistura bidirecional. Note que, para recipientes bem caracterizados que foram projetados com consistência de aumento de escala / redução de escala apropriada em seus parâmetros operacionais, qualquer uma dessas configurações também pode conter recipientes de diferentes tamanhos.
[0056] O fluxo bidirecional entre os recipientes deve aumentar a velocidade com que os recipientes alcançam o equilíbrio, mas se a mistura real pode ser assegurada, esse direcionamento não é estritamente necessário. Isso também foi modelado matematicamente e duas dessas configurações unidirecionais são mostradas na Figura 5. O número de referência 5-100 é o análogo unidirecional do anel 4-100 mostrado na Figura 4, enquanto que 5-101 é o análogo unidirecional da cadeia 4-101. O número de referência 5-102 é a entrada e 5-103 é a saída que precisará ser amarrada em um sistema conservador de fluido.
[0057] A Figura 6 apresenta um exemplo adicional. Como mostrado lá, o biorreator central 6-100 atua como o mestre ou o biorreator controlador, enquanto que os biorreatores de expansão ou satélites 6-106 e 6-108 são os biorreatores escravos. Como mostrado, um biorreator central 6-100 é equipado com sensores usados para o controle de vários analitos ou níveis físicos, incluindo, mas não limitado a, sensores para: oxigênio dissolvido, pH, temperatura, CO2, densidade celular, condutividade, e a viabilidade celular. O biorreator mestre também é equipado com um sistema de mistura e impulsor 6-102, 6-107 e
32/67 aspersores para controlar o nível de oxigênio dissolvido ou remoção de CO2. Estas características são tipicamente utilizadas com um circuito de controle (por exemplo, circuito de PID) para manter os níveis ótimos de qualquer uma das quantidades acima mencionadas. 0 controle na Figura 6 ocorre através de medições no biorreator mestre, enquanto um sistema escravo é usado para monitoramento e relatório tanto para os circuitos mestres quanto para as bombas 6-103 e 6-104. Em certas modalidades tais como as descritas na Figura 4, a capacidade do biorreator pode ser expandida ou escalonada mediante a ligação de outros biorreatores tais como os biorreatores 6-106 e 6-108 ao biorreator central 6-100. Os biorreatores, todos tipicamente pré-esterilizados, são conectados usando conectores assépticos de uso único e conjuntos de tubos associados ou outros conectores fluídicos 6-109 e 6-110 nos biorreatores mestre e escravo, respectivamente. Os conectores são mostrados tanto no mestre quanto no escravo, mas apenas um conjunto é estritamente necessário. Esses conectores assépticos de uso único são comuns na arena de bioprocessamento de uso único e são feitos por empresas como Pall, GE e Colder (por exemplo, pall.com/main/biopharmaceuticais/product.page?id=34125, gelifesciences.com/webapp/wcs/Stores/servlet/productByld/en /GELifeSciences-us/28936612). Observe também que os biorreatores escravos podem ser recipientes passivos ou recipientes tendo estrutura (por exemplo, agregado de placa ou micro-transportadores) para células aderentes onde um mecanismo de agitação não é possível.
[0058] A capacidade de transferir o conteúdo do biorreator mestre para o biorreator escravo é habilitada
33/67
Figure BR102017018636A2_D0034
fundo do biorreator para considerações de pressão hidrostática. As bombas 6-104 são mostradas trazendo o conteúdo do biorreator escravo a partir do fundo desses recipientes de volta para o biorreator mestre. As bombas podem ser bombas peristálticas ou qualquer outro mecanismo conhecido para mover o fluido a partir de um local para outro através de um caminho fechado. Danos mínimos nas células são atualmente esperados quando as bombas utilizadas são bombas centrífugas de baixa císalhamento (por exemplo, bombas Levitronix, levitronix.com), mas isso também não é estritamente necessário e dependerá da velocidade de transferência necessária e da robustez da linha celular em uso. Em algumas modalidades, os biorreatores são dispostos em escalas ou células de carga 6-111, 6-112, 6-113 de modo a manter massa / volumes iguais em cada recipiente. Se o volume total for conhecido antecipadamente é possível ter apenas um subconjunto dos biorreatores em escalas usando um algoritmo simples incorporando a adição ou subtração necessária dos volumes usando equilíbrio de massa.
[0059] Deve ser notado que por conectar biorreatores de escalabilidade conhecida (parâmetros uniformes o suficiente para um aumento de escala bem-sucedida), a questão do aumento de escala conforme discutido anteriormente foi contornada. Em várias implementações, as bombas forçam a troca de conteúdos entre os biorreatores com rapidez suficiente para que, para todos os efeitos, o sistema possa ser considerado um biorreator. Rapidamente, significa que todos os biorreatores são uniformes em termos de certos parâmetros de grupos de parâmetros e que uma amostra de um <í>
34/67 •a ^2·, dos biorreatores nâo pode ser distinguida de uma amostra retirada de outro ao mesmo tempo. Qualquer um dos parâmetros descritos acima pode fornecer a medida da uniformidade; Tais parâmetros geralmente se relacionam com parâmetros dinâmicos de fluidos (por exemplo, cisalhamento experimentado por células, número de Reynolds), parâmetros de composição (por exemplo, concentrações de componentes dissolvidos e/ou pH) , e parâmetros de transferência de massa (por exemplo, coeficiente de transferência de oxigênio). Embora cada processo e linha celular sejam diferentes, se a taxa de troca entre os recipientes exceder a taxa em que esses parâmetros mudam (e, por exemplo, taxas de crescimento celular (duplicação), a uniformidade necessária é preservada. Isso pode ser comprovado experimentalmente para cada processo e linha celular e controlado rigorosamente depois disso, ajustando as velocidades de bomba em conformidade e/ou monitorando os sensores de processo principais. Os sensores podem ser utilizados como um mecanismo de relatório para a velocidade de bomba para manter a homogeneidade dentro do erro típico (ou banda morta) do circuito de controle associado.
[0060] Será útil rever aqui o processo de crescimento celular em termos das modalidades divulgadas. Especificamente, como as populações celulares crescem e mudam em função do tempo? Uma curva típica de crescimento celular é mostrada na Figura 7. Conforme mostrado na Figura, há uma fase de atraso imediatamente após a semeadura do recipiente onde as células são ditas estar se recuperando do estresse de serem imersas em novos meios. Em seguida, é a fase logarítmica ou exponencial em que as taxas de
Figure BR102017018636A2_D0035
35/67 crescimento aceleram até o meio estar esgotado ou ocorrer outro efeito prejudicial. Seguem-se a fase estacionária e a fase de declínio. Uma medida da taxa de crescimento celular é o tempo de duplicação ou o tempo que leva para a população celular dobrar de população (- ver, Guia celular animal de ATCC) durante a fase de logarítmica do ciclo de crescimento. 0 tempo de duplicação das linhas celulares nas condições de crescimento é tipicamente bem caracterizado. Por exemplo, uma linha celular de CHO típica (ovário de hamster chinês) tem um tempo de duplicação de ã 15 horas, enquanto células cardíacas humanas e células estaminais mesenquimais de camundongos têm tempos médios de duplicação de aproximadamente 29 e 22 horas, respectivamente. Os tempos de duplicação de células microbianas são muito mais rápidos; Escherichia coli tem um tempo de duplicação da ordem de 15 a 30 minutos. O tempo de duplicação pode fornecer uma medida razoável da taxa de mudança do processo de crescimento e serve como referência para a taxa em que o material precisa ser trocado entre os recipientes, a fim de manter a homogeneidade da população celular. Nas fases de atraso, estacionária e de declínio, a taxa de troca necessária para a homogeneidade será reduzida a partir da fase de crescimento exponencial em que a taxa de duplicação celular é a mais rápida. Durante a fase de atraso em que as células estão dobrando muito lentamente, a taxa de troca pode ser proporcionalmente lenta. Se um recipiente escravo for adicionado durante a fase logarítmica, um ponto de partida para alcançar a homogeneidade pode usar o fluxo volumétrico / taxa de troca (taxas de bomba dentro e fora dos recipientes) comparado contra o tempo de duplicação celular co Rub o
Figure BR102017018636A2_D0036
36/67
Ücomo métrica. A questão da taxa requerida de troca volumétrica pode ser reduzida à questão de quantas vezes o volume do recipiente precisa ser trocado em comparação com o tempo de duplicação. Se o conteúdo do recipiente for trocado pelo menos uma ordem de magnitude mais rápido do que o tempo de duplicação, o conteúdo dos recipientes múltiplos certamente será homogêneo. Quanto mais lenta pode ser a taxa de troca de conteúdo do recipiente antes da perda da homogeneidade, dependerá dos detalhes da linha celular e do processo?
