BR102014032447A2 - composições antileishmania contendo o fulerol e uso - Google Patents

Abstract

composições antileishmania contendo o fulerol e uso. a presente invenção refere-se às composições farmacêuticas contendo fulerenos, preferencialmente o fulerol, que são nanoestruturas esféricas de carbono, como novas ferramentas para o tratamento das leishmanioses visceral e cutânea. as composições antileishmania contendo o fulerol podem compreender ainda um outro fármaco leishmanicida ou imunomodulador, estando na forma livre ou associada a um nanocarreador, tal como lipossomas, que confere propriedades farmacocinéticas mais favoráveis aos princípios ativos. o fulerol demonstrou de forma surpreendente uma atividade antileishmania, assim como uma capacidade de reduzir a hepatotoxicidade do antimoniato de meglumina quando administrado em associação em modelo animal de leishmaniose visceral. desta forma, o fulerol apresentou-se como o primeiro fármaco a demonstrar a dupla capacidade de exercer ação antileishmania sem efeitos colaterais e de reduzir a toxicidade de outro fármaco leishmanicida sem interferir na sua atividade farmacológica. por fim, a invenção compreende o uso de composições farmacêuticas contendo fulerenos para o tratamento das leishmanioses.

Description

COMPOSIÇÕES ANTILEiSHMANIA CONTENDO O FULEROL E USO

[001] A presente invenção refere-se às composições farmacêuticas contendo fulerenos, preferencialmente o fuieroi, que são nanoestruturas esféricas de carbono, como novas ferramentas para o tratamento das leishmanioses visceral e cutânea. As composições antíleishmania contendo o fulerol podem compreender ainda um outro fármaco Ieishmanicida ou imunomodulador, estando na forma livre ou associada a um nanocarreador, tal como lipossomas, que confere propriedades farmacocinéticas mais favoráveis aos princípios ativos. O fulerol demonstrou de forma surpreendente urna atividade antíleishmania, assim como uma capacidade de reduzir a hepatotoxicidade do antimoniato de meglumina quando administrado em associação em modeio animal de leishmaniose visceral. Desta forma, o fulerol apresentou-se como o primeiro fármaco a demonstrar a dupla capacidade de exercer ação antíleishmania sem efeitos colaterais e de reduzir a toxicidade de outro fármaco Ieishmanicida sem interferir na sua atividade farmacológica. Por fim, a invenção compreende o uso de composições farmacêuticas contendo fulerenos para o tratamento das leishmanioses.

[002] A leishmaniose está entre as doenças tropicais mais negligenciadas no mundo, segundo a resolução da Sexagésima Assembléia Mundial da Saúde, em 2007. Epidemiologicamente, mais de 12 milhões de pessoas encontram-se infectadas no mundo, sendo 1,3 milhões de novos casos registrados a cada ano, com cerca de 20 a 30 mil mortes anuais, cuja doença afeta as populações mais pobres de 88 países (países em desenvolvimento) (World Health Organization -WHO. Report of the Fifth Consuitative Meeting on Leishmanía/HIV Coinfection. Addis Ababa, Ethiopia, 20 a 22 march 2007; WHO. Leishmaniasis. Fev. 2013. Disponível em; http://www.who,int/mediacentre/factsheets/fs375/en/#. Acessado em; 16 de dezembro de 2013).

[003] As leishmanioses são doenças parasitárias causadas por mais de 20 espécies de protozoários do gênero Leishmania spp., da família dos Trypanosomatidae, parasitos hemoflagelados que mostram preferência pelos fagolisossomos do sistema fagocítico mononuelear. São transmitidas para os humanos pela picada do vetor, as fêmeas dos gêneros Phleboiomo sp. e Lutzomyia sp. infectadas. A doença se apresenta com três manifestações clínicas diferentes; viscerat, ou comumente conhecida como calazar; a cutânea; e a muco-cutânea. (RICCIARDI, L.V. Terapêutica antileishmania: revisando e! pasado, ei presente y ei futuro. Gac. Méd. Caracas, v. 117, n. 2. μ.93-111, 2009), [004] A leishmaníose cutânea é a forma mais comum de leishmaníose e apresenta- se por uiceras distribuídas nas partes expostas do corpo, deixando cicatrizes ao iongo da. vida e incapacidade grave. Cerca de 1/3 dos casos ocorrem nas Américas, na bacia do Mediterrâneo, Ásia Centrai e Oriente Médio. A ieishmaniose mucocutânea ieva às lesões mucosas mutiiantes, que consistem na destruição parciai ou total das membranas mucosas do nariz, boca e garganta, sendo a maior parte dos casos relatados na Bolívia. Brasil e Peru (World Health Organízatron WHO, Leishmaniasis. Fev. 2013. Disponível em: http://www.who. int/mediacentre/factsheets/fs375/en/#. Acessado em: 16 de dezembro de 2013).

[005] Contudo, a forma mais grave de leishmaníose compreende a leishmaníose visceral. 90% dos novos casos de calazar ocorrem em seis países: Bangladesh, Brasil, Etiópia, índia, Sudão do Sul e Sudão. A forma zoonótica, para a qual os cães são o principal reservatório e fonte de infecção da doença nas áreas endêmicas, está presente na Bacia do Mediterrâneo, China, Oriente Médio e América do Sul, e é causada pela Leishmania infantum infantum e Leishmania infantum chagasi, sendo esta última a espécie causadora da ieishmaniose visceral no Brasil (GRIENSVEN, J.; BALASEGARAM, M.; MEHEUS, F. et ai. Combination therapy for visceral ieishmaniasis. Lancet fnfect Dis„ v.10, p.184-94, 2010).

[006] O ciclo de vida do parasito é metaxênico, onde o agente passa por transformações no organismo do vetor fiebotomíneo, inseto díptero. O protozoário flagefado L. infantum é encontrado na forma móvel promastigota metacíclica no vetor, e quando fagocitado pelos macrófagos do hospedeiro vertebrado se transforma na forma imóvel amastigota. O cicio tem início com a inocuiação de formas promastigotas infectantes no hospedeiro vertebrado durante o repasto sanguíneo. Ao atingirem a circufação sanguínea, as formas promastigotas utilizam de mecanismos específicos para sobreviver à lise celular, que será ativada pelo sistema complemento. Devido a este mecanismo protetor, o parasito sobrevive ao ataque do hospedeiro e ainda consegue invadir macrófagos através da manipulação de receptores celulares (CAMPOS-PONCE M, PONCE C, PGNCE E, MAINGON RDC. Leishmania chagasí/infantum; further investigatíons on Leishmania tropism in atypicai cutaneous and visceral leishmaniasis foci in Central America. Experimental Parasitotogy, New York, v. 109, p. 209-219, 2005). No interior destes, o parasito encontra-se protegido contra a resposta imune do hospedeiro, residindo no ambiente ácido do iisossomo secundário do macrófago onde sofre sucessivas multiplicações. Uma vez infectado, o hospedeiro torna-se reservatório do parasito.

[007] Em humanos, a leishmaniose visceral apresenta-se como uma enfermidade generalizada, crônica, caracterizada por febre irregular e de longa duração, hepatoesplenomegaiia, tinfadenopatia, anemia com leucopenia, hipergamaglobulinemia e hipoaibuminemia, emagrecimento, edema e estado de debilidade progressivo, levando à caquexia e, até mesmo, ao óbito. A evolução das formas clínicas é diversa, podendo o indivíduo apresentar desde cura espontânea, formas oligossintomáticas e assintomáticas, até manifestações graves, podendo alcançar letalidade entre 10% e 98% em casos tratados inadequadamente e não tratados. Nos últimos anos, a letalidade da leishmaniose visceral vem aumentando gradativamente, passando de 3,6% em 1994 para 6,7% em 2003, com um incremento de 85%, e para 8,4% em 2004 (ALVARENGA, D.G.; ESCALDA, P.M.F.; COSTA, A.S.V. et ai, Leishmaniose visceral: estudo retrospectivo de fatores associados à letalidade. Rev, Soc. Bras. Med. Trop,, v. 43, n, 2, p. 194-97, mar-abr 2010).

