BR102014004106B1

BR102014004106B1 - method of production of antibody fragments by genetically modified pichia pastoris and simplified culture medium

Info

Publication number: BR102014004106B1
Application number: BR102014004106-0A
Authority: BR
Inventors: Adalberto Pessoa Junior; Cesar Andres Diaz Arias; Valker Araujo Feitosa; João Vitor Dutra Molino; Daniela De Araújo Viana Marques; Dulcineia Saes Parra Abdalla; Andrea Queiroz Maranhão
Original assignee: Universidade De São Paulo - Usp; Fundação Universidade de Brasília - FUB
Priority date: 2014-02-21
Filing date: 2014-02-21
Publication date: 2021-06-08
Also published as: BR102014004106A2

Abstract

MÉTODO DE PRODUÇÃO DE FRAGMENTOS DE ANTICORPO POR PICHIA PASTORIS GENETICAMENTE MODIFICADA E MEIO DE CULTIVO SIMPLIFICADO A presente invenção descreve um método de produção de fragmentos de anticorpo (scFv) por meio da levedura Pichia pastoris geneticamente modificada, com reaproveitamento de células em diferentes condições. Ainda, a invenção propõe um meio de cultivo simplificado, o qual permite uma fácil recuperação dos fragmentos durante a etapa de purificação, diminuindo a perda da biomolécula nesta fase.METHOD OF PRODUCTION OF ANTIBODY FRAGMENTS BY GENETICALLY MODIFIED PICHIA PASTORIS AND SIMPLIFIED CULTURE MEDIUM The present invention describes a method of production of antibody fragments (scFv) by means of genetically modified yeast Pichia pastoris, with reuse of cells under different conditions. Furthermore, the invention proposes a simplified culture medium, which allows an easy recovery of the fragments during the purification step, reducing the loss of the biomolecule at this stage.

Description

Field of invention:

[01] A presente invenção se insere na área biotecnológica, mais especificamente na obtenção de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico, e descreve um método de produção de fragmentos de anticorpo (scFv) por meio da levedura Pichia pastoris geneticamente modificada, com reaproveitamento de células em diferentes condições. Ainda, a invenção propõe um meio de cultivo simplificado, o qual permite uma fácil recuperação dos fragmentos durante a etapa de purificação, diminuindo a perda da biomolécula nesta fase.[01] The present invention is in the biotechnology area, more specifically in obtaining recombinant proteins of pharmaceutical interest, and describes a method of production of antibody fragments (scFv) by means of genetically modified yeast Pichia pastoris, with reuse of cells in different conditions. Furthermore, the invention proposes a simplified culture medium, which allows an easy recovery of the fragments during the purification step, reducing the loss of the biomolecule at this stage.

Fundamentals of the invention:

[02] O sistema de estruturas e processos biológicos que protege o nosso organismo contra agentes patogênicos é o sistema imunológico. Uma resposta imune pode ser dividida em duas: inata e adaptativa.[02] The system of biological structures and processes that protect our bodies against pathogens is the immune system. An immune response can be divided into two: innate and adaptive.

[03] A resposta inata refere-se a barreiras físicas (pele, lágrima, saliva, muco) que dificultam a adesão e penetração dos patógenos (fungos, protozoários, bactérias ou vírus), bem como o sistema complemento, composto por proteínas de membrana plasmática e solúveis no sangue que atuam na fagocitose de partículas estranhas.[03] The innate response refers to physical barriers (skin, tear, saliva, mucus) that hinder the adhesion and penetration of pathogens (fungi, protozoa, bacteria or viruses), as well as the complement system, composed of membrane proteins and soluble in the blood that act in the phagocytosis of foreign particles.

[04] A resposta adaptativa é regida pela produção de anticorpos, que se inicia quando ocorre o reconhecimento de partículas estranhas pelos linfócitos B, provocando a diferenciação desses em plasmócitos e linfócitos B de memória.[04] The adaptive response is governed by the production of antibodies, which begins when the recognition of foreign particles by B lymphocytes occurs, causing their differentiation into plasma cells and memory B lymphocytes.

