BR102013033884A2 - composição farmacêutica de carreadores lipídicos nanoestruturados de antraciclinas e ácidos graxos poliinsaturados co-encapsulados, processo de obtenção e uso - Google Patents

Abstract

composição farmacêutica de carreadores llpídlcos nanoestruturados de antraciclinas e ácidos graxos poliinsaturados co-encapsulados, processo de obtenqao e uso. a presente invenção descreve composições farmacêuticas de carreadores lipídicos nanoestruturados contendo antraciclinas na forma de par iônico com um ácido graxo e co-encapsulação de um ácido graxo poliinsaturado dotado de atividade antitumoral. a invenção propõe também o processo de obtenção desses carreadores e composições farmacêuticas contendo os mesmos, bem como o uso dessas composições no tratamento quimioterépico antitumoral. a composição proposta visa não somente a diminuição da toxicidade sistêmica e dos efeitos adversos causados pelas antraciclinas, como também alcançar maior seletividade e aumento da citotoxicidade para as células tumorais, através do sinergismo promovido pela co-encapsulação de um acido graxo poliinsa atividade antitumoral, como o dha.

Description

COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA DE CARREADORES LIPÍDICOS NANOESTRUTURADOS DE ANTRACICLINAS E ÁCIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS CO-ENCAPSULADOS, PROCESSO DE OBTENÇÃO E USO

[001] A presente invenção se situa no campo da nanobiotecnologia de fármacos antitumorais e descreve composições farmacêuticas de carreadores lipídicos nanoestruturados contendo antracíclinas na forma de par iônico com um ácido graxo e co-encapsulação de um ácido graxo poliinsaturado dotado de atividade antitumorai. A invenção propõe também o processo de obtenção desses carreadores e composições farmacêuticas contendo os mesmos, bem como o uso dessas composições no tratamento quimioterápico antitumorai.

[002] As antraciclinas figuram como uma das principais classes de fármacos usados no tratamento contra o câncer. Na década de 60, a primeira antraciclina, chamada de daunorrubicina, foi isolada do pigmento vermelho brilhante produzido pela espécie Streptomyces peucetius. No entanto, estudos demonstraram que a administração crônica do fármaco poderia causar cardiotoxicidade fatal. No intuito de modificar a atividade biológica da daunorrubicina, objetivando o aumento da sua eficácia e a possível diminuição de efeitos adversos, linhagens de Streptomyces foram modificadas para produção de novas antraciclinas, como a doxorrubicina (Weiss, R. B. The Anthracyclines: will we ever find a better doxorubicin? Seminars in Oncology, v. 19, p. 670-686, 1992). Podem ser citados ainda a epirubicina (derivado semissintético da doxorrubicina) e a idarubicina (análogo da daunorrubicina) como fármacos de segunda geração.

[003] A daunorrubicina e doxorrubicina podem ser consideradas protótipos para as demais antraciclinas. Atualmente, estima-se que existem mais de 2000 análogos da doxorrubicina. Entretanto, ela é considerada a molécula mais eficaz no tratamento do câncer dentre as outras do grupo, apesar da elevada cardiotoxicidade (Minotti, G.; Menna, P.; Salvatoreili, E.; Cairo, G.; Gianni, L. Anthracyclines: Molecular Advances and Pharmacologic Developments in Antitumor Activity and Cardiotoxicity, Pharmacol Ver., v. 56, p. 185-229, 2004).

[004] A doxorrubicina (DOX), é um fármaco com grande utilização no tratamento de leucemias e tumores sólidos, seja isoladamente ou em combinação com outros fármacos (Weiss, 1992), Singal também cita o uso do fármaco no tratamento de iinfomas, tumores de mama, carcinoma esofágico, osteosarcomas, sarcoma de Kaposí, carcinomas do tecido mole, câncer testicular, gástrico, ovariano, fígado, biliar, pancreático, carcinoma endometrial e carcinoma de pulmão (Singal, P.K. Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. The New England Journal of Medicine, v. 339, p. 900-905, 1998).

