BR102016018780A2

BR102016018780A2 - Proteínas inseticidas cry6a manipuladas

Info

Publication number: BR102016018780A2
Application number: BR102016018780-0A
Authority: BR
Inventors: Timothy D. Hey; Xiaoping Xu; Todd Glancy; Diaa Alabed; Sarah E. Worden; Nick X. Wang; Carla Ausmus; Shao-Ching Hung
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2015-08-17
Filing date: 2016-08-15
Publication date: 2020-12-08
Also published as: JP2018529652A; CN114685630A; CN108026149A; IL257480A; US20170051304A1; EP3337903A1; BR102016018780A8; ZA201801475B; CN108026149B; CN114685630B; WO2017030843A1; EP3337903A4; US10612036B2

Abstract

proteínas inseticidas cry6aa modificadas, sequências de ácido nucleico, construto de dna, uso de uma planta ou parte de planta, bem como métodos para produzir uma planta transgênica, e para controle de danos causados por pragas de insetos em plantas. a invenção refere-se a toxinas inseticidas cry6aa modificadas e manipuladas, polinucleotídeos que codificam tais toxinas, uso de tais toxinas para o controle de pragas e plantas transgênicas que produzem tais toxinas que são descritas.

Description

"PROTEÍNAS INSETICIDAS Cry6Aa MODIFICADAS, SEQUÊNCIAS DE ÁCIDO NUCLEICO, CONSTRUTO DE DNA, USO DE UMA PLANTA OU PARTE DE PLANTA, BEM COMO MÉTODOS PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA, E PARA CONTROLE DE DANOS CAUSADOS POR PRAGAS DE INSETOS EM PLANTAS".

[001] O presente Pedido reivindica a prioridade a partir de e benefício do Pedido Provisório dos Estados Unidos 62/205.797, depositado em 17 de agosto de 2015. Todo o conteúdo deste Pedido é aqui incorporado por referência ao presente Pedido.

REFERÊNCIA A LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS ENVIADA POR VIA ELETRÔNICA

[002] A cópia oficial da listagem de sequências é enviada eletronicamente através da EFS-Web como uma listagem de sequências no formato ASCII com um arquivo denominado "77095_DIG1000v2_ST25", criado em 18 de julho de 2016 e que tem um tamanho de 411 kilobytes e é depositado concorrentemente com o relatório descritivo. A listagem de sequências contida neste documento em formato ASCII é parte do relatório descritivo e é aqui incorporada por referência na íntegra.

CAMPO TÉCNICO

[003] A presente invenção refere-se, de modo geral, ao campo de biologia molecular, conforme aplicado à agronomia. Mais particularmente, determinadas modalidades se referem a métodos para o uso de segmentos de DNA como sondas diagnósticas e modelos para expressão de proteína inseticida. Métodos de produção e uso dos segmentos de ácido nucleico reivindicados no desenvolvimento de protetores incorporados em plantas em células de plantas e plantas transgênicas são descritos.

ANTECEDENTES DA DESCRIÇÃO

[004] Insetos e outras pragas custam aos agricultores bilhões de dólares por ano em perdas de colheitas e com as despesas para controlar pragas de insetos. As perdas causadas por pragas em ambientes de produção agrícola incluem diminuição na produtividade da cultura, redução na qualidade de colheita e aumento dos custos com a colheita.

[005] Coleópteros são um grupo significativo de pragas agrícolas que causam danos extensos às culturas a cada ano. Exemplos de pragas de coleópteros incluem, porém sem limitações: besouro da batata do Colorado (CPB), lagarta da raiz do milho, gorgulho da alfafa, gorgulho do algodão e besouro Japonês. O besouro da batata do Colorado é uma praga de importância econômica que se alimenta de folhas de batata, berinjela, tomate, pimenta, tabaco e outras plantas da família das solanáceas. O besouro da batata do Colorado é um desfolhador problemático da batata, em parte porque ele desenvolveu resistência a muitas classes de inseticidas.

[006] A lagarta da raiz do milho ocidental (WCR), Diabrotica virgifera virgifera LeConte, é um dos coleópteros mais devastadores na América do Norte e é uma preocupação especial em áreas produtoras de milho do Meio-Oeste dos Estados Unidos. Cerca de 9,3 milhões de acres de milho nos Estados Unidos são infestados com complexos de espécies de lagarta da raiz a cada ano. A lagarta da raiz do milho do Norte (NCR), Diabrotica barberi Smith e Lawrence, é uma espécie estreitamente relacionada que co-habita a maior parte da mesma área que a WCR. Há várias outras subespécies relacionadas de Diabrotica que são pragas significativas nas Américas: a lagarta da raiz do milho Mexicano (MCR), D. virgifera zeae Krysan e Smith; a lagarta da raiz do milho do Sul (SCR), D. undecimpunctata howardi Barber; D. balteata LeConte; D. undecimpunctata tenella; D. speciosa Germar; e D. u. undecimpunctata Mannerheim. O Departamento de Agricultura dos Estados Unidos estimou que as lagartas da raiz do milho causam US $ 1 bilhão em receitas perdidas a cada ano, incluindo US $ 800 milhões em perda de produtividade e US $ 200 milhões em custos com tratamentos.

[007] Tanto ovos de WCR quanto NCR são depositados no solo durante o verão. Os insetos permanecem no estágio de ovo durante o inverno. As larvas eclodem no final de maio ou início de junho e começam a se alimentar das raízes de milho. As lagartas da raiz do milho passam por três estágios larvais. Após alimentação durante várias semanas, as larvas mudam para o estágio de pupa. Elas passam a pupa no solo e, então, emergem do solo como adultos em julho e agosto.

[008] A maioria dos danos ao milho pela lagarta da raiz é causada pela alimentação das larvas. As lagartas da raiz recém eclodidas se alimentam inicialmente sobre os pelos finos da raiz do milho e se enterram nas pontas da raiz. À medida que as larvas crescem, elas se alimentam e se enterram nas raízes primárias. Quando as larvas da raiz do milho são abundantes, a alimentação das larvas resulta, muitas vezes, no desbaste das raízes todo o caminho até a base da haste do milho. A lesão grave da raiz interfere com a capacidade das raízes de transportar água e nutrientes para a planta, reduz o crescimento das plantas e resulta em redução na produção de grãos, deste modo, muitas vezes, reduzindo drasticamente o rendimento global. A lesão grave da raiz também resulta, muitas vezes, em acamamento das plantas de milho, o qual torna a colheita mais difícil e diminui ainda mais o rendimento. Além disso, a alimentação de adultos sobre os tecidos reprodutivos de milho pode resultar em desbaste de sedas na ponta da espiga. Se este "corte de seda" é grave o suficiente durante a liberação de pólen, a polinização pode ser interrompida. Além disso, os membros do gênero Diabrotica atacam culturas de cucurbitáceas (pepino, melão, abóbora, etc.) e muitas culturas hortícolas e agrícolas em produção comercial, bem como aquelas que estão sendo cultivadas em hortas domésticas.

[009] O controle de lagartas da raiz de milho foi tentado por meio de rotação de culturas, inseticidas químicos, biopesticidas, tal como a bactéria Gram-positiva formadora de esporos, Bacillus thuringiensis (B.t.), plantas transgênicas que expressam toxinas de B.t. e uma combinação dos mesmos. A rotação de culturas sofre da desvantagem de impor restrições indesejáveis sobre o uso de terras agrícolas. Além disso, a oviposição de algumas espécies de lagarta da raiz pode ocorrer em campos de soja, deste modo, comprometendo a eficácia da rotação de culturas praticada com milho e soja.

[0010] Inseticidas químicos são a estratégia mais fortemente usada para alcançar o controle da lagarta da raiz do milho. O uso de inseticidas químicos é uma estratégia imperfeita para o controle da lagarta da raiz; altas populações de larvas, fortes chuvas e aplicação indevida do(s) inseticida(s) podem todos resultar em controle inadequado da lagarta da raiz. Além disso, o uso contínuo de inseticidas pode sele-cionar cepas de lagarta da raiz resistentes a inseticidas, bem como suscitar preocupações ambientais significativas em virtude de sua toxicidade para espécies não alvo.

[0011] Os danos às plantas causados por nematoides também são um problema econômico prevalecente e grave. Nematoides causam danos graves e generalizados em muitas espécies de plantas. Muitos gêneros de nematoides são conhecidos por causar tais danos. Nematoides parasitas de plantas incluem membros do Filo Nematoda, Ordens Tylenchida e Dorylaimide. Na Ordem Tylenchida, os nematoides parasitas de plantas são encontrados em duas Super Famílias: Tylenchoidea e Criconematoidea. Há mais de 100.000 espécies descritas de nematoides.

[0012] Os pesticidas químicos constituem um método eficaz de controle de pragas; no entanto, o público se tornou preocupado com a quantidade de resíduos químicos que podem ser encontrados em alimentos, águas subterrâneas e o ambiente. Novas restrições rigorosas sobre o uso de pesticidas químicos e a eliminação de alguns pesticidas eficazes do mercado poderiam limitar as opções econômicas e eficazes para o controle de pragas de alto custo. Assim, há uma necessidade urgente de identificar novos agentes e composições para o controle de pragas.

[0013] O uso regular de pesticidas químicos para o controle de pragas de insetos indesejadas pode selecionar cepas resistentes a produtos químicos. A resistência a produtos químicos ocorre em muitas espécies de insetos de importância econômica e também ocorreu em nematoides de ovelhas, cabras e cavalos. Por exemplo, um método aceito para o controle de nematoides tem se focado em torno da substância benzimidazol e seus congêneres. O uso destas substâncias em grande escala tem levado a muitos casos de resistência entre populações de nematoides (Prichard, R. K. et al.). O desenvolvimento de resistência a pesticidas requer uma pesquisa contínua de novos agentes de controle que tenham modos de ação diferentes.

[0014] No momento, há uma necessidade de ter meios mais eficazes para controlar os muitos coleópteros e nematoides que causam danos consideráveis em hospedeiros e culturas suscetíveis. Vantajosamente, tais meios eficazes empregariam toxinas biológicas altamente seletivas. Foi mostrado que várias proteínas Cry de B.t. são nematicidas, estas incluindo Cry5B, Cry6A, Cry14A e Cry21A (Wei et al., 2003; Aroian e Li (2010).

[0015] B.t. é uma bactéria que vive no solo que produz proteínas cristalinas pesticidas conhecidas como delta endotoxinas ou proteínas Cry. As proteínas Cry são intoxicantes orais que funcionam ao atuar sobre as células do intestino médio de insetos suscetíveis. Foi mostrado que algumas toxinas Cry têm atividade contra nematoides.
Uma extensa lista de delta endotoxinas é mantida e atualizada regularmente no web site Bacillus thuringiensis Toxin Nomenclature mantido por Neil Crickmore (vide http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/toxins2.html e Crickmore et al. 1998, página 808). Toxinas Cry, incluindo membros das famílias Cry1B, Cry1I, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A e Cyt2C (Frankenhuyzen, 2009), têm atividade inseticida contra insetos coleópteros.

[0016] Algumas toxinas B.t. as quais são ativas contra a lagarta da raiz do milho e outros coleópteros são agora conhecidas. Cry6Aa tem atividade reportada contra coleópteros e nematoides (Patente dos Estados Unidos N° 5.186.934; Patente dos Estados Unidos N° 6.632.792 B2; Patente dos Estados Unidos N°2011/02 25681; Patente dos Estados Unidos N° 2011/0239334 A1; e Wei et al., 2003). Por exemplo, a Patente dos Estados Unidos N°4.849.217 descreve vários isolados, incluindo PS52A1 e PS86A1, como tendo atividade contra gorgulhos da alfafa. A Patente dos Estados Unidos N° 5.208.017 descreve PS86A1 como tendo atividade contra a lagarta da raiz do milho Ocidental. As Patentes dos Estados Unidos Nos 5.427.786 e 5.186.934 descrevem, cada uma, isolados e toxinas de B.t. ativos contra coleópteros. Especificamente descrito nestas patentes é o isolado conhecido como PS86A1 e uma toxina ativa para coleópteros obtenível a partir do mesmo conhecida como 86A1. A toxina 86A1 é agora também conhecida como Cry6A (CryVIA). A toxina Cry6Aa de tipo selvagem tem cerca de 54,1 kDa. Uma toxina Cry6B também é conhecida. Esta toxina pode ser obtida a partir do isolado PS69D1. A Cry6Aa é reconhecida como um novo modo de ação contra a lagarta da raiz do milho Ocidental, complementando a Cry3Aa e Cry34Ab1/Cry35Ab1 (Li et al., 2013), tornando-a um parceiro de pirâmide em um programa de gestão de resistência a insetos integrada (Patentes dos Estados Unidos Nos 2013/0167269 A1 e US 2013/0263331 A1).

[0017] As toxinas Cry6A e Cry6B de comprimento completo são conhecidas como tendo atividade contra nematoides. O isolado PS69D1 foi reportado como tendo atividade contra nematoides (Patentes dos Estados Unidos Nos 4.948.734; 5.093.120; 5.262.399; e 5.439.881). Uma fórmula genérica para a sequência de aminoácidos das toxinas CryVI foi descrita no documento WO 92/19739, o qual também ensina que a toxina de comprimento completo tem atividade contra nematoides. Os isolados PS52A1 e PS69D1 são descritos no mesmo. As Patentes dos Estados Unidos Nos 5.262.159 e 5.468.636 também descrevem uma fórmula genérica para toxinas que têm atividade contra pulgões.

[0018] A toxina Cry6A é conhecida por inibir o crescimento de determinados coleópteros e pode ser ativada por meio de clivagem enzimática para produzir uma toxina no núcleo amino terminal que é letal para coleópteros, tal como o lagarta da raiz do milho Ocidental (Patente dos Estados Unidos N° 6.831.062 B2). Além disso, a Cry6A truncada é ativa contra nematoides. A Patente dos Estados Unidos N° 6.831.062 descreve holotoxinas Cry6A truncadas e proteínas de fusão e genes de fusão. Thompson et al. descreveram os fragmentos peptídicos com atividade inseticida identificados como sendo os resíduos 12-390 e 12-443, dependendo do sítio de clivagem. O fragmento grande, aproximadamente a partir dos resíduos 12-390 ou 12-443 resultantes de digestão por tripsina ou outra digestão proteolítica, são denominados os fragmentos centrais ou toxinas. O tratamento de Cry6Aa com tripsina, produzida a partir de B.t. recombinante, aumentou a atividade contra WCR (Patente dos Estados Unidos N° 5.874.288; Patente dos Estados Un idos N° 6.831.062 B2; e Patente dos Estados Unidos N°6.303 .364 B1).

[0019] Embora a produção das proteínas Cry atualmente empregadas em plantas transgênicas possa conferir proteção robusta contra as pragas supracitadas, deste modo, protegendo o rendimento de grãos, pragas adultas têm emergido em ensaios de infestação artificial, indicando controle menos do que completo de insetos larval. Adicionalmente, o desenvolvimento de populações de insetos resistentes ameaça a durabilidade a longo prazo das proteínas Cry no controle de pragas de insetos. Insetos coleópteros desenvolveram resistência às proteínas Cry no campo (Gassman et al, PLoS ONE, julho de 2011 | Volume 6 | Edição 7 | e22629). A resistência dos insetos às proteínas Cry de B.t. pode se desenvolver através de vários mecanismos (Heckel et al., 2007; Pigott e Ellar, 2007). Múltiplas classes de proteínas receptoras para proteínas Cry foram identificadas dentro de insetos e há vários exemplos dentro de cada classe de receptores. A resistência a uma proteína Cry particular pode se desenvolver, por exemplo, por meio de uma mutação dentro da porção de ligação da toxina de um domínio de caderina de uma proteína receptora. Um outro meio de resistência pode ser mediado por uma protease de processamento de protoxina.

[0020] Embora a Cry6Aa nativa naturalmente expressa em cepas de B.t. tenha mostrado boa eficácia contra WCR e determinados nematoides, seu uso como um protetor incorporado em planta eficaz não foi demonstrado em virtude de sua suscetibilidade à proteólise quando expressa em células de plantas. Portanto, toxinas Cry6A manipuladas para serem mais resistentes à proteólise, quando expressas em células de plantas, seriam altamente desejáveis para uso em plantas recombinantes, especialmente milho, como um protetor incorporado em planta.

BREVE SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

[0021] A presente invenção inclui toxinas de proteína inseticida com base em Cry6A manipuladas, incluindo variantes e análogos que, em parte, foram concebidas para limitar a perda de um importante peptídeo carbóxi terminal (Carboxy Terminal Peptide - CTP). Outras modalidades da invenção incluem ácidos nucleicos que codificam as toxinas inseticidas reivindicadas, métodos de controle de pragas usando as toxinas expressas a partir das sequências de ácidos nucleicos reivindicadas, métodos de produção das toxinas em células hospedeiras transgênicas e sementes de plantas transgênicas que compreendem tais ácidos nucleicos e plantas que expressam as toxinas.

[0022] As proteínas inseticidas Cry6Aa modificadas da presente invenção compreendem modificações escolhidas a partir do grupo que consiste em uma região suscetível à proteólise modificada (resíduos 390-451 de SEQ ID NO: 1), afinidade aumentada do CTP pela proteína no núcleo e adição de peptídeos de trânsito subcelulares. Um grupo preferido de proteínas inseticidas Cry6Aa variantes é SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138 e SEQ ID NO: 140. Um grupo mais preferido de variantes é SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132 e SEQ ID NO: 144. Um grupo mais altamente preferido de variantes é SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132. Um grupo ainda mais preferido de variantes é SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120. E a variante mais preferida é SEQ ID NO: 116.

[0023] Um grupo preferido de sequências de ácidos nucleicos que codificam as proteínas inseticidas Cry6Aa variantes é SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO : 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73 , SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO : 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 135 , SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 142 e SEQ ID NO: 143. Um grupo mais preferido de ácidos nucleicos é SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 127 e SEQ ID NO: 131. Um grupo mais altamente preferido de ácidos nucleicos é SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 131 e 139. Um grupo ainda mais preferido de ácidos nucleicos é SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119 e SEQ ID NO: 139. E o ácido nucleico mais preferido é SEQ ID NO: 115.

[0024] Em outra modalidade, a invenção fornece uma planta que compreende um polipeptídeo inseticida de Cry6Aa manipulado descrito aqui.

[0025] Em outra modalidade, a invenção fornece um método para controle de populações de pragas de plantas e danos às plantas por meio de distribuição de uma quantidade eficaz como inseticida de uma proteína inseticida da invenção em um tecido de planta, de modo que uma praga de insetos venha a ingerir a proteína inseticida.

[0026] Em outra modalidade, a invenção fornece um ácido nucleico isolado que codifica um polipeptídeo inseticida de Cry6Aa manipulado descrito aqui.

[0027] Em outra modalidade, a invenção fornece construtos de DNA que compreendem uma sequência de nucleotídeos que codifica um polipeptídeo inseticida de Cry6Aa manipulado operativamente ligado a um promotor que é capaz de dirigir a expressão em uma planta e outras sequências reguladoras que estabilizam o RNA mensageiro. O promotor pode ser nativo ou heterólogo à B.t.

[0028] A invenção também fornece plantas transgênicas que compreendem o construto de DNA estavelmente incorporado em seu genoma e um método para proteção de uma planta contra uma praga que compreende introdução do construto na dita planta.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0029] A Figura 1 é um diagrama esquemático de amostras 1-4 de DIG-177 (Cry6Aa) testadas conforme descrito no Exemplo 3. O diagrama mostra as amostras após digestão com tripsina com e sem redução da ligação de dissulfureto.

[0030] A Figura 2 é um modelo de estrutura 3D em fita de DIG-177 (Cry6Aa) tratada com tripsina (esquerda) que representam resíduos 12-125, 128-387 e 445-472 de SEQ ID NO: 2. A Figura 2 (direita) é um modelo em fita dos resíduos 12-472 de SEQ ID NO: 2; os resíduos que faltam da estrutura tratada com tripsina (esquerda) foram modelados. O peptídeo carbóxi terminal em ambas as estruturas é mostrado em preto.

[0031] A Figura 3 é uma representação da comparação de modelo estrutural dos resíduos 12-472 (esquerda; a partir da Figura 2) e da variante DIG-1000 (direita). O peptídeo carbóxi terminal (CTP) é mostrado em preto à esquerda; o CTP e ligante manipulado são mostrados em preto em DIG-1000 (direita).

[0032] A Figura 4 mostra a análise SDS-PAGE de DIG-177 e DIG-1000 tratadas com proteinase K sob as condições descritas no Exemplo 10. FL se refere à proteína de comprimento completo não digerida, não tratada; 0-50 são tempos de incubação em minutos.

[0033] A Figura 5 é uma análise de expressão transitória de proteínas Cry6Aa em milho por Western blot. O antissoro usado era específico para DIG-177, Cry6Aa. A proteína codificada pelo DNA de plasmídeo bombardeado é observada: Coluna 1, Fluorescent Rainbow Marker (GE Healthcare, Pittsburgh, PA); Coluna 2, controle de embrião não bombardeado; Coluna 3, DIG-177 com TraP8; Coluna 4, DIG-177; Coluna 5, DIG-1000; Coluna 6, DIG-1000 com TraP8; Coluna 7, PAT (controle negativo); Coluna 8, YFP (controle negativo) Coluna 9, DIG-177 padrão a 0,5 ng/coluna; Coluna 10, DIG-1000 padrão a 1 ng/coluna.

[0034] A Figura 6 mostra os resultados dos experimentos de Western blot de expressão em folha de milho T1.

BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS

[0035] SEQ ID NO:1 é uma sequência de DNA que compreende DIG-177 (Cry6Aa) de comprimento completo.

[0036] SEQ ID NO:2 é a sequência de proteína deduzida de DIG-177.

[0037] SEQ ID NO:3 Versão otimizada para códon de milho de DIG-177, também conhecida como IRDIG.522.28; codifica a proteína identificada como SEQ ID NO:2.

[0038] SEQ ID NO:4 Versão com tendência de códon de milho DIG-177 com um peptídeo de trânsito mitocondrial codificado, também conhecida como IRDIG.552.60.

[0039] SEQ ID NO:5 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:4

[0040] SEQ ID NO:6 Versão otimizada para códon de milho de DIG-177 com um peptídeo de trânsito mitocondrial codificado; também conhecida como IRDIG.552.61

[0041] SEQ ID NO:7 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:6

[0042] SEQ ID NO:8 Versão otimizada para códon de milho de DIG-177 com um peptídeo de trânsito em cloroplasto e mitocondrial combinados codificado; também conhecida como IRDIG.552.62

[0043] SEQ ID NO:9 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:8

[0044] SEQ ID NO:10 Versão otimizada para códon de milho de DIG-177 com um peptídeo de trânsito em peroxissomo codificado; também conhecida como IRDIG.552.63

[0045] SEQ ID NO:11 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:10

[0046] SEQ ID NO:12 Versão otimizada para códon de milho de DIG-177 com um peptídeo de trânsito em peroxissomo codificado; também conhecida como IRDIG.552.64

[0047] SEQ ID NO:13 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:12

[0048] SEQ ID NO:14 Versão otimizada para códon de milho de DIG-177 com um peptídeo de trânsito em peroxissomo codificado; também conhecida como IRDIG.552.65

[0049] SEQ ID NO:15 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:14

[0050] SEQ ID NO:16 Versão otimizada para códon de milho de DIG-177 com um peptídeo de trânsito em vacúolo codificado; também conhecida como IRDIG.552.66

[0051] SEQ ID NO:17 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:16

[0052] SEQ ID NO:18 Versão otimizada para códon de milho de DIG-177 com um peptídeo de trânsito em vacúolo codificado; também conhecida como IRDIG.552.67

[0053] SEQ ID NO:19 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:18

[0054] SEQ ID NO:20 Versão otimizada para códon de milho de DIG-177 com um peptídeo de trânsito em vacúolo codificado; também conhecida como IRDIG.552.68

[0055] SEQ ID NO:21 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:20

[0056] SEQ ID NO:22 Versão otimizada para códon de milho de DIG-177 com um peptídeo de trânsito em apoplasto codificado; também conhecida como IRDIG.552.69

[0057] SEQ ID NO:23 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:22

[0058] SEQ ID NO:24 Versão otimizada para códon de milho de DIG-177 com um peptídeo de trânsito em retículo endoplásmico codificado; também conhecida como IRDIG.552.70

[0059] SEQ ID NO:25 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:24

[0060] SEQ ID NO:26 Versão otimizada para códon de milho de DIG-177 com um peptídeo de trânsito nuclear codificado; também conhecida como IRDIG.552.71

[0061] SEQ ID NO:27 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:26

[0062] SEQ ID NO:28 Versão otimizada para códon de milho de DIG-177 com um peptídeo de trânsito nuclear codificado; também conhecida como IRDIG.552.72

[0063] SEQ ID NO:29 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:28

[0064] SEQ ID NO:30 Versão otimizada para códon de milho de DIG-177 com um peptídeo de trânsito em cloroplasto codificado; também conhecida como IRDIG.552.73

[0065] SEQ ID NO:31 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:30

[0066] SEQ ID NO:32 Versão otimizada para códon de milho de DIG-177 com um peptídeo de trânsito em cloroplasto codificado; também conhecida como IRDIG.552.74

[0067] SEQ ID NO:33 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:32

[0068] SEQ ID NO:34 Sequência codificadora de DIG-177, que codifica a mutação C88>A, também conhecida como DIG-614

[0069] SEQ ID NO:35 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:34

[0070] SEQ ID NO:36 Sequência codificadora de DIG-177, que codifica a mutação C88>S, também conhecida como DIG-615

[0071] SEQ ID NO:37 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:36

[0072] SEQ ID NO:38 Sequência codificadora de DIG-177, que codifica a mutação C162>A, também conhecida como DIG-616

[0073] SEQ ID NO:39 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:38

[0074] SEQ ID NO:40 Sequência codificadora de DIG-177, que codifica a mutação C162>S, também conhecida como DIG-617

[0075] SEQ ID NO:41 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:40

[0076] SEQ ID NO:42 Sequência codificadora de DIG-177, que codifica a mutação C451>A, também conhecida como DIG-618

[0077] SEQ ID NO:43 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:42

[0078] SEQ ID NO:44 Sequência codificadora de DIG-177, que codifica a mutação C451>S, também conhecida como DIG-619

[0079] SEQ ID NO:45 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:44

[0080] SEQ ID NO:46 Sequência codificadora de DIG-177, que codifica as mutações C88>S e C451>S, também conhecida como DIG-983

[0081] SEQ ID NO:47 o polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:46

[0082] SEQ ID NO:48 Sequência codificadora de DIG-177, que codifica as mutações C88>A e C451>A, também conhecida como DIG- 984

[0083] SEQ ID NO:49 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:48

[0084] SEQ ID NO:50 LF (Fragmento grande); aminoácidos 12390 de SEQ ID NO:2

[0085] SEQ ID NO:51 CTP 1 (Peptídeo carbóxi terminal 1), aminoácidos 444-475 de SEQ ID NO:2

[0086] SEQ ID NO:52 CTP 2 (Peptídeo carbóxi terminal 2), aminoácidos ou 451-475 de SEQ ID NO:2

[0087] SEQ ID NO:53 Codifica uma proteína de resíduos 1-443 SEQ ID NO 2, também conhecida como DIG-137

[0088] SEQ ID NO:54 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:53

[0089] SEQ ID NO:55 Codifica uma proteína de resíduos 1-432 de SEQ ID NO:2, também conhecida como DIG-138.