[0061] Por exemplo, se um processo de crescimento celular de CHO fosse iniciado em um biorreator de volume de trabalho de 100L com um intervalo operacional de 4:1 completamente preenchido com meio e células e o processo estava na fase de atraso, o grupo que executa o processo pode exigir que um segundo biorreator idêntico e talvez terceiro biorreator idêntico sejam anexados como recipientes escravos para atingir seus objetivos de produto e/ou título. Neste cenário para definir o sistema, as bombas de saída a partir do mestre iríam ligar, de modo que o segundo e o terceiro biorreatores sejam preenchidos com á 25L com os volumes sendo determinados por alteração nos valores de medição nas células de carga. Enquanto as células e o sobrenadante forem transferidos em um período de tempo, de modo que haja pouca alteração na população celular (por exemplo: a população celular ainda pode ser considerada como firmemente na fase de atraso), o mestre e escravos ainda podem ser tratados como homogêneos ou uniformes. As bombas de retorno (a partir de recipientes escravos para o recipiente mestre) permaneceríam desligadas até que o volume v^str,a' d/χ, / M-
Figure BR102017018636A2_D0037
Figure BR102017018636A2_D0038
37/67 desejado fosse atingido nos escravos e então começasse a troca bidirecional ativa entre os recipientes. Meio adicional pode ser adicionado lentamente ao mestre ou a £ usinai o Sj
Figure BR102017018636A2_D0039
vários recipientes novamente com base no volume total e / ou % ruò o rendimento requerido para o processo; o mestre e os escravos podem eventualmente ser preenchidos para o volume de trabalho. A taxa na qual o meio é introduzido no sistema pode ter que corresponder à taxa de alteração da densidade celular de modo que as células não sejam substancialmente perturbadas. Durante a fase de atraso, como mencionado anteriormente, as células não estão crescendo rapidamente e, portanto, os requisitos de fluxo volumétrico de taxa de troca são baixos. Na fase logaritmica, se o tempo de duplicação for de 15 horas, um ponto de partida baseado na discussão acima é para trocar o volume do recipiente a cada 1,5 horas.
Isso significa que 100L / 90 minutos ou cerca de 1,1 SLPM para a taxa de transferência volumétrica. Com base em medidas de parâmetros de crescimento celular relevantes, incluindo, mas não se limitando ao pH do biorreator, concentração de metaboiito, densidade celular, viabilidade celular, etc., as taxas de troca volumétricas podem ser reduzidas. Em certas modalidades, diferentes processos utilizam algoritmos diferentes para controlar as taxas de troca volumétricas e, portanto, manter a homogeneidade. Em certas modalidades, simplesmente manter uma taxa de troca volumétrica muito alta (em comparação com o tempo de duplicação mais rápido) durante todo o processo de crescimento simplificaria o sistema e a incerteza quanto à homogeneidade.
[0062] Conforme mencionado, em certas modalidades, o recipiente mestre geralmente controlará as quantidades
Figure BR102017018636A2_D0040
38/67 g CL· cO importantes, tais como oxigênio dissolvido, pH e temperatura. Mas, em certas modalidades, também pode haver atuadores nos recipientes escravos, como mostrado na Figura 6, números de referência 6-106 e 6-108. Algumas arquiteturas de controle dependem da modalidade física do sistema. Por exemplo, se a taxa de troca entre os recipientes for comparada rapidamente com uma escala de tempo térmica de qualquer recipiente, em algumas implementações, não há apenas necessidade de controlar a temperatura em cada recipiente individual, também não há necessidade de um atuador (por exemplo, cobertor de aquecimento) que é ajustado em um valor nominal. Ter um único controle mestre evita puxar ou comunicação entre circuitos de controle e simplifica o esquema de controle. Ter atuadores e sensores nos biorreatores escravos também permite que o controle seja realizado através do mestre e permite que a velocidade das bombas equilibre os biorreatores mestre e escravo; os sensores nos biorreatores escravos em comparação com os sensores no mestre permitem um caminho de relatório para o controle das bombas, se desejado. Por exemplo, ter impulsores, sensores e aspersores nos biorreatores escravos controlados, mas tendo a aspersão e a mistura nos escravos controlados pelo mestre é um esquema de controle adequado.
O controle passivo por projeto também é possível, onde a velocidade das bombas permite que os escravos sejam elementos ou tanques essencialmente passivos.
[0063] A Figura 8 amplia esse conceito de aumento de escala por recipientes múltiplos conectados e pode utilizar plenamente as matemáticas descritas nas equações 9 e 10. Na Figura 8, o número de referência 8-100 mostra uma versão ^stria/
Figure BR102017018636A2_D0041
39/67
Figure BR102017018636A2_D0042
’/ο/ποϋ' sensores, impulsores, etc. não são mostrados, mas podem ser considerados como incluídos. As bombas (bidirecionais) são mostradas como uma unidade 8-109 e, por uma questão de clareza na Figura 8, os biorreatores 8-101 a 8-107 são mostrados de forma simplificada e sem mostrar os conectores assépticos, enquanto um bloco de biorreator 8-108 ilustra a extensão a qualquer número de recipientes. Este limite é definido por fatores físicos, custos e considerações práticas - não por extensão teórica ou matemática. Se o escalonamento do sistema (bombas, conectores, etc.) tornase custo proibitiva, este escalonamento por adição discreta de tanques pode ser usado em conjunto com um processo de aumento de escala convencional para limitar o número de tanques necessários. Por exemplo, se um biorreator com um intervalo operacional de 5:1 for usado, pode-se iniciar o processo em, digamos, um biorreator de 30 L reduzido para 6 L e, em seguida, preenchê-lo para 30L. Depois disso, um segundo ou terceiro biorreator pode ser adicionado, o que leva o volume de trabalho total a 100L. A produção pode então se mover para o recipiente de 650 L que pode ser reduzida para aproximadamente 115L, e ainda é expansível com dois recipientes adicionais para 1950L. O maior biorreator de uso único na produção comercial hoje tem 2000L, e um grande número de volumes de biorreator entre eles é necessário para escalonar para este volume, o que significa mais partes, mais escalonamento, mais esforço e mais custo. O exemplo que acabamos de revisar permite escalonamento de 6 L para quase 2000L com apenas um passo de aumento de escala em termos de volume de trabalho máximo de biorreator.
40/67
Figure BR102017018636A2_D0043
[0064] Outra aplicação para este tipo d<
escalonável é na arena de medicina personalizada. Esta área de aplicação inclui, mas não se limita a, terapias de células-tronco, terapias de células T de receptor de antígeno quimérico (CAR-T) e tratamentos baseados em linfócitos infiltrantes de tumores (TIL), onde são necessários volumes pequenos, mas potencialmente expansíveis. Atualmente, para tratamentos de tipo CAR-T, um tamanho de lote típico é da ordem de 1L, e a Administração de Drogas e Alimentos dos EUA (FDA) requer aproximadamente a metade dessa qualidade e testes de segurança. Em tais aplicações de imuno-oncologia, o volume inicial de células coletadas e selecionadas de uma amostra de paciente é muito pequeno (30 mL) em comparação com o tamanho do lote (3L) requerido e representa uma amplificação de 100X com alta densidade celular em um cenário de dose de único paciente. O desafio de amplificação é ainda maior para tratamentos heterólogos onde o tamanho do lote de 300L é direcionado (10000 de amplificação), se os custos dos tratamentos devem ser acessíveis e a garantia de qualidade deve ser amortizada em algumas milhares de doses. As modalidades divulgadas fornecem um modo útil de enfrentar tais desafios.
[0065] Em aplicações de medicina personalizadas, se o lote for perdido, um paciente pode perder uma oportunidade para o tratamento de salvar vidas nas últimas etapas de sua doença. Os lotes muitas vezes falham devido à contaminação do processo. Portanto, a capacidade de expandir uma amostra de 30 mL em uma progressão linear de biorreatores efetivamente idênticos é muito atraente, pois o processo pode começar em um recipiente de 300 mL e ser escalonado
Figure BR102017018636A2_D0044
41/67 para dois e eventualmente três ou mais recipientes simultaneamente à medida que as células crescem. Uma vez que o processo é escalonado em três ou mais recipientes, o conteúdo de um recipiente pode ser removido para armazenamento em caso de contaminação do lote inteiro, analisado quanto à qualidade ou armazenado como uma dose de tratamento em armazenamento frio. Os dois recipientes podem então ser reduzidos novamente para o recipiente vazio e um segundo volume de recipiente removido nesse ponto. Isso processo pode ser repetido, se necessário, com um lote coletado todas as semanas, por exemplo, sem comprometer a viabilidade da cultura celular, uma vez que um recipiente pode ser drenado e recarregado com meio ou separado e um novo recipiente assepticamente anexado (ou todos os recipientes na preparação podem ser anexados no início com alguns recipientes vazios e uma válvula estéril sendo usada para determinar quando e se eles forem adicionados à cadeia de processo). Isso pode então ser visto como um processo de lote alimentado contínuo que suporta mudanças de volume discretas. Os lotes também podem ser agrupados em uma única dose, pois podem ser mostrados como materiais idênticos.
[0066] No caso de células sensíveis ao cisalhamento, o conceito do recipiente satélite nesta descrição pode ser aplicado com um conjunto de recipientes mestres tendo impulsores e análise de sensores completa sendo utilizada para controlar o oxigênio, pH e concentrações de metabolitos do meio, e o recipiente satélite (s) sendo passivo com um leito embalado de micro-transportadores, fibras ocas ou placas de adesão. Com as bombas, como na Figura 9, conectando os recipientes passivos aos recipientes mestres, qualquer
Áustria.'