[05] Os anticorpos são um grupo de glicoproteínas que possuem funções cruciais nos mecanismos de resposta imune, tal como a inativação de toxinas, a destruição celular e a ativação do sistema complemento, tendo se destacado como um dos principais produtos biotecnológicos para uso terapêutico, diagnóstico ou em pesquisa biomédicas.[05] Antibodies are a group of glycoproteins that play crucial roles in immune response mechanisms, such as toxin inactivation, cell destruction and complement system activation, having stood out as one of the main biotechnological products for therapeutic use, diagnosis or in biomedical research.

[06] Eles reconhecem o antígeno, em nível de membrana, e, em seguida, ocorre a ativação, proliferação e diferenciação das células B.[06] They recognize the antigen, at the membrane level, and then B cell activation, proliferation, and differentiation occur.

[07] Um antígeno pode apresentar vários epítopos diferentes e provocar a produção de anticorpos de diferentes clones de células B, chamados anticorpos policlonais. Por outro lado, anticorpos específicos para um único epítopo são produzidos por um único clone celular e chamados de monoclonais.[07] An antigen can present several different epitopes and trigger the production of antibodies from different clones of B cells, called polyclonal antibodies. On the other hand, antibodies specific for a single epitope are produced by a single cell clone and called monoclonal.

[08] Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, o que lhes confere excelência diagnóstica e terapêutica.[08] Monoclonal antibodies are highly specific, which gives them diagnostic and therapeutic excellence.

[09] Os anticorpos apresentam forma semelhante a um “Y” e, nessa representação, os “braços” correspondem aos Fabs, que retêm a atividade ligante ao antígeno.[09] Antibodies have a shape similar to a "Y" and, in this representation, the "arms" correspond to the Fabs, which retain the antigen-binding activity.

[010] Os Fabs são constituídos por uma cadeia leve (VL), de aproximadamente 220 aminoácidos, e uma cadeia pesada (VH), de aproximadamente 440 aminoácidos.[010] Fabs are constituted by a light chain (VL), of approximately 220 amino acids, and a heavy chain (VH), of approximately 440 amino acids.

[011] A porção variável do anticorpo denomina-se Fv, sendo composta de aproximadamente 110 aminoácidos, cuja sequência varia de acordo com o antígeno. A porção Fv está localizada na porção amino terminal da molécula, sendo formada pelos domínios variáveis leve e pesado do Fab.[011] The variable portion of the antibody is called Fv, being composed of approximately 110 amino acids, whose sequence varies according to the antigen. The Fv portion is located at the amino terminal portion of the molecule, being formed by the variable light and heavy domains of the Fab.

[012] Cada extremidade carboxi-terminal da cadeia, por sua vez, é referida como uma região constante. Esta sequência de aminoácidos é conservada em todos os anticorpos de uma determinada classe de imunoglobulinas.[012] Each carboxy-terminal end of the chain, in turn, is referred to as a constant region. This amino acid sequence is conserved in all antibodies of a particular class of immunoglobulins.

[013] A menor unidade funcional de um anticorpo está conformada nos fragmentos de cadeia simples variáveis (scFv - do inglês single chain fragment variable) , fragmentos que retêm a atividade de ligação ao antígeno.[013] The smallest functional unit of an antibody is formed in the single chain fragment variable (scFv - from English single chain fragment variable), fragments that retain the activity of binding to the antigen.

[014] O uso de fragmentos de imunoglobulinas é importante quando se pretende alta penetrabilidade molecular, porém apresenta meia-vida reduzida nos indivíduos que recebem a imunização passiva.[014] The use of immunoglobulin fragments is important when you want high molecular penetrability, but has a reduced half-life in individuals who receive passive immunization.

[015] Os scFv podem se ligar e neutralizar vários agentes estranhos, como toxinas ou viroses, e por terem tamanho inferior aos anticorpos intactos, apresentam rápida difusão no tecido e melhor eliminação dos imunocomplexos (complexo anticorpo / antígeno) produzidos.[015] The scFv can bind and neutralize several foreign agents, such as toxins or viruses, and because they are smaller in size than intact antibodies, they present rapid tissue diffusion and better elimination of immune complexes (complex antibody / antigen) produced.