[0090] SEQ ID NO:56 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:55

[0091] SEQ ID NO:57 Codifica uma proteína de resíduos 1-423 de SEQ ID NO:2, também conhecida como DIG-147

[0092] SEQ ID NO:58 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:57

[0093] SEQ ID NO:59 Codifica uma proteína de resíduos 1-400 de SEQ ID NO:2, também conhecida como DIG-148

[0094] SEQ ID NO:60 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:59

[0095] SEQ ID NO:61 Codifica uma proteína de resíduos 1-390 de SEQ ID NO:2, também conhecida como DIG-149

[0096] SEQ ID NO:62 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:61

[0097] SEQ ID NO:63 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 391-395 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-921

[0098] SEQ ID NO:64 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:63

[0099] SEQ ID NO:65 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 396-400 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-922

[00100] SEQ ID NO:66 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:65

[00101] SEQ ID NO:67 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 401-405 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-923

[00102] SEQ ID NO:68 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:67

[00103] SEQ ID NO:69 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 406-410 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-924

[00104] SEQ ID NO:70 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:69

[00105] SEQ ID NO:71 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 406-410 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-925

[00106] SEQ ID NO:72 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:71

[00107] SEQ ID NO:73 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 416-420 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-926

[00108] SEQ ID NO:74 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO: 73

[00109] SEQ ID NO:75 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 421-425 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-927

[00110] SEQ ID NO:76 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO: 75

[00111] SEQ ID NO:77 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 441-445 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-931

[00112] SEQ ID NO:78 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO: 77

[00113] SEQ ID NO:79 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 391-400 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-969

[00114] SEQ ID NO:80 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO: 79

[00115] SEQ ID NO:81 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 401-410 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-970

[00116] SEQ ID NO:82 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO: 81

[00117] SEQ ID NO:83 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 411-420 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-971

[00118] SEQ ID NO:84 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO: 83

[00119] SEQ ID NO:85 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 421-430 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-972

[00120] SEQ ID NO:86 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO: 85

[00121] SEQ ID NO:87 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 431-440 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-973

[00122] SEQ ID NO:88 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO: 87

[00123] SEQ ID NO:89 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 391-405 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-985

[00124] SEQ ID NO:90 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO: 89

[00125] SEQ ID NO:91 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 406-420 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-986

[00126] SEQ ID NO:92 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO: 91

[00127] SEQ ID NO:93 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 421-435 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-987

[00128] SEQ ID NO:94 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:93

[00129] SEQ ID NO:95 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 429-443 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-988

[00130] SEQ ID NO:96 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:95

[00131] SEQ ID NO:97 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 391-410 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-989

[00132] SEQ ID NO:98 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:97

[00133] SEQ ID NO:99 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 411-430 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-990

[00134] SEQ ID NO:100 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:99

[00135] SEQ ID NO:101 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 424-443 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-991

[00136] SEQ ID NO:102 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:101

[00137] SEQ ID NO:103 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 391-415 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-992

[00138] SEQ ID NO:104 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:103

[00139] SEQ ID NO:105 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 415-440 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-993

[00140] SEQ ID NO:106 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:105

[00141] SEQ ID NO:107 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 419-443 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-994

[00142] SEQ ID NO:108 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:107

[00143] SEQ ID NO:109 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 401-443 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-995

[00144] SEQ ID NO:110 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:109

[00145] SEQ ID NO:111 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 391-433 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-996

[00146] SEQ ID NO:112 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:111

[00147] SEQ ID NO:113 Codifica uma proteína com eliminação dos resíduos de aminoácido 391-414 e 425-443 de SEQ ID NO:2, conhecida como DIG-997

[00148] SEQ ID NO:114 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:113

[00149] SEQ ID NO:115 Codifica uma variante de DIG-177 com uma substituição de ligante peptídico para um segmento suscetível à protease, também conhecida como DIG-1000.

[00150] SEQ ID NO:116 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:115

[00151] SEQ ID NO:117 Codifica uma variante de DIG-177 com uma substituição de ligante peptídico para um segmento suscetível à protease, também conhecida como DIG-1049

[00152] SEQ ID NO:118 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:117

[00153] SEQ ID NO:119 Codifica uma variante de DIG-177 com uma substituição de ligante peptídico para um segmento suscetível à protease, também conhecida como DIG-1052

[00154] SEQ ID NO:120 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:119

[00155] SEQ ID NO:121 Codifica uma variante de DIG-177 com uma substituição de ligante peptídico para um segmento suscetível à protease, também conhecida como DIG-1038

[00156] SEQ ID NO:122 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:121

[00157] SEQ ID NO:123 Codifica uma variante de DIG-177 com uma substituição de ligante peptídico para um segmento suscetível à protease, também conhecida como DIG-1055

[00158] SEQ ID NO:124 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:123

[00159] SEQ ID NO:125 Codifica uma variante de DIG-177 com uma substituição de ligante peptídico para um segmento suscetível à protease, também conhecida como DIG-1039

[00160] SEQ ID NO:126 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:125

[00161] SEQ ID NO:127 Codifica uma variante de DIG-177 com uma substituição de ligante peptídico para um segmento suscetível à protease, também conhecida como DIG-1056

[00162] SEQ ID NO:128 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:127

[00163] SEQ ID NO:129 Codifica uma variante de DIG-177 com uma substituição de ligante peptídico para um segmento suscetível à protease, também conhecida como DIG-1040

[00164] SEQ ID NO:130 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:129

[00165] SEQ ID NO:131 Codifica uma variante de DIG-177 com uma substituição de ligante peptídico para um segmento suscetível à protease, também conhecida como DIG-1057

[00166] SEQ ID NO:132 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:131.

[00167] SEQ ID NO:133 Codifica uma variante de DIG-177 com uma substituição de ligante peptídico para um segmento suscetível à protease, também conhecida como DIG-1041.

[00168] SEQ ID NO:134 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:133.

[00169] SEQ ID NO:135 Codifica uma variante de DIG-177 com uma substituição de ligante peptídico para um segmento suscetível à protease, também conhecida como DIG-1058

[00170] SEQ ID NO:136 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:135.

[00171] SEQ ID NO:137 Versão com tendência de códon de milho DIG-1000.

[00172] SEQ ID NO:138 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:137.

[00173] SEQ ID NO:139 Versão com tendência de códon de milho DIG-1000 com um peptídeo de trânsito em cloroplasto.

[00174] SEQ ID NO:140 O polipeptídeo codificado por SEQ ID NO:139.

[00175] SEQ ID NO:141 Versão com tendência de códon de milho DIG-1036.

[00176] SEQ ID NO:142 Versão GC "highest" de milho GC+ERLS de DIG-1036 com Sequência de Localização em ER.

[00177] SEQ ID NO:143 Versão GC "highest" +VLS de milho de DIG-1036 com Sequência de Localização em Vacúolo.

[00178] SEQ ID NO:144 O polipeptídeo codificado por DIG-1036 (DIG-1000 menos sítios de glicosilação: N69>Q; N144>Q; N403>Q; N409>Q).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA DESCRIÇÃO

[00179] A presente invenção é um resultado de estudos de manipulação de proteínas destinados a descobrir os sítios de origem e alvo de dano proteolítico às toxinas Cry6A produzidas em células de planta. Análises de alta resolução, incluindo determinação da estrutura de cristal digerida por tripsina de Cry6Aa, foram concluídas. Este trabalho descreveu vários detalhes moleculares surpreendentes relacionados a como as proteínas inseticidas Cry6Aa funcionam.

[00180] Destas descobertas, foi determinado que a Cry6Aa pertence à família de proteínas hemolisina alfa helicoidal com base na identidade estrutural; outros membros deste grupo incluem HlyE e BLB-B (Eifler et al., 2006; Tzokov et al., 2006; Wallace et al., 2000; Mueller et al., 2009; Madegowda et al., 2008).

[00181] Duas pontes de dissulfureto, entre resíduos de cisteína 88 e 451 e entre as cisteínas 402-404, foram identificados. Surpreendentemente, estas pontes de dissulfureto não eram necessárias para a atividade inseticida de Cry6Aa de comprimento completo em bioensaios de WCR com base em dieta artificial.

[00182] Uma terceira descoberta está relacionada à atividade inseticida da toxina tratada com tripsina. Descobriu-se que um peptídeo carbóxi terminal (CTP), que consiste nos resíduos 444-475 ou 451-475, é ligado por dissulfureto ao fragmento de toxina no núcleo e descobriu-se que é necessário para atividade. O tamanho pequeno do CTP e a natureza lábil da ligação de dissulfureto provavelmente são responsáveis pelo fato de que ele não foi identificado anteriormente (Patente dos Estados Unidos N° 5.874. 288; Patente dos Estados Unidos N° 6.831.062; Patente dos Estados Un idos N° 6303364).

[00183] A utilidade de Cry6Aa como um traço transgênico robusto em plantas (protetor incorporado em planta), especialmente para proteção contra WCR, é dependente do acúmulo intracelular de proteína inseticida ativa. Acredita-se que a clivagem proteolítica entre os resíduos 390-451, em um ambiente redutor, tal como em uma célula de planta, provoque a dissociação do peptídeo carbóxi terminal, levando à perda de atividade inseticida.

[00184] Vários meios de evitar a perda de atividade inseticida de toxinas Cry6Aa expressas em plantas formam a base da presente invenção. Tais meios são compreendidos de redução de proteólise na região suscetível, por exemplo, a região aproximadamente entre os resíduos 390-451, das toxinas em questão ou minimização da dissolução do CTP necessário, podendo ser usados individualmente ou em combinação. Eles são como segue:

[00185] 1. Remodelamento da estrutura primária de aminoácidos da região suscetível, de modo que ela não seja reconhecida por proteases, incluindo encurtamento da região suscetível para torná-la menos suscetível a proteases.

[00186] 2. Redirecionamento da toxina Cry6Aa expressa para um compartimento subcelular ou extracelular onde ela não é acessível a proteases.

[00187] 3. Regulação negativa ou inibição das proteases no ambiente celular onde as toxinas em questão se acumulam.

[00188] 4. Manutenção da associação do CTP à proteína no núcleo ao redirecionar a Cry6Aa expressa para o retículo endoplasmático, para permitir que a ligação de dissulfureto núcleo-CTP permaneça intacta. Sob tais circunstâncias, a proteína Cry6Aa retém a atividade inseticida após proteólise.

[00189] 5. Aumento da afinidade entre a proteína no núcleo e o CTP, no caso onde proteólise ocorre, por meio de manipulação de proteínas. Tais métodos são bem conhecidos na técnica de manipulação de proteínas e incluem manipulação das ligações de hidrogênio entre o núcleo e polipeptídeos CTP. Outra forma é manipular as pontes salinas entre os peptídeos não covalentemente ligados. Uma terceira forma é manipular ar interações hidrofóbicas entre o CTP e a proteína no núcleo. Um quarto método é manipular ligações dissulfureto novas ou existentes, de modo que elas sejam menos suscetíveis à redução.

[00190] Por "isolado", os requerentes pretendem designar que as moléculas de nucleotídeos ou polipeptídeos foram removidas de seu ambiente nativo e foram colocadas em um ambiente diferente pela mão do homem. Assim, as moléculas de nucleotídeos e polipeptídeos isoladas incluem moléculas de DNA ou proteína que foram purificadas, concentradas ou de outra forma tornadas substancialmente isentas de material celular de Bacillus thuringiensis. As modalidades de moléculas de nucleotídeos ou polipeptídeos inseticidas de Cry6Aa manipuladas isoladas podem ter menos do que cerca de 30%, menos do que cerca de 20%, menos do que cerca de 10%, menos do que cerca de 9%, menos do que cerca de 8%, menos do que cerca de 7%, menos do que cerca de 6%, menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3% ou menos do que cerca de 2% ou menos do que cerca de 1% (em peso seco) de proteína contaminante (por exemplo, proveniente de Bacillus thuringiensis). Quando as modalidades de nucleotídeos ou polipeptídeos inseticidas de Cry6Aa manipulados isolados são produzidas de forma recombinante, então, o material de meio de cultura, precursores químicos e/ou nucleotídeo ou polipeptídeo inseticida de Cry6Aa não manipulado representam menos do que cerca de 30%, menos do que cerca de 20%, menos do que cerca de 10%, menos do que cerca de 5%, menos do que cerca de 4%, menos do que cerca de 3% ou menos do que cerca de 2% ou menos do que cerca de 1% (em peso seco) dos nucleotídeos ou polipeptídeos inseticidas de Cry6Aa manipulados isolados.

[00191] Cry6Aa e variantes são parceiros de pirâmide potenciais para Cry34Ab1/Cry35Ab e outros agentes inseticidas para a lagarta da raiz de milho em virtude de sua potência e sequência e identidade estrutural únicas. Além disso, ela não compete pelos sítios de ligação em vesículas da membrana ciliar de WCR com a Cry34Ab1/Cry35Ab1 ou Cry3Aa (Li et al., 2013). Plantas transgênicas que expressam Cry6Aa no citosol não têm sido eficazes; a análise mostra que a proteína é suscetível a processamento proteolítico e possível inativação, conforme similarmente observado no Exemplo 3. Uma estratégia para limitar a proteólise é dirigir a proteína recombinante para compartimentos subcelulares (revisto por Benchabane, 2008), conforme descrito no Exemplo 1. Outra estratégia para limitar a proteólise e possível inativação é através de manipulação de proteínas.

[00192] Toxinas Inseticidas Cry6Aa Manipuladas. A invenção abrange a Cry6Aa manipulada com atividade inseticida e variantes da mesma. Pelo termo "variante", os requerentes pretendem incluir fragmentos, determinados mutantes com eliminações e inserções e determinadas proteínas quiméricas ou de fusão.

[00193] A invenção inclui variantes de proteína inseticida DIG-177 que têm um segmento de toxina que é 90%, 91%, 92%, 93, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idêntico aos aminoácidos 1 a 475 de SEQ ID NO: 2. As variantes podem ser produzidas fazendo mutações aleatórias ou as variantes podem ser concebidas. No caso de mutantes concebidas, há uma elevada probabilidade de geração de variantes com atividade similar à toxina nativa quando a identidade de aminoácidos é mantida em regiões críticas da toxina as quais respondem pela atividade biológica ou estão envolvidas na determinação da configuração tridimensional a qual é, em última análise, responsável pela atividade biológica. Uma elevada probabilidade de retenção de atividade também ocorrerá se as substituições são conservativas. Os aminoácidos podem ser colocados nas seguintes classes: não polares, polares não carregados, básicos e ácidos. As substituições conservativas pelas quais um aminoácido de uma classe é substituído por outro aminoácido do mesmo tipo são menos suscetíveis de alterar significativamente a atividade biológica da variante. A Tabela 1 fornece uma listagem de exemplos de aminoácidos que pertencem a cada classe.

[00194] Em alguns casos, substituições não conservativas podem também ser feitas. O fator crítico é que estas substituições não devem prejudicar significativamente a atividade biológica da toxina. As variantes incluem polipeptídeos que diferem quanto à sequência de aminoácidos em virtude de mutagênese. As proteínas variantes abrangidas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, elas conti-nuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína nativa, ou seja, retêm a atividade pesticida.

[00195] Também podem ser concebidas proteínas variantes que diferem ao nível de sequência, mas que retêm a mesma ou uma estrutura tridimensional essencial global, distribuição de carga de superfície similar e assim por diante. Vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 7.058.515; Larson et al. (2002); Stemmer (1994a, 1994b, 1995) e Crameri et al. (1996a, 1996b, 1997), Patente dos Estados Unidos N° 8.513.492 B2.

[00196] Ácidos Nucleicos. Os ácidos nucleicos isolados e complementos dos mesmos que codificam as toxinas inseticidas Cry6Aa manipuladas são um aspecto da presente invenção. O termo "isolado" é definido aqui acima. Em virtude da redundância do código genético, uma variedade de diferentes sequências de DNA podem codificar as sequências de aminoácidos descritas aqui. Está bem dentro da habilidade daqueles versados na técnica criar estas sequências de DNA alternativas que codificam as mesmas, ou essencialmente as mesmas, proteínas inseticidas.

[00197] Síntese de Genes. Os genes que codificam as proteínas inseticidas Cry6Aa modificados descritas aqui podem ser produzidos por meio de uma variedade de métodos bem conhecidos na técnica. Por exemplo, segmentos de genes sintéticos e genes sintéticos podem ser produzidos através da química com tri-éster de fosfita e fosforamidita (Caruthers et al., 1987) e fornecedores comerciais estão disponíveis para executar a síntese de genes em demanda. Os genes de comprimento completo podem ser montados através de uma variedade de maneiras incluindo, por exemplo, por meio de ligação de fragmentos de restrição ou montagem por reação em cadeia de polimerase de oligonucleotídeos que se sobrepõem (Stewart e Burgin, 2005). Além disso, eliminações e adições de genes de terminais podem ser feitas através de amplificação por PCR usando oligonucleotídeos terminais sítio específicos.

[00198] Os ácidos nucleicos que codificam proteínas inseticidas Cry6Aa manipuladas podem ser produzidos, por exemplo, através de construção sintética por meio de métodos atualmente praticados por qualquer um de vários fornecedores comerciais. (Por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 7.482.119). Estes genes, ou p artes ou variantes dos mesmos, também podem ser construídos sinteticamente, por exemplo, usando um sintetizador de genes e os métodos de concepção, por exemplo, da Patente dos Estados Unidos N° 5.380.831. Alternativamente, variações de genes sintéticos ou que ocorrem naturalmente podem ser facilmente construídas usando técnicas de biologia molecular convencionais para fazer mutações pontuais, adições e/ou eliminações. Os fragmentos destes genes também podem ser produzidos usando exonucleases ou endonucleases comercialmente disponíveis de acordo com processos convencionais. Por exemplo, enzimas tal como Bal31 ou mutagênese sítio dirigida podem ser usadas para cortar sistematicamente nucleotídeos das extremidades destes genes. Também, fragmentos de genes os quais codificam fragmentos de toxina ativa podem ser obtidos usando uma variedade de enzimas de restrição.

[00199] Dada a sequência de aminoácidos para uma proteína inseticida Cry6Aa manipulada, uma sequência codificadora pode ser concebida por meio de tradução reversa da sequência codificadora usando códons sinônimos preferidos pelo hospedeiro pretendido e, então, refinando a sequência usando códons sinônimos alternativos para remover as sequências que possam causar problemas na transcrição, tradução ou estabilidade do mRNA. Além disso, os códons sinônimos podem ser empregados para introduzir códons terminais nos quadros de leitura da Cry6Aa não manipulada (isto é, quadros de leitura 2, 3, 4, 5 e 6) para eliminar quadros de leitura aberta longos espúrios.

[00200] Quantificação de Identidade de Sequência de Polipeptídeo ou Ácido Nucleico. A identidade percentual de duas sequências de aminoácidos ou duas sequências de ácidos nucleicos é determinada primeiro alinhando as sequências para fins de comparação ideal. A identidade percentual entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, identidade percentual = número de posições idênticas/número total de posições (por exemplo, posições sobrepostas) x 100). Em uma modalidade, as duas sequências têm o mesmo comprimento. A identidade percentual entre duas sequências pode ser determinada usando técnicas similares àquelas descritas abaixo, com ou sem permissão de lacunas. No cálculo da identidade percentual, tipicamente, correspondências exatas são contadas.

[00201] A determinação da identidade percentual entre duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Um exemplo não limitativo de tal algoritmo é aquele de Altschul et al. (1990) e Karlin e Altschul (1990), modificado conforme em Karlin e Altschul (1993) e incorporado nos programas BLASTN e BLASTX. Buscas no BLAST podem, convenientemente, ser usadas para identificar sequências homólogas (similares) a uma sequência de consulta em bancos de dados de ácidos nucleicos ou proteínas. Buscas no BLASTN podem ser realizadas (pontuação = 100, comprimento de palavra = 12) para identificar sequências de nucleotídeos que têm homologia com as moléculas de ácidos nucleicos reivindicadas da invenção. Buscas no BLASTX podem ser realizadas (pontuação = 50, comprimento de palavra = 3) para identificar sequências de aminoácidos que têm homologia com as moléculas de proteína inseticida reivindicadas da invenção.

[00202] O Gapped BLAST (Altschul et al., 1997) pode ser usado para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação. Alternativamente, o PSI-Blast pode ser usado para realizar uma busca iterada que detecta relações distantes entre moléculas (Altschul et al., 1997). Quando se usa os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, podem ser usados os parâmetros de default dos respectivos programas. Vide www.ncbi.nlm.nih.gov.

[00203] Um exemplo não limitativo de um algoritmo matemático usado para comparação de sequências é o algoritmo ClustalW (Thompson et al., 1994). O ClustalW compara sequências e alinha a totalidade da sequência de DNA ou aminoácidos e, portanto, pode fornecer dados sobre a conservação de sequência de toda a sequência de aminoácidos ou de sequência de nucleotídeos. O algoritmo ClustalW é usado em vários pacotes de software de análise de DNA/aminoácido comercialmente disponíveis, tais como o módulo Vector NTI Program Suite (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Ao alinhar as sequências de aminoácidos com o ALIGNX, podem-se usar, convenientemente, as configurações de default com uma penalidade por abertura de lacuna de 10, uma penalidade por extensão de lacuna de 0,1 e a matriz de comparação blosum63mt2 para avaliar a similaridade ou identidade percentual de aminoácidos (consenso) entre as duas sequências. Ao alinhar sequências de DNA com o ALIGNX, podem-se usar, conve-nientemente, as configurações de default com uma penalidade por abertura de lacuna de 15, penalidade por extensão de lacuna de 6,6 e a matriz de comparação swgapdnamt para avaliar a identidade percentual entre as duas sequências.

[00204] Outro exemplo não limitativo de um algoritmo matemático usado para comparação de sequências é aquele de Myers e Miller (1988). Tal algoritmo está incorporado no programa wSTRETCHER, o qual é parte do pacote de software de alinhamento de sequências wEMBOSS (disponível em http://emboss.sourceforge.net/). O wSTRETCHER calcula um alinhamento global ideal de duas sequências usando uma modificação do algoritmo de programação dinâmica clássico o qual usa o espaço linear. A matriz de substituição, penalidade por inserção de lacuna e penalidade por extensão de lacuna que são usadas para calcular o alinhamento podem ser especificadas. Quando se usa o programa wSTRETCHER para comparar sequências de nucleotídeos, uma penalidade por abertura de lacuna de 16 e uma penalidade por extensão de lacuna de 4 podem ser usadas com a matriz de pontuação EDNAFULL. Quando usado para comparação de sequências de aminoácidos, uma penalidade por abertura de lacuna de 12 e uma penalidade por extensão de lacuna 2 podem ser usadas com a matriz de pontuação EBLOSUM62.