Figure BR102017018636A2_D0045
42/67 vírus ou bactéria pode ser isolado em um único recipiente pela adição de filtros apropriados 8-119 (tipicamente < 0,22 pm por vírus) nas linhas entre os recipientes. 0 volume da amostra de célula original seria dividido entre os satélites, assim, removendo o risco da falha de expansão de toda a amostra.
[0067] A Figura 9 mostra um sistema de três recipientes em rede, embora também seja expansível para N recipientes. Um biorreator principal 9-100 conectado em rede aos recipientes satélites / escravos 9-108 e 9-109 com conectores assépticos 9-118, bombas bidirecionais 9-107, filtração de vírus em linha 9-119, juntamente com conjuntos de tubulação conectados assépticos 9- 115 que são ambos chamados especificamente apenas em um recipiente, 9-109, mas mostrados em todos os três recipientes. O biorreator principal, ou o mestre, 9-100 é mostrado com um impulsor 9102 e com o aspersor 9-104. Estas características não são explicitamente mostradas nos recipientes escravos 9-108 e 9109, pois podem não ser necessárias. Nesta modalidade, se as células são sensíveis ao cisalhamento e / ou a um custo menor, os recipientes podem ter a mistura, a oxigenação e o ajuste do pH no geral ocorrendo no tanque principal. Dada esta possibilidade, o tanque principal aqui é mostrado como maior em tamanho e volume do que qualquer um dos tanques escravos de modo que ele também pode atuar como balastro e um reservatório para o meio oxigenado, de pH ajustado. Os sensores 9-103 são mostrados nos três recipientes de modo que há relatório para fins de monitoramento e de controle. Especificamente, alterando a velocidade das bombas ou altera os valores do analito no biorreator mestre.
43/67 [0068] escravos são
Além disso, na Figura mostrados sendo utilizados
Figure BR102017018636A2_D0046
no modo de perfusâo
ou em um modo de separação de células dependendo da
aplicação. Um tubo 9-113 que permite que o conteúdo do
biorreator se j a levado para o dispositivo de retenção /
separação de células (separador acústico, filtro, etc.) (por exemplo: applikon-bio.com/pt/news2/itemlist/category/52biosep, spectrumlabs.com/filtration/KR2System.html), 9-114 é mostrado com um circuito de retorno 9-115 para o biorreator com uma bomba, 9-116 ou outro dispositivo para mover o fluido no caminho necessário. Os recipientes podem, portanto, ser usados para implementar um processo de perfusâo com processo de crescimento real ocorrendo nos recipientes escravos, e oxigenação e controle residindo no recipiente mestre, ou em um modo de expansão celular com uma divisão de tarefas similar. O modo de expansão celular é de interesse como Célula T, expansão de célula-tronco, ou crescimento celular aderente podem ocorrer nos escravos sem a necessidade de um impulsor e sem o cisalhamento acompanhante. Os recipientes são novamente mostrados em escalas ou células de carga 9111, 9-112, 9-113 para equilíbrio de massa / volume entre os recipientes. Finalmente, todo o sistema pode ser incluído em uma incubadora ou agitador de incubadora 9-101 para controle de temperatura, bem como mistura se nenhum dos recipientes estiver equipado com impulsores (por exemplo, frascos de agitação ou biorreatores especificamente projetados para funcionar sem um impulsor kuhner.com/pt/product/shakers/single-use/sb200-x.html) .
Isso pode reduzir ainda mais o custo por uso dos recipientes.
[0069] Conforme indicado, um sistema de biorreator
Figure BR102017018636A2_D0047
44/67 de múltiplos recipientes inclui dois, três ou mais recipientes acoplados fluidicamente configurados para realizar coletivamente uma biorreação. Eles fazem isso mantendo condições nominalmente uniformes ou consistentes entre os recipientes durante a biorreação. Como consequência, os recipientes compartilham reagentes e produtos entre os recipientes durante a biorreação. Isto pode ser conseguido através da inclusão de caminhos fluídicos (às vezes implementados aqui como conectores fluídicos, por exemplo, tubos) acoplando os recipientes um ao outro durante a biorreação e dispositivos de transferência de fluido (bombas) em pelo menos alguns dos um ou mais caminhos fluídicos ou conectores.
[0070] Tipicamente, o sistema de biorreator também inclui um sistema de controle configurado para controlar condições de reação nos recipientes para realizar a biorreação. Entre outras responsabilidades, o sistema de controle pode ser encarregado de manter condições de processo uniformes entre os recipientes durante a biorreação. Para este fim, o sistema de controle pode ser configurado para (i) ler ou receber valores de pelo menos um parâmetro que caracteriza um meio de cultura ou outro fluido de reação em um ou mais dos recipientes durante a biorreação, (ii) usar os valores para determinar uma taxa de fluxo ajustada em pelo menos um dos conectores fluídicos para manter valores substancialmente uniformes do parâmetro no fluido de reação de recipiente-a-recipiente entre os recipientes, e (iii) controlar pelo menos um dos dispositivos de transferência de fluido para ajustar a taxa de fluxo determinada em (ii) . Ao controlar o fluxo de fluido de reação desta maneira, a x\iüuS1//^í/
45/67 ¢5
Aò £ Fís cx c$> Rub q\CGl I/D/q i , /1 c temperatura, o pH, as concentrações de analito selecionadas (por exemplo, concentração de oxigênio dissolvido, concentração de glicose), condições hidrodinâmicas, etc.
podem ser mantidas substancialmente consistentes ou uniformes nos recipientes. Substancialmente consistente ou uniforme é determinado a partir de perspectivas relativas à biorreação, de modo que, por exemplo, a viabilidade celular, produtividade celular, título, etc. são consistentes de recipiente-a-recipiente. As diferenças de magnitude dentro das quais uma condição de processo ainda é consistente são determinadas de várias maneiras, conforme apropriado, para o desempenho da biorreação. Por exemplo, pode ser apropriado que a concentração de massa de um analito ou produto selecionado se desvie de mais de cerca de 5% a partir de um recipiente para outro ou que o pH varie em magnitude por não mais do que aproximadamente 0,2 unidades de pH de um recipiente para outro, para que a temperatura não varie em cerca de 0,5 graus C de um recipiente para outro. Novamente, o ponto principal é que a variabilidade esteja dentro dos limites que produzem resultados de biorreação consistentes de recipiente-a-recipiente. Estes resultados podem ser o título e / ou a concentração do produto, a viabilidade celular, etc.
[0071] Em certas modalidades, o sistema de controle é configurado para (i) ler ou receber valores de parâmetros representando o meio de cultura ou outro fluido de reação em um ou mais dos recipientes durante a biorreação, e (ii) controlar um ou mais dispositivos de transferência de fluido para transferir o meio de cultura entre os dois ou mais recipientes de modo que o tempo necessário para trocar o
Figure BR102017018636A2_D0048
46/67 meio de cultura nos recipientes esteja dentro de uma ordem de grandeza do tempo necessário para que as células dos recipientes se dupliquem sob condições nos recipientes. Por exemplo, o tempo necessário para trocar o meio de cultura nos recipientes pode ser no máximo cerca de metade do tempo necessário para que as células nos recipientes se dupliquem sob condições nos recipientes. Em condições de operação mais rigorosas, o sistema de controle transferirá diretamente para o meio de cultura mais rápido, de modo que o tempo necessário para trocar o meio de cultura nos recipientes seja no máximo de um terço, um quinto ou um décimo (ou mesmo um vigésimo) o tempo necessário para que as células nos recipientes se dupliquem sob condições nos recipientes. A taxa real dependerá em parte das condições atuais no sistema de biorreator e do grau de uniformidade necessário (por exemplo, o pH não deve variar em mais de cerca de 0,1 unidade de pH de recipiente-a-recipiente) . Observe que o tempo necessário para trocar o meio de cultura em um recipiente ou recipientes é baseado na quantidade de meio de cultura atualmente no (s) recipiente (s), que não é necessariamente o volume de trabalho do recipiente (s) . (Na prática, é claro, o sistema não removería todo o meio de cultura de um recipiente durante a troca; o sistema fluirá em um novo meio e ao mesmo tempo empurrará para fora uma quantidade correspondente de meio antigo) . Além disso, o tempo de duplicação celular varia dependendo de uma série de fatores, incluindo a fase de crescimento atual das células, e onde na fase a maioria das células atualmente reside. Por exemplo, o tempo de duplicação é dramaticamente diferente para células na fase de atraso e células na fase logarítmica /
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47/67 exponencial. Veja a discussão da Figura 7.