[016] Industrialmente, o principal método para produção de anticorpos é o cultivo em hibridomas, porém, a tecnologia do DNA recombinante favoreceu o desenvolvimento de anticorpos recombinantes que podem ser clonados e expressos em micro-organismos.[016] Industrially, the main method for producing antibodies is the cultivation in hybridomas, however, the technology of recombinant DNA favored the development of recombinant antibodies that can be cloned and expressed in microorganisms.

[017] Assim, scFv podem ser produzidos sem o uso de animais, sendo facilmente selecionados para um antígeno específico por meio do uso de bibliotecas de fagos de anticorpos. Ainda, a sequência de DNA codificante pode ser clonada em micro-organismos para posterior expressão com baixo custo, quando comparado com eucariotes superiores.[017] Thus, scFv can be produced without the use of animals, being easily selected for a specific antigen through the use of antibody phage libraries. Furthermore, the coding DNA sequence can be cloned in microorganisms for further expression at a low cost, when compared to higher eukaryotes.

[018] No entanto, algumas variáveis, como fontes de carbono e nitrogênio, temperatura, concentração de indutor, tempo de indução e meio de cultivo, dentre outras, interferem na produção das proteínas recombinantes.[018] However, some variables such as carbon and nitrogen sources, temperature, inducer concentration, induction time and culture medium, among others, interfere in the production of recombinant proteins.

[019] A Pichia pastorisé uma levedura anaeróbia facultativa pertencente à família Saccharomycetales. Sua morfologia apresenta células esféricas ou ovais, mas as células podem mudar sua forma de acordo com condições de cultivo. Em meio de cultivo sólido, formam colônias não filamentosas com coloração de branco a creme. A levedura tem capacidade de crescer em diferentes fontes de carbono, em uma faixa de pH de 3 a 8 e com temperatura ótima de crescimento em torno dos 30°C.[019] Pichia pastoris is a facultative anaerobic yeast belonging to the Saccharomycetales family. Its morphology presents spherical or oval cells, but the cells can change their shape according to culture conditions. On solid culture medium, they form white to cream non-filamentous colonies. Yeast is able to grow on different carbon sources, in a pH range of 3 to 8 and with an optimal growth temperature around 30°C.

[020] São chamadas de metilotróficas, pois têm a capacidade de utilizar metanol como única fonte de carbono. Essa capacidade é regulada pelo gene álcool oxidase 1 (AOX1), que possui um dos promotores mais conhecidos.[020] They are called methylotrophic, as they have the ability to use methanol as the only source of carbon. This ability is regulated by the alcohol oxidase 1 (AOX1) gene, which has one of the best known promoters.

[021] O genoma da P. pastoriscontém duas cópias da álcool oxidase (AOX), que regula 85% da álcool oxidase ativa na célula, na presença de metanol.[021] The genome of P. pastor contains two copies of alcohol oxidase (AOX), which regulates 85% of the active alcohol oxidase in the cell, in the presence of methanol.

[022] A expressão do gene AOX1 é regulada pela presença de metanol, sendo essa expressão afetada quando outras fontes de carbono (etanol, glicerol ou glicose), estão presentes no meio.[022] The expression of the AOX1 gene is regulated by the presence of methanol, this expression being affected when other carbon sources (ethanol, glycerol or glucose) are present in the medium.

[023] As vantagens mais destacadas da produção de proteínas heterólogas por P. pastorissão as altas densidades celulares, que podem atingir concentrações superiores a 100 g/L com produtividades que podem alcançar os 10 gL-1h-1.[023] The most outstanding advantages of the production of heterologous proteins by P. pastoris are the high cell densities, which can reach concentrations above 100 g/L with yields that can reach 10 gL-1h-1.

[024] Em vista do acima exposto, a presente invenção propõe um método de produção de fragmentos de anticorpo (scFv) por Pichia pastoris geneticamente modificada.[024] In view of the above, the present invention proposes a method of production of antibody fragments (scFv) by genetically modified Pichia pastoris.

[025] Estudos científicos apresentam meios de cultivo ricos em nutrientes, o que influencia na recuperação do fragmento de anticorpo durante o processo de purificação.[025] Scientific studies show nutrient-rich culture media, which influence the recovery of the antibody fragment during the purification process.