[00205] Um outro exemplo não limitativo de um algoritmo matemático usado para comparação de sequências é aquele de Needleman e Wunsch (1970), o qual é incorporado nos pacotes de software de alinhamento de sequência GAP versão 10 e wNEEDLE (http://emboss.sourceforge.net/). O GAP versão 10 pode ser usado para determinar a identidade ou similaridade de sequência usando os seguintes parâmetros: para uma sequência de nucleotídeos, a identidade % e similaridade % são encontradas usando um Peso de LACUNA de 50 e Peso de Comprimento de 3 e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp. Para comparação de sequências de aminoácidos, a identidade % ou similaridade % são determinadas usando um Peso de LACUNA 8 e Peso de Comprimento de 2 e o programa de pontuação BLOSUM62.

[00206] O wNEEDLE lê duas sequências de entrada, encontra o alinhamento ideal (incluindo lacunas) ao longo de todo seu comprimento e escreve seu alinhamento de sequência global ideal no arquivo. O algoritmo explora todos os alinhamentos possíveis e escolhe o melhor usando a matriz de pontuação que contém valores para cada possível correspondência de resíduo ou nucleotídeo. O wNEEDLE encontra o alinhamento com a pontuação máxima possível, onde a pontuação de um alinhamento é igual à soma das correspondências tomadas a partir da matriz de pontuação, menos penalidades provenientes de lacunas de aberturas e extensão nas sequências alinhadas. A matriz de substituição e as penalidades por abertura e extensão de lacuna são especificadas pelo usuário. Quando as sequências de aminoácidos são comparadas, uma penalidade por abertura de lacuna de 10, uma penalidade por extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de comparação EBLOSUM62 são usados por default. Quando as sequências de DNA são comparadas usando o wNEEDLE, uma penalidade por abertura de lacuna de 10, uma penalidade por extensão de lacuna de 0,5 e a matriz de comparação EDNAFULL são usadas.

[00207] Também podem ser usados programas equivalentes. Por "programa equivalente" entenda-se qualquer programa de comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento com correspondências de resíduos de nucleotídeos ou aminoácidos idênticos e uma identidade de sequência percentual idêntica quando comparado com o alinhamento correspondente gerado pelo ALIGNX, wNEEDLE, ou wSTRETCHER. A identidade % é a percentagem de correspondências idênticas entre as duas sequências mais a região alinhada reportada (incluindo quaisquer lacunas no comprimento) e a similaridade % é a percentagem de correspondências entre as duas sequências mais a região alinhada reportada (incluindo quaisquer lacunas no comprimento).

[00208] O alinhamento também pode ser realizado manualmente através de inspeção.

[00209] Hospedeiros Recombinantes. Os genes que codificam as proteínas inseticidas da presente invenção podem ser introduzidos em uma ampla variedade de hospedeiros microbianos, fungos ou plantas. Expressão do gene de proteína inseticida resulta, direta ou indiretamente, na produção e manutenção da proteína pesticida intracelular. Com hospedeiros microbianos adequados, por exemplo, Pseudomonas, os micróbios podem ser aplicados ao ambiente da praga, onde eles proliferarão e serão ingeridos. O resultado é o controle da praga. Alternativamente, o micróbio que hospeda o gene da proteína pesticida pode ser tratado sob condições que prolongam a atividade da proteína e estabilizam a célula hospedeira recombinante. A célula tratada, a qual compreende um polipeptídeo inseticida tratado da presente invenção que retém a atividade inseticida, pode ser aplicada ao ambiente da praga alvo para controlar a praga.

[00210] Onde o gene da proteína inseticida de B.t. é introduzido através de um construto de DNA adequado, por exemplo, um vetor, em um hospedeiro microbiano e o dito hospedeiro é aplicado ao ambiente no estado vivo, é essencial que sejam usados determinados micróbios hospedeiros. São selecionados hospedeiros microbianos que são conhecidos por ocuparem a "fitosfera" (filoplano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplano) de uma ou mais culturas de interesse. Estes micro-organismos são selecionados de modo a serem capazes de competir com êxito no ambiente particular (cultura e outros habitats de insetos) com os micro-organismos indígenas de tipo selvagem, permitir manutenção e expressão estáveis do gene que expressa o polipeptídeo pesticida e, desejavelmente, conferir uma melhor proteção ao pesticida contra degradação e inativação ambientais.

[00211] Um grande número de micro-organismos são conhecidos por habitar o filoplano (a superfície das folhas das plantas) e/ou a rizosfera (o solo que rodeia as raízes das plantas) de uma ampla variedade de culturas importantes. Estes micro-organismos incluem bactérias, algas e fungos. De interesse particular são microorganismos tais como bactérias, por exemplo, os gêneros Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Sinorhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc e Alcaligenes. De interesse particular são tais espécies bacterianas da fitosfera, tais como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium radiobacter, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Sinorhizobium meliloti (anteriormente Rhizobium meliloti), Alcaligenes eutrophus e Azotobacter vinelandii. Ainda de interesse são fungos, especialmente levedura, por exemplo, os gêneros Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula e Aureobasidium e de particular interesse são as espécies de levedura da fitosfera, tais como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae e Aureobasidium pollulans. De particular interesse são os micro-organismos pigmentados.

[00212] Polipeptídeos de Toxina Isolados e Composições da Invenção. Os polipeptídeos de toxina inseticida Cry6Aa manipulada da invenção podem ser tratados ou preparados, por exemplo, para fazer uma composição pesticida formulada. Exemplos de composições pesticidas formuladas incluem uma composição de proteína, composição de proteína pulverizável, uma matriz de isca ou outros sistemas de distribuição. Em um exemplo, células de B.t. ou células hospedeiras recombinantes que expressam uma proteína inseticida Cry6Aa manipulada da invenção são cultivadas usando meios e métodos de fermentação convencionais na técnica. Quando de conclusão do ciclo de fermentação, os esporos de B.t. ou outras células hospedeiras recombinantes e/ou cristais de proteína inseticida do caldo de fermentação podem ser isolados por meio de métodos conhecidos na técnica. Os esporos de B.t. ou células hospedeiras recombinantes também podem ser tratados antes de serem aplicados ou formulados para aplicação às plantas. Por exemplo, esporos e/ou cristais de toxina de B.t. isolados podem ser quimicamente tratados para prolongar a atividade inseticida e, assim, incluir um polipeptídeo tratado da invenção. Métodos de cultivo de polipeptídeos pesticidas de B.t. em hospedeiros recombinantes e, então, tratamento de B.t. para prolongar a atividade pesticida são conhecidos e foram publicados. Vide, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos 4.695.462 e 4.695.455 e Gaertner et al., 1993.

[00213] A proteína inseticida Cry6Aa manipulada isolada ou tratada da presente invenção pode ser formulada em composições de grânulos sólidos finamente divididos em partículas, péletes, pós molháveis, polvilhos, suspensões ou dispersões aquosas, emulsões, pulverização, líquido concentrado ou outras formulações inseticidas. Estas formulações inseticidas são feitas ao combinar um polipeptídeo inseticida de Cry6Aa manipulado aqui com adjuvantes, diluentes, tensoativos, dispersantes, veículos inertes e outros componentes para facilitar o manuseio e aplicação para controlar uma ou mais pragas alvo. Tais ingredientes de formulação são conhecidos na técnica, bem como métodos de aplicação e métodos para determinação dos níveis de esporos de B.t. e/ou cristais de polipeptídeos de Cry6Aa modificada isolados que conferem a atividade inseticida desejada.

[00214] Métodos para Controle de Pragas de Insetos. Quando um inseto ingere uma quantidade eficaz de proteína inseticida Cry6Aa manipulada descrita aqui, a qual é distribuída através de uma composição inseticida (por exemplo, (uma) composição(ões) de proteína formulada(s), composição(ões) de proteína pulverizável(is), uma matriz de isca, expressão em planta transgênica ou outra sistema de distribuição), os resultados são, em geral, a morte do inseto ou os insetos não se alimentam da fonte que torna a proteína pesticida disponível para os insetos. O termo "distribuída" ou "distribuição" aqui se destina a incluir qualquer método de colocação ou fornecimento, sobre ou em um tecido de planta, de uma quantidade eficaz como inseticida da toxina de proteína. Isto inclui expressão de uma proteína inseticida nas células da planta ou aplicação de uma quantidade eficaz a qualquer superfície da planta.

[00215] As toxinas inseticidas de proteína em questão podem ser "aplicadas" ou fornecidas para contatar os insetos alvo através de uma variedade de maneiras. Por exemplo, a proteína inseticida Cry6Aa manipulada da invenção pode ser aplicada após ser formulada com adjuvantes, diluentes, veículos, etc., para fornecer composições na forma de sólidos finamente divididos em partículas, grânulos, péletes, pós molháveis, polvilhos, suspensões ou dispersões aquosas e emulsões. Alternativamente, o polipeptídeo inseticida de Cry6Aa manipulada pode ser distribuído por plantas transgênicas (em que a proteína é produzida por e está presente na planta) e são bem conhecidas na técnica. A expressão dos genes de toxina pode também ser obtida seletivamente em tecidos específicos da planta, tais como as raízes, folhas, etc. Isto pode ser conseguido usando promotores tecido específicos, por exemplo. Aplicações por pulverização são outro exemplo e também são conhecidas na técnica. As proteínas em questão podem ser adequadamente formuladas para o uso final pretendido e, então, pulverizadas (ou de outra forma aplicadas) sobre a planta e/ou em torno da planta/à vizinhança da planta a ser protegida - antes que uma infestação seja descoberta, após os insetos alvo serem descobertos, tanto antes quanto após e assim por diante. Grânulos de isca, por exemplo, também podem ser usados e são conhecidos na técnica.

[00216] Plantas Transgênicas. As proteínas inseticidas Cry6Aa manipuladas descritas aqui podem ser usadas para proteger praticamente qualquer tipo de planta contra danos por uma praga de insetos. Exemplos de tais plantas incluem batata, berinjela, tomate, pimenta, tabaco e outras plantas da família das solanáceas. Outros exemplos de tais plantas incluem milho, girassol, soja, algodão, canola, arroz, sorgo, trigo, cevada, vegetais, plantas ornamentais, pimentas (incluindo pimentões), beterraba sacarínica, frutos e relva, para citar apenas alguns. Métodos para transformação de plantas são bem conhecidos na técnica e métodos de transformação ilustrativos são descritos nos Exemplos.

[00217] Uma modalidade preferida da presente invenção são plantas geneticamente transformadas com genes que codificam proteínas inseticidas Cry6Aa manipuladas e variantes das mesmas. As plantas transformadas são resistentes ao ataque por uma praga de insetos alvo em virtude da presença de quantidades para controle das proteínas inseticidas ou variantes em questão nas células da planta transformada. Ao incorporar o material genético funcional que codifica uma proteína inseticida da invenção, os adultos ou larvas morrem após consumir o tecido da planta que contém as toxinas reivindicadas. Numerosos membros das classificações monocotiledônea e dicotiledônea foram transformados. Culturas agronômicas transgênicas, bem como frutas e legumes, são de interesse comercial. Tais culturas incluem, porém sem limitações, milho, arroz, soja, canola, girassol, alfafa, sorgo, trigo, algodão, amendoins, tomates, batatas e assim por diante. Um grupo mais preferido de culturas é milho, soja e algodão. A cultura mais preferida é o milho.

[00218] Há várias técnicas para a introdução de material genético estranho em células das plantas e para a obtenção de plantas que mantêm e expressam estavelmente o gene introduzido. Tais técnicas incluem a aceleração de material genético revestido sobre micropartículas diretamente em células (Patente dos Estados Unidos N° 4.945.050 e Patente dos Estados Unidos N° 5.141. 131). As plantas podem ser transformadas usando a tecnologia com Agrobacterium; vide Patente dos Estados Unidos N° 5.177.010, Paten te Europeia N° EP131624B1, Patente Europeia N° EP159418B1, Patente Europeia N° EP176112B1, Patente dos Estados Unidos N° 5.149.645 , Patente Europeia N° EP120516B1, Patente dos Estados Unidos N° 5.464.763, Patente dos Estados Unidos N° 4.693.976, Patente Eu ropeia N° EP116718B1, Patente Europeia N° EP290799B1, Patente Europeia N° EP320500B1, Patente Europeia N° EP604662B1, Patente dos Estados Unidos N° 7.060.876, Patente dos Estados Unidos N° 6.037.526, Patente dos Estados Unidos N° 6.376.234, Patente Eu ropeia N° EP292435B1, Patente dos Estados Unidos N° 5.231.019 , Patente dos Estados Unidos N° 5.463.174, Patente dos Estados Un idos N° 4.762.785, Patente dos Estados Unidos N° 5.608.142 e Patente dos Estados Unidos N° 5.159.135. Outra tecnologia de tr ansformação inclui a tecnologia WHISKERS™; vide Patente dos Estados Unidos N° 5.302.523 e Patente dos Estados Unidos N° 5.464.765 . A tecnologia de eletroporação também foi usada para transformar plantas; vide documento WO1987006614, Patente dos Estados Unidos N° 5.472.869, Patente dos Estados Unidos N° 5.384.253, documento WO199209696, Patente dos Estados Unidos N° 6.074.87 7, documento WO1993021335 e Patente dos Estados Unidos N° 5.679. 558. Além de várias tecnologias para transformação de plantas, o tipo de tecido que está em contato com os genes estranhos também pode variar. Tais tecidos podem incluir, porém sem limitações, tecido embriogênico, tecido de caule de tipo I e tipo II, hipocótilo, meristema e assim por diante. Quase todos os tecidos vegetais podem ser transformados durante desdiferenciação usando técnicas apropriadas dentro dos conhecimentos daqueles versados.

[00219] Os genes que codificam as proteínas inseticidas Cry6Aa manipuladas podem ser inseridos em células de planta usando uma variedade de métodos que são bem conhecidos na técnica, conforme descrito acima. Por exemplo, um grande número de vetores de clonagem que compreendem um marcador que permite a seleção das células microbianas transformadas e um sistema de replicação funcional em Escherichia coli estão disponíveis para a preparação e modificação de genes estranhos para inserção em plantas superiores. Tais manipulações podem incluir, por exemplo, a inserção de mutações, truncamentos, adições ou substituições, conforme desejado para o uso pretendido. Os vetores compreendem, por exemplo, pBR322, a série pUC, a série M13mp, pACYC184, etc. Consequentemente, a sequência que codifica as toxinas de proteína ou variantes da invenção podem ser inseridas no vetor em um sítio de restrição adequado. O plasmídeo resultante é usado para a transformação de E. coli, as células da qual são cultivadas em um meio nutriente adequado, então, coletadas e submetidas à lise, de modo que quantidades praticáveis do plasmídeo sejam recuperadas. Análise de sequência, análise de fragmentos de restrição, eletroforese e outros métodos biológicos bioquímicos-moleculares são, em geral, realizados como métodos de análise. Após cada manipulação, a sequência de DNA usada pode ser clivada e ligada à próxima sequência de DNA. Cada sequência de DNA manipulada pode ser clonada no mesmo ou em outros plasmídeos.

[00220] O uso de vetores que contêm T-DNA para a transformação de células de plantas tem sido intensivamente investigado e é suficientemente descrito na Patente Europeia N° EP1 20516B1; Lee e Gelvin (2008), Fraley et al. (1986) e An et al. (1985) e está bem estabelecido no campo.

[00221] Uma vez que o DNA inserido foi integrado no genoma da planta, ele é relativamente estável ao longo das gerações subsequentes. O vetor usado para transformar a célula de planta normalmente contém um gene marcador selecionável que codifica uma proteína que confere tolerância, às células de plantas transformadas, a um herbicida ou resistência a um antibiótico, tal como fosfinotricina Bialafós, canamicina, neomicina, G418, bleomicina, higromicina ou um gene que codifica a tolerância a herbicidas de glifosato, metotrexato, imidazolinonas, sulfonilureias e triazolopirimidina, tais como clorosulfuron, bromoxinil, dalapon e assim por diante. De maior interesse são genes que conferem tolerância a herbicidas tais como haloxifope, quizalofope, diclofope e assim por diante, conforme exemplificado pelos genes AAD (Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 20090093366). O gene marcador selecionável usado individualmente deverá, consequentemente, permitir a seleção de células transformadas, ao mesmo tempo em que o crescimento de células que não contêm o DNA inserido é suprimido pelo composto seletivo.

[00222] Há um grande número de técnicas disponíveis para a inserção de DNA em uma célula de planta hospedeira. Essas técnicas incluem a transformação com T-DNA distribuído por Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes como agente de transformação. Adicionalmente, a fusão de protoplastos de planta com lipossomas que contêm o DNA a ser distribuído, injeção direta do DNA, transformação biolística (bombardeamento com micropartículas) ou eletroporação, bem como outros métodos possíveis, podem ser empregados.

[00223] Em uma modalidade preferida da presente invenção, as plantas serão transformadas com genes em que o uso de códon da região codificadora da proteína foi otimizado para plantas. Vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 5.380.831. P or exemplo, uma toxina inseticida Cry6Aa manipulada da invenção pode ser otimizada para a expressão em uma dicotiledônea, tal como batata, berinjela, tomate, pimenta, tabaco ou outras plantas da família das solanáceas. A toxina inseticida Cry6Aa manipulada da invenção também pode ser otimizada para expressão em outras dicotiledôneas, tais como soja e algodão, ou monocotiledôneas, tal como Zea mays (milho). Além disso, vantajosamente, podem ser usadas plantas que codificam uma toxina truncada. A toxina truncada codificará, tipicamente, cerca de 55% a cerca de 80% da toxina de comprimento completo. Métodos para criação de genes de B.t. sintéticos para uso em plantas são conhecidos na técnica (Stewart, 2007).

[00224] Independentemente da técnica de transformação, o gene é, de preferência, incorporado em um vetor de transferência de gene adaptado para expressar os genes de toxina inseticida de B.t. e variantes na célula de planta por meio de inclusão, no vetor, de um promotor de planta. Além de promotores de planta, promotores de uma variedade de fontes podem ser usados de forma eficiente em células de plantas para expressar genes estranhos. Por exemplo, promotores de origem bacteriana, tais como o promotor de octopina sintetase, o promotor de nopalina sintetase, o promotor de manopina sintase; promotores de origem viral, tais como os promotores 35S e 19S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) e assim por diante podem ser usados. Promotores derivados de plantas incluem, porém sem limitações, ribulose-1,6-bifosfato (RUBP), a pequena subunidade de carboxilase (ssu), o promotor de beta-conglicinina, o promotor de faseolina, o promotor de ADH (álcool desidrogenase), promotores de choque térmico, o promotor de ADF ( fator de despolimerização de actina) e promotores tecido específicos. Os promotores também podem conter determinados elementos de sequência intensificadores que podem aprimorar a eficiência de transcrição. Intensificadores típicos incluem, porém sem limitações, o íntron 1 de ADH1 e o íntron 6 de ADH1. Promotores constitutivos podem ser usados. Promotores constitutivos controlam a expressão genética contínua em quase todos os tipos de células quase todas as vezes (por exemplo, actina, ubiquitina, CaMV 35S). Promotores tecido específicos são responsáveis pela expressão de genes em tipos de células ou tecidos específicos, tais como folhas ou sementes (por exemplo, zeína, oleosina, napina, ACP (Proteína Transportadora de Acila)), e estes promotores também podem ser usados. Também podem ser usados promotores que são ativos durante um determinado estágio de desenvolvimento das plantas, bem como ativos em tecidos e órgãos de planta específicos. Exemplos de tais promotores incluem, porém sem limitações, promotores que são específicos para raiz, específicos para pólen, específicos para embriões, específicos para seda de milho, específicos para fibra de algodão, específicos para endosperma de semente, específicos para floema e assim por diante.

[00225] Sob determinadas circunstâncias, pode ser desejável usar um promotor indutível. Um promotor indutível é responsável pela expressão de genes em resposta a um sinal específico, tais como: estímulos físicos (por exemplo, genes de choque térmico); luz (por exemplo, RUBP carboxilase); hormônios (por exemplo, glucocorticoides); antibióticos (por exemplo, tetraciclina); metabólitos; e estresse (por exemplo, estiagem). Outros elementos de transcrição e tradução desejáveis que funcionam em plantas podem ser usados, tais como sequências líderes 5' não traduzidas, sequências de término de transcrição de RNA e sequências sinalizadoras de adição de poliadenilato. Numerosos vetores de transferência de genes específicos para plantas são conhecidos na técnica.

[00226] Pragas Alvo. As proteínas inseticidas Cry6Aa manipuladas da invenção são particularmente adequadas para uso no controle de pragas de insetos. Coleópteros são um grupo importante pragas agrícolas, hortícolas e domésticas que causam uma grande quantidade de dano a cada ano. Este grande ordem de insetos abrange larvas e adultos que se alimentam de folhas e raízes incluindo, por exemplo, membros das famílias de insetos Chrysomelidae, Coccinellidae, Curculionidae, Dermestidae, Elateridae, Scarabaeidae, Scolytidae e Tenebrionidae. Incluídos dentro destas famílias estão os besouros das folhas e brocas das folhas na família Chrysomelidae, besouros da batata (por exemplo, o besouro da batata do Colorado (Leptinotarsa decemlineata Say), colaspis da uva (Colaspis brunnea Fabricius), besouro da folha de cereais (Oulema melanopus Linnaeus), besouro do girassol (Zygogramma exclamationis Fabricius) e besouros da família Coccinellidae (por exemplo, besouro do feijão Mexicano (Epilachna varivestis Mulsant)). Outros exemplos são percevejos e outros besouros da família Scarabaeidae (por exemplo, besouro Japonês (Popillia japonica Newman), percevejo mascarado do Norte (larva branca, Cyclocephala borealis Arrow), percevejo mascarado do Sul (larva branca, Cyclocephala immaculata Olivier), percevejo Europeu (Rhizotrogus majalis Razoumowsky), larva branca (Phyllophaga crinita Burmeister), besouro da cenoura (Ligyrus gibbosus Geer) e percevejos dos gêneros Holotrichia spp. e Melolontha spp.). Outros exemplos de insetos coleópteros são gorgulhos (por exemplo, gorgulho do algodão (Anthonomus grandis Boheman), gorgulho do arroz (Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel), gorgulho do celeiro (Sitophilus grananus Linnaeus), gorgulho do arroz (Sitophilus oryzae Linnaeus) e gorgulho da folhas do trevo (Hypera punctata Fabricius)). Também estão incluídos o escaravelho do milho (Sphenophorus maidis Chittenden), besouros saltadores (por exemplo, besouro saltador do milho (Chaetocnema pulicara Melsheimer) e besouro saltador das crucíferas (Phyllotreta cruciferae Goeze)), besouro manchado do pepino (Diabrotica undecimpunctata) e lagartas da raiz (por exemplo, lagarta da raiz do milho Ocidental (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), lagarta da raiz do milho do Norte (Diabrotica barben Smith & Lawrence), lagarta da raiz do milho do Sul (Diabrotica undecimpunctata howardi Barber), lagarta da raiz do milho Mexicano (D. virgifera zeae Krysan e Smith), D. balteata LeConte, D. tenella undecimpunctata, D. speciosa Germar e D. u. undecimpunctata Mannerheim). Outros exemplos de pragas de coleópteros são besouros da família Rutelinae (percevejos brilhantes da folha), tal como o gênero Anomala (incluindo A. marginata, A. lucicola, A. oblivia e A. orientalis). Insetos coleópteros adicionais são besouros do tapete da família Dermestidae, brocas da família Elateridae (por exemplo, Melanotus spp., Conoderus spp., Limonius spp., Agriotes spp., Ctenicera spp., Aeolus spp.)), besouros da casca da família Scolytidae e besouros da família Tenebrionidae (por exemplo, Eleodes spp.). Qualquer gênero listado acima (e outros) também pode, em geral, ser objetivado como uma parte da presente invenção pelas composições inseticidas que incluem o polipeptídeo inseticida de Cry6Aa manipulada individualmente ou em combinação com outro agente inseticida. Quaisquer insetos adicionais em qualquer um destes gêneros (como alvos) também estão incluídos dentro do âmbito da presente invenção.

[00227] É contemplado o uso de proteínas inseticidas Cry6Aa manipuladas para controlar pragas de coleópteros de plantas de cultura. Em algumas modalidades, as proteínas Cry podem ser economicamente implantadas para o controle de pragas de insetos que incluem, porém sem limitações, por exemplo, lagartas da raiz, tais como a lagarta da raiz do milho Ocidental (Diabrotica virgifera virgifera LeConte), lagarta da raiz do milho do Norte (Diabrotica barberi Smith & Lawrence), lagarta da raiz do milho do Sul (Diabrotica undecimpunctata howardi Barber), lagarta da raiz do milho Mexicano (D. virgifera zeae Krysan e Smith), D. balteata LeConte, D. undecimpunctata tenella, D. speciosa Germar e D. u. undecimpunctata Mannerheim e larvas tais como as larvas de Cyclocephala borealis (percevejo mascarado do Norte), Cyclocephala imaculada (percevejo mascarado do Sul) e Popillia japonica (besouro Japonês).

