BR102016029764A2 - processo para obtenção de composto das folhas de morus nigra l. e composto obtido para preparação de formulações farmacêuticas, nutracêuticas e aditivos alimentares - Google Patents

Abstract

processo para obtenção de composto das folhas de morus nigra l. e composto obtido para preparação de formulações farmacêuticas, nutracêuticas e aditivos alimentares. a presente patente de invenção envolve o processo de coleta, preparo das amostras e processos de extração de folhas trituradas de morus nigra. o extrato aquoso é obtido através das folhas trituradas de morus nigra e a formulação é produzida através da evaporação da água ou outros solventes por liofilização ou rotaevaporação. a formulação contendo o material extraído e seco tem uso terapêutico na regulação do metabolismo de lipídeos incluindo na peroxidação lipídica e no sistema nervoso central. auxilia em terapias para depressão e em outras doenças neurodegenerativas, pois exerce efeito antidepressivo e neuroprotetor, podendo ser utilizado preventivamente como suplemento e aditivo alimentar.

Description

(54) Título: PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSTO DAS FOLHAS DE MORUS NIGRA L. E COMPOSTO OBTIDO PARA

PREPARAÇÃO DE FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS, NUTRACÊUTICAS E ADITIVOS ALIMENTARES (51) Int. Cl.: A61K 36/605; A61P 3/06; A61P 25/24; A61P 39/06 (73) Titular(es): FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE REGIONAL DE BLUMENAU (72) Inventor(es): ANA LÚCIA BERTARELLO ZENI; ANA PAULA DALMAGRO (57) Resumo: PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSTO DAS FOLHAS DE MORUS NIGRA L. E COMPOSTO OBTIDO PARA PREPARAÇÃO DE FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS, NUTRACÊUTICAS E ADITIVOS ALIMENTARES. A presente patente de invenção envolve o processo de coleta, preparo das amostras e processos de extração de folhas trituradas de Morus nigra. O extrato aquoso é obtido através das folhas trituradas de Morus nigra e a formulação é produzida através da evaporação da água ou outros solventes por liofilização ou rotaevaporação. A formulação contendo o material extraído e seco tem uso terapêutico na regulação do metabolismo de lipídeos incluindo na peroxidação lipídica e no sistema nervoso central. Auxilia em terapias para depressão e em outras doenças neurodegenerativas, pois exerce efeito antidepressivo e neuroprotetor, podendo ser utilizado preventivamente como suplemento e aditivo alimentar.

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PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSTO DAS FOLHAS DE MORUS NIGRA L. E COMPOSTO OBTIDO PARA PREPARAÇÃO DE FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS, NUTRACÊUTICAS E

ADITIVOS ALIMENTARES [001] A presente patente de invenção refere-se ao processo para obtenção de composto através das folhas trituradas de plantas da família Moraceae, gênero Morus, espécie nigra Linnaeus (amoreira-preta) ecompostoobtido, para preparação de formulações farmacêuticas, nutracêuticas e aditivos alimentares, de uso humano e veterinário, que apresenta atividade hipolipidêmica, antidepressiva e neuroprotetora.

[002] De acordo com os dados da Organização Mundial de Saúde (OMS) estima-se que 17 milhões de pessoas morreram em 2008 devido a doenças cardiovasculares. Dentro deste contexto calcula-se que em 2030 serão 23,6 milhões. De acordo com o Ministério da Saúde, a redução dos níveis plasmáticos de colesterol de baixa densidade (LDL-C), o aumento dos níveis de colesterol de alta densidade (HDL-C) e também a redução de triglicerídios, podem reduzir o risco de morte por doenças cardiovasculares. A hipercolesterolemia e a hipertrigliceridemia são os principais fatores de risco, que individual ou conjuntamente aceleram o desenvolvimento de doença coronária e a progressão da aterosclerose.

[003] Tem-se verificado que substâncias antioxidantes são capazes de reverter a disfunção endotelial provocada pela hipercolesterolemia e também reduzir o número de eventos coronários. Um considerável número de extratos de plantas e seus constituintes utilizados como agentes antidepressivos e para demência, possuem ações antioxidante e neuroprotetora, possuindo potencial terapêutico nas doenças crônicas como a Doença de Alzheimer, a depressão e a esquizofrenia bem como nos distúrbios agudos, como isquemia e traumatismo, pois a excitotoxicidade é um elemento chave nos diversos transtornos neurodegenerativos. Neste sentido, os produtos naturais são uma opção a ser investigada.