[0072] Em certas modalidades, o sistema de controle gera taxas de fluxo do meio de cultura em cada dos recipientes, de modo que o tempo necessário para trocar o meio de cultura em qualquer dos recipientes é menor do que o tempo de mistura do meio de cultura para os respectivos recipientes. Em certas modalidades, o tempo de troca é dentro de uma ordem de grandeza do tempo de mistura. Por exemplo, o tempo de troca pode não ser superior a cerca de metade do tempo de mistura, ou não superior a cerca de um terço, ou um quinto ou um décimo do tempo de mistura. Em certas modalidades, o tempo de troca não é superior a cerca de um décimo do tempo de mistura. Uma maneira de considerar isso é que o tempo necessário para troca total de meio de cultura presente em um recipiente usando a taxa de fluxo operacional no recipiente é mais rápido do que o tempo necessário para misturar os componentes do recipiente usando os acionadores de mistura intrínsecos de um recipiente (por exemplo, convecção, difusão, etc.). Como explicado, o tempo de mistura pode ser definido de várias maneiras. Para os fins desta modalidade, assume-se que a taxa de mistura é definida pelo tempo que leva para que um marcador recentemente introduzido ser distribuído homogeneamente dentro do biorreator ao nível requerido para um bioprocesso bem-sucedido. Isso pressupõe que o meio de cultura não está entrando ou deixando o recipiente durante a mistura; ou seja, assume que o recipiente onde ocorre a mistura é um sistema fechado. Em certas modalidades, a distribuição homogênea é definida de tal forma que a concentração do marcador varia em não mais do que cerca de 10% entre quaisquer dois pontos no
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48/67 recipiente .
RECIPIENTE [0073] Como deve ser aparente, há muitos benefícios ao usar recipientes relativamente pequenos. Exemplos de tais benefícios incluem evitar certos desafios de aumento de escala (por exemplo, menos experimentação e incerteza), reduzindo a variação intra-recipiente em condições de processo, etc. Portanto, os tamanhos dos recipientes individuais no sistema de biorreator de múltiplos recipientes são relativamente pequenos. Por exemplo, cada recipiente tem um volume de trabalho não superior a cerca de 700 litros, ou não superior a cerca de 500 litros, ou não superior a cerca de 100 litros, ou não superior a cerca de 50 litros. Deve ser entendido que os termos volume total e volume de trabalho são usados às vezes na indústria, e consistente com esse uso, o termo volume total refere-se à capacidade total de um recipiente, independentemente dos limites do volume de fluido, enquanto o termo volume de trabalho refere-se ao volume máximo de fluido que pode ser preenchido em um recipiente para sofrer uma biorreação.
[0074] Como indicado, um sistema de biorreator pode incluir dois, três ou mais recipientes. O número de recipientes influencia, mas não determina completamente, a proporção de volume de trabalho total do sistema de biorreator (por exemplo, a soma dos volumes de trabalho dos dois ou mais recipientes que compõem o sistema de biorreator) para o volume de trabalho maior dos dois ou mais recipientes. Em certas modalidades, essa proporção é pelo menos cerca de 2 ou pelo menos cerca de 3. Proporções no intervalo de cerca de 2-4 são frequentemente apropriadas para sistemas de
49/67
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biorreator de volume total relativamente grandes; exemplo, sistemas tendo um volume total de cerca de 1000 litros ou superior, ou cerca de 1500 litros ou superior, ou cerca de 2000 litros ou superior. Para algumas aplicações, tais como aplicações de menor escala (por exemplo, cerca de 500 litros de volume de trabalho total ou menos) ou aplicações de medicamentos personalizadas, a proporção de volume de trabalho total do sistema de biorreator para o volume de trabalho do maior dos recipientes pode ser maior, por exemplo, pelo menos cerca de 6. O número total de recipientes utilizados no biorreator em qualquer momento durante a biorreação pode ser pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 6, pelo menos cerca de 10 ou pelo menos cerca de 12. 0 número é escolhido com base em uma série de fatores, incluindo o produto ou aplicação de biorreator, o volume de trabalho total do sistema de biorreator, a necessidade de substituir, remover ou adicionar recipientes ao longo de uma biorreação, etc.
[0075] Como um exemplo do poder desta abordagem quando acoplada com os intervalos operacionais de recipiente típicos, considere um intervalo operacional de 4:1 ou 5:1 em um recipiente de 500 litros, o volume de trabalho do sistema de múltiplos recipientes acoplado pode escalonar de 100 125L até 1500L a 2000L sem alterar os tamanhos dos recipientes. Isto significa que um fabricante de recipientes de biorreator pode ter uma oferta de produtos focada em que apenas alguns tamanhos de recipientes são necessários para fornecer um intervalo extremamente amplo de volumes de biorreator efetivos. Por exemplo, a preparação de quatro ou mais tamanhos de biorreatores na Figura 1 pode ser
50/67 \ViJUSfr/a/ o RlJt} substituído por dois ou três biorreatores totais para todo o processo de aumento de escala.
[0076] Em algumas implementações, os recipientes individuais do sistema de biorreator são semelhantes entre si em volume de trabalho, geometria, materiais de construção e/ou sistema de agitação / mistura. Por exemplo, os recipientes podem ter intervalos operacionais semelhantes; por exemplo, não há dois recipientes com índices de variação variando um do outro por mais que cerca de 20%. Em algumas modalidades, todos os recipientes são feitos a partir do mesmo material; por exemplo, todos os recipientes têm paredes de recipiente poliméricas ou recipientes com paredes de aço inoxidável.
^0//199^ [0077] Em certas modalidades, como explicado, um dos vários recipientes é um recipiente mestre e os outros são recipientes satélites ou escravos. Frequentemente, embora não necessariamente, o recipiente mestre tem um volume de trabalho maior do que qualquer um dos recipientes satélites. Normalmente, o recipiente mestre é usado para fornecer alguma medida de controle sobre as condições nos recipientes satélites. Por exemplo, o sistema de controle pode monitorar e ajustar as condições primeiro no recipiente mestre e, em seguida, usar transferência de fluido entre recipientes nos recipientes satélites para seguir as no mestre. Em certas modalidades, o recipiente mestre inclui um ou mais sensores para o pH, temperatura, uma concentração de metabolito celular, e oxigênio dissolvido no meio de cultura. Em certas modalidades, o sistema de controle recebe valores de tais parâmetros a partir de sensores nos recipientes mestres e / ou satélites e usa esses valores para primeiro ajustar as
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51/67 xnúusíria/ condições no recipiente mestre. Em certas modalidades, o sistema de controle inclui um único circuito de controle configurado para controlar o recipiente mestre e, em alguns casos, pelo menos um sistema de mistura configurado para agitar o meio de cultura no recipiente mestre. Em certas modalidades, os recipientes satélites contêm aspersores ajustados a uma velocidade substancialmente constante. Nesses casos, aspersão de ar ou oxigênio pode ocorrer nos recipientes satélites, enquanto o ponto de controle primário emprega sensores no recipiente mestre.
[0078] Em alguns casos, o recipiente mestre pode incluir o sistema de mistura configurado para agitar o meio de cultura no mestre. Em alguns desses casos, nenhum dos recipientes satélites inclui um sistema de mistura. Exemplos de sistemas de mistura adequados, sejam eles implementados em um recipiente mestre ou satélite, incluem impulsores, agitadores orbitais, balancim de onda e pulverizadores.
[0079] Conforme explicado, o arranjo de recipientes, conforme ditado por conexões diretas entre recipientes individuais no sistema de biorreator, pode ter muitas configurações. Os exemplos incluem uma configuração em estrela, uma configuração linear, uma configuração de circuito fechado e uma combinação de quaisquer duas das mesmas. Por exemplo, o arranjo pode ser uma configuração de aro e roda ou uma configuração de lasso tendo um circuito com uma cauda estendendo de um dos recipientes de circuito, ou uma configuração de anel fundido. O arranjo pode ser conexões fluidicas bidirecionais ou simplesmente uma conexão fluidica de circuito fechado. Conforme ilustrado, uma configuração de circuito forma um circuito fechado para fluxo
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52/67 de fluido.
[0080]
Em certas modalidades, os sistemas de biorreator incluem um recipiente adicional inicialmente desconectado dos dois ou mais recipientes conectados fluidicamente, mas inclui uma conexão fluídica suplementar para conexão ao sistema de biorreator após a operação do sistema de biorreator. Isso permite que os sistemas aumentem a escala durante o curso da biorreação, conforme apropriado ao cultivar as próprias células de um paciente (ou uma sua variante modificada) para serem usadas em um tratamento subsequente administrado ao paciente. Em alguns casos, o sistema de controle é configurado para preencher pelo menos parcialmente o recipiente adicional com meio de cultura a partir de um ou mais outros recipientes durante a biorreação. Alternativamente ou adicionalmente, um ou mais dos recipientes do sistema é configurado para ser removido, antes da biorreação completa, juntamente com o meio de cultura e células cultivadas no meio.
SISTEMA DE CONTROLE [0081] Conforme mencionado, o sistema de controle pode ser encarregado de manter condições de processo uniformes entre os recipientes durante a biorreação. Isso pode exigir que, por exemplo, as taxas de crescimento celular e / ou os títulos dos produtos não sejam diferentes em mais de alguns por cento (por exemplo, não mais de cerca de 10%) de recipiente-a-recipiente.
[0082] Em várias modalidades, o sistema de controle é configurado para manter valores substancialmente uniformes de pH de recipiente-a-recipiente. Por exemplo, o sistema de controle pode ser configurado para ajustar as condições nos \(\ódi.'!i/a/
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53/67 dois ou mais recipientes para garantir que o pH médio meio de cultura nos dois ou mais recipientes não varie de recipiente para outro em mais de cerca de 0,2 unidades de (ou não mais do que cerca de 0,1 unidades de pH ou não mais do que cerca de 0,05 unidades de pH). Isto é particularmente útil quando os recipientes individuais são pequenos o suficiente e/ou bem misturados o suficiente para que a variação interna nas condições seja mínima. Por exemplo, os dois ou mais recipientes e o sistema de controle podem ser projetados ou configurados de modo que o pH do meio de cultura dentro de qualquer dos recipientes tenha variância de no máximo cerca de 0,1 unidades de pH.