[00228] Lepidópteros são outro grupo importante de pragas agrícolas, hortícolas e domésticas que causam uma grande quantidade de dano a cada ano. A invenção estabelece o uso de proteínas inseticidas Cry6Aa manipuladas em combinação com outros inseticidas para controlar pragas de insetos dentro desta ordem. Esta ordem de insetos abrange larvas e adultos que se alimentam das folhas e raízes incluindo, por exemplo, membros das famílias de insetos Arctiidae, Gelechiidae, Geometridae, Lasiocampidae, Lymantriidae, Noctuidae, Pyralidae, Sesiidae, Sphingidae, Tineidae e Tortricidae. Pragas de insetos lepidópteros incluem, porém sem limitações: Achoroia grisella, Acleris gloverana, Acleris variana, Adoxophyes orana, Agrotis ipsilon (lagarta negra), Alabama argillacea, Alsophila pometaria, Amyelois transitella, Anagasta kuehniella, Anarsia lineatella, Anisota senatoria, Antheraea pernyi, Anticarsia gemmatalis, Archips sp., Argyrotaenia sp., Athetis mindara, Bombyx mori, Bucculatrix thurberiella, Cadra cautella, Choristoneura sp., Cochylls hospes, Colias eurytheme, Corcyra cephalonica, Cydia latiferreanus, Cydia pomonella, Datana integerrima, Dendrolimus sibericus, Desmia feneralis, Diaphania hyalinata, Diaphania nitidalis, Diatraea grandiosella (broca do milho do Sudeste), Diatraea saccharalis (broca da cana-de-açúcar), Ennomos subsignaria, Eoreuma loftini, Esphestia elutella, Erannis tilaria, Estigmene acrea, Eulia salubricola, Eupocoellia ambiguella, Eupoecilia ambiguella, Euproctis chrysorrhoea, Euxoa messoria, Galleria mellonella, Grapholita molesta, Harrisina americana, Helicoverpa subflexa, Helicoverpa zea (lagarta da espiga de milho), Heliothis virescens (lagarta do tabaco), Hemileuca oliviae, Homoeosoma electellum, Hyphantia cunea, Keiferia lycopersicella, Lambdina fiscellaria, Lambdina fiscellaria lugubrosa, Leucoma salicis, Lobesia botrana, Loxagrotis albicosta (lagarta do feijão Ocidental), Loxostege sticticalis, Lymantria dispar, Macalla thyrisalis, Malacosoma sp., Mamestra brassicae, Mamestra configurata, Manduca quinquemaculata, Manduca sexta, Maruca testulalis, Melanchra picta, Operophtera brumata, Orgyia sp., Ostrinia nubilalis (broca do milho Europeu), Paleacrita vernata, Papiapema nebris (broca comum do caule), Papilio cresphontes, Pectinophora gossypiella, Phryganidia californica, Phyllonorycter blancardella, Pieris napi, Pieris rapae, Plathypena scabra, Platynota flouendana, Platynota stultana, Platyptilia carduidactyla, Plodia interpunctella, Plutella xylostella (traça diamantenegro), Pontia protodice, Pseudaletia unipuncta (lagarta do cartucho), Pseudoplasia includens, Sabulodes aegrotata, Schizura concinna, Sitotroga cerealella, Spilonta ocellana, Spodoptera frugiperda (lagarta do cartucho), Spodoptera exigua (lagarta da beterraba), Thaurnstopoea pityocampa, Ensola bisselliella, Trichoplusia ni, (lagarta verde da couve), Udea rubigalis, Xylomyges curiails e Yponomeuta padella.

[00229] Também é contemplado o uso das proteínas inseticidas Cry6Aa concebidas para controlar nematoides parasitas incluindo, porém sem limitações, nematoide da raiz (Meloidogyne incognita) e nematoide do cisto de soja (Heterodera glycines).

[00230] Anticorpos Antitoxina. Anticorpos às toxinas descritas aqui, ou toxinas equivalentes, ou fragmentos destas toxinas, podem ser prontamente preparados usando procedimentos convencionais na técnica. Tais anticorpos são úteis para purificar ou detectar a presença das toxinas Cry6Aa manipuladas.

[00231] Uma vez que a proteína inseticida de B.t. foi isolada, anticorpos específicos para a proteína podem ser estimulados por meio de métodos convencionais que são bem conhecidos na técnica. Injeções repetidas em um hospedeiro de escolha ao longo de um período de semanas ou meses provocará uma resposta imune e resultará em titulações séricas significativas antitoxina de B.t. Os hospedeiros preferidos são espécies de mamíferos e espécies mais altamente preferidas são coelhos, cabras, ovelhas e camundongos. O sangue tirado de tais animais imunizados pode ser processado através de métodos estabelecidos para obter antissoro (anticorpos policlonais) reativo com a toxina inseticida de B.t. O antissoro pode, então, ser purificado por afinidade através de adsorção da toxina de acordo com métodos conhecidos na técnica. O antissoro purificado por afinidade pode ser adicionalmente purificado por meio de isolamento da fração de imunoglobulina dentro do antissoro usando procedimentos conhecidos na técnica. O material resultante será uma população heterogênea de imunoglobulinas reativas com a toxina inseticida de B.t.

[00232] Anticorpos antitoxina de B.t. também podem ser gerados preparando um imunogênio semissintético que consiste em um fragmento peptídico sintético da toxina inseticida de B.t. conjugado com um veículo imunogênico. Inúmeros esquemas e instrumentos úteis para produzir fragmentos peptídicos são bem conhecidos na técnica. Muitos veículos imunogênicos adequados, tais como albumina de soro bovino ou hemocianina do molusco Crepidula fornicata, são bem conhecidos na técnica, bem como técnicas para acoplamento do imunogênio e das proteínas veículo. Uma vez que o imunogênio semissintético tenha sido construído, o procedimento para produzir anticorpos específicos para o fragmento de toxina inseticida de B.t. é idêntico àqueles usados para produzir anticorpos reativos com a toxina de B.t. natural.

[00233] Anticorpos monoclonais antitoxina de B.t. (mAbs) são prontamente preparados usando proteína inseticida de B.t. purificada. Métodos para a produção de MAbs têm sido praticados há mais de 20 anos e são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Injeções intraperitoneais ou subcutâneas repetidas de proteína inseticida de B.t. purificada em adjuvante estimularão uma resposta imune na maioria dos animais. Linfócitos B hiperimunizados são removidos do animal e fundidos com uma linhagem de células parceira de fusão adequada capaz de ser cultivada indefinidamente. Animais preferidos cujos linfócitos B podem ser hiperimunizados e usados na produção de mAbs são mamíferos. Animais mais preferidos são ratos e camundongos e mais preferido é o gênero de camundongo BALB/c.

[00234] Numerosas linhagens de células de mamíferos são parceiros de fusão adequados para a produção de hibridomas. Muitas destas linhagens estão disponíveis a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e fornecedores comerciais. Linhagens de células de parceiros de fusão preferidas são derivadas de mielomas de camundongo e a linhagem de células de mieloma HL1® Friendly (Ventrex, Portland, ME) é mais preferida. Uma vez fundidos, os hibridomas resultantes são cultivados em um meio de crescimento seletivo durante uma a duas semanas. Dois sistemas de seleção bem conhecidos estão disponíveis para eliminação de células de mieloma não fundidas, ou fusões entre células de mieloma, a partir da cultura de hibridoma mista. A escolha do sistema de seleção depende do gênero de camundongo imunizado e do parceiro de fusão de mieloma usado. O sistema de seleção AAT, descrito por Taggart e Samloff (1983), pode ser usado; no entanto, o sistema de seleção HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina), descrito por Littlefield (1964), é preferido em virtude de sua compatibilidade com o gênero de camundongo e parceiro de fusão preferido mencionados acima. O meio de crescimento consumido é, então, rastreada quanto à secreção do MAb imunoespecífico. Procedimentos de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) são melhor adequados para esta finalidade; porém, radioimunoensaios adaptados para grande volume de rastreio também são aceitáveis. Vários ensaios concebidos para rastrear consecutivamente um número considerável de culturas irrelevantes ou menos desejadas podem ser realizados. Culturas que secretam MAbs reativos com a toxina inseticida de B.t. podem ser rastreadas quanto à reatividade cruzada com toxinas inseticidas de B.t. conhecidas. O isotipo de MAbs que se ligam preferencialmente à toxina inseticida de B.t. preferida pode ser determinado usando ensaios comercialmente disponíveis. MAbs preferidos são da classe IgG e MAbs mais altamente preferidos são aqueles dos subisotipos IgG1 e IgG2a.

[00235] Culturas de hibridoma que secretam MAbs preferidos podem ser subclonadas diversas vezes para estabelecer a monoclonalidade e estabilidade. Métodos bem conhecidos para subclonagem de culturas de células não aderentes eucariotas incluem diluição limitativa, técnicas de separação de células ativada por fluorescência e agarose macio. Após cada subclonagem, as culturas resultantes são, de preferência, novamente ensaiadas quanto à secreção de anticorpos e isotipo para garantir que uma cultura que secretam um MAb estável preferido foi estabelecida.

[00236] Os anticorpos antitoxina de B.t. são úteis em vários métodos para detectar a toxina inseticida de B.t. reivindicada da presente invenção e variantes ou fragmentos dos mesmos. É bem sabido que anticorpos marcados com um grupo repórter podem ser usados para identificar a presença de antígenos em uma variedade de meios. Anticorpos marcados com radioisótopos têm sido usados ao longo de décadas em radioimunoensaios para identificar, com grande precisão e sensibilidade, a presença de antígenos em uma variedade de fluidos biológicos. Mais recentemente, anticorpos marcados com enzimas têm sido usados como um substituto para anticorpos radiomarcados no ensaio ELISA. Além disso, os anticorpos imunorreativos com a toxina inseticida de B.t. da presente invenção podem ser ligados a uma substância de imobilização, tal como uma cavidade ou partículas de poliestireno, e usados em imunoensaios para determinar se a toxina de B.t. está presente em uma amostra de teste.

[00237] Detecção Usando Sondas. Um outro método para identificar os polipeptídeos e genes da presente invenção é usando sondas de oligonucleotídeos. Estas sondas são sequências de nucleotídeos detectáveis. Estas sequências podem ser tornadas detectáveis em virtude de um marcador radioativo apropriado ou podem ser tornadas inerentemente fluorescentes, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos N° 6.268.132. Conform e é bem conhecido na técnica, se a molécula de sonda e a amostra de ácido nucleico hibridizam por meio de formação de ligações de emparelhamento de base fortes entre as duas moléculas, pode ser razoável presumir que a sonda e a amostra têm homologia de sequência substancial. De preferência, a hibridização é realizada sob condições rigorosas, por meio de métodos bem conhecidos na técnica conforme descrito, por exemplo, em Keller e Manak (1993). A detecção da sonda constitui um meio para determinar, de uma forma conhecida, se a hibridização ocorreu. Tal análise de sonda constitui um método rápido para a identificação de genes que codificam as toxinas da presente invenção. Os segmentos de nucleotídeos que são usados como sondas de acordo com a invenção podem ser sintetizados usando um sintetizador de DNA e procedimentos convencionais. Estas sequências de nucleotídeos também podem ser usadas como iniciadores de PCR para amplificar os genes da presente invenção.

[00238] Hibridização. Conforme é bem conhecido por aqueles versados em biologia molecular, a similaridade de dois ácidos nucleicos pode ser caracterizada por sua tendência de hibridizar. Conforme usado aqui, os termos "condições rigorosas" ou "condições de hibridização rigorosas" se destinam referir-se a condições sob as quais uma sonda hibridizará (recozimento) à sua sequência alvo em um grau detectavelmente maior do que outras sequências (por exemplo, pelo menos 2 vezes em relação à base). Condições rigorosas são dependentes da sequência e serão diferentes em diferentes circunstâncias. Ao controlar o rigor da hibridização e/ou condições de lavagem, sequências alvo que são 100% complementares à sonda podem ser identificadas (hibridização homóloga). Alternativamente, condições rigorosas podem ser ajustadas para permitir alguma incompatibilidade nas sequências, de modo que menores graus de similaridade sejam detectados (hibridização heteróloga). Em geral, uma sonda tem menos do que cerca de 1000 nucleotídeos de comprimento, de preferência menos do que 500 nucleotídeos de comprimento.

[00239] Tipicamente, condições rigorosas serão aquelas nas quais a concentração de sal é íons de Na a menos do que cerca de 1,5 M, tipicamente uma concentração de íons de Na (ou outros sais) de cerca de 0,01 a 1,0 M em um pH de 7,0 a um pH de 8,3 e a temperatura é pelo menos cerca de 30 °C para sondas curtas (por e xemplo 10 a 50 nucleotídeos) e pelo menos cerca de 60 °C para sond as longas (por exemplo, mais do que 50 nucleotídeos). As condições rigorosas também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores, tal como formamida. Exemplos de condições de baixo rigor incluem hibridização com uma solução tampão de formamida a 30% a 35%, NaCl a 1M, SDS (dodecilsulfato de sódio) a 1% a 37 °C e uma lavagem em 1X a 2X SSC (20X SSC = NaCl a 3,0 M/citrato trissódico a 0,3 M) a 50 °C a 55 °C. Cond ições de rigor moderado exemplificativas incluem hibridização em formamida a 40% a 45%, NaCl a 1,0 M, SDS a 1% a 37 °C e uma lavagem em 0,5X a 1X SSC a 55 °C a 60 °C. Exemplos de condições de rigor elevado incluem hibridização em formamida a 50%, NaCl a 1 M, SDS a 1% a 37 °C e uma lavagem em 0,1X SSC a 60 °C a 65 °C. Opcionalme nte, os tampões de lavagem podem compreender SDS a cerca de 0,1% a cerca de 1%. A duração de hibridização é, em geral, menos do que cerca de 24 horas, usualmente cerca de 4 a cerca de 12 horas.

[00240] A especificidade é, tipicamente, a função de lavagens póshibridização, os fatores críticos sendo a temperatura e força iônica da solução de lavagem final. Para híbridos de DNA/DNA, o ponto de fusão térmica (Tm) é a temperatura (sob força iônica e pH definidos) na qual 50% de uma sequência alvo complementar hibridiza com uma sonda perfeitamente correspondente. A Tm é reduzida em cerca de 1°C para cada 1% de incompatibilidade; assim, a T m, condições de hibridização e/ou condições de lavagem podem ser ajustadas para facilitar a hibridização de sequências da identidade desejada. Por exemplo, se sequências com > 90% de identidade são procuradas, a Tm pode ser diminuída 10 °C. Em geral, condições rigo rosas são selecionadas para serem cerca de 5 °C menor do que a Tm para a sequência específica e seu complemente em uma força iônica e pH definidos. No entanto, condições altamente rigorosas podem usar uma hibridização e/ou lavagem a 1 °C, 2 °C, 3 °C ou 4 ° C menor do que a Tm; condições moderadamente rigorosas podem usar uma hibridização e/ou lavagem a 6 °C, 7 °C, 8 °C, 9 °C ou 10 °C meno r do que a Tm e condições de baixo rigor podem usar uma hibridização e/ou lavagem a 11 °C, 12 °C, 13 °C, 14 °C, 15 °C ou 20 °C menor do que a Tm.

[00241] A Tm (em °C) pode ser determinada experimentalmente ou pode ser aproximada por cálculo. Para híbridos de DNA-DNA, a Tm pode ser aproximada a partir da equação de Meinkoth e Wahl (1984):

[00242] Tm(°C) = 81,5 °C + 16,6(log M) + 0,41(%GC) - 0,61(% formamida) - 500/L

[00243] onde M é a molaridade dos cátions monovalentes, % GC é a percentagem de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA, % de formamida é a percentagem de formamida na solução de hibridação (peso/v) e L é o comprimento do híbrido em base de pares. Alternativamente, a Tm é descrita pela fórmula (Beltz et al., 1983) a seguir:
Tm(°C) = 81,5 °C + 16,6(log[Na+]) + 0,41(%GC) - 0,6 1(% formamida) - 600/L

[00244] onde [Na+] é a molaridade dos íons de sódio, % GC é a percentagem de nucleotídeos de guanosina e citosina no DNA ,% de formamida é a percentagem de formamida na solução de hibridização (peso:v) e L é o comprimento do híbrido em pares de bases.

[00245] Usando as equações, composições de hibridização e lavagem e a Tm desejadas, aqueles versados na técnica entenderão que variações no rigor de hibridização e/ou soluções de lavagem são inerentemente descritas. Se o grau desejado de incompatibilidade resulta em uma Tm de menos do que 45 °C (solução aquosa) ou a 32°C (solução de formamida), é preferível aumentar a concentração de SSC de modo que uma temperatura mais alta possa ser usada. Um guia extensivo para hibridização de ácidos nucleicos pode ser encontrado em Tijssen (1993) e Ausubel et al. (1995). Vide também Sambrook et al. (1989).

[00246] A hibridização de DNA imobilizado sobre Southern blots com sondas específicas para o gene radioativamente marcado pode ser realizada por meio de métodos convencionais (Sambrook et al., supra). Isótopos radioativos usados para marcação de sondas de polinucleotídeo podem incluir 32P, 33P, 14C ou 3H. A incorporação de isótopos radioativos em moléculas de sonda de polinucleotídeo pode ser feita através de qualquer um de vários métodos bem conhecidos por aqueles versados no campo de biologia molecular (vide, por exemplo, Sambrook et al., supra). Em geral, a hibridização e lavagens subsequentes podem ser realizadas sob condições rigorosas que permitam a detecção de sequências alvo com homologia aos genes codificadores de proteína inseticida reivindicados. Para sondas de gene de DNA fita dupla, a hibridização pode ser realizada durante a noite a 20 °C a 25 °C abaixo da T m do híbrido de DNA em 6X SSPE, 5X solução de Denhardt, SDS a 0,1%, 0,1 mg de DNA desnaturado/mL (20X SSPE é NaCl a 3 M, NaHPO4 a 0,2 M e EDTA a 0,02 M (sal de sódio de ácido etileno diamina tetra acético); 100X solução de Denhardt é 20 g/L de polivinilpirrolidona, 20 g/L de Ficoll tipo 400 e de 20 g/L de albumina de soro bovino (fração V)).

[00247] As lavagens são, tipicamente, realizadas como segue:

[00248] - duas vezes em temperatura ambiente durante 15 minutos em 1X SSPE, SDS a 0,1% (lavagem de baixo rigor)

[00249] - uma vez na Tm - 20 °C durante 15 minutos em 0,2X SSPE, SDS a 0,1% (lavagem de rigor moderado).

[00250] Para sondas de oligonucleotídeos, a hibridização pode ser realizada durante a noite a 10 °C a 20 °C abaixo da Tm do híbrido em 6X SSPE, 5X solução de Denhardt, SDS a 0,1%, 0,1 mg/ml de DNA desnaturado. A Tm para sondas de oligonucleotídeos pode ser determinada por meio da fórmula a seguir (Suggs et al., 1981):

[00251] Tm (°C) = 2 (número de pares de bases T/A) + 4 (númer o de pares de base G/C)

[00252] As lavagens são, tipicamente, realizadas como segue:

[00253] - duas vezes em temperatura ambiente durante 15 minutos, 1X SSPE, SDS a 0,1% (lavagem de baixo rigor)

[00254] - uma vez na temperatura de hibridização durante 15 minutos em 1X SSPE, SDS a 0,1% (lavagem de rigor moderado).

[00255] As moléculas de sonda para hibridização e moléculas híbridas formadas entre as moléculas de sonda e o alvo podem ser tornadas detectáveis através de outros meios que não marcação radioativa. Tais métodos alternativos se destinam a estar dentro do âmbito da presente invenção.

[00256] Ao usar o termo "material genético" aqui, entenda-se como incluindo todos os genes, ácidos nucleicos, DNA e RNA. O termo "dsRNA" se refere a RNA fita dupla. Para designações de resíduos de nucleotídeos de polinucleotídeos, DNA, RNA, oligonucleotídeos e iniciadores e para denominações de resíduos de aminoácidos de proteínas, as abreviaturas convencionais da IUPAC são empregadas ao longo deste documento. As sequências de ácidos nucleicos são apresentadas na direção convencional de 5' para 3' e as sequências de proteína são apresentadas na direção convencional do amino término (N) para o carbóxi término (C).

[00257] A menos que especificamente indicado ou implícito, os termos "um", "uma", "o" e "a" significam "pelo menos um(a)", conforme usado aqui.

[00258] Todas as percentagens são em peso e todas as proporções das misturas de solventes são em volume, a menos que indicado de outra maneira. Todas as temperaturas estão em graus Celsius.

[00259] Todas as Patentes, Pedidos de Patentes, Pedidos Provisórios e Publicações mencionados ou citados aqui são incorporados por referência na íntegra, na medida em que não sejam incompatíveis com os ensinamentos explícitos do presente relatório descritivo.

[00260] Deverá ser entendido que os exemplos e modalidades descritos aqui são apenas para fins ilustrativos e que várias modificações ou alterações à luz dos mesmos serão sugeridas para aqueles versados na técnica e devem ser incluídas dentro do espírito e alcance do presente Pedido de Patente e no âmbito das reivindicações anexas. Estes exemplos não devem ser interpretados como limitativos.

EXEMPLO 1 Transformação de DIG-177 (Cry6Aa de tipo selvagem) com peptídeos de trânsito em milho

[00261] Concepção de uma versão otimizada para planta da sequência codificadora para o polipeptídeo inseticida de B.t. Aqueles versados na técnica de biologia molecular de plantas entenderão que várias sequências de DNA podem ser concebidas para codificar uma única sequência de aminoácidos. Um meio comum para aumentar a expressão de uma região codificadora para uma proteína de interesse é configurar a região codificadora, de modo que sua composição de códons se assemelhe à composição global de códons do hospedeiro no qual o gene se destina a ser expresso. Orientações em relação à concepção e produção de genes sintéticos pode ser encontrada, por exemplo, no documento WO1997013402, Patente dos Estados Unidos N° 6.166.302 e Patente d os Estados Unidos N° 5.380.831.

[00262] Uma sequência de DNA que tem uma tendência para códon de milho foi concebida e sintetizada para produzir uma proteína inseticida DIG-177 em plantas monocotiledôneas transgênicas (SEQ ID NO: 2). Uma tabela de uso de códons para milho (Zea mays L.) foi calculada a partir de centenas de sequências codificadoras de proteínas obtidas a partir de sequências depositadas no GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov). Um conjunto de códons de milho reescalonado foi calculado após omitir qualquer códon sinônimo usado menos do que cerca de 10% do total de usos de códon para este aminoácido.

[00263] Para derivar uma sequência de DNA de milho com códons otimizados que codifica a proteína DIG-177, variantes ou quimeras de proteínas inseticidas DIG-177, ou fragmentos inseticidas das mesmas, são o objeto de substituições de códon na sequência de DNA de DIG177 (nativa) experimentalmente determinada (SEQ ID NO: 1) que codifica a proteína pesticida, de modo que a sequência de DNA resultante tivesse a composição global de códons da tabela de tendência de códons otimizados para milho. Refinamentos das sequências foram feitos para eliminar os sítios de reconhecimento de enzimas de restrição indesejáveis, potenciais sítios de splicing de íntrons de planta, trechos longos de resíduos de A/T ou C/G e outros motivos que possam interferir com a estabilidade do mRNA, transcrição ou tradução da região codificadora em células de planta. Outras alterações foram feitas para introduzir sítios de reconhecimento de enzimas de restrição desejados e eliminar Quadros de Leitura Aberta internos longos (outros quadros que não +1). Estas alterações foram todas feitas dentro das limitações de retenção da composição de códons re-escalonada com tendência para o milho. Uma sequência de DNA otimizada para milho que codifica polipeptídeo DIG-177 é descrita como SEQ ID NO: 3.

[00264] Concepção de Construto e Lista de Plasmídeo. Todos os construtos foram concebidos para transformação nuclear, transcrição nuclear e tradução citosólica convencionais. O promotor de ubiquitina de milho e regiões não traduzidas 3' de peroxidase de milho foram usados para regular as regiões codificadoras de DIG-177. Seleção de herbicida foi conferida pelo gene AAD-1 (Wright et al. 2010) sob o controle do promotor do vírus baciliforme de cana-deaçúcar com um líder de vírus da listra do milho e íntron de álcool desidrogenase; a região não traduzida 3' era do gene de lipase do milho. Sete compartimentos subcelulares diferentes foram testados quanto ao acúmulo de DIG-177. Um resumo dos peptídeos de trânsito usados é mostrado na Tabela 2. Com exceção do apoplasto, múltiplos peptídeos de trânsito foram testados para cada compartimento. O códon de metionina inicial de DIG-177 nativo foi removido para peptídeos de trânsito amino terminais. Os peptídeos de trânsito foram ajustados para refletir uma tendência de códons similar à região codificadora de DIG-177.