[004] A planta medicinal M. nigraL., é conhecida popularmente como amoreira preta, porém na medicina popular existem outras denominações,

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2/9 como amoreira-negra ou até amoreira-do-bicho-da-seda. Essa espécie de amoreira é a mais abundante no Brasil e pertence ao gênero Morus e à família Moraceae. Por possuir características ornamentais é utilizada no paisagismo e arborização urbana de ruas no Sul do Brasil. Há também plantações do fruto para destinação alimentar. É originária do continente Asiático, mais precisamente na China, e apesar de ser proveniente de regiões de clima temperado, se adapta bem ao clima tropical e subtropical, sendo então perfeitamente cultivável no Brasil.

[005] Em geral, as plantas do gênero Morus possuem diversas indicações terapêuticas e uso popular. As espécies desse grupo são utilizadas como anti-inflamatório, diurético, antitussígeno, analgésico e antipirético. O chá das folhas da amora preta, popularmente, é indicado como terapia de reposição hormonal, e para o alívio dos sintomas de cefaleia e irritação que ocorrem no período pré-menstrual. Na medicina chinesa as folhas são eficazes no combate à febre, dor de cabeça, beribéri, vômitos e dor estomacal causada pela cólera.

[006] As folhas de Morus nigra têm sido estudadas quanto às atividades anti-hiperglicêmica, moduladora hormonal, anti-inflamatória, antinociceptivo e hepatoprotetor. Quanto à composição química e atividades biológicas Padilha et al. (2009) isolou um composto chamado germanicol, com efeito antiinflamatório. Memonet al (2010) estudou o perfil dos ácidos fenólicos de M. nigra identificando nas folhas os seguintes compostos: m-cumárico, pcumárico, siríngico, clorogênico, vanílico, p-hidroxidobenzóico e aldeído protocatecúico.

[007] O processo de oxidação é fundamental à vida, tendo em vista que a partir dele são gerados energia, síntese de substâncias, fagocitose, regulação e sinalização intracelular. Ocorre de forma natural ou por alguma injúria ao organismo (tabagismo, dieta inadequada, sedentarismo, radiação ultravioleta), gerando estruturas que possuem um elétron desemparelhado no átomo de oxigênio (ERO), de nitrogênio (ERN) ou enxofre (ERS).Dessa forma, as espécies reativas ao oxigênio e ao nitrogênio desencadeiam aumento da peroxidação lipídica, oxidação de proteínas, danos ao DNA e comprometimento da cadeia respiratória mitocondrial, paralisando-a.

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3/9 [008] O organismo possui mecanismos intrínsecos de defesa, como as enzimas (catalase, superóxido dismutase, glutationa), moléculas endógenas (bilirrubinas, ácido úrico) e moléculas exógenas que são adquiridas pela dieta, como polifenois, flavonoides e vitaminas. Porém, quando há desequilíbrio entre a produção dos radicais livres e o controle dos danos causados pelos mesmos, há predisposição a doenças como a depressão, Doença de Parkinson, Doença de Alzheimer, câncer e diabetes mellitus.

[009] A depressão é interpretada por muitos pesquisadores como uma condição relativamente comum, podendo ser crônica e recorrente. As principais consequências para os pacientes são incapacidade funcional, comprometimento da saúde física, limitações em atividades corriqueiras e do bem-estar. De acordo com publicação da OMS, essa patologia afeta em torno de 365 milhões de pessoas no mundo, das mais variadas faixas etárias. Há previsão que, em 2020, será a segunda causa de mortes e incapacidade funcional.

[010] Os principais sintomas apresentados pelos pacientes, de acordo com o Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais (DSM - 1995) são: humor deprimido na maior parte do dia, na maioria dos dias; interesse diminuído nas atividades exercidas; perda ou ganho significativo de peso; insônia ou hipersonia; agitação ou retardo psicomotor; fadiga exacerbada; sentimento de inutilidade ou culpa excessiva; capacidade diminuída de pensar ou concentrar-se e pensamentos de morte recorrente.