[026] Assim, a presente invenção ainda provê um meio de cultivo simplificado, com número de substratos reduzidos e concentrações mínimas necessárias para a produção dos fragmentos e, ao mesmo tempo, permite a fácil recuperação dos mesmos no processo de purificação.[026] Thus, the present invention still provides a simplified culture medium, with reduced number of substrates and minimum concentrations necessary for the production of fragments and, at the same time, allows the easy recovery of the same in the purification process.

[027] Por fim, a reutilização das células permitiu maior tempo de produção com apenas uma fase de crescimento, diminuindo os custos na fase de produção da biomassa.[027] Finally, the reuse of cells allowed longer production time with only one growth phase, reducing costs in the biomass production phase.

State of the art:

[028] Documentos do estado da técnica descrevem diferentes métodos de produção de fragmentos de anticorpo, tais como scFv, usando leveduras como sistema de expressão.[028] Prior art documents describe different methods of producing antibody fragments, such as scFv, using yeast as an expression system.

[029] O documento WO 96/27612 A1 descreve o preparo de um produto proteico, o qual incorpora fragmentos de cadeias pesadas e leves de anticorpos. Para tal, uma levedura metalotrófica (tal como a Pichia pastoris) é transformada para incorporar as sequências de nucleotídeos e, em seguida, a mesma é cultivada em condições definidas que propiciam a expressão dos polipeptídios.[029] WO 96/27612 A1 describes the preparation of a protein product, which incorporates antibody heavy and light chain fragments. For this purpose, a metallotrophic yeast (such as Pichia pastoris) is transformed to incorporate the nucleotide sequences and then cultivated under defined conditions that allow for the expression of the polypeptides.

[030] O documento EP 0.698.097 B1 faz referência a um processo de produção de um fragmento de anticorpo, utilizando como base anticorpos de camelos. Os fragmentos são posteriormente transferidos para um sistema de expressão de proteínas heterólogas, como a levedura Pichia pastoris. O fragmento obtido apresenta secreção otimizada, bem como propriedades ligantes melhoradas.[030] The document EP 0.698,097 B1 makes reference to a process of production of an antibody fragment, using as a basis camel antibodies. The fragments are then transferred to a heterologous protein expression system, such as the yeast Pichia pastoris. The obtained fragment has optimized secretion as well as improved binding properties.

[031] Em WO 2012/161956 A9, é previsto um método para a produção de uma mistura de anticorpos (homodímero) de cadeia simples, tais como scFv, utilizando um bolus de etanol. A célula hospedeira na qual as subunidades proteicas são produzidas é uma levedura, preferencialmente a Pichia pastoris. A expressão dos anticorpos ocorre por meio de promotores, tal como a presença de álcool oxidases - AOXs.[031] In WO 2012/161956 A9, a method for the production of a mixture of single-chain antibodies (homodimer), such as scFv, using a bolus of ethanol is provided. The host cell in which the protein subunits are produced is a yeast, preferably Pichia pastoris. Antibody expression occurs through promoters, such as the presence of alcohol oxidases - AOXs.

[032] O artigo “Optimal conditions for the expression of a single-chain antibody (scFv) gene in Pichia pastoris” estuda o uso da levedura Pichia pastoris como sistema heterólogo de expressão de proteínas e a importância de controle dos parâmetros (como temperatura, composição do meio e pH) para a produção proteica (mais especificamente, anticorpos scFv).[032] The article "Optimal conditions for the expression of a single-chain antibody (scFv) gene in Pichia pastoris" studies the use of the yeast Pichia pastoris as a heterologous protein expression system and the importance of controlling parameters (such as temperature, medium composition and pH) for protein production (more specifically, scFv antibodies).

[033] O artigo “Methanol induction optimization for scFv antibody fragment production in Pichia pastoris” apresenta otimização de um dos parâmetros do processo de produção de fragmento de anticorpo em Pichia pastoris, que consiste na etapa de indução e alimentação com metanol como fonte de carbono.[033] The article "Methanol induction optimization for scFv antibody fragment production in Pichia pastoris" presents optimization of one of the parameters of the antibody fragment production process in Pichia pastoris, which consists of the step of induction and feeding with methanol as a carbon source .

[034] Como é possível observar, a expressão de scFv por Pichia pastorisé estudada há vários anos. O método descrito na presente invenção, destaca-se por suas etapas, o meio de cultivo utilizado e as condições de produção. Juntos, todos esses elementos garantem a melhor recuperação do bioproduto.[034] As it can be seen, the expression of scFv by Pichia pastoris has been studied for several years. The method described in this invention stands out for its steps, the culture medium used and the production conditions. Together, all these elements ensure the best bioproduct recovery.