Tabela 2 Resumo dos plasmídeos, as regiões codificadoras e peptídeos de trânsito

[00265] (N denota a localização amino terminal; C indica a localização carbóxi terminal)

[00266] Design Experimental de T0 e T1. Uma meta de vinte e cinco eventos transgênicos por construto foi definida, com quinze sendo baixa cópia. Todos os eventos foram analisados quanto ao número de cópias de inserto e acúmulo foliar de DIG-177 por LC/MS/MS. Os eventos de baixa cópia foram postos de lado, os não expressadores descartados e os expressadores levados para a produção de semente T1. Isto garantiu a recuperação de eventos parcialmente eficazes os quais poderiam ser perdidos no bioensaios de T0. Eventos que expressam múltiplas cópias foram bioensaiados no estágio T0; aqueles que passaram foram guardados para a produção de semente T1 e posterior análise. As sementes T1 foram plantadas, as plantas analisadas quanto à proteína (LC/MS/MS e Western blot) tanto em tecidos foliares quanto da raiz, cinco irmãos foram testadas no bioensaio.

[00267] Início de cultura de Agrobacterium. As cepas de Agrobacterium tumefaciens contendo os construtos de transformação de plantas DIG-177 (Tabela 2) foram obtidas a partir do DAS Recombinant Culture Collection. As culturas foram colocadas, a partir de estoques de glicerol, sobre meio mínimo para Agrobacterium e incubadas a 20 °C no escuro durante 3 dias. As cult uras de Agrobacterium foram, então, colocadas sobre uma placa de meio YEP e incubadas a 20 °C no escuro durante 1 dia.

[00268] No dia do experimento, uma mistura de meio de inoculação e acetossiringona foi preparada em um volume adequado para o número de construtos no experimento. Uma solução de estoque de acetossiringona a 1 M em sulfóxido de dimetila a 100% foi adicionada ao frasco contendo o meio de inoculação em um volume apropriado para fazer uma concentração final de acetossiringona de 200 µM.

[00269] Para cada constructo, 1-2 loops de Agrobacterium a partir da placa de YEP foram suspensos em 15 ml da mistura de meio de inoculação/acetossiringona dentro de um tubo para centrífuga de 50 ml estéril e descartável e a densidade óptica da solução a 600 nm (OD600) foi medida em um espectrofotômetro. A suspensão foi, então, diluída para baixo da 0,25-0,35 OD600 usando mais mistura de meio de inoculação/acetossiringona. O tubo de suspensão de Agrobacterium foi, então, colocado horizontalmente sobre um conjunto de plataforma de agitação a 75 rpm em temperatura ambiente durante entre 1 e 4 horas antes de uso.

[00270] Esterilização de Espiga e Isolamento de Embriões. Espigas de Zea mays cultivar B104 foram produzidas em instalações de estufa e colhidas 10-12 dias após a polinização. As espigas colhidas foram descascadas e a superfície esterilizada por imersão em uma solução a 20% de alvejante comercial (Ultra Clorox® Germicidal Bleach, hipoclorito de sódio a 6,15%) e duas gotas de sabão, durante 20 minutos, seguido por três lavagens em água deionizada estéril dentro de uma coifa de fluxo laminar. Embriões zigóticos imaturos (1,8- 2,2 mm de comprimento) foram assepticamente excisados de cada espiga e distribuídos em um ou mais tubos para microcentrífuga contendo 2,0 ml de suspensão de Agrobacterium na qual 2 mL de tensoativo Break-Thru® S233 a 10% tinham sido adicionados.

[00271] Cocultura de Agrobacterium. Quando de término da atividade de isolamento de embrião, o tubo de embriões foi fechado e colocado sobre uma plataforma oscilante durante 5 minutos. O conteúdo do tubo foi, então, vertido sobre uma placa de meio de cocultura e a suspensão líquida de Agrobacterium foi removida com uma pipeta de transferência de solução estéril descartável. A placa de cocultura contendo embriões foi colocada na parte de trás da coifa de fluxo laminar com a tampa entreaberta durante 30 minutos; após o que, os embriões foram orientados com o escutelo voltado para cima usando um microscópio. A placa de cocultura com embriões foi, então, retornada para a parte de trás da coifa de fluxo laminar com a tampa entreaberta durante mais 15 minutos. A placa foi, então, fechada, selada com fita adesiva 3M Micropore™ e colocada em uma incubadora a 25 °C com 24 horas/luz do dia a aproxi madamente 60 µmol m-2 s-1 de radiação fotossinteticamente ativa (Photosynthetically Active Radiation - PAR).

[00272] Seleção de Caule e Regeneração de Eventos Transgênicos. Após o período de cocultura, os embriões foram transferidos para meio de descanso. Não mais do que 36 embriões foram transferidos para cada placa. As placas foram incubadas a 27 °C com 24 horas/luz do dia a aproximadamente 50 µmol m-2 s-1PAR durante 7-10 dias. Os embriões com caule foram, então, transferidos para meio de Seleção I. As placas foram incubadas a 27 °C com 24 horas/luz do dia a aproximadamente 50 µmol m-2 s-1 PAR durante 7 dias. Os embriões com caule foram, então, transferidos para meio de Seleção II. As placas foram incubadas a 27 °C com 2 4 horas/luz do dia a aproximadamente 50 µmol m-2 s-1 PAR durante 14 dias.

[00273] Neste estágio, caules resistentes foram transferidos para meio de pré-regeneração. As placas foram incubadas a 27 °C com 24 horas/luz do dia a aproximadamente 50 µmol m-2 s-1 PAR durante 7 dias. Os caules em regeneração foram, então, transferidos para meio de regeneração em Phytatrays™ e incubados a 28 °C c om 16 horas de luz/8 horas de escuridão por dia a aproximadamente 150 µmol m-2 s -1 PAR durante 7-14 dias ou até desenvolver brotos. Pequenos brotos com raízes primárias foram, então, isolados e transferidos para meio de Fortificação. As plântulas enraizadas de cerca de 6 cm ou mais altas foram transplantadas para o solo e transferidas para uma câmara de crescimento para o endurecimento.

[00274] Isolamento de DNA Genômico para PCR a Partir de Tecidos de Plantas. Amostras de tecido de folha, equivalente a 2 punções de folha, foram coletadas em placas de coleta com 96 cavidades (Qiagen, Hilden, Alemanha). Ruptura do tecido foi realizada com um pulverizador tecidual Klecko™ (Garcia Manufacturing, Visalia, CA) no tampão de lise Biosprint96 AP1 com uma esfera de aço inoxidável. Após maceração do tecido, o DNA genômico foi isolado em formato de alto rendimento. O DNA genômico foi diluído para DNA/H2O a 2:3 antes de configurar a reação de qPCR para alcançar pontuações de Cp apropriadas.

[00275] Ensaio de Sonda de Hidrólise. A detecção de transgene pelo ensaio de sonda de hidrólise foi realizada por PCR em tempo real. Os ensaios foram concebidos na Dow AgroSciences para os genes de interesse (GOI) Cry6Aa (IRDIG522.28) usando LightCycler® Probe Design Software 2.0. Os ensaios de detecção de RNA foram executados como reações individuais usando milho TIP41-like como a referência. Para amplificação, mistura LightCycler®480 Probes Master (Roche Applied Science) foi preparada em uma concentração final de 1x em um volume de reação biplex de 10 µL contendo 0,4 µM de cada iniciador e 0,2 µM de cada sonda. A reação de amplificação em duas etapas foi realizada com uma extensão a 60 °C duran te 40 segundos com aquisição de fluorescência. As pontuações de Cp, o ponto no qual o sinal de fluorescência cruza o limite de fundo usando o algoritmo de pontos de ajuste (software LightCycler® versão 1.5) e o módulo Absolute Quant (com base no método de ∆∆Ct), foram usados para executar análise de dados por PCR em tempo real.

[00276] T0 na Estufa. Plantas trazendo eventos selecionados foram transplantadas para vasos de 5 galões. Os sacos para broto foram colocados sobre os brotos antes de emergência da seda para evitar a contaminação cruzada por pólen disperso. O segundo broto foi, então, coberto e usado para polinizações. As sedas foram cortadas no dia antes de polinização para fornecer uma borda uniforme para aceitar o pólen. O pólen proveniente do endógamo B104 foi usado para todas as polinizações. Cruzamentos recíprocos foram realizados quando possível. As espigas foram descascadas em 21 dias após a polinização para melhorar a seca, seguido de colheita completa (espiga removida da planta) a 42 dias após as polinizações. As espigas foram colocadas no secador durante 1 semana, seguido por tratamento de sementes (debulhar, contar, embalar).

[00277] Amostragem de Folha para Análises Western blot e LC/MS/MS. As plantas foram amostradas nos estágios V-3 e V-5 dentro de um dia de coleta do bioensaio. Duas amostras de folha com diâmetro de 6 mm foram armazenadas em um suporte para tubos Cluster com 96 cavidades a -80 °C até o dia da anál ise. Duas esferas de aço Daisy™ e 300 µl de tampão de extração (solução de PBS contendo Tween 20 a 0,05% e 5 µl/ml de inibidores de protease, Sigma) foram adicionados a cada tubo. As amostras foram moídas em um moinho de esferas Kelco durante 3 minutos na configuração máxima. As amostras foram centrifugadas a 3000 x g durante 5 minutos; 100 µl do sobrenadante foram transferidos para um tubo de ensaio vazio. Mais 100 µl de tampão de extração foram adicionados à amostra de planta e a esfera moída mais 3 minutos, centrifugada e 100 µl deste extrato foram combinados com os primeiros 100 µl. Os sobrenadantes combinados foram misturados e analisados no mesmo dia que a extração.

[00278] Amostragem de Raiz para Análises Western blot e LC/MS/MS. O sistema de raiz completo foi coletado, lavado com água e armazenado a -80 °C para todas as plantas T 1 nos estágios V-3 e V5. Cada planta permaneceu uma amostra separada em sacos plásticos individuais. Cada sistema de raiz foi triturado com gelo seco em um processador de alimentos industrial e o gelo seco sublimado a - 20°C, mantendo as amostras congeladas. As amostras congeladas sublimadas moídas foram, então, liofilizadas durante 2 semanas. Porções dos sistemas de raiz liofilizadas foram pesadas e colocadas em tubos Cluster individuais no formato de 96 cavidades. As amostras foram preparadas conforme descrito acima para amostragem de folhas.

[00279] Quantificação de DIG-177 por LC/MS/MS. Amostras de folhas foram extraídas para cada planta em bicarbonato de amônio a 25 mM + Tween 20 a 0,05%. As amostras foram extraídas duas vezes por um moinho de esferas e, então, reunidas. Para amostras de raízes, tecido de raiz moído e liofilizado foi pesado em um recipiente e extraído, conforme descrito acima. As amostras foram desnaturadas com DTT a 6 mM a 95 °C durante 20 minutos. Após as amostras terem esfriado, 1 g de tripsina foi adicionado a cada amostra e as amostras foram digeridas a 37 °C durante 16 horas. Após a di gestão, as amostras foram tratadas com ácido fórmico a 1%, incubadas durante 30 minutos a 4 °C e centrifugadas a 4000 rpm durant e 10 minutos. As amostras digeridas foram analisadas por LC/MS/MS. Uma curva padrão de padrões de peptídeo DIG-177 foi preparada na matriz B104 digerida (preparada conforme descrito acima). A curva padrão era linear a partir de 0,488-31,25 ng/mL. As amostras foram analisadas em uma bomba binária Waters Acquity LC e um QTrap Sciex 6500 usando uma coluna Acquity UPLC BEH130 C18, 1,7 µm, 2,1 x 50 mm. Cada amostra foi injetada a 20 µl e eluída usando um gradiente rápido (95% -45% de A durante 1 min, 45-10% de A durante 1 min, manter a 10% 1 min, 10-95% 1 min: Tampão A: Água + ácido fórmico a 0,1%, Tampão B: acetonitrila + ácido fórmico a 0,1%). Dois peptídeos foram rastreados (m/z 694,820 e m/z 586,778) para cada amostra. A quantificação foi com base na transição mais sensível, m/z 694,820 a m/z 912,417.

[00280] Western Blot. Métodos convencionais de eletroforese e transferência (Gallagher et al., 2008) foram usados com dispositivos Invitrogen™ e reagentes básicos. Um anticorpo de coelho anti-Cry6a foi o anticorpo primário para a detecção de Cry6a em folha e raiz. Todas as proteínas foram detectadas com um sistema de detecção por fluorescência e um sistema de detecção de Avidina-Biotina, fosfatase alcalina.

[00281] Bioensaio de Raiz de Milho T0 e T1. Ovos de Diabrotica virgifera (lagarta da raiz Ocidental, WCR) sem diapausa foram recebidos no solo a partir da Crop Characteristics (Farmington, MN) e incubados a 28 °C e 60% de UR durante 10 dias. No 1 0º dia após o início da incubação (aproximadamente um dia antes da eclosão esperada), os ovos foram preparados para bioensaio. O solo foi removido destes ovos. Os ovos foram suspensos em uma solução de agar em água a 0,15% em uma concentração de aproximadamente 100-200 ovos por 0,5 ml e colocados em placas de eclosão. O número de ovos viáveis nas placas de eclosão foi contado para determinar a concentração aproximada de ovos na suspensão e, assim, calcular o volume de suspensão necessário a ser adicionado às plantas de bioensaio para alcançar a infestação desejada. As placas foram mantidas em uma incubadora a 28 °C em uma caixa esc ura.

[00282] Plantio e Preparação para Bioensaio de WCR. As plantas transformadas provenientes do laboratório (T0s) foram transferidas para a câmara de crescimento Conviron onde foram mantidas até chegarem ao estágio V3-V4. As plantas V3-V4 saudáveis com bons sistemas de raiz foram transferidas para a estufa. As plantas que eram fracas, pequenas ou tinham pobre desenvolvimento das raízes foram deixadas na Conviron até saudáveis o suficiente para o bioensaio. Após um ou dois dias na estufa, as plantas foram transplantadas para tubetes com solo Metro-Mix.

[00283] Sementes para as plantas de controle foram plantadas diretamente em solo Metro Mix nos tubetes começando semanalmente pelo menos duas semanas antes da disponibilidade esperada das primeiras plantas T0 para bioensaio. Cerca de 4 dias após o transplante, as plantas T0, juntamente com cinco plantas de controle de cada tipo no mesmo estágio de crescimento, foram infestadas com ovos de WCR.

[00284] Plantas de controle negativo foram as seguintes: o endógamo B104, o endógamo 7SH382 Herculex RW (HX-RW) e 101556, um transgênico de proteína fluorescente amarela. Os controles positivos foram a linhagem de milho 7SH382RW Herculex RW (HX-RW).

[00285] As plantas foram infestadas com aproximadamente 200 ovos/planta. A taxa de eclosão foi assumida como sendo cerca de 50%, portanto, espera-se que cada planta tenha cerca de 100 larvas eclodidas e se alimentando sobre as raízes. A rega foi monitorada cuidadosamente ao longo do curso do bioensaio para garantir que cada vaso permanecesse úmido.

[00286] Duas semanas após a infestação, cada planta foi classificada quanto aos danos na raiz, começando com as plantas de controle. Cada planta foi cuidadosamente removida do tubete, mantendo a massa de raiz intacta. A primeira ou duas polegadas do solo foram raspadas da raiz e a área exposta resultante das raízes foi lavada com água de modo a ver claramente os danos pela alimentação na base das plantas (parte superior das raízes nodais). O dano pela alimentação foi pontuado usando a escala de pontuação de danos na raiz de 0,0 a 1,0, a qual é derivada de uma escala de pontuação de danos na raiz de milho no campo de 0,0 a 3,0 publicada (J. Oleson et al. 2005) para fins de pontuação dos danos na raiz de mudas de milho na estufa. Esperava-se que os controles negativos (endógamo RW, B104 e 101556) tivessem danos elevados (pontuação de raiz de cerca de 0,75 a 1,0) e esperava-se que o controle positivo (transgênico Herculex™ RW (HX-RW)) tivesse um baixo dano (pontuação de raiz de 0,0 a 0,25). Após pontuação das plantas de controle ter sido concluída, então, as plantas T0 foram pontuadas usando um método de passou/falhou (pontuação de 0 a 1,00) e perturbando a bola de raiz tão pouco quanto possível. As plantas que passaram foram imediatamente transplantadas para vasos de 5 galões com solo Promix-50-50. Após todas as plantas terem sido pontuadas, as plantas que passaram foram tratadas com uma aplicação de solo de 1 colher de chá de FORCE (inter alia, teflutrina) e tratadas adequadamente durante todo o desenvolvimento.

[00287] T1 na Estufa. Plantas selecionadas foram transplantadas para vasos de 5 galões. Sacos para broto foram colocados sobre os brotos antes de emergência da seda para evitar a contaminação cruzada por pólen disperso. O segundo broto foi, então, coberto e usado para polinizações. As sedas foram cortadas no dia antes de polinização para fornecer uma borda uniforme para aceitar o pólen. O pólen da borda da planta foi usado para polinizar a espiga sobre a mesma planta. Autopolinizações foram realizadas quando possível. Se uma autopolinização não pôde ser realizada, então, pólen de B104 foi levado para a espiga transgênica. As espigas foram descascadas a 21 dias após a polinização para melhorar a seca, seguido de colheita completa (espiga removida da planta) a 42 dias após a polinização. As espigas foram colocadas no secador durante 1 semana, seguido por tratamento de sementes (descascar, contar, embalar em envelopes pré-impressos).

[00288] Resultados de Acúmulo de Proteínas a partir de Eventos T0. Uma série de 8 a 28 eventos de baixa cópia que expressam DIG-177 foram obtidos com uma frequência de transformação global de 9%. Todos os eventos regenerados que passaram na triagem de análise molecular de cada um dos quinze construtos foram analisados quanto ao acúmulo de proteína DIG-177 na folha através de LC/MS/MS. O acúmulo médio de proteína é mostrado na Tabela 3. O nível médio de acúmulo de proteína na folha T0 variava de 0 ng/cm2 a 98,9 ng/cm2 , com o construto pDAB117255, objetivado ao pré-vacúolo, tendo o menor acúmulo médio e o construto pDAB117261, objetivado ao cloroplasto, tendo o maior acúmulo médio. Em geral, os maiores níveis médios de acúmulo de proteína foram observados a partir dos dois construtos que objetivaram a proteína DIG-177 ao cloroplasto, pDAB117260 e pDAB11261, respectivamente. O acúmulo de proteínas por estes dois construtos foi maior do que aquele foi observado no experimento citosólico anterior, o qual tinha uma média de 23,6 ng/cm2 . Por outro lado, os construtos objetivados ao vacúolo, pré-vacúolo e apoplasto resultaram no menor acúmulo de proteínas na folha.
Tabela 3
Acúmulo médio de proteína DIG-177 na folha, conforme determinado por LC/MS/MS

[00289] Tecido foliar de alguns eventos T0 para cada um dos quinze construtos foi analisado por Western blot. As proteínas foram dirigidas aos compartimentos específicos usando peptídeos de trânsito. As proteínas precursoras, deste modo, tinham pesos moleculares maiores do que a proteína DIG-177 de tipo selvagem de comprimento completo a 54,2 kDa. Dependendo do compartimento, os peptídeos de trânsito (TraP) podem ou não ser clivados após translocação, resultando em uma forma madura da proteína. Os pesos moleculares previstos do precursor e formas maduras das proteínas são mostrados na Tabela 4.
Tabela 4
Chave para plasmídeo, nomes de proteína, compartimento-alvo e pesos moleculares das proteínas DIG-177 modificadas com peptídeo de trânsito usadas neste estudo

[00290] Amostras de controle negativo não transgênicas não mostraram quaisquer bandas de fundo as quais reagiram com os antissoros de DIG-177. Nas amostras transgênicas, uma banda distinta de proteína madura aparente (comigra com o padrão DIG177), consistente com o peptídeo de trânsito que está sendo removido, foi detectada em muitas amostras. Em alguns casos, bandas maiores do que a proteína madura também foram detectadas, consistente com a detecção das proteínas precursoras (peptídeos de trânsito não removidos). Todos os construtos mostraram manchas de material DIG177 provenientes da banda madura aparente de 54 kDa a aproximadamente 40 kDa, consistente com degradação parcial da proteína.

[00291] Resultados de Bioensaio dos Eventos T0. Os sistemas de raiz provenientes de eventos que representam as 15 bases diferentes foram desafiados durante duas semanas com larvas de WCR no estágio V3-V4 de desenvolvimento. As amostras foram, então, pon-tuadas usando um sistema passou/falhou, conforme descrito acima, para danos ao sistema de raiz. Um total de 228 eventos foi analisado, dos quais 15 eventos tiveram uma pontuação de 'passou' e foram guardados para o bioensaio de T1.

[00292] Análise de Eventos T1. Os eventos T1 foram analisados quanto à produção de proteínas transgênicas e acúmulo tanto em tecidos foliares quanto da raiz. O acúmulo médio de proteína na folha aumentou para cada uma das quinze bases a partir da geração T0 para T1 e variou de 11,6 a 731,5 ng/cm2 (Tabela 3 acima). O acúmulo na raiz de T1 foi significativamente menor do que o acúmulo na folha T1 em todas as bases (Tabela 5).
Tabela 5
Acúmulo médio de proteína DIG-177 no evento T1 para tecidos de folhas e raízes, conforme determinado por LC/MS/MS

[00293] Tanto tecido da folha quanto tecido da raiz de cada um dos eventos T1 foram analisados quanto à estabilidade de proteínas por meio de Western blot. Os resultados foram similares àqueles observados em T0; bandas distintas de proteína madura aparente (comigra com o padrão DIG-177) eram consistentes com o peptídeo de trânsito que está sendo removido. Além disso, bandas maiores do que a proteína madura também foram detectadas, consistente com as proteínas precursoras. Finalmente, todos os construtos resultaram em uma mancha de material de DIG-177 a partir de aproximadamente 54 kDa a aproximadamente 40 kDa, consistente com degradação parcial da proteína.

[00294] Resultados de Bioensaios de Eventos T1. Cinco plantas de eventos que representam as 15 diferentes bases foram desafiadas durante duas semanas com larvas de WCR no estágio de desenvolvimento V3-V4. As amostras foram classificadas conforme antes quanto aos danos no sistema de raiz; plantas com uma Pontuação de Raiz ≤ 0,5 foram consideradas como passando.
Nenhum dos eventos testados passou neste bioensaio; nenhum dos eventos era significativamente diferente do controle negativo em relação à proteção da raiz. Portanto, a localização a vários compartimentos subcelulares individualmente, usando peptídeos de trânsito, não protege suficientemente a DIG-177 contra degradação por protease.

[00295] Análise Western Blot. Os resultados dos experimentos de expressão em folha de milho T1 são mostrados na Figura 6. Análise de Western não mostrou nenhuma expressão de proteínas Cry6Aa nos controles negativos; B104 (coluna 2) e pDAB115782 (coluna 3) ou nos controles de transformação que contêm YFP e PAT (coluna 12). As seis colunas mais à direita são padrões de proteína de DIG-1000 (47,3 kDa).

[00296] As colunas 3, 8, 11 e 14 do pDAB117261 (DIG-177) contêm amostras T1 como controle para comparar o processamento com DIG 1000. Os resultados foram similares àqueles observados em T0; bandas distintas de proteína madura aparente (comigra com o padrão DIG-177) eram consistentes com o peptídeo de trânsito que está sendo removido. Além disso, bandas maiores do que a proteína madura também foram detectadas, consistente com as proteínas precursoras. Este construto de controle produziu uma mancha de material de DIG-177 a partir de aproximadamente 54 kDa a aproximadamente a 40 kDa, consistente com degradação parcial da proteína.

[00297] Os resultados para pDAB126937 (DIG-1000), objetivado ao peroxissomo, estão localizados nas colunas 5 e 10 da Figura 6. Há uma grande banda produzida no tamanho correto, a qual corresponde ao padrão DIG 1000. A coluna 10 contém uma banda distinta menor ligeiramente menor do que a mancha de 40 kDa produzida com DIG 177, indicando um local de processamento específico.

[00298] Os resultados para pDAB126938 de DIG-1000, objetivado às mitocôndrias, estão localizados nas colunas 4, 6, 9 e 13 da Figura 6. Este construto produziu duas bandas, uma do tamanho correto e outra um pouco maior, provavelmente representando a proteína precursora. Estes dados são consistentes com a sequência codificadora de DIG-1000 expressando uma proteína inseticida estável em célula de planta útil para o controle de lagarta da raiz do milho Ocidental.

EXEMPLO 2 Identificação de Ligações de Dissulfureto em DIG-177

[00299] Plasmídeos de Expressão de Proteína Recombinantes Sequências codificadoras de DIG-177 e variantes de DIG-177 foram clonadas no vetor de expressão de Pseudomonas individual, pDOW1169. Os vetores de expressão foram, então, transformados em Pseudomonas fluorescens e as colônias transformadas resultantes foram caracterizadas e armazenadas.