[0083] Em certas modalidades, o sistema de controle é ainda configurado para ajustar as condições nos dois ou mais recipientes para garantir que a temperatura média do meio de cultura seja mantida de recipiente-a-recipiente até cerca de 0,5 graus C (ou dentro de cerca de 0,1 graus C) .
[0084] Em certas modalidades, o sistema de controle é ainda configurado para ajustar as condições nos dois ou mais recipientes para garantir que as forças de cisalhamento experimentadas pelas células nos dois ou mais recipientes sejam substancialmente iguais de um recipiente para outro durante a biorreação. Por exemplo, o número de células que morrem devido a cisalhamento pode estar dentro de 5% entre os dois recipientes. Idealmente, durante o curso de uma biorreação, poucas células em qualquer recipiente ou morrem devido a forças de cisalhamento ou pelo menos não mais de cerca de 10% morrem devido a forças de cisalhamento.
[0085] Em certas modalidades, o sistema de controle é ainda configurado para ajustar as condições nos dois ou
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54/67 mais recipientes para garantir que as taxas de transferência de gás de meio de cultura nos dois ou mais recipientes sejam substancialmente iguais de um recipiente para outro durante a biorreação (por exemplo, os valores médios de um ou mais dos parâmetros de transferência acima listados não variam em mais de cerca de 5% de recipiente-a-recipiente). Claro, o nível de oxigênio dissolvido não deve estar abaixo de um nível no qual as células começam a morrer devido à falta de oxigênio.
[0086] Em certas modalidades, um ou mais dos recipientes no sistema de biorreator são fornecidos em escalas e/ou células de carga para monitorar suas massas durante a biorreação. 0 sistema de controle pode ser configurado para monitorar as saídas a partir das escalas e / ou células de carga e ajustar taxas de fluxo entre os recipientes para garantir que o volume / massa nos recipientes individuais permaneça dentro das especificações.
[0087] Em termos gerais, o controlador pode ser eletrônico tendo vários circuitos integrados, lógica, memória e/ou software que recebem instruções, emitem instruções, controlam operação, habilitam operações de limpeza, permitem medições e similares. O hardware de controlador pode conter um ou mais processadores, dispositivos de memória e interfaces para se comunicar com sensores, bombas, aspersores, misturadores e similares. Os processadores podem incluir chips na forma de firmware que armazenam instruções de programa, processadores de sinais digitais (DSPs), chips definidos como circuitos integrados de aplicação específica (ASICs) e / ou um ou mais microprocessadores ou microcontroladores que executam
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55/67 instruções de programa (por exemplo, software). Instruções de programa podem ser instruções comunicadas ao controlador na forma de vários ajustes individuais (ou arguivos de programa), definindo parâmetros operacionais para a realização de um processo particular em um biorreator.
[0088] 0 controlador pode ser integrado com a eletrônica para controlar a operação antes, durante e após a execução de um bioprocesso. O controlador, de acordo com os requisitos de processamento e / ou o tipo de sistema, pode ser programado para controlar qualquer um dos processos aqui revelados, incluindo os meios de bombeamento entre recipientes, ajuste da temperatura, controle de condições de meios, tais como pH, concentração de nutrientes, etc, e remoção de produtos de biorreações.
[0089] 0 controlador, em algumas modalidades, pode ser uma parte de ou acoplado a um computador que é integrado com, acoplado ao sistema, de outra forma em rede para o sistema, ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, o controlador pode estar na nuvem ou todo ou uma parte de um sistema de computador de hospedeiro de instalações, o que pode permitir acesso remoto do bioprocessamento. O computador pode permitir o acesso remoto ao sistema para monitorar o progresso atual das operações de bioprocessamento, examinar um histórico das operações de bioprocessamento passadas, examinar tendências ou métricas de desempenho a partir de uma pluralidade de operações de bioprocessamento, para alterar os parâmetros de processamento atuais, para definir as etapas de processamento seguintes de um processamento atual, ou para iniciar um novo processo.
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56/67
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[0090] Em alguns exemplos, um computador remoto (por exemplo, um servidor) pode fornecer instruções de operação de processo para um sistema através de uma rede, que pode incluir uma rede local ou a Internet. O computador remoto pode incluir uma interface de usuário que permite a entrada ou programação dos parâmetros e/ou configurações, que são então transmitidos para o sistema a partir do computador remoto. Em alguns exemplos, o controlador recebe instruções sob a forma de dados, que especificam parâmetros para cada dos passos de processamento a serem executados durante uma ou mais operações. Assim, como descrito acima, o controlador pode ser distribuído, tal como pelo fato de compreender um ou mais controladores discretos que são conectados em rede e que trabalham no sentido de um efeito comum, tais como os processos e controles descritos no presente documento. Um exemplo de um controlador distribuído para esse efeito seria um ou mais circuitos integrados em um reator em comunicação com um ou mais circuitos integrados localizados remotamente (por exemplo, no nível de plataforma ou como parte de um computador remoto) que se combinam para controlar um processo no reator.
[0091] Cada algoritmo ou outro elemento computacional de um controlador pode ser implementado como uma coleção organizada de dados de computador e instruções. Em certas modalidades, um módulo para controlar o fluxo entre os recipientes, um módulo para ajustar a temperatura de um ou mais recipientes, um módulo para ajustar introdução e / ou a remoção de material a partir de um ou mais recipientes pode cada ser visto como uma forma de aplicação de software que interage com o usuário e com o software de sistema.
57/67
Software de sistema normalmente faz a interface com hardware ' de computador, normalmente implementado como um ou mais processadores (por exemplo, CPUs ou ASICs como descrito) e memória associada. Em certas modalidades, o software de sistema inclui software de sistema operacional e/ou firmware, bem como qualquer middleware e controladores instalados no sistema. O software de sistema oferece as funções básicas não específicas de tarefas do computador. Em contraste, os módulos e outro software de aplicação são usados para realizar tarefas específicas. Cada instrução nativa para um módulo é armazenada em um dispositivo de memória e é representada por um valor numérico.
[0092] Em um nível, um elemento computacional é implementado como um conjunto de comandos preparados pelo programador / desenvolvedor. No entanto, o software de módulo que pode ser executado pelo hardware de computador é código executável empenhado para memória usando códigos de máquina selecionados a partir do conjunto de instruções de linguagem de máquina específico, ou instruções nativas, projetado para o processador de hardware. O conjunto de instruções de linguagem de máquina, ou conjunto de instruções nativas, é conhecido para, e essencialmente incorporado, o processador (s) de hardware. Esta é a linguagem pela qual o software de sistema e aplicação se comunicam com os processadores de hardware. Cada instrução nativa é um código discreto que é reconhecido pela arquitetura de processamento e que pode especificar registros particulares para as funções de aritmética, endereçamento ou controle; locais de memória ou deslocamentos particulares; e modos de endereçamento particulares usados para interpretar operandos. Operações
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58/67
S ©<b % mais complexas são construídas através da combinação destas instruções nativas simples, que são executadas sequencialmente, ou como de outra forma dirigidas por instruções de fluxo de controle.
[0093] A inter-relação entre as instruções de software executáveis e o processador de hardware é estrutural. Em outras palavras, as instruções em si são uma série de símbolos ou valores numéricos. Não transmitem intrinsecamente nenhuma informação. É o processador, que por projeto, foi pré-configurado para interpretar os símbolos / valores numéricos, que comunicam o significado das instruções.
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CONEXÕES FLUÍDICAS E DISPOSITIVOS DE TRANSFERÊNCIA DE
FLUIDOS [0094] Como mencionado, um ou mais conectores fluídicos, ou mais geralmente caminhos fluídicos, conectam os recipientes. Em geral, os conectores são configurados para fornecer fluxo de meio de cultura entre os dois ou mais recipientes durante a biorreação. Eles podem ser canos, tubos, barris e similares. Eles têm um comprimento de viagem fluido, diâmetro transversal, condição de rugosidade de superfície, rigidez / flexibilidade, etc., conforme necessário, para suportar as taxas de fluxo e as condições de fluxo (por exemplo, laminar, turbulenta, de transição) para transferir o meio de cultura ou outro fluido de reação para manter o (s) nível (s) de uniformidade requerido de recipiente para recipiente. Em certas modalidades, os caminhos fluídicos são feitos de material que é USP Classe VI / ISO10993, livre de derivado de componente animal, livre de látex, livre de ftalato e/ou estável de radiação gama
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59/67
O.'
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/ beta.
[0095] Em algumas implementações, cada dos conectores fluídicos é configurado para permitir o fluxo bidirecíonal do meio de cultura entre dois dos recipientes. Nesses casos, dois ou mais caminhos de fluxo podem ser fornecidos entre recipientes ou uma bomba bidirecional pode ser fornecida em um conector fluídico.