[011] Destaca-se que no máximo 70% dos pacientes em tratamento para o quadro depressivo, respondem satisfatoriamente aos tratamentos disponíveis. Dessa forma, as pesquisas de tratamentos eficazes, com efeitos colaterais reduzidos e acessíveis à população, são fundamentais para o manejo da patologia.

[012] A presente invenção surge como uma opção mais econômica, tão eficiente quanto medicamentos existentes no mercado, sem toxicidade conhecida, com benefícios múltiplos a exemplo do medicamento atorvastatina que vem sendo utilizado para dislipidemias e tem efeito benéfico na Doença de Alzheimer, porém com custo elevado e efeitos colaterais consideráveis.

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4/9 [013] Através do tratamento de camundongos induzidos à hiperlipidemia com tyloxapol e tratados com extrato provindo da extração aquosa das folhas de amoreira-preta - onde havia predominância de flavonoides e polifenois na composição fitoquímica, verificou-se a diminuição dos níveis séricos de colesterol e aumento do high density level cholesterol HDL-c, além de diminuição dos níveis de peroxidação lipídica avaliados pelo teste de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS).

[014] A presente invenção buscou obter material vegetal, extratos, formulação farmacêutica, nutracêutica e/ou aditivo alimentar para obtenção de fitoterápicos e produtos no manejo de terapias envolvendo dislipidemia e doenças neurodegenerativas, como a depressão bem como material melhorador na indústria alimentícia.

[015] Trata-se de uma formulação farmacêutica que apresenta atividade hipolipidêmica, antidepressiva e neuroprotetora, às obtenções desta formulação a partir de coleta de folhas de plantas da família Moraceae, gênero Morus, espécie nigra Linnaeus (amoreira-preta) e aos processos de obtenção destas formulações.

[016] Mais precisamente, a invenção refere-se à extração e concentração do extrato aquoso das folhas trituradas da planta, à obtenção de produto que pode ser explorado como fitoterápico. Neste item este gênero positivamente encontra-se citado no RENINSUS uma lista de plantas de interesse ao SUS e, ao uso medicinal no tratamento das dislipidemias e doenças como a depressão e outras doenças neurodegenerativas bem como seu uso como nutracêutico e/ou aditivo alimentar. A invenção refere-se a coleta e formulação de extrato de folhas de Morus nigra L. para seu uso no manejo de doenças do metabolismo de lipídeos e distúrbios no sistema nervoso central, como a depressão.

[017] As folhas secas a temperatura entre 25 e 45 °C e trituradas são submetidas à extração com água por duas formas, infusão e decocção (solvente atóxico). A mesma amostra também foi submetida à extração hidrometanólica. O extrato, por infusão, foi utilizado em tratamento agudo (3 dias, duas doses diárias de 100 a 400 mg/kg) em ratos com hiperlipidemia induzida através da administração de Triton WR-1339. Os animais tratados

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5/9 com o extrato em doses de diferentes concentrações tiveram seus níveis de triglicerídeos e colesterol diminuídos comparativamente ao fenofibrato (controle positivo adquirido no comércio). Além disso, as lipoproteínas light density level cholesterol (LDL-c), very light density cholesterol (VLDL-c) tiveram seus índices diminuídos e algo difícil e não alcançado pelo medicamento de referência foi demonstrado, o aumento dos níveis plasmáticos de HDL-c, uma lipoproteína de alta densidade (FIGURA 1). Também nesta etapa, hipocampo, cortex cerebral, rins e fígado obtidos de ratos tratados com o extrato, foram protegidos da peroxidação lipídica provocada pela alta de lipídeos sanguíneos.

[018] A vantagem deste invento, comparativamente aos medicamentos alopáticos, reside em uma eficácia maior, principalmente no aspecto de subir HDL. Constatou-se também a possibilidade de diminuição de efeitos colaterais observados nas terapias correntes como, problemas musculares, distúrbios gastrointestinais e cognitivos, hemorragia e aumenta risco para diabetes. Algumas estatinas são contraindicadas na gravidez, lactação, certas doenças do fígado, entre outros.