[008] Compostos antimoniais foram utilizados no tratamento da leishmaniose pela primeira vez em 1912 peio médico brasileiro Gaspar Vianna, ínicialmente na forma trivaiente. Embora os antimoniais pentavalentes, como o antimoniato de meglumina (Glucantime®, Sanofi-Aventis), tenham sido reconhecidos como clinicamente eficazes em 1947, atualmente ainda são os fármacos de primeira escolha para todas as leishmanioses na maioria dos países em desenvolvimento (BERMAN JD. Human leishmaniasis: clinicai, diagnostic, and chemotherapeutic developments ín the iast 10 years.Clin. Infect. Dis. 24, 684, 1997).A anfotericina B suas várias formulações são utilizados como medicamentos de segunda escolha (Ministério da Saúde. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral, Brasília, 2003) [009] No Brasil, a terapêutica das ieishmanioses consiste no uso do antimoniato de meglumina (RICCIARDI, L.V, Terapêutica antileishmania: revisando ei pasado, el presente y el futuro. Gac. Méd. Caracas, v,117, n. 2, p.93-111, 2009). Todavia, alguns fatores relacionados à farmacocinética deste farmaco desfavorecem o seu uso. A baixa absorção oral e elevada depuração piasmátiea determinam que seja administrado diariamente por via parenteral (endovenosa ou intramuscular), por um período de 20 a 40 dias. Além disso, os efeitos colaterais representam um problema importante no uso dos antimoniais pentavalentes. Estes aparecem principalmente ao finai do tratamento e incluem náuseas, vômitos, diarréia, atralgias, mialgias, anorexia, elevação dos níveis de enzimas hepáticas, anomalias eletrocardiográficas, convulsões, pancreatite química e nefrotoxicidade. Reclamações de pacientes com sensação de dor no local e no momento da aplicação desses medicamentos são também comuns (FRÉZARD et al. Pentavalent Antimoniais: New Perspectives for Old Drugs. Moiecules 14, 2317, 2009).

[010] O modelo geralmente aceito para o mecanismo de ação dos antimoniais pentavalentes (SbV) é que estes seriam um pró-fármaco, sendo reduzido à forma ativa e tóxica de antímônio trivalente (Sblil), que destrói as formas amastigotas dentro do fagoíisossomos dos macrófagos. Neste contexto, Sblil promovería desbalanço no metabolismo dos tióis, resultando em estresse oxidativo e apoptose (FRÉZARD et al. Pentavalent Antimoniais: New Perspectives for Old Drugs. Moiecules 14, 2317, 2009).

[011] Contudo, o Gíucantime® é contra indicado em pacientes que fazem uso de beta-bfoqueadores e drogas antíarrítmicas, com insuficiência renal ou hepática, em mulheres grávidas nos dois primeiros trimestres de gestação. Não há contraindicações absolutas ao uso da anfoteriGina B; entretanto, complicações renais limitam o seu uso (Ministério da Saúde. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral. Brasília, 2003).

[012] Uma estratégia atualmente recomenda peia Organização Mundial da Saúde (OMS) refere-se ao tratamento com associação de fármacos leishmanicídas diferentes, tendo como principais benefícios, um tratamento mais eficaz e seguro e com menor risco de desenvolvimento de resistência (Ministério da Saúde. Manual de vigilância e controle da leishmaniose visceral. Brasília, 2003) Dentre os mediGamentos que podem vir a substituir os antimoniais pentavalentes destacam-se: anfoterícína B lipossomal (AmBísome®), miltefosina (impávido®) e paromomicina ou aminosidina. Entretanto, o uso desses medicamentos até hoje encontra-se limitado, seja pelo elevado custo e por problema de estabilidade (Ambisome®), pela baixa eficácia (paromomicina), por efeitos tóxicos indesejáveis (miltefosina, paromomicina) ou pelo aparecimento de resistência (miltefosina) (FRÉZARD et ai. Pentavalent Antimoniais: New Perspectives for Old Drugs. Moiecules 14, 2317, 2009).

[013] Outro problema na terapêutica dessa doença no Brasil é sua grande ocorrência em zonas rurais, o que dificulta a assistência aos pacientes que têm que se deslocar até um centro de saúde para receber o tratamento sob controle médico. Nesse contexto, os casos de interrupção de tratamento se tornam frequentes, o que pode resultar no aparecimento de resistência ao medicamento.

[014] No cão, o principal reservatório doméstico de L. infantum chagasi, é recomendada a utilização de uma combinação de antimoníato de meglumina com alopurinol ou a combinação de miitefosina e alopurinol. O prolongamento do tratamento pode ser necessário e o prognóstico pode variar de favorável a desfavorável, isso dependerá do estado clínico e da resposta imunológica do animal (DANTAS-TORRES, F.; SOLANO-GALLEGO, L; BANETH, G.; RIBEIRO, V. M. et al. Canine leishmaniosis in the Old and New Worlds: unveiled similarities and differences. Trends in Parasitology, Oxford, v. 28, n. 12, p. 531-538, 2012). Todavia, independente do fármaco de escolha, a cura parasitológica está muito longe de ser obtida, uma vez que mesmo que o tratamento permita redução da transmissão do agente através dos flebotomíneos, isto ocorre por um curto período. O que vai determinar a eficiência do tratamento está relacionado com o estado imune do cão, a farmacocinética e a sensibilidade de cada isolado de Leishmania, ou a resistência destes aos medicamentos (AIT-OUDHIA, K.; et al. In vitro susceptibilíty to anttmoniais and amphotericin B of Leishmania infantum strains isolated from dogs in a region lacking drug selecion pressure. Veterinary Parasitology, Amsterdam, v. 187, p. 386-393, 2012).

[015] As evidências sobre a ineficácia do tratamento farmacológico de cães infectados são cumulativas; elas demonstram que o animai apesar de apresentar melhoras clínicas não apresenta reversão do estado infectado, o que mantém o cão como fator de risco para a população e ainda aumenta a possibilidade de gerar cepas resistentes aos medicamentos de uso humano. Por não existir estratégias suficientes para evitar a transmissão da doença aos homens e animais, a conduta atual de maior segurança indicada é o sacrifício dos cães infectados (ORGANIZAÇÃO PANAMERICANA OE SAÚDE - OPAS. Encuentro sobre vigilância, prevención y control de leishmaniasis visceral (LV) en el Cono Sur de Sudamérica. Foz do Iguazú, Brasil. 2009. Disponível em: http://new.paho.org/hq/index. php?option=com_docman&task=doc_view&gíd=16961 & ftemid=, Acesso em: 17 de dezembro de 2013).

[016] Nesse contexto, a inexistência de tratamento efetivo da ieishmaniose viscerai canina representa uma importante limitação da terapêutica atuai. O pequeno número de medicamentos disponíveis associado às limitações encontradas no seu uso aponta para a necessidade urgente de desenvolver novos fármacos ou formulações.