[0096] Podem ser utilizadas várias estruturas físicas dos conectores fluídicos. Um exemplo inclui tubulação e conectores assépticos anexados aos dois ou mais recipientes. Em algumas implementações, pelo menos um caminho de fluido dos conectores fluídicos se liga em ou perto dos fundos dos dois ou mais recipientes. Isso permite que o fluxo de fluido aproveite a pressão hidrostática da cabeça, particularmente em grandes recipientes. Claro, outros desenhos de recipientes podem sugerir a localização dos caminhos de fluido de entrada e saída. Por exemplo, no caso de um conector fluídico de duas vias e um recipiente tendo um impulsor direcionando o fluido para baixo, a saída do conector fluídico pode se conectar abaixo do nível inferior do impulsor, e o conector fluídico de entrada pode anexar em ou acima do nível superior do impulsor.
[0097] Podem ser utilizados vários tipos de dispositivos de transferência de fluidos. Por exemplo, pelo menos um dos dispositivos de transferência de fluido pode ser uma bomba. Uma bomba é amplamente definida para incluir todos os tipos usados para mover o líquido por ação mecânica. Exemplos incluem bombas rotodinâmicas (por exemplo, centrífugas ou axiais) e bombas de deslocamento positivo (por exemplo, tipo seringa, tipo engrenagem, tipo diafragma,
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Um objetivo recipiente mantêm tipo pistão, tipo êmbolo, tipo parafuso ou tipo palheta)
PERFUSÃO [0098] Conforme explicado, um ou mais recipientes do sistema de biorreator podem ser configurados para operar em um modo de perfusão, pelo qual o meio de cultura é distribuído (flui) sobre as células restritas ao recipiente. Tipicamente, no modo de perfusão, as condições são mantidas de modo que as células sejam mantidas em um recipiente enquanto meio novo é trazido para dentro. A taxa que o meio é trazido depende da linha celular e da fase de crescimento.
manter um ambiente de crescimento substancialmente ótimo (em termos de concentrações de nutrientes, título de produto, temperatura, condições hidrodinâmicas, etc.) e, como consequência, as células de um um estado biológico relativamente consistente em termos de taxa de produção, viabilidade, etc. por um período de tempo mais longo em comparação com o modo de lote ou modos de crescimento de lote alimentados. Em certas modalidades, um sistema de biorreator configurado para operar em modo de perfusão inclui dois ou mais recipientes acoplados fluidicamente configurados para realizar coletivamente uma biorreação, em que pelo menos um dos recipientes é um recipiente de perfusão tendo uma entrada fluídica, uma saída fluídica e um filtro ou outro mecanismo configurado para impedir que células biológicas abandonem o recipiente de perfusão durante a biorreação. Além disso, como com alguns outros sistemas aqui descritos, um sistema de biorreator de modo de perfusão pode incluir um ou mais conectores fluídicos (ou, mais geralmente, caminhos fluídicos) acoplando os dois ou mais recipientes uns aos
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61/67 outros e, durante a biorreação. 0 sistema tipicamente inclui um ou mais dispositivos de transferência de fluidos (por exemplo, bombas) em pelo menos um dos um ou mais conectores fluídicos. Coletivamente, os conectores fluídicos e os dispositivos de transferência de fluido são configurados para fornecer fluxo de meio de cultura entre os dois ou mais recipientes.
[0099] Além disso, um sistema de biorreator de modo de perfusão pode conter um sistema de controle configurado para (i) ler ou receber valores de dois ou mais parâmetros representando o meio de cultura em um ou mais dos recipientes durante a biorreação, (ii) usar os valores para determinar as condições de processo para manter valores substancialmente uniformes dos dois ou mais parâmetros no meio de cultura a partir de recipiente-a-recipiente entre os dois ou mais recipientes, e (iii) introduzir o meio de cultura para o recipiente de perfusão através da entrada fluídica, fluir o meio de cultura sobre as células biológicas enquanto elas são retidas no recipiente de perfusão, e fluir o meio de cultura para fora da saída fluídica, para assim operar em um modo de perfusão.
[00100] Dito de outra maneira, pelo menos um dos recipientes fluidicamente acoplados inclui uma entrada fluídica e uma saída fluídica, e o sistema de biorreator é configurado para introduzir o meio de cultura novo no pelo menos um recipiente através da entrada fluídica, permitir o fluxo do meio de cultura novo para o biorreator contendo células biológicas enquanto são retidas nesse recipiente, e fluir o meio de cultura esgotado para fora da saída fluídica, para assim operar o pelo menos um recipiente em um modo de
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62/67 perfusão. Vários mecanismos podem ser empregados para garantir que as células permaneçam no recipiente. Por exemplo, uma saída fluídica pode incluir um filtro ou armadilha configurada para evitar que as células biológicas no recipiente deixem o pelo menos um recipiente ou a sua saída fluídica. Em algumas implementações, um recipiente configurado para operar em modo de perfusão inclui microtransportadores, filtro de fibra oco, um assentador de células, e/ou um separador acústico, qualquer um dos quais pode ser empregado para reter células dentro de um recipiente em modo de perfusão.
[00101] Qualquer individual um ou mais dos recipientes no sistema de biorreator de múltiplos recipientes pode ser configurado para operar em modo de perfusão. Em algumas implementações, pelo menos dois dos recipientes fluidicamente acoplados incluem cada uma entrada fluídica e uma saída fluídica, e o sistema de biorreator é configurado para introduzir o meio de cultura novo no pelo menos dois recipientes através das entradas fluídicas, fluir o meio fresco para os recipientes enquanto as células são retidas nos pelo menos dois recipientes, e fluir o meio de cultura esgotado para fora das saídas fluídicas, para operar desse modo pelo menos dois recipientes em um modo de perfusão. Em alguns casos, um recipiente simplesmente fornece o meio carregado de nutriente e oxigênio ao sistema de perfusão, atuando como um reservatório para novos meios e oxigenando e estabilizando o fluido retornando do recipiente onde o processo de crescimento de perfusão está ocorrendo.
[00102] Em algumas implementações, um dos recipientes
63/67
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\CÜu^z?à/ /
r/s «üò
V e um recipiente mestre configurado para fornecer meios dè^ cultura ao pelo menos um outro recipiente através da entrada fluídica para fornecer perfusão. Além disso, o sistema de controle e o recipiente mestre podem ser configurados em conjunto para manter valores de concentração de oxigênio dissolvido, temperatura e pH no meio de cultura no recipiente mestre e no pelo menos um recipiente. Em certos sistemas de biorreator configurados por perfusão, o recipiente mestre inclui um sistema de mistura, enquanto o pelo menos um recipiente não inclui nenhum sistema de mistura.
MÉTODOS DE ESCALONAMENTO DE UM BIOPROCESSO [00103] Conforme explicado, os conceitos revelados facilitam o escalonamento de um volume de trabalho de bioprocessamento a partir do de um biorreator de pequena escala para o de um biorreator de grande escala. Em certas modalidades, um processo de escalonamento inícialmente envolve determinar condições de processo apropriadas para a realização do bioprocesso em um recipiente de teste tendo um volume de trabalho relativamente pequeno (por exemplo, não superior a cerca de 700 litros). Exemplos de condições de processo que podem ser projetadas para o recipiente de teste incluem valores de dois ou mais parâmetros representando o meio de cultura no recipiente durante o bioprocesso. Os parâmetros relevantes discutidos acima, incluindo temperatura, pH, concentração de oxigênio dissolvido, etc., podem ser utilizados. Após a determinação das condições de processo para o recipiente de teste, o processo de escalonamento envolve projetar um sistema de biorreator com um sistema de controle e dois ou mais recipientes de produção conectados fluidicamente. Cada um dos recipientes de
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64/67 produção tem um volume de trabalho semelhante ao do recipiente de teste (por exemplo, dentro do intervalo do intervalo operacional para o recipiente de teste. Em algumas modalidades, cada recipiente de produção tem um volume de trabalho que está entre aproximadamente 0,7 e 1,5 vezes o volume de trabalho do recipiente de teste. Em certas modalidades, a soma dos volumes de trabalho dos dois ou mais recipientes de produção é pelo menos aproximadamente 2 vezes maior do que o volume de trabalho do recipiente de teste.
[00104] Em certas modalidades, o processo de desenho envolve projetar o sistema de controle para manter valores substancialmente uniformes de um ou mais parâmetros, desde o recipiente de produção até o recipiente de produção, durante a realização da biorreação. Conforme discutido acima, um sistema de controle adequado pode (i) ler ou receber valores de produção dos dois ou mais parâmetros representando o meio de cultura em um ou mais dos dois ou mais recipientes durante o bioprocesso, (ii) usar os valores de produção lidos ou recebidos para determinar uma taxa de fluxo ajustada do meio de cultura entre os dois ou mais recipientes de produção para manter valores de produção substancialmente uniformes dos dois ou mais parâmetros no meio de cultura a partir de recipiente-a-recipiente entre os dois ou mais recipientes de produção durante o bioprocesso, e (iii) controlar um dos dispositivos de transferência de fluido dispostos entre os dois ou mais recipientes de produção para ajustar a taxa de fluido conforme determinado em (ii) . Deve ser notado que esse circuito de controle mantém as condições substancialmente iguais de recipiente-arecipiente no sistema de biorreator, em oposição a um
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65/67
C circuito de controle diferente, que pode ser implementado um recipiente mestre que mantém os valores de parâmetros dentro dos intervalos requeridos (intervalos absolutos).