[019] O extrato também foi administrado a camundongos de forma aguda (60 minutos), subcrônica (1 dose diária por 7 dias) e novamente na forma sub-crônica em um modelo de depressão por estresse pela administração crônica (21 dias) de corticosterona. Após, os animais foram submetidos a testes comportamentais bem estabelecidos pela literatura que medem tempo de imobilidade e locomoção, este último para evitar falsopositivos, isto é, que diminuam o tempo de imobilidade por uma maior atuação do sistema locomotor. O extrato diminuiu o tempo de imobilidades nos referidos testes e modelos de depressão utilizados sem alterar a locomoção dos animais (FIGURA 2).

[020] Em outra etapa experimental os animais tratados com extrato foram sacrificados e seus cérebros forneceram hipocampo e córtex cerebral que foram utilizados como fatias para teste ex vivo na morte induzida por glutamato. As fatias provenientes de animais tratados foram protegidas da morte mostrando viabilidade celular mais alta do que os controles, mostrando desta forma um efeito neuroprotetor. O ácido siríngico, fenólico majoritário,

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6/9 exerceu os mesmos efeitos do extrato, mostrando pelo menos em parte sua participação nos efeitos do extrato (FIGURA 3).

[021] A vantagem deste invento comparando aos medicamentos disponíveis no mercado novamente reside em uma possível maior eficácia, pois tem efeito na forma aguda e 7 dias após enquanto que os medicamentos alopáticos precisam de 3 semanas para iniciar o efeito, sendo que existem pacientes que não respondem ao tratamento, economicamente mais vantajoso e podendo diminuir efeitos colaterais indesejados como náuseas, boca seca, tonturas, aumento de peso disfunção sexual. Uma interrupção súbita do tratamento pode resultar em sintomas piores, por exemplo, problemas digestivos (náuseas, diarreia), perturbações do sono (pesadelos, insônias), dores de cabeça, tonturas e, sensação de choques elétricos.

[022] Um fato importante a destacar é que existe a opção de não utilizar solvente orgânico, desta forma não poluindo o ambiente e sem deixar resíduos nas formulações originadas.

[023] Os extratos possuem atividade antioxidante e compostos antioxidantes que podem ser aproveitados pela indústria alimentícia que sofre com a constante oxidação e mudanças de sabor de seus produtos, sem falar da diminuição de tempo de prateleira e efeitos colaterais de antioxidantes de uso comum na indústria Butil-hidroxianisol (BHA) e butil-hidroxitolueno entre outros, são suspeitos de causar prejuízos ao fígado, câncer e danos ao DNA.

[024] A presente invenção pode ser melhor compreendida através das seguintes figuras:

[025] A FIGURA 1 demonstra o efeito de extratos de infusão de Morus nigra (MN) nos níveis séricos de colesterol total (A), triglicerídeos (B), HDL (C) e LDL (D) em ratos hiperlipêmicos induzidos por Triton WR-1339 (HCG). Os valores são expressos como médias ± SEM (n = 6-8). *** p <0,001 HCG em comparação com outros grupos e ### p <0,001 ou #p <0,05 em comparação com o grupo HCG.

[026] A FIGURA 2 evidencia o efeito da administração aguda de extrato aquoso de Morus nigra (MN, 3 - 100 mg/kg, po), fluoxetina (FLU, 10 e 20 mg / kg, po) ou ácido siringico (SA 0,1-100 mg/Kg, po) no FST (painel A) e TST

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7/9 (painéis B e C). Os valores são expressos como médias ± S.E.M. (N = 5-8). P <0,05; ** P <0,01 e *** P <0,001 comparativamente com o controle tratado com veículo.