[00300] Expressão de Proteína Recombinante. Um mililitro de estoques de glicerol foi inoculado em 500 mL de meio de produção Ultra™ em um frasco Ultra Yield de 2,5 L (Thomson Instrument Company, Oceanside, CA) e incubado durante 24 horas a 30 °C, agitando a 225 rpm com uma capacidade máxima de 1 polegada. A expressão foi induzida com 150 l de IPTG a 1M. As células foram incubadas a 25 °C durante 24 horas, ponto no qual u ma amostra de 0,5 mL foi tomada e os frascos foram removidos do agitador. As culturas foram coletadas por meio de centrifugação a 19.000 rpm durante 10 minutos em um rotor JA-20 (Beckman Coulter, Brea, CA) ou 11.409 rpm durante 15 min em um rotor FIBERLite™ F12-6X500 LEX (Thermo Scientific); as pastas celulares foram armazenadas a - 80°C.

[00301] Enriquecimento de Proteína Recombinante. DIG-177 e as proteínas variantes, descritas abaixo, se acumularam em P. fluorescens como corpos de inclusão (Inclusion Bodies - IBs). A pasta celular foi descongelada a 4 °C. As células foram s uspensas a 10% peso/v em tampão de lise (Tris a 50 mM, pH de 7,5, NaCl a 200 mM, Glicerol a 10%, EDTA a 20 mM, Triton X-100 a 0,5%, benzamidina a 5mM e DTT a 1 mM acrescentado imediatamente antes de uso) e completamente misturadas com um homogeneizador. A mistura foi passada duas vezes através de um microfluidizador Microfluidics (Westwood, MA, EUA) a (12000+ psi). O lisato foi centrifugado a 14.000 x g a 4 durante 40 min °C. O sobrenadante fo i retido. O pélete de corpos de inclusão foi ressuspenso a 10% peso/v em tampão de lise e lisozima (L-7651; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi adicionada em uma concentração final de 400 g/mL. A suspensão foi incubada em temperatura ambiente (~ 20 °C) durante 60 minuto s e centrifugada. O pélete de corpos de inclusão foi lavado com tampão de lise e uma vez com tampão de lise menos Triton™ X-100 uma segunda vez. Finalmente, o pélete de corpos de inclusão foi ressuspenso a 30% peso/v em solução de EDTA a 10 mM e armazenado a -80 °C em alíquotas de 2 mL. A pureza da amostra foi analisada por SDS-PAGE (gel de Bis-Tris NuPAGE, Protocolo Pub. N° MAN00078 94 Rev. A.0, Invitrogen Life Technologies, Waltham, MA).

[00302] Solubilização de Corpos de Inclusão. A pasta de IB armazenada a -80 °C foi descongelada a 4 °C durante a noite e depois centrifugada a 23.000 × g durante 25 min a 4 °C e o sobrenadante foi removido. O pélete de IB foi suspenso a 20% (peso/v) em CAPS a 100mM, pH de 11 e solubilizado em temperatura ambiente durante 2 horas. A amostra foi centrifugada conforme anteriormente e o sobrenadante coletado. O tampão foi trocado para CAPS a 10 mM, pH de 10 através de da coluna de dessalinização PD-10. A proteína foi quantificada pelo ensaio de proteína de Bradford seguindo o protocolo "Quick Start™ Bradford Protein Assay - Bio-Rad" (Bio-Rad, Hercules, CA). O padrão foi BSA (albumina de soro bovino, Albumin Standard da Pierce, Grand Island, NY).

[00303] SDS-PAGE. SDS-PAGE foi executado seguindo o protocolo para géis de Bis-Tris NuPAGE da Invitrogen Life Technologies (Protocolo Pub. N° MAN0007894 Rev. A.0 , Ref.2). Resumidamente, as amostras foram misturadas com tampão de amostra desnaturante (Invitrogen) mais DTT a 5 mM (para PAGE redutor) ou menos DTT (para PAGE não redutor) e aquecidas a 95 °C durante 5 minutos. As amostras foram carregadas em gel de Bis/Tris da Invitrogen. O gel foi passado com tampão contínuo de MOPS ou MES sob 200 V durante ~ 43 minutos. O gel foi corado com solução de coloração de azul de Coomassie (Bio-Rad) durante 30 minutos e descolorado com solução de descoloração (ácido acético a 7% e metanol a 5% em água) até que a base clarificasse.

[00304] Análise de Peso Molecular Intacto/Distribuição de Estado de Carga. Análise de massa intacta foi realizada em um sistema Agilent 1200 HPLC/MSD TOF 1969A usando um separador de dessalinização Michrom aquecido a 50 °C. Cada amost ra foi diluída para uma concentração de 0,2 µg/mL em tampão de CAPS a 10 mM, pH de 11. As amostras também foram analisadas após terem sido reduzidas com TCEP a 50 mM (cloridrato de (2-carboxietil)fosfina) durante 10 minutos. Cerca de 1 µg de proteína foi injetado na coluna. A amostra foi eluída usando um gradiente (10% de tampão D durante 1 minuto, 10-60% de tampão D durante 2 minutos, 60-98% de tampão D durante 2 minutos, 10% de tampão D durante 1 min), onde o tampão A é ácido fórmico a 0,1% em água e o tampão D é 70% de isopropanol, 20% de acetonitrila,10% de água + ácido fórmico a 0,1%. A massa foi calculada usando o software Mass Hunter Qualitative Analysis e o algoritmo de deconvolução de entropia máxima.

[00305] Análise por espectrometria de massa de DIG-177 tanto sob condições redutoras quanto não redutoras verificaram duas ligações de dissulfureto presentes na proteína. DIG-177 tem cinco resíduos de cisteína localizados nas posições 88, 162, 402, 404 e 451. Para identificar os resíduos que contribuem para as ligações de dissulfureto, mutações foram feitas na cisteínas selecionadas e as proteínas recombinantes foram expressas. Os pesos da molécula intacta para as proteínas variantes foram analisados na presença ou ausência de um agente redutor. Sob estas condições, espera-se que cada ligação de dissulfureto presente na proteína explique um aumento m/z de 2 quando reduzida com TCEP. Quando de redução da proteína de tipo selvagem (DIG-177), observou-se um aumento m/z de 3,8, indicando que duas ligações de dissulfureto estão presentes na proteína. DIG614 (SEQ ID NO: 35), 615 (SEQ ID NO: 37), 618 (SEQ ID NO: 43), 619 (SEQ ID NO: 45), 983 (SEQ ID NO: 47) e 984 ( SEQ ID NO: 49) mostraram, cada uma, uma alteração de massa de aproximadamente +2 quando de redução, o que representa uma única ligação de dissulfureto. Espera-se que cada uma destas variantes resulte em eliminação da ligação de dissulfureto entre os resíduos cisteína 88 e 451. Com base nestes dados, uma ligação de dissulfureto adicional estava presente, envolvendo dois dos resíduos de cisteína 162, 402 ou 404. Os mutantes DIG-616 ( SEQ ID NO: 39) e 617 (SEQ ID NO: 41), os quais era esperado romper uma ligação de dissulfureto envolvendo Cys162, mostraram uma alteração de aproximadamente +4 quando de redução, novamente conforme com a DIG-177, indicando a presença de duas ligações de dissulfureto. Uma vez que uma destas ligações de dissulfureto era encontrada entre as cisteínas 88 e 451, a segunda ligação de dissulfureto foi mostrada, por inferência, como estando entre os resíduos cisteína 402 e 404.
Tabela 6
MW intacto de mutantes de cisteína mais e menos redução com TCEP

EXEMPLO 3

[00306] Caracterização de DIG-177 Tratada com Tripsina

[00307] Em resumo, a DIG-177 tratada com tripsina (núcleo de tripsina, TC) consistia em um fragmento grande (LF; aminoácidos 12-390 de SEQ ID NO: 50) e qualquer um de dois pequenos fragmentos (aminoácidos 444-475 (SEQ ID NO: 451-475 51or SEQ ID NO: 52) denominados peptídeos carbóxi terminais (CTP). Descobriu-se que o LF e o CTP estavam unidos através de uma ligação de dissulfureto entre cys88 e cys451. Sob condições não redutoras, a amostra tratada com tripsina tinha atividade inseticida e, sob condições redutoras, os fragmentos dissociaram (LF e CTP) e a atividade diminuiu. Nem o LF nem o CTP mostrou atividade inseticida nos níveis testados. Estas observações indicam que o CTP, ligado ao LF, é necessário para manter a atividade da toxina após proteólise com tripsina.

[00308] Visão Geral das Amostras Tratadas com Tripsina Preparadas, Caracterizadas e Testadas. Quatro amostras diferentes foram preparadas, caracterizadas e bioensaiadas para determinar qual combinação de peptídeos tinha atividade inseticida contra WCR (vide Figura1).

[00309] Amostra 1: DIG-177 tratada com tripsina, CTP presente e ligada por ligação de dissulfureto ao LF.

[00310] Amostra 2: DIG-177 tratada com tripsina, CTP presente, a amostra foi tratada com agente redutor após digestão; o agente redutor foi, então, removido por meio de diálise.

[00311] Amostra 3: DIG-177 tratada com tripsina, LF isolado

[00312] Amostra 4: DIG-177 tratada com tripsina, CTP isolado

[00313] Digestão com Tripsina. A proteína DIG-177 foi produzida em Pseudomonas fluorescens e purificada conforme descrito no Exemplo 2. A proteína recombinante foi tratada com tripsina em tampão de digestão (tampão de CAPS a 100 mM, pH de 10,5, CaCl2 a 5mM, MgCl2 a 5 mM) contendo tripsina (TPCK tratada, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) em uma proporção final de 15 partes de proteína para 1 parte de tripsina (peso/peso). A reação foi agitada com agitação suave em temperatura ambiente. Uma alíquota foi removida em cada ponto de tempo (5 minutos, 2 e 17 horas) para análise, a digestão foi interrompida mediante adição de tampão de dodecil sulfato de lítio (LDS) para amostra com DTT a 5 mM e aquecimento a 95 °C durante 5 min.

[00314] As proteínas tratadas com tripsina foram purificadas por meio de cromatografia de troca iônica (Ion Exchange Chromatography - IEC) usando um purificador de proteína AKTA (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). A amostra foi diluída com CAPS a 10 mM, pH de 10, para 1:1 e filtradas por um filtro acionado a vácuo com uma membrana de 0,22 m. A amostra foi injetada sobre uma coluna HiTrap™ Q pré-equilibrada (GE, Pittsburgh, PA) em uma taxa de fluxo de 3 mL/min, a coluna foi lavada com ~ 25 mL de tampão A (CAPS a 50mM, pH de 10) e a proteína foi eluída com 20% de tampão B (tampão A + NaCl a 1 M) e, então, seguido por 30%, 40% e 50% de tampão B. Cada eluição foi de ~ 25 mL. As frações foram coletadas a partir de cada eluição com base na absorbância de UV, respectivamente. Estas frações foram analisadas por SDS-PAGE (vide protocolo para géis de Bis-Tris NuPAGE da Invitrogen Life Technologies, Protocolo Pub. N° MAN0007894 Rev. A.0 ).

[00315] As frações que continham a proteína-alvo foram reunidas e concentradas até ~ 3 mL usando um dispositivo de filtro para centrífuga com uma membrana com corte de peso molecular de 10 kDa (MWCO) (Millipore, Billerica, MA). O tampão de amostra foi convertido em CAPS a 10 mM, pH de 10, através de diálise. As amostras concentradas foram transferidas para um cassete de diálise Slide-A-Lyzer™ (Thermo Scientific). Os cassetes foram substituídos em 4L de CAPS a 10 mM, pH de 10 e submetidos à dialise a 4 °C de um dia para o outro (~ 18 horas). As amostras, avaliadas em mais do que 95% de pureza por SDS-PAGE (conforme descrito no Exemplo 2), foram coletadas para bioensaio de WCR e/ou caracterização, respectivamente.

[00316] A concentração de proteína foi medida pelo ensaio de proteína de Bradford, seguindo o protocolo do fabricante "Quick Start™ Bradford Protein Assay - Bio-Rad" (Bio-Rad). BSA (albumina de soro bovino) foi usada como padrão.

[00317] Amostra 1: Preparação e Caracterização de DIG-177 Tratada com Tripsina (LF mais CTP). DIG-177 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 2) foi digerida com tripsina durante 16 horas e passada sobre uma coluna de troca iônica para remover a tripsina. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE (conforme descrito no Exemplo 2) sob condições redutoras desnaturantes. O material de comprimento completo não digerido migrou a ~ 54 kDa, uma pequena quantidade de dímero apareceu a aproximadamente ~ 108 kDa. DIG-177 pode formar quantidades detectáveis de agregados de elevado peso molecular. A amostra tratada com tripsina, antes de fracionamento, passou como uma única banda de aproximadamente 43 kDa, que representa o LF, previsto como sendo os resíduos 12-390 com base em sítios de clivagem de tripsina.

[00318] Sequenciamento N-terminal. O amino término do LF foi confirmado por meio de sequenciamento N-terminal por degradação de Edman realizada em um Shimadzu Protein Sequencer (Modelo PPSQ-33A) usando química de degradação de Edman básica. A amostra de proteína foi separada com SDS-PAGE sob condições redutoras e, então, as proteínas foram transferidas para membrana de PVDF por meio de transferência de líquido. As bandas de proteína alvo foram excisadas e carregadas em uma câmara de reação de vidro. Então, a câmara foi inserida no sequenciador e submetida à degradação de Edman. Uma mistura padrão de 20 PTH-aminoácidos (Shimadzu, Kyoto, Japão) foi passada de cada vez. Os resíduos de aminoácidos de cada ciclo de degradação de Edman foram determinados com base em seus tempos de retenção a partir da coluna C-18 comparado com padrões. Este processo foi repetido sequencialmente até se obter a sequência amino terminal da proteína. Degradação de Edman determinou o N-término do LF como começando no resíduo 12 de SEQ ID NO: 2.

[00319] Análise de peso molecular de proteína intacta foi realizada (conforme descrito no Exemplo 2), sem redução, resultou em uma espécie dominante com uma massa de 46.844,19 Da e uma espécie menor com uma massa de 45.995,25 Da (Tabela 7). O valor médio de MW intacto deconvoluto de 46.844,19 Da coincide com o valor teórico (46.843,43 Da) esperado para uma proteína que contém cadeias polipeptídicas de 12-390 dissulfuretos ligados à cadeia 444-475 (CTP1). As espécies menores, com MW médio de 45.995,25 Da, coincidem com o valor teórico de 45.996,51 para uma proteína que contém cadeias polipeptídicas de 12-390 dissulfuretos ligados à cadeia 451-475 (CTP2).
Tabela 7
Análise de peso molecular intacto de uma amostra sob condições não redutoras

[00320] O peso molecular intacto da amostra foi determinado (condições redutoras) após tratamento com TCEP; dois componentes foram observados (Tabela 8). Um componente importante a 42.729,71 Da, corresponde à massa teórica de 42.729,4 para a DIG-LF 177 tratada com tripsina (resíduos 12-390, sem CTP). Um componente menor também foi observado, com uma massa de 46.844,14 Da, correspondendo à massa do LF com CTP1 ainda ligado (redução incompleta). Os resultados indicam que CTP1 e 2 foram, em grande parte, removidos através de redução com TCEP.
Tabela 8
Análise de peso molecular intacto de uma amostra sob condições redutoras

[00321] Amostra 2: Preparação e Caracterização de DIG-177 Tratada com Tripsina (LF com CTP Após Redução). DIG-177 tratada com tripsina foi purificada sob condições não redutoras, conforme descrito para a Amostra 1. DTT foi adicionado à amostra em uma concentração final de 5 mM e incubado em temperatura ambiente durante 10 minutos. A amostra foi, então, submetida à dialise durante a noite contra CAPS a 10 mM, pH de 10, para remover o DTT para criar a Amostra 2. As Amostras 1 e 2 foram analisadas por SDS-PAGE usando um gel de Bis/Tris a 4-12% e tampão contínuo de MOPS para obter uma melhor resolução em torno de 40 kDa. Sob condições redutoras, a Amostra 1 e Amostra 2 (tratadas com DTT) mostraram uma banda no peso molecular esperado de ~ 43 kDa, consistente com o LF (12-390), uma segunda banda na parte inferior do gel são o CTP (CTP1 e CTP2 não são decompostos sob estas condições) foram liberados pela redução de dissulfureto). Sob condições não redutoras, a Amostra 1 correu em um peso molecular esperado de ~ 46 kDa, consistente com o LF (resíduos 12-390) e o CTP estando ligado. A Amostra 2 (tratada com DTT, removida) mostrou duas bandas de peso molecular maior, uma de ~ 43 kDa, consistente com o LF (resíduos 12- 390); a segunda banda de ~ 46 kDa, consistente com o LF mais CTP. Uma terceira banda está presente na parte inferior do gel, a qual corresponde ao CTP. Estes resultados demonstram que, na Amostra 2, a maior parte do CTP não está ligada ao fragmento grande; uma fração da amostra parece ter se reassociado.

[00322] O espectro sem tratamento com TCEP mostrou três picos dominantes, com um MW médio medido de 42.729,46, 45.994,89 e 46.844,14 Da (Tabela 9). O pico de 42.729,46 correspondeu à massa teórica (42.729,0 Da) do LF, resíduos 12 - 390. O componente de 45.994,89 combinava com a massa teórica (45.995,0 Da) do LF mais CTP2 (resíduos 12 - 390 + 451-475). O componente de 46.844,14 combinava com um MW médio teórico (46.843,72 Da) do LF mais CTP1 (resíduos 12 - 390 + 444-475).
Tabela 9
Análise de peso molecular intacto da Amostra 2 sob condições não redutoras

[00323] O espectro com tratamento com TCEP a 50 mM mostrou apenas um componente com MW médio de 42.729,27 (Tabela 10); o CTP não foi capturado nesta janela de espectros. Estes resultados confirmaram que o tratamento DTT liberou o CTP e, após remoção do DTT, uma fração do PTC está associada ao LF.
Tabela 10
Análise de peso molecular intacta da Amostra 2 em condições redutoras

[00324] Amostra 3: Preparação e Caracterização de LF. Para separar a DIG-177 tratada com tripsina, o LF e os CTPs gerados, purificação por IEC após digestão com tripsina foi realizada sob condições redutoras (DTT a 5 mM). As amostras foram analisadas por meio de SDS-PAGE não redutor. A amostra não reduzida tratada com tripsina migrou para o peso molecular esperado de ~ 46 kDa, consistente o LF (12-390) ligado ao CTP. A amostra de material de iniciação (tratada com DTT durante a preparação) migrou de modo substancialmente rápido e era consistente com a perda do CTP. O LF menos CTP foi obtido na Fração 3.

[00325] Para verificar a composição da Fração 3, a amostra foi submetida à análise de peso molecular intacto (Tabela 11). O espectro sem tratamento com TCEP mostrou uma espécie dominante, com um MW médio de 42.729,76 Da e um componente menor com 45.995,19 Da. O componente dominante a 42.729,76 Da combinava com um MW médio teórico (42.729,0 Da) do LF tratado com tripsina (resíduos 12- 390), confirmando que o CTP foi removido. O componente menor a 45.995,19 Da combinava com um MW médio teórico de 45.995,0 Da de uma segunda espécie composta do LF (resíduos 12 - 390) e CTP2 (resíduos 451 - 475), indicando que a redução não foi concluída durante purificação. Estes resultados confirmam que a maior parte da amostra representa o LF sem o CTP.
Tabela 11
Análise de peso molecular intacto da Amostra 3 sob condições redutoras

[00326] Amostra 4: Isolamento e Caracterização dos Peptídeos C-terminais (CTP). A DIG-177 digerida com tripsina, purificada sob condições não redutoras (vide acima), foi tratada com DTT a 5 mM para liberar o peptídeo C-terminal. A amostra tratada foi passada através de um dispositivo de filtro para centrífuga com MWCO de 10 kDa (Millipore). O peptídeo C-terminal estava presente no fluxo passante, enquanto que o fragmento grande foi retido na unidade de filtração. O fluxo passante e a amostra retida foram coletados e os tampões foram trocados para CAPS a 10 mM, pH de 10, por meio de diálise.

[00327] A amostra de peptídeo C-terminal (Amostra 4) foi analisada por meio de MALDI-TOF/TOF MS para determinar as massas de peptídeo e, subsequentemente, fragmentadas no modo LIFT para confirmar a sequência do peptídeo. MALDI-TOF MS e MS/MS foram realizados com espectrômetro de massa Bruker UltraFlextreme™. A amostra de peptídeo C-terminal foi diluída com TFA (ácido trifluoroacético) a 0,2% para 1:1 (v/v) e dessalinizada usando um C-18 Ziptip (Millipore). Os peptídeos foram eluídos com acetonitrila (ACN) a 60% em TFA a 0,1% e misturada com uma matriz de ácido 2,5-dihidroxibenzoico (DHB) (15 mg/ml em ACN:H2O (50:50)). Após colocar 1 mL da mistura sobre uma placa para MALDI de amostras, a massa do peptídeo foi analisada usando o modo de reflexão positivo e o peptídeo foi fragmentado usando o modo LIFT. O instrumento foi calibrado com CM 2 (mistura de calibração 2, Kit Peptide Mass Standards, Applied Biosystems Sciex, Foster City, CA). O espectro de massa foi coletado e analisado usando o software Flex Analysis. A sequência foi verificada usando o software BioTools (Bruker) e o motor de busca MASCOT (Matrix Science, Boston, MA). MALDI MS mostrou três picos principais com massas de 4.114,894, 3.266,38 e 2.154,933 Da e vários picos secundários (Tabela 12). O pico a 4.114,89 m/z correspondia à massa teórica de 4.113,66 que representa os resíduos 444-475 (CTP1); o pico a 3.266,38 m/z corresponde à massa teórica de 3.265,26 que representa os resíduos 451-475 (CTP2). O pico a 2.154,933 m/z não correspondia a nenhum peptídeo C-terminal e sua origem ainda não foi determinada.
Tabela 12
Análise de peso molecular intacto da Amostra 2 sob condições redutoras

[00328] Os dois peptídeos, m/z 4.114,894 e 3.266,38 Da, foram sequenciados por meio de MALDI MS/MS. Os resultados confirmaram que o pico a 4.114,894 tinha a sequência NSNLEYKCPENNFMIYWYNNSDWYNNSDWYNN (resíduos sublinhados foram identificados e atribuídos), os quais correspondiam à sequência de CTP1 dos resíduos 444 - 475 de SEQ ID NO: 51. O pico a 3.266,38 tinha a sequência CPENNFMIYWYNNSDWYNNSDWYNN, a qual correspondia à sequência de CTP2 a partir dos resíduos # 451 - 475 de SEQ ID NO: 52.

[00329] Atividade Inseticida das Amostras 1 - 4. Ovos de WCR que não estão na diapausa (Crop Characteristics Inc., Farmington, MN) foram incubados a 28 °C no solo durante 10 dias . A terra destes ovos foi lavada com água, a superfície esterilizada com formaldeído a 10% e triplamente enxaguada com água estéril. Estes ovos foram deixados eclodir e alimentados com uma dieta proprietária para WCR. Bioensaios de sobreposição de dieta foram realizados em placas de titulação com 24 cavidades, com cada uma das cavidades contendo 1,5 ml de dieta artificial para WCR. As amostras de teste foram aplicadas sobre a superfície da dieta na dose de 100 g/cm2 (80 mL) (a menos que indicado de outra forma) e secas sob temperatura ambiente em fluxo laminar. A superfície da dieta tratada de cada cavidade foi infestada com cinco D. virgifera recém-eclodidos (24-48 h de idade) e os insetos teste foram encerrados na placa de bioensaio com coberturas permeáveis a gás Respire Easy®, a placa foi selada e mantida sob condições ambiente controladas (28 °C, fase de 24 horas, 60-80% de umidade relativa). Vinte insetos foram testados por repetição. O número de insetos vivos, insetos mortos e o peso vivo agrupado de insetos por tratamento foram registrados após cinco dias de incubação. O número de insetos mortos e o peso dos insetos sobreviventes foram registrados.

[00330] A mortalidade percentual e inibição de crescimento percentual foram calculadas para cada tratamento. A inibição de crescimento (Growth Inhibition - GI) é calculada como segue:
GI = [1 - (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]

[00331] onde TWIT é o peso total de insetos no tratamento, TNIT é o número total de insetos no tratamento, TWIBC é o peso total de insetos na verificação de base (controle de tampão) e TNIBC é o número total de insetos na verificação de base (controle de tampão). Os controles negativos eram tampão de citrato de sódio a 20 mM, pH de 3,5, tampão de CAPS a 10 mM, pH de 10 e 350 g/cm2 de Cry1Fa. Os controles positivos eram 100 g/cm2 de Cry34/35Ab1 em tampão de citrato de sódio e/ou 100 g/cm2 de DIG-177 em tampão de CAPS. As Amostras 1-4 da DIG-177 tratada com tripsina foram bioensaiadas a 100 g/cm2 (LC50 DIG-177 ~40 µg/cm2 ). Os resultados do bioensaio estão resumidos na Tabela 13, Cry1Fa e duas amostras de tampão foram usadas como controles negativos. DIG-177 de comprimento completo foi usada como o controle positivo.