[017] Uma estratégia bem sucedida para aumentar o índice terapêutico de fármacos contra a Ieishmaniose viscerai refere-se à sua associação reversível a um nanossistema carreador, permitindo prolongar sua meía-vida no organismo e direcioná-los para os sítios de infeção (FRÉZARD, F.; DEMíCHELI, C. New deüvery strategies for the old pentavalent antimonial drugs. Expert Opínion on Drug Deíivery, v. 7, p. 1343-1358, 2010), [018] Entre os nanossistemas carreadores de medicamentos atualmente disponíveis, os lipossomas ocupam uma posição de destaque. Essas vesículas esféricas, constituídas por uma ou várias bicamadas concêntricas de lipídeos, podem armazenar em seu compartimento aquoso interno princípios ativos hidrossolúveis ou terem princípios ativos iipofíiicos ou anfifíiicos incorporados em suas membranas. Lipossomas convencionais são tipicamente formados de um fosfolipideo. tai como a fosfatidilcolína, ou de um surfactante não iônico. Podem também incluir na sua composição o colesterol, um fosfolípideo com carga negativa, como por exemplo, fosfatidifglícerol, ácido fosfatidico, dicetilfosfato, e/ou um fosfolípideo com carga positiva, tal como esterarilamina.

[019] O medicamento administrado por via parenteral na forma encapsulada em lipossomas é liberado lentamente, evitando, por consequência, sua rápida eliminação pelo organismo. O resultado é um aumento da biodisponibilidade do medicamento, com potenciaiização da ação e redução da toxicidade.

[020] Por serem rapidamente clareados da circulação sanguínea pelos macrófagos do sistema fagocítico mononuclear, principalmente o fígado, o baço e a medula óssea, os lipossomas convencionais carregam a droga para os principais sítios de infecção da Ieishmaniose visceral, o que disponibiliza uma maior quantidade do fármaco para interagir com o parasito. Nesse contexto, foi desenvolvida uma formulação de anfotericina B em lipossomas convencionais (AmBisome) que foi usada com sucesso no tratamento de pacientes não responsivos aos medicamentos antimoniais, o mesmo ocorrendo no tratamento de pacientes com a forma PKDL, sem relato de efeitos colaterais. A eficácia na faixa de 100% em pacientes imunocompetentes rendeu-lhe a aprovação pela U.S. Food and Drug Adminístration (FDA) como a primeira apresentação à base de üpossomas a ser reconhecida para tratamento do caiazar (MEYERHOFF A. U.S. Food and Drug Administration approval of AmBisome (liposomal amphotericin B) for treatment of visceral leishmaniasis. Clinicai Infecííous Disease, v. 28, p. 42-48, 1999).

[021] Encontra-se também no estado da técnica, pedido de patente intitulado “COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA COMPREENDENDO LIPOSSOMAS CONVENCIONAIS E LIPOSSOMAS DE CIRCULAÇÃO PROLONGADA COMO SISTEMA ENTREGADOR DE FÁRMACOS LEISHMANICIDAS” (BR102012005265) que reivindica composições farmacêuticas para o tratamento da leishmaniose visceral caracterizada por compreender a associação de üpossomas convencionais e de üpossomas de círcuiação prolongada como sistema entregador de fármacos ieishmanícidas. Essa composição permite que o fármaco atinja com eficiência todos os sítios de infecção peto parasito, sendo que os üpossomas de cicuiação prolongada promovem o direcionamento mais efetivo de fármacos Ieishmanícidas para a medula óssea e o baço, enquanto üpossomas convencionais atuam no direcionamento do fármaco para o fígado.

[022] Os fulerenos foram descobertos em 1985 (ADAMS, P.D., GROSSE-KUNSTLEVE, R.W., HUNG, L.-W., et ai. C60: buckminsterfullerene. Nature, v. 318, p.162.163, 1985) e representam uma família extensa de nanoestruturas esféricas de carbono, tendo como exemplo clássico a molécula de 0« denominada fuiereno. Devido ás suas propriedades químicas e físicas, estas moléculas tornaram-se alvos atraentes para o uso na medicina (REBECCA, ML; HSING-LIN, W.; JUN,G., et al. Impact of physicochemical properties of engineered fulierenes on key. Toxic. and App. Pharmac., v.234, p.58-67, 2009).

[023] Essas nanoestruturas destacam-se pela alta estabilidade química e sua capacidade de compiexar radicais livres e promover a expressão gênica de enzimas antioxidantes, inibindo os danos oxidativos (JENSEN, A.W.; WILSON, S.R., SCHUSTER, D.l. Bioiogícal Applications of Fulierenes . Bioorg. Med. Chem. v. 4, 767-79, 1996). Os fulerenos possuem alta reatividade com espécies reativas de oxigênio (ROS), tais como superóxtdo, radicais hidroxüados e oxido nítrico, os quais ataGam macromoléculas biológicas como proteínas, lipídeos e DNA (BOSI, S.; ROS T.D.; SPALLUTO, G. et a!, Fulierene derivatives: an attractive tool for biological applications, v. 38, p. 913-23, 2003). Entretanto, a aplicação tecnológica do fuiereno na área bíomédíca tem sido limitada pelo caráter hidrofóbico da molécula. Neste contexto, foi desenvolvida uma ciasse de fulerenos polihidroxiiados, também chamados de fuíerenot ou fulerot, formados por modificação química, A solubilidade de cada molécula de fulerenol é dependente do número de grupos hidroxiía introduzidos (KOKUBO, K. Water-Soluble Singte-Nano Carbon Particies: Fullerenol and Its Derivatives. The Delivery of Nanoparticles. <Disponível em: http://www.intechopen.com/download/geVtype/pdfs/id/36889>. Acessado em: 18 de dezembro de 2013). Dentre estas moléculas, foi feita a adição de 22-24 hidroxüas na sua superfície, gerando um composto hidrofílico denominado fulerol, o que aumenta sua solubilidade em solução aquosa e reduz a sua citotoxicídade (Lt, J » TAKEUCHI, A., OZAWA, M„, LI, X., et al, Fuilerol formation catalyzed by quaternary ammonium hydroxides. J. Chem. Soc., Chem, Commun, p. 1784-1785, 1993). Desde então, estas moléculas vem sendo estudadas pelo seu potencial terapêutico em diferentes patologias, incluindo doenças infectocontagiantes, que envolvem o estresse oxidativo. oncóticas.

[024] Um derivado polihidroxilado de fulereno solúvel em água, o fuiereneí, demonstrou atividade antiviral em céluías mononucieares periféricas de humanos (PBMC) com infecção aguda e células H9 cronicamente infectadas com vírus HIV-1, apresentando EC50 de 7,3±5,9 μΜ e 10,8+8,2 μΜ, respectivamente. Jã em células PBMC infectadas de forma aguda com HIV-2ROD, cepa resistente aos fármacos anti-retrovirais, o fulerenel apresentou uma EC50^ 0,0Ü3±G,004 μΜ, mostrando-se portanto altamente eficaz como fármaco antiviral no tratamento desta síndrome (Schinazi, R. F.; Sijbesma, R.. Srdanov, G.; Hiíí, C. L.; Wudl, F. Synthesis and Virucidal Activity of a Water-Soluble, Configurationally Stabfe, Derivatized C60 Fullerenel. Antimicrob. Agents Chemother, v. 37, p. 1707-10. 1993).

[025] Foi comprovado que o fulerol pode agir como fármaco neuroprotetor em doenças degenerativas relacionadas ao estresse oxidativo (DORDEViC, A. e BOGDANOVIC, G. Fuliereno! - a new nanopharmaceutic? Arch. Oncof., v.16, p.42-5, 2008). O mecanismo de neuroproteção mediada pelo fulerenol ocorre pela inibição dos receptores para glutamato, e também pela redução da liberação de gfutamato via aumento nas concentrações intracelulares de cálcio, um mecanismo crítico de excitotoxicidade em neurônios {SILVA, G.A. Nanotechnology approaches for the regeneration and neuroprotection of the central nervous System. Surgical Neuroíogy , v. 63, p. 301-306, 2005).