[00105] Muitas vezes, o processo de projeto do sistema de controle para o sistema de biorreator de grande escala envolve projetar o sistema de controle para manter, durante o bioprocesso, os valores de produção dos dois ou mais parâmetros para serem substancialmente iguais aos valores de teste dos dois mais parâmetros.
[00106] Depois de projetar os recipientes de produção e o sistema de controle, o processo envolve realmente construir e/ou arranjar dois ou mais recipientes de produção e o sistema de controle conforme especificado para produzir o biorreator de grande escala. Finalmente, o bioprocesso pode ser realizado no biorreator de grande escala. Em algumas implementações, o sistema de biorreator de grande escala é configurado para permitir o fluxo bidirecional do meio de cultura entre dois dos recipientes de produção e / ou os dois ou mais recipientes de produção são dispostos em circuito fechado.
[00107] Durante o bioprocesso, a quantidade total de meio de cultura no sistema de biorreator pode aumentar. Por exemplo, o bioprocesso pode ser realizado em um primeiro volume de trabalho total de meio de cultura no biorreator e, em seguida, o bioprocesso pode ser conduzido em um segundo volume de trabalho total de meio de cultura maior do que o primeiro volume de trabalho total, mas ainda usa apenas os dois ou mais recipientes de produção do biorreator de grande escala. Isso pode ser feito adicionando meio de cultura ao sistema de biorreator antes do bioprocesso concluir. Em outra
Figure BR102017018636A2_D0067
66/67 abordagem, pelo menos uma parte do bioprocesso pode ser conduzida no biorreator, e então, mais um recipiente de produção adicional é adicionado ou ativado no sistema de biorreator. Posteriormente, o sistema de biorreator pode ser operado para preencher pelo menos parcialmente um ou mais recipientes de produção adicionais com meio de cultura a partir de um ou mais outros recipientes de produção do sistema de biorreator. Ainda outro modo de operação envolve (i) realizar o bioprocesso no sistema de biorreator e, em seguida, (ii) remover um ou mais dos dois ou mais recipientes de produção contendo meio de cultura e células cultivadas no meio de cultura. Esta abordagem pode ser apropriada quando as células de um recipiente são cultivadas para tratar um paciente.
[00108] Em certas modalidades, o sistema de biorreator em grande escala inclui mais de dois recipientes de produção - por exemplo, como explicado acima, três, quatro, cinco, seis ou mais recipientes de produção configurados para realizar coletivamente o bioprocesso. Em certas modalidades, cada recipiente de produção tem um volume de trabalho não superior a cerca de 500 litros. Em algumas implementações, a proporção de volume de trabalho total· dos dois ou mais recipientes de produção para o volume de trabalho do maior dos dois ou mais recipientes de produção é pelo menos aproximadamente 3. Em certas modalidades, os dois ou mais recipientes de produção estão conectados em uma configuração em estrela ou em uma configuração de circuito fechado.
[00109] escala pode
Em geral, ter qualquer o sistema de biorreator de grande um ou mais dos recursos descritos /-j/
67/67 em outro lugar aqui para esses sistemas. Por exemplo, cada dos dois ou mais recipientes de produção e o recipiente de teste podem ter um intervalo operacional, e os intervalos operacionais de qualquer um dos dois ou mais recipientes de produção e o recipiente de teste podem ser limitados para não variar mais que cerca de 20%. Além disso, o sistema de controle pode ser configurado para ajustar as condições nos dois ou mais recipientes de produção para garantir que o pH médio do meio de cultura nos dois ou mais recipientes de produção não varie de um recipiente para outro em mais do que cerca de 0,1 unidades de pH.
[00110] Em muitas modalidades, um dos dois ou mais recipientes de produção é um recipiente mestre e os outros são recipientes satélites, onde o recipiente mestre inclui um sistema de mistura configurado para agitar o meio de cultura. Qualquer um dos recipientes satélites pode ou não incluir um sistema de mistura. Em algumas dessas modalidades, o recipiente mestre tem um volume de trabalho maior do que qualquer um dos recipientes satélites. Em algumas implementações, o recipiente mestre inclui um ou mais sensores para o pH, temperatura, uma concentração de metabolito celular, e oxigênio dissolvido no meio de cultura.
Figure BR102017018636A2_D0068
Figure BR102017018636A2_D0069
1/11

Claims (36)

  1. REIVINDICAÇÕE S
    1. Sistema de biorreator caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) dois ou mais recipientes acoplados fluidicamente configurados para realizar coletivamente uma biorreação;
    (b) um ou mais caminhos fluidicos acoplando os dois ou mais recipientes um ao outro, em que um ou mais caminhos fluidicos são configurados para fornecer fluxo de meio de cultura entre os dois ou mais recipientes durante a biorreação;
    (c) um ou mais dispositivos de transferência de fluido ao longo de pelo menos alguns do um ou mais caminhos fluidicos; e (d) um sistema de controle configurado para (i) ler ou receber valores de um ou mais parâmetros representando o meio de cultura em um ou mais dos recipientes durante a biorreação, (ii) usar referidos valores para determinar uma taxa de fluxo ajustada em pelo menos um dos caminhos fluidicos para manter valores substancialmente uniformes de um ou mais parâmetros no meio de cultura a partir de recipiente-a-recipiente entre os dois ou mais recipientes, e (iii) controlar pelo menos um dos dispositivos de transferência de fluido para ajustar a taxa de fluxo determinada em (ii), em que cada dos caminhos fluidicos é configurado para permitir o fluxo bidirecional do meio de cultura entre dois dos recipientes e/ou os dois ou mais recipientes são dispostos em circuito fechado.
  2. 2. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação
    2/11
    1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos-, mais um recipiente acoplado fluidicamente para um total de três ou mais recipientes acoplados fluidicamente configurados para realizar coletivamente a biorreação.
  3. 3. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que um ou mais parâmetros compreendem um parâmetro selecionado do grupo consistindo de pH, temperatura, concentração de metabolito celular e concentração de oxigênio dissolvido do meio de cultura.
  4. 4. Sistema de biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que cada recipiente possui um volume de trabalho não superior a cerca de 100 litros.
  5. 5. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proporção do volume de trabalho total dos dois ou mais recipientes para o volume de trabalho do maior dos dois ou mais recipientes é de pelo menos aproximadamente 3.
  6. 6. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os dois ou mais recipientes compreendem paredes de recipiente poliméricas.
  7. 7. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende cinco ou mais recipientes fluidicamente acoplados, incluindo os dois ou mais recipientes.
  8. 8. Sistema de biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que um dos •a# dois ou mais recipientes é um recipiente mestre e os outros dos dois ou mais recipientes são recipientes satélites, em que o recipiente mestre compreende um sistema de mistura
    3/11 configurado para agitar o meio de cultura.
  9. 9. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o recipiente mestre compreende um ou mais sensores para o pH, temperatura, uma concentração de metabolito celular e oxigênio dissolvido no meio de cultura.
  10. 10. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o recipiente mestre tem um volume de trabalho maior do que qualquer um dos recipientes satélites.
  11. 11. Sistema de biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que os dois ou mais recipientes e um ou mais caminhos fluidicos fornecem o sistema de biorreator em uma configuração em estrela.
  12. 12. Sistema de biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que os dois ou mais recipientes e um ou mais caminhos fluidicos fornecem o sistema de biorreator em uma configuração de circuito fechado.
  13. 13. Sistema de biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que os dois ou mais recipientes são fornecidos em uma ou mais escalas e/ou células de carga para monitorar suas massas durante a biorreação.
  14. 14. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o sistema de controle é ainda configurado para:
    ler ou receber pelo menos uma saída de uma ou mais escalas e/ou células de carga, como pelo menos um dos jV\üuí>íi iat %
    4/11
    Λ Fls ro Rub -¾ 'c7i valores de um ou mais parâmetros; e com base nas saídas das escalas e/ou células de carga, controlar um ou mais dos dispositivos de transferência de fluido para transferir o meio de cultura entre os dois ou mais recipientes, de modo que um volume do meio de cultura nos dois mais recipientes seja controlado.
  15. 15. Sistema de biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que os caminhos de fluido anexam próximo dos fundos dos dois ou mais recipientes.
  16. 16. Sistema de biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o sistema de controle é ainda configurado para ajustar condições nos dois ou mais recipientes para garantir que o pH médio do meio de cultura nos dois ou mais recipientes não varie de um recipiente para outro em mais de cerca de 0,1.
  17. 17. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que os dois ou mais recipientes e o sistema de controle são configurados de modo que o pH do meio de cultura dentro de qualquer dos recipientes tenha variância de no máximo cerca de 0,1 unidades de pH.
  18. 18. Sistema de biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que o sistema de controle é ainda configurado para ajustar condições nos dois ou mais recipientes para garantir que as forças de cisalhamento experimentadas pelas células nos dois ou mais recipientes sejam substancialmente iguais de um recipiente para outro durante a biorreação.