[00332] A Amostra 1, o fragmento grande + CTP, mostrou atividade inseticida quase equivalente àquela do controle positivo de comprimento total. A Amostra 2, o fragmento grande com o CTP liberado, mas presente na amostra, tinha atividade baixa, mas mensurável, demonstrando que o tratamento com DTT, seguido por diálise, reduziu substancialmente a atividade inseticida. Os dados de espectrometria de massa analítica mostram alguns dos CTPs estavam associados ao fragmento grande para criar um complexo de toxina ativa nestas amostras. As Amostras 3 e 4, o fragmento grande e o CTP, foram testadas separadamente; em todos os casos, estas amostras não mostram atividade significativamente diferente do controle negativo nesta dose única, indicando que ambos os fragmentos são necessários.
Tabela 13
Atividade inseticida de Amostras de 1-4 de DIG-177 tratada com tripsina contra a lagarta da raiz do milho Ocidental

[00333] Mortalidade larval média percentual e inibição de crescimento médio percentual da lagarta da raiz do milho Ocidental no primeiro instar após exposição a 100 µg/cm2. Os controles negativos foram 350 µg/cm2 de Cry1Fa, CAPS a 10 mM (pH de 10) e tampões de citrato de sódio a 20 mM (pH de 3,5), enquanto que o controle positivo foi 100 µg/cm2 de Cry34/35Ab1.
Tabela 14
Resposta à dose de TcdA, Cry34/35Ab1 e DIG-1000

[00334] Os valores foram extrapolados além da faixa da taxa testada

EXEMPLO 4 Eliminação Genética do Carbóxi Término de DIG-177

[00335] Uma série de cinco regiões codificadoras, DIG-137 (SEQ ID NO: 53), DIG-138 (SEQ ID NO: 55), DIG-147 (SEQ ID NO: 57), DIG148 (SEQ ID NO : 59) e DIG-149 (SEQ ID NO: 61), resultantes de eliminações sequenciais a partir do carbóxi término de DIG-177, foram construídas e expressas conforme descrito no Exemplo 2. As proteínas recombinantes se acumularam na fração solúvel das células hospedeiras de Pseudomonas e foram purificadas como segue: a pasta de células contendo a proteína recombinante do congelador a - 80 °C foi transferida para -20 °C durante a noite e ressuspensa em tampão de extração (Tris a 50 mM, EDTA a 5 mM, de pH 8,0). Ela foi misturada com um homogeneizador ultrassônico e em 5 ciclos de 3 min usando um 250 (Branson) Sonifier com uma ponta plana (sonda) em um ciclo de trabalho de 30%, seguido por uma pausa de 5 minutos após cada ciclo sobre gelo. Após lise das células, a mistura foi centrifugada a 22.000 x g durante 25 minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi filtrado através de filtros de 0,45 m. A purificação foi um protocolo de cromatografia em duas etapas usando resinas de troca iônica e interação hidrofóbica. Primeiro, o sobrenadante foi injetado em uma coluna Q (coluna HiTrap Q HP de 5 mL da GE Healthcare, Piscataway, NJ) pré-equilibrada em Tris a 50 mM, EDTA a 5 mM, pH de 8,0 e as proteínas foram eluídas por um gradiente salino de NaCl a 0-0,6 M. As frações foram coletadas com base na absorbância de UV e verificadas por SDS-PAGE. As frações que continham a proteína recombinante foram reunidas e diluídas com tampão A mais sulfato de amônio a 2 M em uma proporção de 1:1; a concentração final de sulfato de amônio atingiu 1 M. A amostra foi aplicada em uma coluna Phenyl HIC (coluna HiTrap Phenyl FF High Sub de 5 mL da GE Healthcare), as proteínas foram eluídas por um gradiente de (NH4)2SO4 a 1-0 M. As frações que continham a proteína-alvo foram reunidas e concentradas com um filtro para centrífuga com MWCO de 10 kDa e submetidas à diálise contra COPS a 10 mM, pH de 10. A concentração de proteína foi determinada por Bradford e densitometria.

[00336] As composições das amostras de proteína foram confirmadas por meio de espectrometria de massa, conforme descrito no Exemplo 3. Os materiais foram testados quanto à atividade contra a lagarta da raiz do milho inseticida Ocidental, conforme descrito no Exemplo 3. Os resultados mostram que a eliminação da região dos resíduos 444-475 (DIG-137) tinha uma atividade similar à DIG-177 na concentração testada. Quando tratada com tripsina, a DIG-137 mostrou diminuição da atividade, enquanto que a DIG-177 reteve a atividade quando não reduzida, conforme mostrado no Exemplo 3.

[00337] Esta observação demonstra que o CTP não era especificamente necessário para a atividade na ausência de tratamento com tripsina. Eliminações maiores (DIG-138, DIG-147, DIG-148 e DIG-149) mostraram menos atividade inseticida do que o controle DIG-177. O tratamento com tripsina destas amostras reduziu a atividade inseticida além das amostras não tratadas com tripsina contra WCR. Estes resultados foram consistentes com aqueles de Wei et al., o qual mostrou que eliminações carbóxi terminais de Cry6Aa, até o resíduo 382, mantinham alguma atividade contra nematoides na ausência de proteólise. Estes resultados confirmam a importância de estabilizar o polipeptídeo de DIG-177 na região entre os resíduos 390- 475 para manter a atividade inseticida potente.
Tabela 15
Atividade inseticida de eliminações carbóxi terminais contra WCR

[00338] Mortalidade percentual média das larvas e inibição de crescimento percentual média de lagarta da raiz do milho Ocidental no primeiro instar após exposição a 100 µg/cm2 de diversas amostras, média de dois conjuntos de dados. Os controles negativos eram 350 µg/cm2 de Cry1Fa, tampões de CAPS a 10 mM (pH de 10) e citrato de sódio a 20 mM (pH de 3,5), enquanto que o controle positivo era 100 µg/cm2 de Cry34/35Ab1.

EXEMPLO 5 Estudo da Ligação de Dissulfureto C88-C451

[00339] Para investigar a importância da ligação de dissulfureto cys88-cys45 para a atividade inseticida, os mutantes DIG-616 (C163> A; (SEQ ID NO: 39)) e DIG-984 (C88> A; 451> A; (SEQ ID NO: 49)) foram caracterizados conforme descrito nos Exemplos 2 e 3. Foi mostrado que as proteínas DIG-616 e DIG-984 têm o peso molecular e o número de ligações de dissulfureto esperados por espectrometria de massa.
Tabela 16
Análise do peso molecular intacto de mutantes de DIG-177 sob condições não redutoras e redutoras

[00340] Tanto DIG-616 quanto DIG-984 tinham atividade inseticida sobre WCR a 100 g/cm2 , equivalente à DIG-177 em bioensaios de dieta (Tabela 17). Quando tratada com tripsina, a DIG-616 manteve a atividade inseticida, enquanto que a DIG-984 tinha menos atividade inseticida do que a DIG-616 ou DIG-177 quando tratada com tripsina. Análise por espectrometria de massa descreveu que a DIG-616 tratada com tripsina reteve o CTP e a DIG-984 perdeu o CTP, confirmando a necessidade do peptídeo para a atividade sobre a lagarta da raiz do milho Ocidental (Tabela 16) após proteólise e a afinidade limitada do LF e CTP na ausência da ligação de dissulfureto.
Tabela 17
Análise de peso molecular intacto de mutantes de DIG-177 após digestão com tripsina sob condições não redutoras e redutoras

[00341] Mortalidade larval média percentual e inibição de crescimento média percentual de lagarta da raiz do milho Ocidental no primeiro instar após a exposição a 100 µg/cm2 de várias amostras. Os controles negativos foram 350 µg/cm2 de Cry1Fa, tampões de CAPS a 10 MM (pH de 10) e citrato de sódio a 20 mM (pH de 3,5), enquanto que o controle positivo foi 100 µg/cm2 de DIG-177.

EXEMPLO 6 Digestão de DIG-177 com Proteinase K

[00342] A suscetibilidade proteolítica da proteína DIG-177 foi determinada usando proteinase K (foi mostrado que a proteinase K tem especificidade mais ampla do que a tripsina, clivando sobre o lado carboxila dos resíduos alifáticos e aromáticos, enquanto que tripsina clivava em resíduos de lisina e arginina. A proteína da amostra de DIG-177 foi preparada conforme descrito no Exemplo 2. Ela foi digerida em Tris a 50 mM, pH de 7,5, CaCl2 a 2 mM em uma concentração de 1 mg/mL em uma proporção em massa de 40:1 de proteinase K (SIGMA -ALDRICH, St. Louis, MO), com agitação suave a 20 °C. As amostras para ponto de tempo foram reti radas a 0, 5, 10, 30, 50 e 90 minutos, com as digestões terminadas mediante adição de PMSF até uma concentração final de 5 mM. O ponto de tempo 0 foi tomado imediatamente após a proteinase K ser adicionada à amostra. As amostras foram analisadas por SDS-PAGE, espectrometria de massa e bioensaio de insetos, conforme descrito nos Exemplos 2 e 3.

[00343] A digestão de DIG-177 de comprimento completo a 50 minutos, sob estas condições, resultou em um fragmento grande de aproximadamente 43 kDa. Em virtude da ampla especificidade da proteinase K, os endpoints dos peptídeos foram de faixa heterogênea, no amino término, dos resíduos 5-73 e, no carbóxi término, dos resíduos 386-456. Dependendo dos endpoints dos peptídeos, em alguns casos, os fragmentos de CTP foram ligados ao fragmento grande da ligação de dissulfureto C88-C451. Descobriu-se que as regiões de suscetibilidade à proteinase K eram consistentes com os resultados para tripsina apresentados no Exemplo 3.

EXEMPLO 7 Caracterização de Eliminações Internas em DIG-177 para Atividade Inseticida e Estabilidade à Proteinase K

[00344] Três séries de eliminações sequenciais foram feitas em toda a região proteoliticamente processada de DIG-177, ~ resíduos 390-443 de SEQ ID NO: 2. O primeiro conjunto de eliminação foi de 5 aminoácidos, resultando em proteínas (DIG-921 a 927 ( SEQ ID NOs: 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76) e DIG-931 (SEQ ID NO: 78), o segundo 10 (DIG-969-973 (SEQ ID NOs: 80, 82,84, 86, 88)), o terceiro (DIG-985- 997 (SEQ ID NOs: 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112 114)) era de 15, 20, 25 e 43 resíduos. Cada série foi expressa em Pseudomonas, purificada e testada quanto à atividade inseticida contra a lagarta da raiz do milho Ocidental, conforme descrito nos Exemplos 2 e 3. A estabilidade das proteínas foi determinada por meio de digestão com proteinase K, conforme descrito acima. Em todos os casos, as proteínas mutantes tinham atividade inseticida. As proteínas foram aproximadamente tão suscetíveis à proteinase K quanto a DIG177; uma exceção notável é a DIG-995 (SEQ ID NO: 110), uma eliminação de aminoácido 43, a qual mostrou menos digestão.
Tabela 19
Descrição das eliminações em DIG-177

EXEMPLO 8 Determinação da Estrutura de Cristal da DIG-177 Tratada com Tripsina

[00345] Preparação de Corpo de Inclusão (IB). Pasta de células de Pseudomonas fluorescens que expressam DIG-177 de comprimento completo (SEQ ID NO: 2) foi transferida do armazenamento -80 °C para 4 °C e ressuspensa a 20% peso/v em tampão de lise gelado (Tris a 50 mM, NaCl a 200 mM, glicerol a 10%, Triton X-100 a 0,5%, EDTA a 20 mM, TCEP a 1 mM, pH de 7,5) e misturada cuidadosamente com um homogeneizador manual. A suspensão foi, então, passada através de um microfluidizador (M110EH) duas vezes a (16.000 psi), então, centrifugada (rotor SLC6000/14.000 g/40 minutos/4 °C). O sobrenadante foi descartado. O pélete de corpos de inclusão foi ressuspenso em tampão de lise a 10% peso/v em temperatura ambiente com 0,4g/L de lisozima (L-6876, Sigma-Aldrich) e totalmente ressuspenso por meio de homogeneização. A suspensão foi incubada a 30 °C du rante 30 minutos, com breves homogeneizações a cada 10 minutos. Os corpos de inclusão foram, então, centrifugados (rotor SLC-6000/14.000g/40 minutos/4 °C) e o sobrenadante descartado. O pélete foi ressuspenso uma última vez em tampão de lise gelado a 10% peso/v usando o homogeneizador e centrifugado (rotor SLC-6000/14.000 g/40 minutos/4 °C) e o sobrenadante descartado. O pélete de corpos de inclusão foi suspenso em tampão de lise gelado a 10% peso/v sem Triton X-100 (Tris a 50 mM, NaCl a 200 mM, glicerol a 10%, EDTA a 20 mM, TECP a 1 mM, pH de 7,5) usando o homogeneizador e centrifugado (rotor SLC-6000/14.000 g/40 minutos/4 °C) e o sobrenadante descartado; esta etapa foi repetida. Os corpos de inclusão foram ressuspensos para 30% (peso/v) em EDTA a 10 mM, pH de 8,0 ou divididos em alíquotas de 1,5 ml e congelados a -80 °C até necessários.

[00346] Preparação do Núcleo de Tripsina em DIG-177. Oito tubos de 2 ml de suspensão em IB de DIG-177 de comprimento completo foram descongelados e extraídos em um volume final de 80 ml (diluição a 1:5) de CAPS a 10 mM, pH de 11,0. O pH foi medido a 9,1 e, então, ajustado para 11,0 com NaOH. Ao extrato, 50 mg de tripsina recém preparada (25 mg/ml de solução de tripsina (Sigma, TLCK tratada com T1426-1G) em (HCl a 1 mM, CaCl2 a 5 mM). O pH foi mantido a 11,0 e a solução agitada durante a noite a 4 °C .

[00347] A solução foi aplicada a uma coluna Source 15Q 16/10 préequilibrada em tampão A (CAPS a 25 mM, pH de 11,0) em uma taxa de fluxo de 10 mL/minuto e eluída com um gradiente de Tampão A + NaCl a 1 M durante 75 minutos. DIG-177 truncada eluiu como um único pico grande, o qual foi concentrado de 100 mL para 10 mL usando quatro concentradores rotativos de 15 ml Amicon 10.000 MWCO em um rotor JA-12 a 4 °C e 5000 x g. A amostra para troca iônica concentrada foi aplicada a uma coluna de filtração de gel Superdex 75 26/90 pré-equilibrada em CAPS a 25 mM, pH de 11,0 e NaCl a 50 mM. A amostra foi eluída usando uma taxa de fluxo de 2,5 mL/minuto. As frações contidas no grande pico central de DIG-177 foram reunidas (80mL a 2,05 mg/mL).

[00348] Preparação de DIG-177 de Comprimento Completo. Cerca de 500 mg de IB foram descongelados a 4 °C e centrifugados a 23000 x g durante 25 min a 4 °C. O sobrenadante foi removido e o pélete de IB foi solubilizado em 30 mL de CAPS a 100 mM, pH de 11,0 e a suspensão foi suavemente agitada durante duas horas em temperatura ambiente para solubilizar a proteína DIG-177. Após solubilização, a mistura foi centrifugada a 23.000 x g durante 25 min a 4 °C. O sobrenadante foi submetido à diálise contra CAPS a 25 mM, pH de 10,0 de um dia para o outro.

[00349] A amostra de DIG-177 com tampão trocado foi, então, filtrada através de um filtro para seringa de 0,22 mícron e aplicada a uma coluna de troca iônica Source 15Q 16/6 em uma taxa de fluxo de 5 mL/min. A coluna foi pré-equilibrada com tampão A (CAPS a 25 mM, pH de 10). A proteína foi eluída com um gradiente em etapas de 20%, 30%, 40% e 50% de tampão B (tampão A + NaCl a 1 M). Cada eluição foi de ~ 50 mL. As frações foram coletadas a partir de cada eluição com base na absorbância de UV e analisadas por SDS-PAGE.

[00350] DIG-177 de comprimento completo estava nas frações de 20% de B, as quais foram reunidas e concentradas para ~ 30 mL usando um dispositivo de filtro para centrífuga com uma membrana com corte de peso molecular de 10 kDa (Millipore).

[00351] A amostra concentrada foi adicionalmente purificada por meio de cromatografia de exclusão de tamanho. Para cada ensaio, 4,0mL da amostra foram aplicados sobre uma coluna de filtração de gel Superdex 75 26/90 pré-equilibrada em CAPS a 25 mM, pH de 10, NaCl a 50 mM em uma taxa de fluxo de 2,5 mL/min. Dois picos foram observados; o primeiro pico eluiu no volume vazio e continha dímeros de DIG-177. As frações provenientes do pico 2 continham predominantemente monômeros. As frações provenientes do pico 2 foram reunidas separadamente e enviadas para experimentos de cristalização.

[00352] Determinação da Concentração de Proteína. O ensaio BCA (Pierce Life Technologies, Grand Island, NY) foi realizado de acordo com as instruções do fabricante, exceto que um reagente de trabalho a 1000 µL foi adicionado a uma amostra de 50 µl. Bradford Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA) foi realizado de acordo com as instruções do fabricante, exceto que um reagente de trabalho a 1000 µL foi adicionado a uma amostra de 20 µL.

[00353] Cristalização, Coleta de Dados e Determinação da Estrutura do Núcleo de Tripsina em DIG-177. O núcleo de tripsina em DIG-177 foi concentrado para 100 mg/mL. Os cristais iniciais foram obtidos usando Rigaku Reagents, Inc. Wizard Classic I (Bainbridge Island, WA). Após rastreio sob várias condições, os cristais adequados foram obtidos a partir de PEG 1000 a 20% (peso/v), fosfato de Na/ácido cítrico a 0,1 M, pH de 4,2; sulfato de lítio a 0,2 M. Os dados foram coletados a 100 K a partir de um único cristal em um detector Mar CCD-300 em LS-CAT (Advanced Proton Sources, Argonne National Laboratory). As constantes de célula foram a = 112,07, b =112,07, c= 76,6, α = 90,0, β = 90,0, γ =120,0. As coletas de dados iniciais na fonte original sugeriram o grupo espacial P65 ou P61; portanto, os dados foram inicialmente processados em P65. No entanto, análise subsequente levou à constatação de que o grupo espacial era P63.

[00354] A estrutura da forma truncada da toxina DIG-177 foi resolvida por meio do método de substituição molecular usando PHASER (1) (pacote CCP4 (Winn, M.D. et al., 2011), seguido por reconstituição manual e refinamento de modelo. A cadeia de polialanina da estrutura de cristal de Hemolisina B de Bacillus cereus (entrada 2NRJ no Protein Data Bank), a qual consiste nos resíduos 19- 334, foi usada como um modelo de pesquisa. O modelo final foi obtido realizando vários ciclos de refinamento que consistiam em construção de modelos usando COOT (Emsley et al., 2010), seguido de refinamento restringido com REFMAC (Murshudov et al., 1997).
Tabela 20
Coleta de dados e estatísticas de refinamento cristalográfico para a DIG-177 tratada com tripsina (PDB)

[00355] a Rassociação = 100Σ(h)Σ(i)|I(i)-|/ Σ(h)Σ(i)I(i) onde I(i) é a iª medição de intensidade de reflexão h e é a intensidade média a partir de múltiplas observações.

[00356] b Rcrist = Σ||Fobs|-|Fcalc||/ Σ|Fobs|. Onde Fobs e Fcalc são as amplitudes de fator de estrutura de dados e do modelo, respectivamente. Rlivre é Rcrist com 10% dos fatores de estrutura.

[00357] Cristalização, Coleta de Dados e Determinação de Estrutura da DIG-177 de Comprimento Completo. Proteína DIG-177 de comprimento completo foi concentrada para 15 mg/ml usando um filtro para centrífuga Amicon com uma membrana com corte de peso molecular de 10 kDa (Millipore) em tampão de HEPES a 10 mM, pH de 7,5 e NaCl a 25 mM. Os rastreios de cristalização iniciais foram realizados usando rastreios com Classics, Classics Lite, Classics II, PEG’s, PEG’s II, PhClear e PACT comercialmente disponíveis (Hampton Research, Aliso Viejo, CA) por meio do método de gotas assentadas em placas de cristalização de fundo redondo com 96 cavidades (Greiner Bio-One, GmbH, Alemanha) usando um Mosquito Robotic System (TTP LabTech, Hertfordshire, Reino Unido). Cristais de proteína DIG-177 de qualidade para difração foram crescidos a 291 K a partir de gotas assentadas contendo 3 mL da amostra de proteína e 1,5 mL de solução reservatório (ácido cítrico a 0,1 M, pH de 4,6, PEG 6000 a 4%). A análise de SDS-PAGE de amostras de proteínas obtidas através da dissolução dos cristais em tampão de SDS não descreveu quaisquer produtos de degradação e confirmou a presença apenas da proteína de DIG-177 de comprimento completo nas 3s usados para coleta de dados.

[00358] Para a coleta de dados, os cristais foram colhidos com glicerol a 20% (v/v) na solução reservatório. Os dados de difração foram coletados a 100 K a partir de um único cristal em um detector Mar CCD-300 em LS-CAT (Advanced Proton Sources, Argonne National Laboratory). Os dados foram processados e indexados com HKL-2000 (Z. Otwinowski e W. Minor, 1997). Os cristais pertenciam ao grupo espacial ortorrômbico P21212 e continha uma molécula de DIG-177 de comprimento completo por unidade assimétrica.

[00359] A estrutura da DIG-177 de comprimento completo foi resolvida por meio de substituição molecular usando PHASER (McCoy, A. J. J. Appl. Cryst. (2007)) com a estrutura da forma truncada de DIG-177 como um modelo de busca. O modelo final da toxina DIG-177 de comprimento completo foi obtido realizados vários ciclos que consistiam na construção de modelos manuais usando COOT (Winn, M.D. et al., 2011), seguido de refinamento da estrutura com REFMAC (Murshudov et al., 1997).
Tabela 21
Coleta de dados e estatísticas de refinamento de DIG-177 de comprimento completo (PDB: Ciclo para sujeição de verificação)

[00360] a Rassociação = 100Σ(h)Σ(i)|I(i)-|/ Σ(h)Σ(i)I(i) onde I(i) é a iª medição de intensidade de reflexão h e é a intensidade média a partir de múltiplas observações.

[00361] b Rcrist = Σ||Fobs|-|Fcalc||/ Σ|Fobs|. Onde Fobs e Fcalc são as amplitudes de fator de estrutura de dados e do modelo, respectivamente. Rlivre é Rcrist com 10% dos fatores de estrutura.

[00362] Estrutura Molecular de DIG-177 Tratada com Tripsina e DIG-177 de Comprimento Completo. O diagrama de fitas da estrutura molecular de Cry6Aa tratada com tripsina (DIG-177) mostrado na Figura 2 consiste em um núcleo de feixe alfa helicoidal com uma estrutura em gancho alfa helicoidal dobrada para cima sobre o feixe. Estruturalmente, a DIG-177 foi reconhecida como um hemolisina alfa helicoidal e compartilha similaridade estrutural com hemolisina E de Escherichia coli (1QOY; Wallace 2000) e o componente B de hemolisina BL de Bacillus cereus (2NRJ; Madegowda et al. 2008).

[00363] A estrutura molecular da DIG-177 de comprimento completo era quase sobreponível com a estrutura tratada com tripsina; os resíduos entre 125-128 e 387-451 não foram resolvidos; os resíduos entre 387-452 foram modelados. As estruturas são mostradas na Figura 2.

EXEMPLO 9 Construção de Variantes de DIG-177 Proteoliticamente Estáveis

[00364] Foi mostrado que a Cry6Aa (DIG-177) é uma proteína cristalina de Bacillus thuringiensis que possui atividade inseticida contra a lagarta da raiz do milho Ocidental (Diabrotica virgifera virgifera) em bioensaios de dieta. Proteólise na região aproximadamente entre os resíduos 390-451 leva a uma redução da atividade inseticida. Para limitar a suscetibilidade proteolítica de DIG177, a estrutura 3D molecular foi usada para conceber ligantes de substituição para esta região. O segmento substituído pelos ligantes usaram vários endpoints entre os resíduos 381 e 457. Alguns dos ligantes foram modelados usando a função "loop modeler" do software MOE (Molecular Operating Environment) do Chemical Computing Group (Montreal, Quebec, Canadá).

[00365] Os novos modelos foram expressos em Pseudomonas, purificados e ensaiados quanto à atividade inseticida e resistência relativa à proteinase K, conforme descrito nos Exemplos 4 e 6. Este trabalho demonstrou que diversas variantes tinham tanto atividade inseticida quanto aumento de resistência à proteinase K em relação à proteína precursora DIG-177.
Tabela 22
Variantes de DIG-177 testadas como conferindo maior resistência à protease

[00366] A sequência ligante é mostrada entre as marcas de barra. A atividade inseticida contra a lagarta da raiz do milho Ocidental é apresentada como % de mortalidade e a resistência relativa à proteinase K foi determinada usando o ensaio de proteinase K descrito no Exemplo 6 (0 = suscetibilidade à proteinase K similar à DIG-177; + = aumento de resistência à proteinase K em relação à DIG-177). -- são eliminações dentro da proteína DIG-177.