[026] Já se sabe que o fulerot não apresenta toxicidade aguda ou sub-aguda em roedores e protege os tecidos de danos ceiuiares causados por ROS após exposição a substâncias tóxicas pro-oxidántes incluindo alguns fármacos, por absorver estes radicais livres que causariam injúrias teciduais e celulares (BOSí. S.; DA ROS, T.; SPALLUTO, G., et aí. Fullerene derivatives: an attractive toei for biologícai applications. Europear Journal of Medicinai Chemistry, v. 38, p, 913-23, 2003).

[027] Uma patente concedida intitulada "FULLERENE PHARMACEUTlCAL COMPOSITIONS FOR PREVENTING OR TREATÍNG DiSORDERS” (US 6.777.445 82), refere-se a um método para a prevenção e tratamento de infecções bacterianas causadas por bactérias gram-positivas e gram-negativas e doenças virais, taís como dengue e encefaiite virai compreendendo a administração de composições farmacêuticas contendo um fulereno, sendo este administrado in vivo numa quantidade de cerca de 0,001 a cerca de 100 mg/kg de peso corporal do indivíduo. Entretanto, nesta invenção, foi testado um único fulereno solúvel em água derivado de ácido carboxílico de fórmula estrutural Cm(C3) simétrico, se diferenciando primordialmente da presente invenção por esta ser um fulereno com adição de 22-24 hidroxilas na superfície, além desta não reivindicar a administração parentera! de formulações com nanossistemas carreadores. Ademais, distingui-se por se tratar do uso do fuleroi para tratamento das leishmanioses visceral e cutânea.

[028] Outra patente concedida, a US 7.947.262 B2, intitulada “USE OF FULLERENES FOR THE TREATMENT OF MAST CELL AND 8ASOPHIL-MEDíÂTED DISEASE” que compreende o uso de derivados fulerenos solúveis em água, preferencialmente C4o-C8o para o tratamento de distúrbios envolvendo células do sistema imune como mastócitos e basófilos periféricos sanguíneos relacionados com processos alérgicos e inflamatórios, como artrite, Essa invenção refere-se ainda a moléculas quiméricas de fulerenos solúveis em água funcíonaiizadas com compostos capazes de se ligar a receptores presentes em mastócitos ou basófilos, mediando a liberação de citocinas e imunoglobulínas, como por exemplo peptídeos derivados de fatores de crescimento de céluías-tronco. A patente apesar de reivindicar composições farmacêuticas de fulerenos C^-Cao encapsulados em lipossomas, não avalia pré-clinica e clinicamente, e tampouco especifica as formulações lipossomais. Além de apresentar uma aplicabilidade distinta da tecnologia aqui descrita.

[029] A patente intitulada “FINELY PARTICULATE COMPOSITE CONTAIN1NG CARBON COMPOUND ENCAPSULATED THEREIN" (US 2007/0077432 A1), que reivindica composições contendo nanocompostos a base de polímeros fechados de carbono Cso-Caooo, preferencialmente entre 60-120 átomos de carbono, como fulerenos ou nanotubos podendo conter um metal associado, sendo estes empregados na medicina para a terapêutica ou usados para diagnósticos, distingui-se da presente tecnologia por esta compreender composições antileishmanla contendo fulerenos, preferencialmente o fulerol, estando estes em associação a fármaco ieishmanicida ou imunomoduiador, livre ou encapsulado em nanossistema carreador coloidaL

[030] Assim, diante do que foi encontrado no estado da técnica, frente à problemática do alto índice mundial de casos de infecção por Leishmania spp., dos graves efeitos colaterais ocasionados pelo medicamento atual antimoniato de megiumina e do número escasso de outros medicamentos disponíveis para o tratamento das letshmanioses, conclui-se que as composições antileishmania contendo o fulerol e demais composições contendo um íulereno solúvel em água mostram-se ferramentas promissoras para serem produzidas e utilizadas na terapêutica contra as letshmanioses, A presente invenção relata de forma surpreendente a atividade antileishmania do fulerol, assim como sua dupla capacidade de exercer ação antileishmania sem efeitos colaterais e de reduzir os efeitos colaterais do antimoniato de megiumina sem interferir nas propriedades farmacológicas deste, quando administrado em associação via parenteral. O tratamento de camundongos infectados experimentalmente com Leishmania infantum chagasi com fulerol livre ou encapsulado reduziu a carga parasitária hepátíca de modo equivalente ao observado pelo antimoniato de megiumina. O fuferol apresentou uma maior atividade antileishmania na forma encapsuiada em lipossomas que na forma livre. Todavia, quando comparada a posoiogia deste (5 doses de 0,05 mg/kg a cada 4 dias) com a do medicamento de primeira escolha (20 doses de GSucantíme 120 mg Sb/kg/dia), o fulerol mostrou-se muito mais eficaz considerando a baixa dose administrada e o longo intervalo de tempo entre as doses. Ademais, quando avaliado o tratamento com fulerol encapsulado em lipossomas em associação ao Glucantíme, não foram observadas as alterações hístopatoiógicas no fígado dos animais ocasionadas com o uso do fármaco de primeira escolha e que caracterizam a hepatotoxicrdade. O que demonstra a ação hepatoprotetora do co-tratamento com o fulerol encapsulado em lipossomas. Portanto, essa invenção reivindica composições farmacêuticas contendo os fulerenos como novos medicamentos antíleishmania e o uso destes em associação com fármaco(s) leishmanicida(s) ou imunomodulador(es) para potenciar a eficácia e reduzir a toxicidade dos mesmos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[031] Figura 1; A figura 1 mostra de forma comparativa a carga parasitária no fígado de camundongos BALB/c infectados experimentaímente com Leishmania infantum (modelo murino de leishmaniose visceral). A quantidade de parasitos foi determinada por PCR em tempo reai quantitativa, após 20 dias de tratamento administrados por via intraperitoneal com doses diárias de Glucantime (120 mg Sb/kg), fulerol livre (0,05 mg/kg), fuferol encapsulado em lipossomas (0,05 mg/kg) e salina (controle negativo).

[032] Figura 2: A figura 3 mostra a eficácia do tratamento associando o fulerol com Glucantime em modelo murino de ieishmaniose visceral, sendo o fulerol administrado na forma livre ou encapsulada em lipossomas. Avaliou-se a carga parasitária no fígado de camundongos BALB/c infectados com Leishmania infantum chagasi, determinada por PCR em tempo reai quantitativa, após 20 dias de tratamento por via intraperitoneal com fulerol encapsulado em lipossomas (0,05 mg/kg/dose com intervalo de 4 dias), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia) + Fulerol (0,05 mg/kg/dose/4 dias), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia) + Fulerol em lipossomas (0,05 mg/kg/dose/4 dias) ou salina.

[033] Figura 3: A figura 3 apresenta os resultados de análise histopatológica e de apoptose por microscopía óptica utilizando o método de coloração HE do fígado de camundongos BALB/c infectados experimentalmente com Leishmania infantum, após 20 dias de tratamento por via intraperitoneal com Glucantime (120 mg Sb/kg/dia), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia) associado ao Fulerol (0,05 mg/kg/dose/4 dias), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia) associado ao Fuiero! em lipossomas (0,05 mg/kg/dose/4 dias) ou saüna. Gs parâmetros histopatoíógícos avaliados foram a degeneração hidrópica (Â) e o índice apoptótico (B).