[027] A FIGURA 3 mostra a análise de viabilidade celular ex vivo de fatias de hipocampo incubadas com glutamato (GLU, 10 mM) durante 1 hora. Quando presente, foi administrado previamente em murganhos, por gavagem, um extracto aquoso de Morus nigra (MN, 3-100 mg / kg, po), Fluoxetina (FL, 10 mg / kg, po) ou SA (1 ou 10 mg / kg, po) (7 dias antes da preparação das fatias). Após este período, o meio de incubação foi retirado e substituído por meio de cultura fresco sem GLU e mantido durante mais 3 h. O grupo de controlo (primeira barra preta) foi considerado 100% e representa a viabilidade celular de fatias incubadas apenas em meio de cultura. Os valores representam médias ± DP de pelo menos 5 experiências realizadas em triplicata. ** p <0,01 e *** p <0,001 significativamente diferentes do grupo de controlo (100%); ### p <0,001 significativamente diferente do grupo GLU.

[028] A FIGURA 4 apresenta o cromatograma obtido por RP-HPLC (330 nm) de s fenólicos de infusão, decocção e extratos hidrometanólicos de folhas de amoreira-preta (Morus nigra L.). Picos: (1) quercetina, (2) rutina, (3) ácido gálico, (4) catequina, (5) ácido clorogênico, (6) ácido caféico e (7) ácido ferúlico.

[029] A FIGURA 5 retrata o perfil cromatográfico de extrato aquoso de Morus nigra L. (MN). Os picos representam a quercetina, a rutina e o ácido siríngico, respectivamente.

[030] Esta invenção baseia-se no processo de obtenção dos extratos aquosos (decocção e infusão) e hidrometanólico, liofilizado do extrato aquoso infusão (EA) e compostos majoritários, especialmente ácido siríngico (AS), seus usos e formulações farmacêuticas. Para obtenção do EA, as folhas são secas em estufa entre as temperaturas de 25 a 45 °C, preferencialmente até 40°C ou em temperatura ambiente, sendo após trituradas. Após as folhas são submetidas à extração aquosa na proporção variável, de folhas moídas/água de 1 a 3%. A água deve estar entre 70 e 100 °C, por exemplo, 90 °C por um tempo de 5 a 20 minutos, que pode ser, por exemplo, 10 minutos em ambiente isento de luz. O material extraído é então filtrado com gaze dupla ou tripla e

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8/9 liofilizado em uma temperatura variando entre -50 e -20°C, acondicionado em frasco âmbar e conservado em temperatura entre -14 a -17 °C para uso.

[031] De forma semelhante é obtido o extrato aquoso decocção, com a diferença do anterior que neste a fervura dura entre 5 a 20 minutos, que pode ser, por exemplo, 10 minutos. E o último hidrometanólico, com solvente na proporção 30:70 com extração de duração de 5 a 25 minutos, melhor em 15 minutos, sob constante agitação.

[032] A caracterização fenólica, flavonoídica e carotenoídica bem como conteúdo de vitamina C foi realizada. E a capacidade antioxidante também foi mensurada (Tabela). A realização de cromatografias por HPLC de fenólicos também foram realizadas (FIGURAS 4 e 5). Utilizando-se para esta etapa o extrato das folhas trituradas de Morus nigra L. oriundo da extração com água com temperatura entre 90 e 100 °C de acordo com o item 2.1 e 3, e após extração líquido-líquido com acetato de etila por 3 horas. Resultando na seleção do extrato aquoso de infusão para os experimentos com animais, pois existe restrição no uso de animais pelos comitês de ética.

[033] Tabela - Atividade capacidade antioxidante de DPPH, teor total de fenóis (TP), flavonóides (TF) e ácido ascórbico (AA) de Morus nigra de acordo com o método de extração.

Extratos (Rendimento %)	DPPH- scavenging activityb	-1 O o	TFd	AAe
Infusão	83.85 ±	75.86 ± 0.87a	79.96 ± 0.71a	2.13 ± 0.13a
(25.5 ± 0.02)	0.99a
Decocção (30.0 ± 0.03)	74.37 ± 0.2b	64.59 ± 0.14b	67.83 ± 1.24b	4.35 ± 0.14b
Hidrometanólico	81.71 ±	51.01 ± 0.86c	76.76 ± 0.78a	2.51 ± 0.13a
(16.0 ± 0.01)	0.05a

^aMédia ± desvio padrão (n = 3).

^bValores expressos em percentagem de descoloração. ^cValores expressos em mg / g de peso seco GAE. ^dValores expressos em pg / g QE de peso seco. ^eValores expressos em mg / 100 g de peso seco.