[035] As mudanças ora propostas garantem uma boa produção dos fragmentos de anticorpo, além de recuperação melhorada e que facilita a purificação.[035] The changes proposed here ensure a good production of antibody fragments, in addition to improved recovery and facilitating purification.

Brief description of the invention:

[036] A presente invenção descreve um método de produção de fragmentos de anticorpo (scFv) por meio da levedura Pichia pastoris geneticamente modificada, com reaproveitamento de células em diferentes condições e com meio de cultivo modificado.[036] The present invention describes a method of production of antibody fragments (scFv) through genetically modified yeast Pichia pastoris, with reuse of cells under different conditions and with modified culture medium.

Brief description of the figures:

[037] A figura 1 representa o fluxograma do método de produção de fragmentos de anticorpo da presente invenção.[037] Figure 1 represents the flowchart of the method of producing antibody fragments of the present invention.

[038] A Figura 2 representa graficamente a produção do fragmento de anticorpo em meio de cultivo padrão.[038] Figure 2 graphically represents the production of the antibody fragment in standard culture medium.

[039] A Figura 3 representa graficamente a produção do fragmento de anticorpo em meios de cultura simplificado, ora objeto da invenção.[039] Figure 3 graphically represents the production of the antibody fragment in simplified culture media, object of the invention.

[040] A Figura 4 representa o efeito da faixa de temperatura sobre a produção dos diferentes tipos de fragmento de anticorpo produzido.[040] Figure 4 represents the effect of the temperature range on the production of the different types of antibody fragment produced.

Detailed description of the invention:

[041] O método de produção de fragmentos de anticorpo (scFv) por Pichia pastoris, geneticamente modificada, descrito na presente invenção, compreende as seguintes etapas: a) Pré-inóculo; b) Inóculo; c) Crescimento; d) Primeira indução; e) Segunda indução; f) Terceira indução; e g) Separação.[041] The method of production of antibody fragments (scFv) by Pichia pastoris, genetically modified, described in the present invention, comprises the following steps: a) Pre-inoculum; b) Inoculum; c) Growth; d) First induction; e) Second induction; f) Third induction; and g) Separation.

[042] Opcionalmente, o método da presente invenção ainda compreende a etapa de:[042] Optionally, the method of the present invention further comprises the step of:

[043] h) Reaproveitamento.[043] h) Reuse.

[044] A seguir, as etapas do método proposto serão mais bem detalhadas:[044] The steps of the proposed method will be further detailed below:

a) Pre-inoculum:

[045] Para dar início ao método, prepara-se um pré- inóculo a partir do descongelamento das células de Pichia pastoris armazenadas em estoque, a uma temperatura que pode variar de 2 a 30°C.[045] To start the method, a pre-inoculum is prepared from the thawing of Pichia pastoris cells stored in stock, at a temperature that can vary from 2 to 30°C.

[046] A concentração das células armazenadas em estoque é importante para a eficácia do método. Logo, as mesmas devem ser armazenadas em glicerol de 5% a 50% v/v, preferencialmente 20% v/v, e temperatura de -20 a -90°C, preferencialmente -70°C, com uma concentração de 5,3x1010 a 5,3x1015 UFC em meio de cultivo YPG.[046] The concentration of cells stored in stock is important for the effectiveness of the method. Therefore, they must be stored in glycerol from 5% to 50% v/v, preferably 20% v/v, and at a temperature of -20 to -90°C, preferably -70°C, with a concentration of 5.3x1010 at 5.3x1015 CFU in YPG culture medium.