EXEMPLO 10 Caracterização de DIG-1000

[00367] DIG-1000 (SEQ ID NO: 116), uma nova variante da Cry6Aa que tem o resíduo de treonina 387 substituído por prolina 452 com o ligante de 7 resíduos: VATITSG, foi preparada. A região ligante foi selecionada usando a estrutura de cristal 3D para o núcleo de tripsina de DIG-177 e a função "loop modeler" do software MOE (Molecular Operating Environment) do Chemical Computing Group (Montreal, Quebec, Canadá). O ligante foi concebido para limitar a proteólise através de substituição do loop maior suscetível por um segmento curto menos suscetível (vide Figura 3).

[00368] DIG-1000 foi expressa em Pseudomonas, purificada e bioensaiadas, conforme descrito no Exemplo 3. Foi mostrado que a DIG-1000 tem atividade inseticida contra a lagarta da raiz do milho Ocidental.
Tabela 23
Atividade inseticida de DIG-177 e DIG-1000 contra a lagarta da raiz do milho Ocidental

[00369] Resistência à Proteinase K. DIG-177 e DIG-1000 foram expressas e purificadas conforme descrito no Exemplo 3. As proteínas foram testadas quanto à suscetibilidade à resistência à proteinase K (Figura 4) conforme no Exemplo 6. DIG-177 (54,2 kDa) mostrou degradação parcial substancial no ponto de tempo T = 0 (proteinase adicionada, amostra imediatamente retirada). A degradação continuou até que um núcleo proteoliticamente estável fosse observado em 90 minutos. Em contraste, DIG-1000 (47,3 kDa) não mostrou degradação em T = 0, alguma degradação parcial foi observada em T = 5 minutos, aproximadamente 50 por cento da proteína de comprimento completo foram convertidos em 10 minutos. Conversão de um núcleo proteoliticamente estável foi concluída em 50 minutos. Estes dados confirmaram que DIG-1000 é substancialmente mais resistente à proteinase K in vitro.

EXEMPLO 11 Expressão Transitória de DIG-1000 em Milho

[00370] A expressão transitória de DIG-177 e DIG-1000 foi testada usando bombardeamento de partículas de embriões de milho imaturos (B104) colhidos 10-12 dias após a polinização (documentos WO 2014/028295 A; US 2012/0060238 A1). As regiões codificadoras de DIG-177 (SEQ ID NO: 1) e DIG-1000 (SEQ ID NO: 115) foram reconstruídas, conforme descrito no Exemplo 1, de modo a refletir um códon com tendência para milho para o teste transitório em células de milho, resultando em SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 137, respectivamente. Um peptídeo de trânsito (TRAP), para dirigir as proteínas expressas para o compartimento de cloroplasto, também foi testado em DIG-177 e DIG-1000. As regiões codificadoras modificadas são mostradas em SEQ ID NO: 32 e SEQ ID NO: 139, resultando nos polipeptídeos de SEQ ID NO: 33 e SEQ ID NO: 140, respectivamente.

[00371] A expressão foi dirigida a partir de um plasmídeo com base em pUC que contém o promotor de ubiquitina de milho, a região codificadora de interesse e a região 3' não traduzida de peroxidase de milho 5, conforme mostrado na Tabela 23. Plasmídeos que expressam a proteína fluorescente amarela e PAT (fosfinotricina acetil transferase) foram usados como controles de expressão.
Tabela 24
Plasmídeos usados para expressão transitória de embriões de milho

[00372] Um estoque de partículas de ouro foi preparado pesando 50 mg de Gold Macrocarriers a 0,6 M ou 1 M (Bio-Rad, Hercules, CA) em um tubo para microcentrífuga estéril de 2,0 ml. As partículas foram lavadas três vezes com etanol, seguido por três lavagens com água esterilizada. Em cada lavagem, o material foi coletado por meio de centrifugação em uma microcentrífuga a 1500 g durante 2 minutos. As partículas foram suspensas em 500 l de glicerol estéril a 50% e armazenadas a -20 °C.

[00373] Espigas imaturas B104 com a superfície esterilizada foram usadas para o isolamento de embriões. Os embriões imaturos (10-12 dias após polinização; 1,8-2,4 mm) a partir de 3-4 espigas foram isolados em tubos para microcentrífuga de 2 ml contendo 1,75 mL de sais MS líquidos a 2,2-4,3 g/L (Murshige e Skoog, 1962) e 1 ml/L de solução de vitaminas MS modificada (1000x) ou 4,3 g/L de meio LS (Linsmaier e Skoog, 1965) e 1 ml/L de solução de vitaminas N6 de Chu (1000x), 68,4 g/l de sacarose, 36 g/l de glicose, 100-700 mg/L de L-prolina e com ou sem 1,5 mg/l de 2, 4 D (ácido 2,4- diclorofenoxiacético).

[00374] Após o isolamento de embrião, o meio líquido foi removido e descartado. Os embriões foram depois cultivados em placas de Petri contendo um meio de cultura semissólido para tratamento osmótico. Este meio consistia em 4,3 g/l de sais MS, 1 ml/l de solução de vitaminas MS modificada (1000x), 500 mg/l de MES, 100 mg/l de mioinositol, 100 mg/l de hidrolisado enzimático de caseína, 120 g/l de sacarose ou 45 g/l de cada um de sorbitol e manitol, com ou sem 3,3 mg/l de dicamba, 15 mg/l de nitrato de prata e 2,5 g/l de gelzan (Gelrite). Os embriões foram distribuídos em grades quadradas de 5 x 8 dentro da área alvo para o bombardeamento de partículas. Todas as placas foram incubadas durante 24 horas antes de bombardeamento de partículas em 24 horas, sob uma câmara de baixa luz de 50 µM a 27 °C.

[00375] Antes de revestimento das partículas de ouro, cada um dos DNA foi misturado a partir de construtos de interesse com um construto de controle que contém o gene PAT padrão em uma proporção de 1:1. Além disso, o DNA de um construto que contém um gene YFP foi usado para transformação como um controle visual. Cada um dos tubos contendo 50 µl de estoque de partículas de ouro acima foi suspenso em um tubo de 2,0 ml estéril. O seguinte foi adicionado a cada um dos tubos de partículas de ouro: DNA do construto de teste (5µg)/DNA do construto de controle (5 µg) de pDAB112364, 50 µl de CaCl2 a 2,5 M e 20 µl de espermidina a 0,1 M. Os tubos foram, então, agitados em vórtice em alta velocidade durante 10-15 minutos em temperatura ambiente, seguido por três lavagens com 200 µl de etanol a 100% e, finalmente, as partículas de ouro revestidas foram ressuspensas em 30 µl de etanol a 100% e todos os tubos foram colocados sobre gelo.

[00376] Dois macrotransportadores para cada um dos construtos testados foram marcados e 5 µL da mistura de DNA/ouro foram espalhados uniformemente sobre o centro de um microtransportador e deixados secar durante 10 minutos. Os discos com ruptura variando entre (650-1100 psi) (Bio-Rad, Hercules, CA) foram esterilizados com propanol a 70% e deixados secar parcialmente antes de bombardeamento. Duas placas contendo 40 embriões para cada um dos construtos foram bombardeadas. Os embriões bombardeados foram mantidos sobre os mesmos meios e incubados durante 24 horas sob condições de pouca luz a 50 µM a 27 °C de um dia para o outro.

[00377] Após 24 horas de bombardeamento, os embriões transformados com o construto de controle pDAB100286 foram observados quanto à expressão de YFP. Este controle foi usado para monitorar o processo de revestimento de DNA/ouro, bem como o processo de bombardeamento de partículas. Após confirmação da expressão de YFP em embriões de controle, duas placas de cada um dos construtos testados foram coletadas para análise de proteínas. Cada amostra continha 20 embriões, permitindo múltiplas repetições técnicas para análise de proteínas, bem como o processo de transformação. Um total de quatro amostras para cada um dos construtos foi submetido à análise de proteínas.

[00378] Após o bombardeamento e as incubações, as amostras foram armazenadas em um suporte para tubos agrupados com 96 cavidades a -80 °C até o dia da análise. Duas esfer as de aço Daisy™ e 300 µl de tampão de extração (solução de PBS contendo Tween 20 a 0,05% e 5 µl/ml de inibidores de protease, Sigma, catálogo número 9599) foram adicionados a cada tubo. As amostras foram moídas em um moinho de esferas Kelco durante 3 minutos na configuração máxima. As amostras foram centrifugadas a 3000 x g durante 5 minutos; 100 µl do sobrenadante foram transferidos para um tubo de ensaio vazio.

[00379] Métodos de eletroforese e blotting convencionais (Gallagher, S. et al., 2008) foram usados com dispositivos Invitrogen™ e reagentes básicos. Um anticorpo de coelho anti-Cry6a foi o anticorpo primário para a detecção de Cry6a. Todas as proteínas foram detectadas com um sistema de detecção de fluorescência Cy3 e digitalizadas usando um sistema de imagiologia GE Typhoon™ (GE Healthcare, Pittsburgh, PA).

[00380] Os resultados dos experimentos de expressão são mostrados na Figura 5. Análise de Western não mostra nenhuma expressão de proteínas Cry6Aa nos controles negativos, os quais incluíam os embriões de milho não bombardeados e aqueles bombardeados com os plasmídeos de YFP e PAT. As duas colunas mais à direita são padrões de proteína DIG-177, Cry6Aa de comprimento total (54,1 kDa) e DIG-1000 (47,3 kDa). A coluna com DIG-177 + TraP contém uma banda fraca acima do padrão, provavelmente representando a proteína precursora. Três outras bandas estão presentes, uma próxima ao tamanho do padrão DIG177, enquanto as outras são substancialmente menores, provavelmente indicando degradação parcial; a coluna DIG-177 mostra um padrão similar, no entanto, sem a proteína precursora putativa. DIG-1000 e DIG-1000 + TraP parecem idênticas, com bandas individuais que parecem migrar com o padrão DIG-1000 (representando alguma distorção das colunas finais do gel). Estes dados são consistentes com a sequência codificadora de DIG-1000 que expressa uma proteína inseticida em célula de planta estável, útil para o controle da lagarta da raiz do milho Ocidental.

EXEMPLO 12 Expressão Estável de Toxina Inseticida DIG-1000 em Dicot

[00381] Transformação de Arabidopsis. Arabidopsis thaliana Col01 é transformada usando o método de imersão floral (Weigel e Glazebrook, 2002). A colônia de Agrobacterium selecionada é usada para inocular culturas de 1 mL a 15 mL de caldo YEP contendo os antibióticos adequados para seleção. A cultura é incubada durante a noite a 28 °C com agitação constante a 220 rpm. Cad a cultura é usada para inocular duas culturas de 500 mL de caldo YEP contendo os antibióticos apropriados para seleção e as novas culturas são incubadas durante a noite a 28 °C com agitação cons tante. As células são peletizadas a aproximadamente 8700 x g durante 10 minutos em temperatura ambiente e o sobrenadante resultante é descartado. O pélete de células é suavemente ressuspenso em 500 mL de meio de infiltração = contendo: 1/2x sais de Murashige e Skoog (SigmaAldrich)/vitaminas B5 de Gamborg (Gold Biotechnology, St. Louis, MO), sacarose a 10% (peso/v), benzilaminopurina a 0,044 µM (10 µL/litro de 1 mg/mL em DMSO) e 300 mL/litro de Silwet L-77. Plantas de aproximadamente 1 mês de idade são mergulhadas nos meios durante 15 segundos, com o cuidado para assegurar submersão da inflorescência mais nova. As plantas são, então, colocadas sobre os seus lados e cobertas (transparente ou opaco) durante 24 horas, lavadas com água e colocadas na posição vertical. As plantas são cultivadas a 22 °C, com um fotoperíodo de 8 horas d e luz/16 horas de escuridão. Aproximadamente 4 semanas após a imersão, as sementes são colhidas.

[00382] Crescimento e Seleção de Arabidopsis. Sementes T1 recentemente colhidas são deixadas secar durante pelo menos 7 dias em temperatura ambiente na presença de um secativo. A semente é suspensa em uma solução de agar a 0,1%/água (Sigma-Aldrich) e, então, estratificada a 4 °C durante 2 dias. Para pr eparar para o plantio, Sunshine Mix LP5 (Sun Gro Horticulture Inc., Bellevue, WA) em bandejas de germinação de (10,5 polegadas x 21 polegadas) (T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN) é coberta com vermiculita fina, subirrigada com solução de Hoagland ( Hoagland e Arnon, 1950) até úmida, então, deixada escorrer durante 24 horas. A semente estratificada é semeada sobre a vermiculita e coberta com cúpulas de umidade (KORD Products, Bramalea, Ontário, Canadá) durante 7 dias. As sementes são germinadas e as plantas são cultivadas em câmara de crescimento Conviron™ (Modelos CMP4030 ou CMP3244; Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canadá) sob condições de dias longos (16 horas de luz/8 horas de escuridão) em uma intensidade de luz de 120-150 mol/m2seg sob temperatura (22°C) e umidade (40-50%) constantes. As plantas sã o regadas inicialmente com solução de Hoagland e posteriormente com água deionizada para manter o solo úmido, mas não molhado.

[00383] As cúpulas são removidas 5-6 dias após a semeadura e as plantas são pulverizadas com um agente de seleção químico para matar as plantas germinadas a partir de sementes não transformadas. Por exemplo, se o gene marcador selecionável passível de expressão em planta fornecido pelo vetor de transformação binário de plantas é um gene pat ou bar (Wehrmann et al., 1996), as plantas transformadas podem ser selecionadas pulverizando uma solução de 1000X Finale (glufosinato de amônio a 5,78%, Farnam Companies Inc., Phoenix, AZ). Duas pulverizações subsequentes são realizadas em intervalos de 5-7 dias. Os sobreviventes (plantas que crescem de forma ativa) são identificados 7-10 dias após a pulverização final e transplantadas para vasos preparados com Sunshine Mix LP5. As plantas transplantadas são cobertas com uma cúpula de umidade durante 3-4 dias e colocadas em uma câmara de crescimento Conviron™ sob as condições de crescimento mencionadas acima.

[00384] Aqueles versados na técnica de transformação de plantas dicotiledôneas entenderão que outros métodos de seleção de plantas transformadas estão disponíveis quando são usados outros genes de marcador selecionável passíveis de expressão em plantas (por exemplo, genes de tolerância a herbicidas).

[00385] Bioensaios de Inseto em Arabidopsis Transgênica. Foi mostrado que linhagens transgênicas de Arabidopsis que expressam proteínas de toxina inseticida DIG-1000 são ativas contra espécies de insetos sensíveis em ensaios de sobreposição de dietas artificiais. A proteína extraída a partir de linhagens de Arabidopsis transgênicas e não transgênicas é quantificada por meio de métodos adequados e os volumes de amostra são ajustados para normalizar a concentração de proteína. Os bioensaios são conduzidos em dieta artificial, conforme descrito acima. Arabidopsis não transgênica e/ou tampão e água são incluídos em ensaios como tratamentos de verificação de base.

EXEMPLO 13 Expressão Estável de Toxina Inseticida DIG-1000 em Milho

[00386] Transformação de Milho Mediada por Agrobacterium. Sementes de um cruzamento High II F1 (Armstrong et al., 1991) são plantadas em vasos de 5 galões contendo uma mistura de 95% de terra Metro-Mix 360 sem meio de crescimento (Sun Gro Horticulture, Bellevue, WA) e 5% de argila/terra argilosa. As plantas são cultivadas em uma estufa usando uma combinação de lâmpadas de halogeneto de metal e sódio em alta pressão com um fotoperíodo de 16 horas:8 horas de luz/escuridão. Para obtenção de embriões imaturos F2 para transformação, polinizações entre irmãos controladas são realizadas. Os embriões imaturos são isolados a 8-10 dias após a polinização, quando os embriões têm aproximadamente 1,0 a 2,0 mm de tamanho.

[00387] Infecção e Cocultura. A superfície das espigas de milho é esterilizada por meio de lavagem com sabão líquido, imersão em etanol a 70% durante 2 minutos e depois imersão em alvejante comercial a 20% (hipoclorito de sódio a 0,1%) durante 30 minutos antes de ser enxaguada com água estéril. A suspensão de células de Agrobacterium contendo um vetor superbinário é preparada transferindo 1-2 ciclos de bactérias cultivadas em meio YEP sólido que contém 100 mg/L de espectinomicina, 10 mg/L de tetraciclina e 250 mg/L de estreptomicina a 28 °C durante 3/2 dias em 5 ml de meio de infecção líquido (meio basal LS (Linsmaier e Skoog, 1965), vitaminas N6 (Chu et al., 1975), 1,5 mg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4- D), 68,5 g/L de sacarose, 36,0 g/L de glicose, L-prolina a 6 mM, pH de 5,2) contendo 100 µM de acetossiringona. A solução é submetida a vórtice até que uma suspensão uniforme seja obtida e a concentração é ajustada para uma densidade final de 200 unidades Klett usando um colorímetro Klett-Summerson com um filtro púrpura ou uma densidade óptica equivalente medida a 600 nm (OD600). Os embriões imaturos são isolados diretamente para um tubo para microcentrífuga contendo 2 ml do meio de infecção. O meio é removido e substituído por 1 ml de solução de Agrobacterium com uma densidade de 200 unidades Klett ou a OD600 equivalente e a solução de Agrobacterium e o embrião são incubados durante 5 minutos em temperatura ambiente e, então, transferidos para o meio de cocultura (Meio Basal LS, vitaminas N6, 1,5 mg/L de 2,4-D, 30,0 g/L de sacarose, L-prolina a 6 mM, 0,85 mg/L de AgNO3, 100µM de acetossiringona, 3,0 g/L de goma gelana (PhytoTechnology Laboratories, Lenexa, KS), pH de 5,8) durante 5 dias a 25 °C sob condições de escuridão.

[00388] Após a cocultura, os embriões são transferidos para meio seletivo, após o que isolados transformados são obtidos ao longo de aproximadamente 8 semanas. Para a seleção de tecidos de milho transformados com um plasmídeo superbinário que contém um geme marcador selecionável pat ou bar passível de expressão em planta, um meio com base em LS (meio basal LS, vitaminas N6, 1,5 mg/L de 2,4-D, 0,5 g/L de MES (mono-hidrato de ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico; PhytoTechnologies Labr.), 30,0 g/L de sacarose, L-prolina a 6 mM, 1,0 mg/L de AgNO3, 250 mg/L de cefotaxima, 2,5 L/g de goma gelana, pH de 5,7) é usado com bialafós (Gold BioTechnology). Os embriões são transferidos para meio de seleção que contém 3 mg/L de bialafós até que isolados embriogênicos sejam obtidos. Os isolados recuperados são tornados volumosos por meio de transferência para meio de seleção fresco em intervalos de 2 semanas para regeneração e análise adicional.

[00389] Aqueles versados na técnica de transformação de milho entenderão que outros métodos de seleção de plantas transformadas estão disponíveis quando outros genes marcadores selecionáveis passíveis de expressão em plantas (por exemplo, genes de tolerância a herbicidas) são usados.

[00390] Regeneração e Produção de Sementes. Para regeneração, as culturas são transferidas para meio de indução "28" (sais e vitaminas MS, 30 g/L de sacarose, 5 mg/L de benzilaminopurina, 0,25mg/L de 2,4-D, 3 mg/L de bialafós, 250 mg/L de cefotaxima, 2,5 g/L de goma gelana, pH de 5,7) durante 1 semana sob condições de pouca luz (14 µEm-2s -1), então, uma semana sob condições de muita luz (aproximadamente 89 µEm-2s -1). Os tecidos são posteriormente transferidos para meio de regeneração "36" (mesmo conforme o meio de indução, exceto que sem reguladores de crescimento). Quando as plântulas crescem até 3-5 cm de comprimento, elas são transferidas para tubos de cultura de vidro contendo meio SHGA (1972) (sais e vitaminas de Schenk e Hildebrandt); PhytoTechnologies Labr.), 1,0 g/L de mio-inositol, 10 g L de sacarose/e 2,0 g/L de goma gelana, pH de 5,8) para permitir o crescimento e desenvolvimento da parte aérea e raízes. As plantas são transplantadas para a mesma mistura de solo conforme descrito anteriormente aqui e crescidas até floração na estufa. Polinizações controladas para a produção de sementes são conduzidas.

EXEMPLO 14 Bioensaio de Milho Transgênico

[00391] A bioatividade das plantas estavelmente transformadas que expressam as toxinas inseticidas da presente invenção produzidas em células de planta é demonstrada por meio de métodos convencionais de bioensaio (vide, por exemplo, Huang et al., 2006). Um deles é capaz de demonstrar a eficácia, por exemplo, pela alimentação de vários tecidos de planta ou pedaços de tecido derivados de uma planta que produz uma toxina inseticida Cry6Aa manipulada para insetos-alvo em um ambiente de alimentação controlado. Alternativamente, extratos de proteínas podem ser preparados a partir de vários tecidos de planta derivados de uma planta que produz a toxina inseticida Cry6Aa manipulada e as proteínas extraídas incorporadas em bioensaios de dieta artificial, conforme anteriormente descrito aqui. Será entendido que os resultados de tais ensaios de alimentação devem ser comparados com bioensaios realizados de forma similar, os quais empregam tecidos de controle adequados provenientes de plantas hospedeiras que não produzem uma toxina inseticida Cry6Aa manipulada ou outras amostras de controle.

Claims

Proteína inseticida Cry6Aa modificada, caracterizada pelo fato de que compreende modificações escolhidas a partir do grupo que consiste em uma região suscetível à proteólise, afinidade aumentada do peptídeo carbóxi terminal (CTP) pela proteína no núcleo e adição de peptídeos de trânsito subcelulares.
Proteína inseticida Cry6Aa modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é escolhida do grupo que consiste em SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO : 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO: 106, SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 136, SEQ ID NO: 138, SEQ ID NO: 140 e SEQ ID NO: 144.
Proteína inseticida Cry6Aa modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é escolhida do grupo que consiste em SEQ ID NO: 110, SEQ ID NO: 112, SEQ ID NO: 114, SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 132, SEQ ID NO: 140 e SEQ ID NO: 144.
Proteína inseticida Cry6Aa modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é escolhida do grupo que consiste em SEQ ID NO: 116, SEQ ID NO: 118, SEQ ID NO: 120, SEQ ID NO: 140, SEQ ID NO: 144.
Proteína inseticida Cry6Aa modificada de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que é SEQ ID NO: 116.
Sequência de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica uma proteína inseticida Cry6Aa modificada como definida na reivindicação 1.
Sequência de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica uma proteína inseticida Cry6Aa modificada como definida na reivindicação 2.
Sequência de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica uma proteína inseticida Cry6Aa modificada como definida na reivindicação 3.
Sequência de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica uma proteína inseticida Cry6Aa modificada como definida na reivindicação 4.
Sequência de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica uma proteína inseticida Cry6Aa modificada como definida na reivindicação 5.
Construto de DNA, caracterizado pelo fato de que que compreende uma sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 6, operativamente ligada a um promotor que é capaz de dirigir a expressão em uma planta.
Método, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma planta transgênica ou parte de planta compreendendo uma proteína inseticida Cry6Aa modificada como definida na reivindicação 1.
Método, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma planta transgênica ou parte de planta compreendendo uma proteína inseticida Cry6Aa modificada como definida na reivindicação 3.
Método para controle de danos causados por pragas de insetos em plantas, caracterizado pelo fato de que compreende distribuição de uma quantidade eficaz como inseticida de uma proteína inseticida como definida na reivindicação 1, de modo que a praga de insetos venha a ingerir a referida proteína inseticida.
Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o dano por praga de insetos é causado por insetos da ordem Coleoptera.
Método, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o dano por praga de insetos é causado por larvas da raiz do milho Ocidental, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.
Método para controle de danos por pragas de insetos às plantas, caracterizado pelo fato de que compreende preparação de uma planta transgênica como definida na reivindicação 12, e apresentação da dita planta a uma população de pragas de insetos.
Método para controle de danos por pragas de insetos às plantas, caracterizado pelo fato de que compreende preparação de uma planta transgênica como definida na reivindicação 13, e apresentação da referida planta a uma população de pragas de insetos.
Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o dano por praga de insetos é causado por insetos da ordem Coleoptera.
Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o dano por praga de insetos é causado por larvas da raiz do milho Ocidental, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.
Uso de uma planta ou parte de planta compreendendo uma sequência de ácido nucleico como definida na reivindicação 6 ou 8, caracterizado pelo fato de que é para cruzar com uma segunda planta, regenerar uma planta transgênica, plantar ou cultivar um campo de plantas transgênicas ou produzir um produto de planta.
Invenção, caracterizada em quaisquer formas de suas concretizações ou em qualquer categoria aplicável de reivindicação, por exemplo, de produto ou de processo ou uso ou qualquer outro tipo de reivindicação englobada pela matéria inicialmente descrita, revelada ou ilustrada no pedido de patente.