[034] Figura 4: A figura 4 apresenta a viabilidade de macrófagos peritoniais expostos ao fulerol. A viabilidade celular foi representada através de valores de absorbância pós 72 horas de exposição a concentrações crescentes de fulerol.*p <0,05 = diferença significativa em relação ao grupo controle (0). Teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn's, [035] Figura 5: A figura 5 apresenta a atividade antileishmania in vitro do fulerol e glucantime, índice de infecção de macrófagos peritoneais com amastígotas de L. Infantum (cepa BH 46), 72 horas após exposição ao Glucantime (0,05 mg/ml, 0,75mg/m! ou 1 mg/ml), fulerol G,12mg/ml. Os dados são mostrados como medias ± EP. *p < 0,05 = diferença significativa em relação ao grupo não tratado. Análise com One-Way ANOVA e pós teste Bonferroni.

[036] Figura 6: A figura 6 apresenta a atividade antileishmania de diferentes doses do fulerol encapsulado em lípossomas no fígado de camundongos BALB/c infeGtados com L, infantum. Em A, carga parasitária no fígado de camundongos BALB/c infectados com L. infantum determinada por PCR quantitativa, após 20 dias de tratamento por via intraperitoneal com Glucantime (120 mg Sb/kg/dla), fulerol livre (0,05 mg/kg/4dias) e fulerol encapsulado em lipossomas (0,05 e 0,2 mg/kgMdias) e lípossomas vazios (mesma dose de lipídeo que nos grupos recebendo o fulerol encapsulado). As barras representam as medianas da carga parasitaria (n = 6). *P< 0,05 e *** p<0,001 teste de Kruskai-Wailís com pós-teste de Dunn's. Em B, proporção de camundongos com fígado positivo para Leíshmania por PCR. ** p<0,05 no teste exato de Fischer.

[037] Figura 7; A figura 7 apresenta a atividade antileishmania de diferentes doses do fulerol encapsulado em lipossomas no baço de camundongos BALB/c infectados com L. infantum. Carga parasitária no fígado de camundongos BALB/c infectados com L. infantum determinada por PCR quantitativa, após 20 dias de tratamento por via intraperitoneal com fulerol encapsulado em lipossomas (0,05 e 0.2 mg/kg/4 dias), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia), fulerol livre (0,05 mg/kg/4 dias), lipossomas vazios (mesma dose de lipídeo que nos grupos recebendo o fulerol encapsulado) e salina. As barras representam as medianas da carga parasitaria (n = 6). *P< 0,05 e *** p<0,001, teste de Kruskai-Wallis com pós-teste de Dunn's. *P<0,05 Mann Whitney test para comparação entre os grupos Glucantime e Fu! Lipo 0,2.

[038] Figura 8: A figura 8 apresenta o perfil de citocinas no fígado de camundongos BALB/c infectados com L. infantum, após tratamento com diferentes doses de fulerol encapsulado em lipossomas. Perfil de citocinas determinadas no fígado de camundongos BALB/c infectados com L. infantum, após 20 dias de tratamento por via intraperitoneal com fulerol encapsulado em lipossomas (0,05 e 0,2 mg/kg/4dias), fulerol livre ¢0,05 mg/kg/4 dias), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia), lipossomas vazios (mesma dose de lipídeo que nos grupos recebendo o fuleroi encapsulado) e salina, As barras representam as medias da concentração de citocina (n = 6). *P< 0,05, teste de One Way ANGVA com pós-teste de Bonferoni, DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[039] A presente invenção refere-se às composições farmacêuticas contendo fuierenos, como novas ferramentas para o tratamento das leishmanioses visceral e cutânea. Essas composições compreende preferencialmente os fuierenos solúveis em água de 60 a 120 carbonos com adição de grupamentos hídroxila, tai como o fulerol C6oOH2?.24. As composições antileishmania contendo o fulerol podem compreender o fármaco em associação com outro(s) fármaco(s) leishmanicida(s) ou imunomodutador(es), estando na forma livre ou associada a um nanocarreador, como iipossomass, que confere aos princípios ativos propriedades farmacocinéticas mais favoráveis. Por fim, a invenção compreende o uso de composições farmacêuticas contendo fuierenos para o tratamento das leishmanioses. 1. G fulerol foi sintetizado de acordo com o processo já descrito na patente depositada BR 0404543-2 A2, intitulada “PROCESSO E SISTEMA DE PRODUÇÃO CONTÍNUA EM LARGA ESCALA DE NANOESTRUTURAS DE CARBONO CONSTITUÍDO DE DISPOSITIVOS PARA EFETUAR O PROCESSO”. O fulerol foi também encapsulado em lipossomas formados de fosfatídilcolina, colesteroi e fosfatidilgíiceroi na relação molar 5:4:1 usando o método de desidratação-reidratação (FRÉZARD, F. e SCHETTINi, D.A. Lipossomas: propriedades físico-químícas e farmacofógicas, aplicações na Quimioterapia à base de antimônio. Quim. Nova, V. 28, n. 3, p.511-518, 2005). No entanto esses podem ser formados de colesteroi e um lipídeo com carga negativa ou positiva, na presença ou ausência e de polímeros e/ou lígantes acoplados em suas superfícies. 2. A encapsuSação foi seguida da calíbração do tamanho das vesículas por extrusão através de membrana de policarbonato de poro de diâmetro de 200 nm (NAYAR, R., HOPE, M.J., CULLIS, P.R. Generation of large unilamellar vesicles from long-chain saturated phosphatidylchoíines by extrusion tecbnique. Biochim. Biophys. Acta, v. 986, p. 200-206, 1989), na presença ou ausência e de polímeros e/ou iiganíes acoplados em suas superfícies.

[040] A atividade antileishmania e a ação quimioprotetora do fulerol foram avaliadas em camundongos BALB/c infectados com Leishmania infantum, como modelo muríno de Seíshmaniose visceral tratado ou não com Glucantime® (antimoniato de meglumina). No primeiro teste, foram utilizados quatro grupos (n = 9-10) que receberam doses diárias por via intraperitoneal durante 20 dias dos seguintes tratamentos: 1) Glucantime na dose de 120 mg Sb/kg de peso corporal; 2) Fulerol na dose de 0,05 mg/kg de poso corporal; 3) Fulerol encapsulado em lipossomas na dose de 0,05 mg/kg; 4) salina (controle negativo). Depois dos tratamentos, os animais foram sacrificados para a determinação da carga parasitária no fígado pela técnica de PCR em tempo real quantitativa.

[041] Também foi avaliada a eficácia do Fulerol iívre e encapsulado em lipossomas após a administração de apenas cinco doses (0,05 mg/kg/dose), com intervalo de 4 dias (diferentemente das 20 doses administradas no primeiro teste) em comparação à eficácia do Glucantime (120 mg kg/dia) administrado diariamente durante 20 dias. G resultado obtido estabeleceu que o uso do fulerol encapsulado em lipossomas apresentou uma atividade antileishmania similar a demonstrada pelo Glucantime, porém com posologia mais aceitável, [042] Dessa forma, de acordo com a presente invenção, o fulerol pode ser associado a nanossistemas carreadores e/ou sistemas de liberação controlada de fármaco, visando um aumento da sua estabilidade, uma maior bíodisponibilidade, uma ação mais prolongada e/ou um direcionamento para o tecido alvo. Esses sistemas carreadores ou de liberação controlada classicamente usados no estado da técnica incluem, de forma não limitante, ciclodextrinas, polímeros, polímeros mucoadesivos, vesículas tipídicas, lipossomas, poiimersomas, nanopartícuias iípídlcas sólidas, micro- e nanopartícuias poiíméricas, micro- e nanocapsulas, micro-e nanoemuisôes, dendrímeros, micelas, micelas poiíméricas, nanopartícuias inorgânicas, nanopartícuias de carbono, adesivos transdérmicos, matrices poiíméricas ímplantáveís e dispositivos que possam ser implantados.