[005] O mecanismo de ação da doxorrubicina é complexo e ainda não está bem esclarecido. No entanto, a intercalação com o DNA, a geração de estresse oxidativo e a inibição da topoisomerase II são as principais hipóteses (Fornari, F.A.; Randolph, J.K.; Yalowich, J.C.; Ritke, M.K.; Gewirtz, D.A. Interference by doxorubicin with DNA unwinding in MCF-7 breast tumor cells. Molecular Pharmacology, v. 45, p. 649-656, 1994), a inibição da biossíntese de macromoléculas (Momparler, R.L.; Karon, M.; Siegel, S.E.; Avila, F. Effect of Adriamycin on DNA, RNA and protein synthesis in cell-free systems and intact cells. Câncer Research, v. 36, p. 2891-2895, 1976; Sinha, B.K.; Mimnaugh, E.G. Free radicais and anticancer drug resistance: oxygen free radicais in the mechanisms of drug cytotoxícity and resistance by certain tumors. Free Radical Biology & Medicine, v. 8, p. 567-881, 1990; Darpa, P.; Liu, L. F. Topoisomerase-targeting antitumor drugs. Biochimica Biophysical Acta, v. 989, p. 163-177, 1989). O principal mecanismo é a formação de um complexo triplo com a topoisomerase II e o DNA. A doxorrubicina estabiliza esse complexo, após a quebra da cadeia de replicação do DNA, impedindo a dupla hélice de ser liberada e, assim, parando o processo de replicação.

[006] A DOX é um fármaco hidrofílico, o que acarreta sua baixa biodisponibilidade por via oral; ademais, há eliminação do fármaco pelo metabolismo de primeira passagem devido ao complexo do citocromo P450 e à bomba de efluxo da glicoproteína P, presente em grandes quantidades no intestino, fígado e rim (Beiiamy, W. T. P-glycoproteins and multidrug resistance. Annual Review of Pharmacology and Toxicoiogy, v. 36, p. 161-183, 1996). Devido à baixa absorção via oral, a doxorrubicina é administrada na forma de cloridrato por via endovenosa (WEISS, 1992). No entanto, esse fármaco tem um índice terapêutico baixo, e seu uso é limitado devido à mielossupressão, calvície, náusea aguda e vômito, estomatite, e principalmente à cardiotoxicidade cumulativa irreversível que pode conduzir à insuficiência cardíaca congestiva potencialmente fatal (Pai, V.B.; Nahata, M.C. Cardiotoxicity of chemotherapeutic agents: incidence, treatment and prevention. Drug Safety, v. 22, p. 263-302, 2000).

[007] Sendo assim, sistemas de liberação de fármacos (SLF), propositaimente planejados e produzidos com tamanho na faixa de nanômetros, constituem uma alternativa promissora para aumento da especificidade, proporcionando maior concentração do fármaco no tumor (Mamot, C.; Drummond, D.C.; Hong, K.; Kirpotin, D.B.; Park, J.W. Liposome-based approaches to overcome anticancer drug resistance. Drug Resistance Update, v. 6, p. 271-279, 2003; Thierry, A.R., Vige, D., Coughlin, S.S., Belfi, J.A., Dritschilo, A., Rahman, A. Modulation of doxorubicin resistance in multidrug-resistant cells by liposomes. The FASEB Journal, v. 7, p. 572-579, 1993) e redução da toxicidade (0'Brien, M.E.; Wigler, N.; Inbar, M.; Rosso, R,; Grischke, E.; Santoro, A.; Catane, R.; Kieback, D.G.; Tomczak, P.; Ackland, S.P.; Orlandi, F.; Mellars, L.; Alland, L.; Tendler, C.; Caelyx Breast Câncer Study Group. Reduced cardiotoxicity and comparable efficacy in a phase III trial of pegylated liposomal doxorubicin HCI (CAELYX/ Doxil) versus conventional doxorubicin for first-line treatment of metastatic breast câncer. Annals of Oncology, v. 15, p. 440-449, 2004).