[047] As células armazenadas são inoculadas em frascos contento meio BMSY e, em seguida, são incubadas em agitador orbital entre 50 e 500 rpm, preferencialmente 250 rpm, com temperatura entre 10 e 40°C, preferencialmente 30°C, durante 10 a 32 horas, preferencialmente 16 horas.[047] The stored cells are inoculated into flasks containing BMSY medium and then incubated in an orbital shaker between 50 and 500 rpm, preferably 250 rpm, with a temperature between 10 and 40°C, preferably 30°C, for 10 to 32 hours, preferably 16 hours.

binoculars;

[048] Decorrido o tempo necessário para a etapa (a), o cultivo é transferido para um biorreator contendo um meio de cultivo padrão ou o meio de cultivo simplificado, ora objeto da presente invenção.[048] After the time necessary for step (a), the culture is transferred to a bioreactor containing a standard culture medium or the simplified culture medium, object of the present invention.

c)Growth:

[049] Para promover o crescimento celular, o biorreator é configurado para conduzir o processo em uma temperatura que varia de 10 a 40°C, preferencialmente 30°C, e kLa de 50 a 100 h-1, preferencialmente 96 h-1, por um intervalo de tempo de 15 a 32 horas, preferencialmente 24 horas.[049] To promote cell growth, the bioreactor is configured to conduct the process at a temperature ranging from 10 to 40°C, preferably 30°C, and kLa from 50 to 100 h-1, preferably 96 h-1, for a time interval of 15 to 32 hours, preferably 24 hours.

d) First induction:

[050] A primeira indução ocorre após a fase de crescimento.[050] The first induction occurs after the growth phase.

[051] A temperatura é ajustada de acordo com o tipo de scFv que se deseja produzir em maior quantidade, mais especificamente, entre 2 e 40°C. O kLa é controlado entre 2 e 50 h-1, preferencialmente 12 h-1, e deve-se adicionar de 0,1% a 4% v/v de metanol, preferencialmente 0,5% (v/v) de metanol.[051] The temperature is adjusted according to the type of scFv that you want to produce in greater quantity, more specifically, between 2 and 40°C. The kLa is controlled between 2 and 50 h-1, preferably 12 h-1, and from 0.1% to 4% v/v of methanol should be added, preferably 0.5% (v/v) of methanol.

e) Second induction:

[052] Decorridas 24 horas após a primeira indução, deve- se adicionar metanol de modo a manter preferencialmente 0,5% v/v, mantendo a temperatura e o kLa nas faixas inicialmente determinadas.[052] After 24 hours after the first induction, methanol should be added in order to maintain preferentially 0.5% v/v, keeping the temperature and kLa in the initially determined ranges.

f) Third induction:

[053] Decorridas 24 horas após a segunda indução, deve- se adicionar metanol de modo a manter preferencialmente 0,5% v/v, mantendo a temperatura e o kLa nas faixas inicialmente determinadas.[053] After 24 hours after the second induction, methanol should be added in order to maintain preferentially 0.5% v/v, keeping the temperature and kLa in the initially determined ranges.

g) Separation:

[054] Decorridas 5 a 40 horas após a terceira indução, os fragmentos obtidos são recuperados no sobrenadante.[054] After 5 to 40 hours after the third induction, the fragments obtained are recovered in the supernatant.

[055] A etapa de separação é executada por meio de qualquer procedimento tradicional que permita a recuperação das células viáveis, como: centrifugação, filtração tangencial e decantação, dentre outras.[055] The separation step is performed through any traditional procedure that allows the recovery of viable cells, such as: centrifugation, tangential filtration and decantation, among others.

[056] Preferencialmente, a separação é executada por meio da centrifugação, utilizando de 50 xg a 10000 xg, com tempo estimado entre 1 e 180 minutos e temperatura estimada entre 2 e 40°C, preferencialmente 5000 xg durante 15 minutos à temperatura de 4°C.[056] Preferably, the separation is performed by means of centrifugation, using from 50 xg to 10000 xg, with an estimated time between 1 and 180 minutes and an estimated temperature between 2 and 40°C, preferably 5000 xg for 15 minutes at a temperature of 4 °C.

h) Reuse:

[057] Opcionalmente, as células de Pichia pastoris separadas podem ser reutilizadas. O reaproveitamento ocorre pela ressuspensão das células em solução, como tampão de sais entre 0,01M e 5M, preferencialmente tampão fosfato 1M, com pH entre 3,0 e 9,0, preferencialmente pH 6,0.[057] Optionally, the separated Pichia pastoris cells can be reused. The reuse occurs by resuspension of the cells in solution, as a salt buffer between 0.01M and 5M, preferably 1M phosphate buffer, with a pH between 3.0 and 9.0, preferably pH 6.0.