[043] Sabendo que o fulerol apresenta propriedades antíoxidantes, o teste seguinte foi para avaliar se haveria algum benefício oriundo da associação do fulerol com o Glucantime, em termos de ganho de eficácia e de redução de toxicidade. Foi utilizado o modelo muríno de leishmaniose visceral para avaliar, por PGR em tempo real quantitativa, a carga parasitária no fígado dos animais após os tratamentos. Observou-se uma redução significativa da carga parasitária hepátsea nos grupos tratados com Glucantime e Giucantime associado ao Fulerol encapsuiado em lipossomas, quando comparado ao grupo controle. Todavia, a associação entre o fulerol e o Glucantime pareceu ser mais eficaz no tratamento da leishmaniose, quando comparada ao efeito do Fulerol ou do Glucantime isolado, [044] Portanto, a presente invenção refere-se também a composições farmacêuticas que comprendem fulerenos associados a um ou mais fármacos leishmanicidas e estes serem: antimoniais pentavalentes, preferencialmente o antimoniato de meglumina; anfotericina B; alopurinol; cetoconazol; itraconazol; fluconazol; posaconazol; tucaresoí; paramomícína; pentamídina; miitefosína, sitamaquina, iminoquimod; azitromicina; buparvaquona; tamoxifeno; terbinafina; furazoiidona; fluoroquinolona; domperídona; derivado de alquil-iisofosfoiipídeo ou de alquil-fosfolipídeo; aza-esterol; licocaicona A; maesabaiid III; tricotecenos; n-acetü-cisteina; quinolina 3-substituída, ou a uma ou mais substâncias imunomoduladoras, preferencialmente peptídeos ou proteínas imunogênicas derivadas de Leishmania, interferon gama, citocinas, lipideo A, oligonucleotídeos. imunoprotetores e antiinflamatórios esteroidais. Os fígados dos animais com leishmaniose visceral e submetidos à quimioterapia antimoníal também foram utilizados para a análise de alterações histopatológicas e de apoptose utilizando o método de coloração HE por míscroscopia óptica. Alterações histopatológicas características de degeneração hidrópica foram observadas nos fígados dos animais que receberam Glucantime isolado, evidenciando a hepatotoxicidade do fármaco que pode ser atribuída à indução de estresse oxidativo. Gontudo, essas alterações não foram observadas no grupo que recebeu a associação Glucantime+fulerol encapsuiado em lipossomas, o que demonstra a ação he pato protetora do co-tratamento com o fulerol em sistema de nanocarreadores.

[045] Sendo assim, o fulerol demonstrou de forma surpreendente uma atividade antileishmania, assim como uma capacidade de reduzir a hepatotoxicidade ocasionada pelo Glucantime quando administrado em associação em modelo animal para leishmaniose visceral. Logo, o fulerol apresentou-se como sendo o primeiro fármaco a demonstrar a dupla capacidade de exercer ação antileishmania sem efeitos colaterais e de reduzir a toxicidade de outro fármaco ieishmanicida sem interferir nas sua atividade farmacológica, [046] Dessa forma, o conjunto de resultados obtidos nos testes permitiu antecipar que composições farmacêuticas contendo o fármaco antimoníal e fulerol, principalmente aquelas baseadas em lipossomas, apresentam atividade antileishmanía mais elevada e toxicidade reduzida, quando comparado ao medicamento comercial Giucantime.

[047] Essa composições contendo fuierenos solúveis em água puros ou associados a fármacos leíshmanicidas ou imunomodufadores podem ser ainda administradas por via parenterai, preferencial mente endovenosa, intramuscular, subcutânea, íntralesional e intraperítoneal; via orai, preferencíalmente na forma de cápsulas, drágeas, comprimidos, xaropes ou elixir; tópica, preferencialmente na forma de pomada, loção, pasta ou gel.

[048] Na presente tecnologia as composições compreendem partícularmente o fuleroi associado com o antimoniato de meglumina encapsulados em lipossomas .

[049] A invenção poderá ser melhor compreendida a partir dos exemplos, não fimitantes, que seguem.

Exemplo 1: Atividade antileishmania do Fuleroi [050] Para avaliar se o Fuleroi apresentaria atividade antileishmania, analisou-se a carga parasitária no fígado de camundongos BALB/c infectados experimentalmente com Leishmania infantum (modelo murtno de leishmaniose visceral). Os animais foram divididos em quatro grupos (n = 9-10). Durante 20 dias, foram administradas por via intraperítoneal doses diárias de Giucantime (120 mg Sb/kg), Fuierol livre (0,05 mg/kg), Fuierol encapsulado em lipossomas (0,05 mg/kg) e Salina (controle negativo). Após o período de tratamento, os animais foram sacrificados para determinar a carga parasitária no fígado utilizando a técnica de PCR em tempo rea! quantitativa. A Figura 1 mostra uma redução significativa da carga parasitária hepática dos animais tratados com Giucantime, Fuierol e Fuierol encapsulado em lipossomas na dose de 0,05 mg/kg (*P < 0,05 com relação ao grupo controle; teste de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn's). Portanto, estabelecemos pela primeira vez a atividade anti-leishmania do fuierol em modelo experimental de leishmaniose, que mostrou-se equivalente àquela do fármaco comercial Giucantime.

Exemplo 2: Eficácia da associação do Fuierol com o Giucantime em modelo murino de leishmaniose visceral [051] Avaliou-se a carga parasitária no fígado de camundongos BALB/c infectados com Leishmania infantum (n = 5-6/grupo) determinada por PCR em tempo real quantitativa, após 20 dias de tratamento por via intraperítoneal com fuleroi encapsuiado em lipossomas (0,05 mg/kg/dose com intervalo de 4 dias), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia) associado ao Fulerol (0,05 mg/kg/dose/4 dias), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia) associado ao Fulerol em lipossomas (0,05 mg/kg/dose/4 dias) ou salina. A Figura 2 mostra uma redução significativa da carga parasitária bepática apenas nos grupos tratados com Glucantime e Glucantime associado ao Fulerol encapsuiado em lipossomas, quando comparado ao grupo controle (*P < 0,05 com relação ao grupo salina; teste de Kruskaí-Wallis com pós-teste de Dunn's). Todavia, a associação entre o Fulerol e o Glucantime pareceu ser mais eficaz no tratamento da ieishmaniose, quando comparada ao Fulerol ou Glucantime isolado. Portanto, esse exemplo estabelece o benefício da associação do Glucantime com o fulerol encapsuiado em lipossomas, em termos de ganho de eficácia no tratamento da Ieishmaniose visceral.

Exemplo 3: Efeito quimioprotetor do Fulerol em modelo de Ieishmaniose visceral submetido à quimioterapia antimonial [052] Foi feita a análise histopatológica e de apoptose por mrcroscopia óptica utilizando o método de coloração HE do fígado de camundongos BALB/c infectados experimentalmente com Leishmanía infantum, após 20 dias de tratamento por via intraperitoneal com Glucantime (120 mg Sb/kg/dia), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia) associado ao Fulerol (0,05 mg/kg/dose/4 dias), Glucantime (120 mg Sb/kg/dia) associado ao Fulerol em lipossomas (0,05 mg/kg/dose/4 dias) ou salina. Os parâmetros histopatológicos avaliados foram a degeneração hidrópica (A) e o índice apoptótico (8). A Figura 3, mostra alterações histopatológicas características de degeneração hidrópica e aumento do índice apoptótico no fígado dos animais que receberam Glucantime evidenciando a hepatotoxicidade do fármaco. Essas alterações foram observadas também no grupo que recebeu a associação Glucantime + fulerol, mas não no grupo que recebeu a associação do Glucantime + fulerol encapsuiado em lipossomas, demonstrando a ação hepatoprotetora do co-tratamento com fulerol encapsuiado em lipossomas. Ou seja, além de exercer ação antiieishmania, o fulerol em lipossomas mostrou uma ação quimioprotetora, evidenciada pela redução da hepatotoxicidade do Glucantime na presença do fulerol em lipossomas.