[008] Entre as nanopartículas lipídicas contendo doxorrubicina, os lipossomas são SLF que têm especial relevância clinicamente. O desenvolvimento de lipossomas de circulação prolongada (recobertos com polietilenoglicol) carreando doxorrubicina possibilitou a obtenção de um produto comercial (cloridrato de doxorrubicina lipossomal injetável), denominado Doxil® (Janssen Biotech, Inc; Johnson & Johnson, EUA). Esse foi um dos primeiros produtos lipossomais disponibilizado comercialmente e muitos benefícios clínicos foram observados como a redução significativa da cardiotoxicidade, mielossupressão, vômitos e alopécia (Harris, L., Batist, G., Belt, R., Rovira, D., Navari, R., Azarnia, N., Welles, L., Winer, E. Liposome-encapsulated doxorubicin compared with conventional doxorubicin in a randomized multicenter trial as first-line therapy of metastatic breast carcinoma. Câncer, v. 94, p. 25-36, 2002; 0'Brien, et ai., 2004; Lorusso, V., Manzione, L., Silvestris, N. Role of liposomal anthracyclines in breast câncer. Annuals of Oncology, v. 18, p. 70-73, 2007).

[009] A patente US 2008/0279927 A1 (Non-pegyiated long-circulating liposomes) cita o encapsulamento da doxorrubicina na forma de cloridrato em lipossomas, formulação diferente da apresentada na presente invenção. Além disso, na descrição do preparo dos lipossomas, relata-se a necessidade de uso de solventes orgânicos.

[010] Em outro aspecto, foi supracitado que uma das possíveis estratégias descritas para aumentar a eficácia da DOX, consiste na sua combinação com outros fármacos. Nesse contexto, estudos têm demonstrado benefícios para a combinação de DOX e ácidos graxos políinsaturados (AGP), cujo de maior atividade encontrada foi o ácido docosahexaenóico (DHA) (Colas, S., Mahéo, K., Denis, F., Goupille, C., Hoinard, C., Champeroux, P., Tranquart, F., Bougnoux, P. Sensitization by dietary docosahexaenoic acid of rat mammary carcinoma to anthracycline: a role for tumor vascularization. Clinicai Câncer Research, v. 12, p. 5879-5886, 2006; Wang, Y., Li, L„ Jiang, W., Yang, Z., Zhanga, Z. Synthesis and preliminary antitumor activity evaluation of a DHA and doxorubicin conjugate. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, v.16, 2974-2977, 2006; Bougnoux, P., Hajjaji, N., Ferrasson, M.N., Giraudeau, B., Couet, C., Le Floch, O. Improving outcome of chemotherapy of metastatic breast câncer by docosahexaenoic acid: a phase II trial. British Journal of Câncer, v. 101, p. 78-85, 2009; Siddiqui, R. A., Harvey, K. A., Xu, Z., Bammerlin, E.M., Walker, C., Altenburg, J.D. Docosahexaenoic acid: a natural powerful adjuvant that improves efficacy for anticancer treatment with no adverse effects. Biofactors, v. 37, p. 399-412, 2011). Quando investigado em modelos animais, este efeito foi confirmado e atribuído a uma redução na vascularização do tumor induzida pelo DHA, potencializando a ação antitumoral da doxorrubicina (COLAS et ai, 2006). Mahéo e colaboradores (2005) verificaram que as seis ligações duplas da molécula de DHA proporcionam uma alta susceptibilidade à oxidação. Estes autores identificaram uma amplificação do estresse oxidativo e subseqüente lipoperoxidação por DHA nas células tumorais como um potencial mecanismo de sinergismo para a sensibilização à doxorrubicina (Mahéo, K., Vibet, S., Steghens, J.P., Dartigeas, C., Lehman, M., Bougnoux, P., Goré, J. Differential sensitization of câncer cells to doxorubicin by DHA: a role for lipoperoxidation. Free Radiccal Biology and Medicine, v.39, p. 742-751, 2005). Esses achados motivaram a investigação clínica dessa combinação e um importante estudo recente de fase II demonstrou que a associação com o DHA melhorou os resultados da quimioterapia com antraciclinas em pacientes com câncer mamário metastático (BOUGNOUX et al., 2009).