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Diferentes letras na mesma coluna representam diferenças significativas (p<0,05) entre os extratos.

[034] A formulação farmacêutica a ser obtida das folhas trituradas pode ser na forma de saquinhos com o pó e realizar a extração, pode ser extrato liofilizado, na forma de cápsulas, apresentando as seguintes condições e especificações: coloração verde, odor característico, com o objetivo de normalização de perfil lipídico e auxílio em desordens do sistema nervoso central.

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Claims (8)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSTO DAS FOLHAS

   DE MORUS NIGRA, caracterizado por conter as etapas de:

   I. colheita das folhas de Morus nigra L. mais maduras, sem amarelados ou outras cores que denotem deterioração, que estejam a 24 horas ou mais sem precipitação, que sejam plantas adultas e coordenadas por monitoramento sazonal,

   II. secagem das folhas à sombra ou em temperaturas entre 25 e 45°C, com ventilação,

   III. moagem ou trituração das folhas,

   IV. conservação em temperatura entre 2 a - 2 °C,

   V. extração seletiva dos componentes de interesse, com água e/ou solventes, de 1 a 3% da amostra,

   VI. filtragem dos compostos com material neutro, do tipo tecido, com boa porosidade,

   VII. concentração dos componentes,

   VIII. conservação em temperatura entre -14 a -17 °C;
2. 2. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSTO DAS FOLHAS DE MORUS NIGRA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por as etapas de II a VIII serem realizadas em ausência de luz;
3. 3. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSTO DAS FOLHAS DE MORUS NIGRA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a etapa V ser realizada através da extração do composto com água, em temperatura entre 70 e 100 °C, permanecendo em contato com a amostra vegetal de 5 a 20 minutos, em recipiente tampado;
4. 4. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSTO DAS FOLHAS DE MORUS NIGRA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a etapa V ser realizada através da extração do composto com água, em temperatura entre 90 e 100 °C, permanecendo em fervura com a amostra vegetal por 5 a 20 minutos, em recipiente tampado;

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5. 5. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSTO DAS FOLHAS DE MORUS NIGRA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a etapa V ser realizada através da extração do composto com água e metanol, na proporção de 30:70, em temperatura entre 25 e 35 °C, permanecendo em agitação com a amostra vegetal por 5 a 20 minutos, em recipiente tampado;
6. 6. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSTO DAS FOLHAS DE MORUS NIGRA, de acordo com as reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado por a etapa VII da reivindicação 1, ser realizada por meio de liofilização em temperatura variando entre - 50 a - 20 °C, no caso dos extratos aquosos;
7. 7. PROCESSO PARA OBTENÇÃO DE COMPOSTO DAS FOLHAS DE MORUS NIGRA, de acordo com as reivindicações 1, e 4, caracterizado por a etapa VII da reivindicação 1, ser realizada por meio de secagem por rotaevaporação, em temperatura abaixo de 45°C, no caso de solvente nãoaquoso;
8. 8. PRODUTO OBTIDO PELO PROCESSO DEFINIDO DA REIVINDICAÇÃO 1, caracterizado por conter maior concentração de ácido siríngico e, contendo ainda, quercetina e rutina.

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   FIGURA 01

   A

   500-1

   C olesterol (m g/dL)

   C

   40-i

   NCG HCG MN 100 MN 200 MN 400 FF ITriton WR 1339 (400 mg/kg) ###

   B

   Triton WR 1339 (400 mg/kg)

   NCG HCG MN 100 MN 200 MN 400 FF

   D

   250

   200

   150

   100

   NCG

   Triton WR 1 339 (400 mg/kg)

   HCG MN 100 MN 200 MN 400 FF I-1

   Triton WR 1339 (400 mg/kg)

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   FIGURA 02

   Tratamentos (mg/kg)

   B

   Tratamentos (mg/kg)

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   FIGURA 03

   V e íc u Io β Tratamentos (mg/kg)

   G lutam ato 1 0 m M

   Tratamentos (mg/kg)

   Veículo Glutam ato 10 m M

   Tratamentos (mg/kg)

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   FIGURA 04

   Minutes

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   FIGURA 05

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