[058] Após a ressuspensão, as células de Pichia pastoris são novamente transferidas para o biorreator contendo o meio de cultivo, assegurando-se de que as concentrações descritas para cada um dos meios não seja alterada.[058] After resuspension, Pichia pastoris cells are again transferred to the bioreactor containing the culture medium, ensuring that the concentrations described for each of the media are not changed.

[059] Conforme mencionado na etapa (b) do método proposto, pode ser utilizado um meio de cultivo padrão ou o meio de cultivo simplificado, ora objeto da presente invenção.[059] As mentioned in step (b) of the proposed method, a standard culture medium or the simplified culture medium, herein object of the present invention, can be used.

[060] O meio de cultivo simplificado proposto permite a fácil recuperação dos fragmentos durante a purificação, diminuindo a perda da biomolécula nesta fase.[060] The proposed simplified culture medium allows the easy recovery of the fragments during purification, reducing the loss of the biomolecule at this stage.

[061] A composição do meio de cultivo simplificado proposto é mostrada na Tabela 1 abaixo: Tabela 1 - Composição do meio de cultivo simplificado

[061] The composition of the proposed simplified culture medium is shown in Table 1 below: Table 1 - Composition of the simplified culture medium

[062] O método de produção utilizando o meio de cultivo otimizado melhorou a recuperação do fragmento de anticorpo, obtendo concentrações na faixa de 90 a 120 mg/L.[062] The production method using the optimized culture medium improved the recovery of the antibody fragment, obtaining concentrations in the range of 90 to 120 mg/L.

[063] Como pode se observar na Tabela 2 abaixo, o meio de cultivo proposto apresenta menor quantidade dos componentes e a remoção do extrato de levedura.[063] As can be seen in Table 2 below, the proposed culture medium has a smaller amount of components and the removal of yeast extract.

[064] Essas alterações reduzem o custo do meio e diminuem sua complexidade, facilitando a purificação. Além disso, a remoção do extrato de levedura reduz a formação de espuma no biorreator, reduzindo a chance de contaminação. Tabela 2 - Composição do meio de cultivo padrão e o meio de cultivo simplificado

[064] These changes reduce the cost of the medium and reduce its complexity, facilitating purification. In addition, removing the yeast extract reduces foaming in the bioreactor, reducing the chance of contamination. Table 2 - Composition of the standard culture medium and the simplified culture medium

Tests: - Influence of the carbon source:

[065] Como pode ser observado nas Figuras 2 e 3, a produção de fragmentos de anticorpo foi maior quando a sacarose foi utilizada como fonte de carbono.[065] As can be seen in Figures 2 and 3, the production of antibody fragments was higher when sucrose was used as a carbon source.

[066] A sacarose apresenta baixo custo e alta abundância no mercado. Além disso, as chances de contaminação da cultura diminuem, uma vez que outros micro-organismos precisam ter o maquinário bioquímico necessário para o uso dessa fonte.[066] Sucrose has low cost and high abundance in the market. In addition, the chances of contamination of the culture are reduced, since other microorganisms need to have the necessary biochemical machinery to use this source.

[067] A melhora está relacionada em parte devido a melhora no processo de purificação, uma vez que o meio de cultivo simplificado possui uma matriz menos complexa, favorecendo a purificação do fragmento de anticorpo.[067] The improvement is related in part due to the improvement in the purification process, since the simplified culture medium has a less complex matrix, favoring the purification of the antibody fragment.

- Influence of temperature:

[068] Conforme pode ser observado na Figura 4, a temperatura influencia na quantidade de fragmento de anticorpo produzido.[068] As can be seen in Figure 4, the temperature influences the amount of antibody fragment produced.

[069] A maior concentração de Di-scFv foi registrada quando a produção foi realizada entre 24 e 30°C. Por outro lado, a maior concentração de scFv glicosilado foi registrada quando a produção foi realizada entre 16 e 24°C. Por fim, quando a produção foi realizada entre 10 e 16°C, foi registrado que a concentração de scFv (monômero) foi mais alta.[069] The highest concentration of Di-scFv was recorded when production was carried out between 24 and 30°C. On the other hand, the highest concentration of glycosylated scFv was recorded when production was carried out between 16 and 24°C. Finally, when production was carried out between 10 and 16°C, it was recorded that the concentration of scFv (monomer) was higher.