Exemplo 4: Atividade antiieishmania in vitro do fulerol [053] Este estudo foi realizado em três etapas. Na primeira etapa, avaliou-se a faixa de concentração cítotóxica do fulerol em macrófagos peritoneais. Na segunda etapa, investigou-se a atividade antileishmania do fuíeroí em concentração não citotóxica para os macrófagos, em modelo de macrófago infectado com Leishmania. Na terceira etapa, avaliou-se a concentração citotóxica do fulero! na forma promatígota de Leishmania.

[054] Para os testes de citotoxicidade in vitro e de atividade antileishmania em modelo de macrófago infectado com Leishmania, macrófagos peritoneais foram isolados de camundongos BALB/c, 3 dias após injeção intraperitoneal de tioglicolato 3%, por favagem peritoneal com solução meio RPMI geiado. As células foram lavadas, contadas e uma suspensão resultante de densidade de 1x106 células/mL foi obtida. As células foram mantidas a 37°C em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, estreptomicina (50 pg/mL) e penicilina (1000 U/mL).

[055] No primeiro experimento, foi avaliada a citotoxicidade do fulerol em macrófagos peritoneais. Para isto, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços na densidade de 5x103 céiulas/poço e esperou-se a ocorrência de sua aderência. No dia seguinte, as células foram expostas aos compostos fulerol em concentrações crescentes (0 - 0,15mg/mL) e foram mantidas a 37 °C em incubadora umidíficada e atmosfera contendo 5% de C02. Após 72 horas de exposição ao fulerol e giucantime, 3-[4,5-dimetiftiazo!-2il]-2,5-difeniltetrazofium bromidetiazolit azul (MTT- 5 mg/mL) foi adicionado a cada poço e aguardou-se 4 horas. O ensaio de MTT é baseado na redução do tetrazolium pela ação de monoxigenases mitocondriais das células viáveis, resultando na formação de formazan (Mosman, 1983). Após a formação de cristais de formazan, estes foram soiubilizados em DMSO e lidos em leitor de Elisa a 570 nm. Os resultados foram mostrados como valores de absorbância e controles (não exposto ao antimoníal e/ou fulerol).

[056] No segundo experimento, as células foram plaqueadas em placas de 24 poços contendo lamínulas esféricas em cada poço, na densidade de 3x105 células/poço, e esperou-se por 1 hora para a ocorrência de sua aderência. Foi feita então a lavagem para a retirada dos macrófagos não aderentes e acrescentou 3x106 de células promastigotas de Leishmania infantum (cepa MHOM/BR/1970/BH46). Esperou-se 4 horas para a infecção e iniciou-se o tratamento expondo as amastigotas intramacrofágicas a uma concentração de fulerol (0.12mg/m!) e a concentrações crescentes de giucantime. Como controle, usou-se amastigotas intramacrofágicas não tratadas. As células foram mantidas em incubadora umidifícada a 37°C e atmosfera contendo 5% de C02. Após 72 horas de exposição ao fulerol e/ou glucantime, as lamínulas foram retiradas e coradas em Gíemsa, montadas em lâminas e analisadas em microscópio óptico. Os resultados de carga parasitária foram expressos como índice de Infecção obtido pela seguinte fórmula: (% de macrófagos infectados) x (amastigotas/macrófagos infectados)/100. Os dados foram submetidos a análise de variância simples One Way Anova seguido pelo teste de comparação múltipla de Bonferroni. £057] No terceiro experimento, células promastigotas de Leishmania infantum (cepa BH46} foram mantidas em meio essencial mínimo de cultura (α-MEM, Gibco), suplementado com 10% de soro fetal bovino inatívado, 1G0pg/mL de kanamíGÍna e 50pg/mL de ampiciiina e incubadas a 24±1°C e pH 7,0 em estufa B.O.D. As promastigotas em fase logarítmíca de crescimento foram colocadas em placas de 96 poços na densidade de 1G6 cétufas/mL e expostas a concentrações crescentes de fulerol de 0,005 a 0,2 mg/mL Replicatas na ausência da droga foram estabelecidas como controle. Após 72 horas, o crescimento foi avaliado através de medição da absorbância das culturas a 60Gnm utilizando um sistema automatizado de leitura de microplacas.

[058] Como mostrado na Figura 4, até a concentração de 0,12 mg/ml, não há efeito significativo do fulerol na viabilidade celular. Em contrapartida, a partir de 0,15mg/ml o valor de absorbância começa a decrescer significativamente indicando diminuição da viabilidade celular. Este dado nos permite inferir que a concentração máxima de fulerol a ser usada, sem causar dano celular é de 0,12 mg/ml.

[059] Para avaliar a atividade antileishmania do fulerol, este foi utilizado em concentração máxima não cltotóxica (0,12 mg/ml) no modelo de macrófago infectado por Leishmania infantum (cepa BH46). Gomo mostrado na Figura 5, o fulerol sozinho reduziu a carga parasitária em cerca de 75% quando comparado ao grupo controle (barra escura). O efeito foi equivalente aquele do Glucantime dado em concentração de Sb 0,75 mg/ml.

[060] No estudo de crescimento de células promastigotas de Leishmania infantum na presença do concentrações crescentes de fulerol, na faixa de 0 a 0,2 mg/ml, não foi detectada ação citotóxíca do fulerol.

[061] Em conclusão, foi demonstrada a ação antileishmania do fulerol no modelo de macrófago infectado por Leishmania infantum. O fato de que o fulerol não exerceu citotoxicídade no modelo de promastigotas sugere uma ação indireta do fulerol no parasita através de ativação do macrófago.

Exemplo 5: Influência de diferentes doses de fuierol encapsulado em lipossomas na atividade antileishmania e no perfil de resposta imune, em modelo murino de leishmaniose visceral [062] Este estudo teve como objetivo avaliar se a administração do fuierol encapsulado em lipossomas em doses crescentes resultaria em maior eficácia em modelo murino de leishmaniose visceral, bem como a sua possível ação imunomoduladora in vivo.

Avaliação de eficácia in vivo do tratamento com as formulações [063] Para os testes de eficácia, foram utilizados camundongos BALB/c fêmeas, com idade de 6-8 semanas e peso de 20-25g provenientes do Centro de Bioterismo do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG - CEBIO. Os procedimentos utilizados foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFMG (protocolo n° 46/2013), [064] Os animais foram infectados pela via intraperitoneal com inóculo de 2χ107100μ! promastígotas de L tnfantum (cepa MHOM/BR/1970/BH46).

[065] O tratamento iniciou-se 7 dias após ínocuiação da cepa BH46 e teve duração de 20 dias. Os animais foram alocados em 6 grupos experimentais (n = 6 por grupo) que receberam os seguintes tratamentos por via intraperitoneal: [066] Grupo 1: tratado com o glucantíme (12Gmg Sb/kg/dia - 20 doses);

[067] Grupo 2: tratado com o fuierol livre em solução NaCi 0,15 M (Q,05mg/kg/4dias - 5 doses);

[068] Grupo 3: tratado com soiução NaCI 0,15 M contendo fuierol encapsulado em lipossomas {0,05mg/kg/4dias - 5 doses);

[069] Grupo 4: tratado com solução NaCi 0,15 M contendo fuierol encapsulado em lipossomas (0,2mg/kg/4días - 5 doses);

[070] Grupo 5: tratado com solução de lipossomas vazios (mesma dose de lipídeos de que nos grupos 4 e 5);

[071] Grupo 6: tratado com salina (controle).