  19. 19. Sistema de biorreator, de acordo com qualquer uma rπ®
    5/11 condições nos dois ou mais recipientes para garantir que as taxas de transferência de gás de meio de cultura nos dois ou mais recipientes sejam substancialmente iguais de um recipiente para outro durante a biorreação.
  20. 20. Sistema de biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o sistema de controle compreende um único circuito de controle que é configurado para controlar um recipiente mestre, em que um dos dois ou mais recipientes é o recipiente mestre e os outros dos dois ou mais recipientes são recipientes satélites, em que o recipiente mestre compreende um sistema de mistura configurado para agitar o meio de cultura.
  21. 21. Sistema de biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos dois ou mais recipientes acoplados fluidicamente compreende uma entrada fluídica e uma saída fluídica, e em que o sistema de biorreator é configurado para introduzir o meio de cultura ao pelo menos um recipiente através da entrada fluídica, trocar o meio de cultura no recipiente enquanto mantendo as células biológicas nesse recipiente, e fluir o meio de cultura para fora da saída fluídica, para assim operar o pelo menos um recipiente em um modo de perfusão.
  22. 22. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a saída fluídica compreende um filtro configurado para evitar que as células biológicas, no pelo menos um recipiente, saiam do pelo menos um recipiente e a saída fluídica.
    6/11
  23. 23. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação^
    21, caracterizado pelo fato de que um dos dois ou mais recipientes é um recipiente mestre configurado para fornecer meios de cultura ao pelo menos um recipiente através da entrada fluídica para fornecer perfusão.
  24. 24. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o sistema de controle e o recipiente mestre são configurados em conjunto para manter substancialmente valores definidos de concentração de oxigênio dissolvido, temperatura e pH no meio de cultura no recipiente mestre e no pelo menos um recipiente.
  25. 25. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o recipiente mestre compreende um sistema de mistura, enquanto o pelo menos um recipiente não inclui qualquer sistema de mistura.
  26. 26. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que pelo menos um recipiente compreende ainda um ou mais micro-transportadores, fibras ocas e/ou placas de adesão.
  27. 27. Sistema de biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 26, caracterizado pelo fato de que o sistema de controle é ainda configurado para controlar um ou mais dispositivos de transferência de fluido para transferir o meio de cultura entre os dois ou mais recipientes, através de um ou mais caminhos fluídicos, tal que o tempo necessário para trocar o meio de cultura nos dois ou mais recipientes é no máximo cerca de um décimo do tempo necessário para que as células nos recipientes se dupliquem sob condições nos dois ou mais recipientes.
  28. 28. Método para realizar uma biorreação em um sistema de jÔUSÍHS/
    7/11 /F's — to Rub
    X,;
    I biorreator que compreende: (1) dois ou mais recipientes acoplados fluidicamente configurados para realizar coletivamente uma biorreação; (ii) um ou mais caminhos fluidicos acoplando os dois ou mais recipientes um ao outro, em que um ou mais caminhos fluidicos são configurados para fornecer fluxo de meio de cultura entre os dois ou mais recipientes durante a biorreação; e (iii) um ou mais dispositivos de transferência de fluido ao longo de pelo menos alguns do um ou mais caminhos fluidicos, em que cada dos caminhos fluidicos é configurado para permitir o fluxo bidirecional do meio de cultura entre dois dos recipientes e / ou os dois ou mais recipientes são dispostos em circuito fechado, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) ler ou receber valores de um ou mais parâmetros representando o meio de cultura em um ou mais dos recipientes durante a biorreação;
    (b) usar referidos valores para determinar uma taxa de fluxo ajustada em pelo menos um dos caminhos fluidicos para manter valores substancialmente uniformes de um ou mais parâmetros no meio de cultura a partir de recipiente-arecipiente entre os dois ou mais recipientes, e (c) controlar pelo menos um dos dispositivos de transferência de fluido para ajustar a taxa de fluido determinada em (b).
  29. 29. Método de escalonamento de um volume de trabalho de bioprocesso a partir de um biorreator de pequena escala para o de um biorreator de grande escala, o método caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) determinar condições de processo para realizar o bioprocesso em um recipiente de teste tendo um volume de %
    u o
    ~ o
    ο.
    te,
    8/11 trabalho não superior a cerca de 700 litros, em que as condições de processo compreendem valores de teste de um ou mais parâmetros representando o meio de cultura no recipiente durante o bioprocesso;
    (b) projetar um sistema de biorreator compreendendo um sistema de controle e dois ou mais recipientes de produção conectados fluidicamente, cada tendo um volume de trabalho não superior a aproximadamente 1,5 vezes o volume de trabalho do recipiente de teste, e a soma dos volumes de trabalho dos dois ou mais recipientes de produção sendo pelo menos aproximadamente 2 vezes maior do que o volume de trabalho do recipiente de teste, em que projetar o sistema de biorreator compreende projetar o sistema de controle para (i) ler ou receber valores de produção de um ou mais parâmetros representando o meio de cultura em um ou mais dos dois ou mais recipientes durante o bioprocesso, (ii) usar referidos valores de produção lidos ou recebidos para determinar uma taxa de fluxo ajustada do meio de cultura entre os dois ou mais recipientes de produção para manter valores de produção substancialmente uniformes de um ou mais parâmetros no meio de cultura a partir de recipiente-a-recipiente entre os dois ou mais recipientes de produção durante o bioprocesso, e (iii) controlar um dos dispositivos de transferência de fluido dispostos entre os dois ou mais recipientes de produção para ajustar a taxa de fluido conforme determinado em (ii), e em que o sistema de biorreator é configurado para permitir o fluxo bidirecional do meio de cultura entre dois dos recipientes de produção e / ou os dois ou mais recipientes de produção são dispostos em circuito fechado; e
    9/11 (c) construir e/ou arranjar os dois ou mais recipiente_ de produção e o sistema de controle conforme especificado em (b) para produzir o biorreator de grande escala.
  30. 30. Sistema de biorreator caracterizado pelo fato de que compreende:
    (a) dois ou mais recipientes fluidicamente acoplados configurados para realizar coletivamente uma biorreação, em que pelo menos um dos referidos recipientes é um recipiente de perfusão tendo uma entrada fluídica, uma saída fluídica e um filtro ou outra estrutura de retenção celular configurada para evitar células biológicas de deixarem o recipiente de perfusão durante a biorreação;
    (b) um ou mais caminhos fluídicos acoplando os dois ou mais recipientes um ao outro, em que um ou mais caminhos fluídicos são configurados para fornecer fluxo de meio de cultura entre os dois ou mais recipientes durante a biorreação;
    (c) um ou mais dispositivos de transferência de fluido ao longo de pelo menos alguns do um ou mais caminhos fluídicos; e (d) um sistema de controle configurado para (i) ler ou receber valores de um ou mais parâmetros representando o meio de cultura em um ou mais dos recipientes durante a biorreação, (ii) usar referidos valores para determinar uma taxa de fluxo ajustada em pelo menos um dos caminhos fluídicos para manter valores substancialmente uniformes de um ou mais parâmetros no meio de cultura a partir de recipiente-a-recípiente entre os dois ou mais recipientes, (iii) controlar pelo menos um dos dispositivos de transferência de fluido para ajustar a taxa de fluxo
    10/11 determinada em (ii), e (iv) introduzir o meio de cultura para o recipiente de perfusão através da entrada fluídica, trocar o meio de cultura no recipiente enquanto mantendo as células biológicas nesse recipiente, e fluir o meio de cultura para fora da saída fluídica, para Portanto, operar em um modo de perfusão.
  31. 31. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação
    30, caracterizado pelo fato de que um dos dois ou mais recipientes é um recipiente mestre configurado para fornecer meios de cultura para o recipiente de perfusão através da entrada fluídica para fornecer perfusão.
  32. 32. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação
    31, caracterizado pelo fato de que o sistema de controle e o recipiente mestre são configurados em conjunto para manter valores de concentração de oxigênio dissolvido, temperatura e pH no meio de cultura no recipiente mestre e no recipiente de perfusão.
  33. 33. Sistema de biorreator, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o recipiente mestre compreende um sistema de mistura, enquanto o recipiente de perfusão não inclui qualquer sistema de mistura.
  34. 34 . Sistema de biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 33, caracterizado pelo fato de que o sistema de biorreator é configurado para preencher pelo menos parcialmente o recipiente de perfusão com meio de cultura a partir de um ou mais outros recipientes durante a biorreação.
  35. 35. Sistema de biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 34, caracterizado pelo fato de que o recipiente de perfusão é configurado para ser removido a
    11/11 ê i &
    partir do sistema de biorreator, juntamente com o meio de cultura do recipiente de perfusão e células cultivadas no meio de cultura, antes da biorreação ser concluída.
  36. 36. Sistema de biorreator, de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 35, caracterizado pelo fato de que a estrutura de retenção de células compreende um ou mais micro-transportadores, fibras ocas e/ou placas de adesão.
    Μ
    Ο •rl
    Μ
    Φ +J
    Φ
    4J
    Í4 (ϋ
    Μ ΐτ •Η ^0/1799^
    2/9
    2-101
    4/3
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