[070] O controle do processo permite o direcionamento do produto desejado de acordo com os objetivos de emprego do mesmo.[070] The process control allows the direction of the desired product according to its employment objectives.

[071] Em vista do acima exposto, os resultados indicam que o método ora descrito na invenção é eficiente na produção de fragmentos de anticorpo (scFv) utilizando Pichia pastoris, sendo útil, assim, na obtenção de proteínas recombinantes de interesse farmacêutico.[071] In view of the above, the results indicate that the method described in the invention is efficient in the production of antibody fragments (scFv) using Pichia pastoris, thus being useful in obtaining recombinant proteins of pharmaceutical interest.

[072] O meio de cultivo simplificado ora proposto facilitou a purificação do produto, reduzindo a perda da biomolécula, os custos de produção e melhorando o rendimento global do método proposto.[072] The simplified culture medium now proposed facilitated the purification of the product, reducing the loss of the biomolecule, production costs and improving the overall yield of the proposed method.

Claims

1. Method of production of antibody fragments by genetically modified Pichia pastoris characterized by comprising the following steps: a) Pre-inoculum; b) Inoculum; c) Growth; d) First induction; e) Second induction; f) Third induction; and g) Separation.

2. Method according to claim 1, characterized in that it optionally comprises the step of cell reuse.

3. Method according to claim 1, characterized in that, in step "a", the pre-inoculum is prepared by thawing Pichia pastoris cells stored at a temperature ranging from 2 to 30°C and inoculation of them in BMSY medium.

4. Method according to claim 1, characterized in that Pichia cells are stored in glycerol from 5% to 50% v/v, preferably 20% v/v, and temperature from -20 to -90°C, preferably - 70°C, with a concentration of 5.3x1010 to 5.3x1015 UFC in YPS culture medium.

5. Method according to claim 3, characterized in that the inoculated cells are incubated in an orbital shaker between 50 and 500 rpm, preferably 250 rpm, with a temperature between 10 and 40°C, preferably 30°C, for 10 to 32 hours, preferably 16 hours.

6. Method according to claim 1, characterized in that, in step "b", the culture is transferred to a bioreactor containing a standard culture medium or the simplified culture medium.

7. Method according to claim 1, characterized in that, in step "c", cell growth is conducted in a bioreactor at a temperature ranging from 10 to 40°C, preferably 30°C, and kLa from 50 to 100 h-1, preferably 96 h-1, for a time interval of 15 to 32 hours, preferably 24 hours.

8. Method according to claim 1, characterized in that, in step "d", the first induction is conducted at a temperature ranging from 2 to 40°C and kLa from 2 to 50 h-1, preferably 12 h- 1, with addition of 0.1% to 4% v/v, preferably 0.5% (v/v) of methanol.

9. Method according to claim 1, characterized by the fact that, in step "e", the second induction is conducted after 24 hours, with maintenance of the parameters and the concentration of methanol in the medium.

10. Method according to claim 1, characterized in that, in step "f", the third induction is conducted after 24 hours, with maintenance of the parameters and the concentration of methanol in the medium.

11. Method according to claim 1, characterized in that, in step "g", the separation is conducted from 5 to 40 hours after step "f", by means of centrifugation, tangential filtration, decantation or other traditional technique allowing the recovery of viable cells in the supernatant.

12. Method according to claim 11, characterized in that, preferably, the separation is performed by means of centrifugation, using from 50 xg to 10000 xg, with time between 1 and 180 minutes and temperature between 2 and 40°C, preferably 5000 xg for 15 minutes at 4°C.

13. Method according to claim 1, characterized in that, in the optional step "h", the reuse is conducted by resuspension of the cells in a buffer solution of salts between 0.01M and 5M, preferably phosphate buffer, and subsequent transfer to the bioreactor.

14. Simplified culture medium for production of antibody fragments by genetically modified Pichia pastoris, according to the method defined in claims 1 to 13, characterized in that it comprises: - 0.5% casein peptone; - 0.2% YNB medium with addition of 10% ammonium sulphate; - 0.5% of casamino acids; - 0.5% methanol; and - 100mM potassium phosphate buffer.