[072] Ao final do tratamento, os animais foram submetidos à eutanásia por deslocamento cervical, após sedação com 8mg/kg cetamina e 5mg/kg de xííazína via intraperitoneal. Os órgãos fígado e baço foram coletados para determinação de carga parasitária por PCR quantitativa (qPCR).

[073] Para determinar o perfil de citocinas no fígado, os órgãos foram pesados individualmente e homogeneizados em PBS contendo Tween 20 a 0,05% e inibidores de protease (phenyimethilsulfcnyl fluoride 0,1 mM; benzethonium chloride 0,1 mM; EDTA 10 mM e aprotínin A 20 Kl), Após centrifugacão a 8,000g por 10 min a 4 °C, os sobrenadantes foram utilizados para dosagem das citocinas (IL-4, IL-10, TNF-alfa e IFN-gamma) por ELISA usando kit comerciai e seguindo as instruções do fabricante.

[074] A Figura 6 (A e B) e a Figura 7 mostram os resultados da carga parasitária no fígado e baço, respectivamente. Podemos observar uma redução significativa da carga parasitária tanto no fígado quanto no baço, nos grupos tratados com fuleroi encapsuiado em lipossomas (0,05 e 0,2 mg/kg) e com Glucantime, quando comparados ao grupo salina, É também interessante notar que o fuleroi livre administrado a cada 4 dias não promoveu redução significativa da carga parasitária e que a forma encapsulada foi significativamente mais efetiva que a forma livre. O aumento da dose de fuleroi Iipossomal de 0,05 para 0,2 mg/kg resultou em redução mais pronunciada da carga parasitária (Figura 6A e Figura 7), sendo que não foi possívei detectar o parasito no fígado dos animais dentro o limite de detecção do método de RCR (Figura 6B).

[075] É importante ressaltar que o tratamento com fuierol iipossomal mostrou-se significativamente mais efetivo que o tratamento convencionai com Glucantime.

[078] Visando esclarecer o mecanismo de ação do fuleroi na eliminação do parasito no fígado e evidenciar uma possível ação imunomoduladora, foi avaliado o perfil da resposta imunoiógica ao finai do tratamento, através da dosagem das citocinas IL-4, 1L-10, TNF-alfa e IFN-gamma no tecido. Gomo mostrado na Figura 8, na análise comparativa entre os grupos tratados e o controle (salina), o Fuleroi Iipossomal na dose de 0,2 mg/kg induziu uma perfil imunológico proinflamatório, com aumento significativo de TNF-alfa e IFN-gamma, sem variação significativa de IL-10 e IL-4. Por outro lado, o grupo Glucantime mostrou indução de apenas IL-4 e IL-10.

[077] Essa dado evidencia uma forte ação imunomoduladora do fuierol Iipossomal no fígado que contribuiu muito provavelmente para a eliminação do parasito neste tecido. TNF-alfa é uma citocina conhecida por estimular hepatócitos a sintetizar e secretar proteínas de fase inflamatória aguda (proteína ligada a manose, proteína C reativa) que servem para ativar sistema complemento e quimiotaxia de células fagocíticas (células dendríticas, macrófagos e neutrófifos).

[078] Em conclusão, demonstramos que: í) o fulerol administrado na forma lipossomal em dose de 0,2 mg/kg/4dias promove uma forte redução da carga parasitária no fígado e no baço em modeio murino de leishmaniose visceral, sendo que houve eliminação completa do parasito no fígado; ií) a atividade antiieishmania da formulação Iipossoma! é muito maior que aquela do medicamento padrão (Glucantime); Ui) a eficácia da formulação lipossomal no fígado parece resultar da indução de perfil imunológico proinfiamatórío; iv) a formulação lipossomal do fulerol pode encontrar aplicações no tratamento de outras patologias acometendo o fígado e para as quais um perfil imunológico proinfiamatórío seria beneficiai.

REIVINDICAÇÕES

Claims (10)

1. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEÍSHMANIA caracterizadas por compreender fuierenos solúveis em água,

2. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelos fuierenos solúveis em água possuírem de 60 a 120 carbonos com adição de grupamentos hidroxila.

3. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizadas pelo fulereno ser preferencialmente o fuierol (C60OH22-24).

4. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com as reivindicações de 1 a 3, caracterizadas pelos fuierenos solúveis em água estarem associados ou não a um ou mais fármaoos ieishmanicidas ou imunomoduladores.

5. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com a reivindicação 4, caracterizadas pelos fármacos Ieishmanicidas serem selecionados do grupo compreendendo antimoniais pentavalentes, preferencialmente o antimoniato de megiumina; anfotericina B; alopurinoi; cetoconazol; itraconazol; fluconazol; posaconazoí; tucaresoi; paramomrcina; pentamidina; miitefosína, sítamaquina, iminoquímod; azitromicina; buparvaquona; tamcxifeno; terbinafina; furazolidona: fluoroquinolona; domperidona; derivado de alquiWisofosfolipídeo ou de aiquil-fosfolipideo; aza-esterol; licocalcona A; maesabaiid III; trícotecenos; n-acetil-cisteina; quinolina 3-substituída e os imunomoduladores serem selecionados do grupo compreendedo peptídeos ou proteínas imunogênicas derivadas de Leishmania, interferon gama, citocinas, lipídeo A, olígonucleotídeos, imunoprotetores e antiínflamatórios esteroidais.

6. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com a reivindicação de 1 a 5, caracterizadas pelos fuierenos solúveis em água estarem associados ou não a nanossistemas carreadores e/ou sistemas de liberação controlada de fármacos selecionados do grupo compreendendo ciclodextrinas, polímeros, polímeros mucoadesivos, vesículas tipídicas, lipossomas, poiímersomas. nanopartículas lipídícas sólidas, micro- e nanopartículas poliméricas, micro- e nanocapsulas, micro- e nanoemulsões, dendrímeros, míceias, micelas poliméricas» nanopartículas inorgânicas, adesivos transdérmicos, matríces poliméricas implantáveis e dispositivos que possam ser implantados.

7. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com as reivindicações de 1 a 6, caracterizadas pelos fuierenos solúveis em água estarem ou não encapsulados em lipossomas, podendo os iipossomas ser compostos por fosfolipídeos, colesterol e um lipídeo com carga negativa ou positiva, na presença ou ausência e de polímeros e/ou iigantes acoplados em suas superfícies.

8. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com a reivindicação de 7, caracterizadas pelos lipossomas serem constituídos preferencialmente de fosfatidtlcolina, colesterol e fosfatidilgüceroí.

9. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA de acordo com as reivindicações de 1 a 6, caracterizadas por serem administradas por via parenteral, preferencialmente endovenosa, intramuscular, subcutânea, intralesional e intraperítoneal; via oral. preferencialmente na forma de cápsulas, drágeas, comprimidos, xaropes ou elixir; tópica, preferencialmente na forma de pomada, loção, pasta ou gel.

10. USO DAS COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTILEISHMANIA descritas nas reivindicações de 1 a 9, caracterizado por ser na preparação de medicamentos para o tratamento das leishmanioses visceral, mucocutânea e cutânea, preferencialmente a ieishmaniose visceral e as composições compreenderem preferencíalmente o fulerol associado com o antimoniato de megiumina encapsulados em lipossomas.