[011] A patente US 2013/0197087 (Composition comprising a combination of DHA and EPA for administration prior to commencement of chemotherapy) cita a administração de ácido docosahexaenóico (juntamente com ° ácido eicosapentaenóico) antes das sessões de quimioterapia para aumentar a eficácia do tratamento e/ou prevenir os efeitos adversos. Dessa forma, não se trata de administração concomitante de ambos os compostos em um sistema de liberação de fármacos. Também nesse aspecto, a patente US 2012/0213872 (Compositions comprising polyunsaturated fatty acid monoglycerides or derivatives thereof and uses thereof) cita formulações contendo monoglicerídeos de ácido graxos poliinsaturados, suas derivações e usos. Contudo, nenhuma das composições reivindicadas é igual à composição proposta para o presente pedido e também não descrevem a co-encapsulação com antraciclinas.

[012] Entretanto, as diferentes posologias dos fármacos usados na terapia de combinação dificultam o controle dos perfis farmacocinético e farmacodinâmico dos agentes combinados. Além disso, obter uma co-entrega temporal e local desses fármacos é um grande desafio. Nesse sentido, a co-encapsulação de fármacos em sistemas de liberação de fármacos constitui uma alternativa promissora (Parhi, P., Mohanty, C., Sahoo, S.K. Nanotechnology-based combinational drug delivery: an emerging approach for câncer therapy. Drug Discovery Today, v. 17, p. 1044-1052, 2012), na medida em que esses sistemas possuem vantagens como: farmacocinética controlada e sincronizada de fármacos, melhora da biodisponibilidade e o potencial de superar os mecanismos de resistência das células tumorais. Dessa forma, esses sistemas podem resultar numa melhora da eficácia dos fármacos combinados em uma única formulação (Okuda, T., Kidoaki, S. Multidrug Delivery Systems with Single Formulation - Current status and Future Perspectives. Journal of Biomaterials and Nanobiotechnology, v. 3, p. 50-60, 2012; PARHI et al., 2012).

[013] Em outro aspecto é sabido que a capacidade de encapsulação de agentes ativos em nanopartículas lipídicas sólidas (NLS), por exemplo, é limitada pela solubilidade do fármaco no lipídeo fundido, pela estrutura e pelo estado polimórfico da matriz lipídica. O encapsulamento de fármacos lipofílicos em NLS é geralmente favorecido devido à maior afinidade pela matriz lipídica. No entanto, para os fármacos hidrofílicos, como a doxorrubicina, ele é geralmente baixo e a formação de um par iônico com um grupo lipofílico tem sido proposta como uma alternativa para aumentar a taxa de encapsulação (Zara, G.P., Cavalfí, R., Fundarò, A., Bargoni, A., Caputo, O., Gasco, M.R. Pharmacokinetics of doxorubicin incorporated in solid lipid nanospheres (SLN). Pharmaceutical Research, v. 40, p. 281-286, 1999).

[014] A patente WO 2013/105101 (Solid lipid nanoparticles entrapping hydrophilic/amphiphilic drug and a process for preparing the samé) descreve um processo de preparação para a encapsulação de fármacos hidrofílicos em uma matriz lipídica. Contudo, o processo não descreve formação de par iônico para a encapsulação. Ademais, trata-se de uma nanopartícula lipídica sólida, constituída de matriz lipídica diferente da matriz do carreador lipídico nanoestruturado, apresentado no presente pedido.

[015] Na literatura há descrição de nanoemulsões contendo o par iônico doxorrubicina-ácido oleico, entretanto, a composição da formulação no artigo citado é diferente da proposta na presente invenção, pois apresenta uma nanopartícula diferente do carreador lipídico nanoestruturado; além disso, não apresenta co-encapsulação com outro fármaco dotado de atividade antitumoral (Zhang, X., Sun, X., Lí J., Zhang, X., Gong T, Zhang, Z. Lipid nanoemulsions loaded with doxorubicin-oleic acid ionic complex: characterization, in vitro and in vivo studies. Pharmazie, v. 66, p. 496-505, 2011).

[016] Apesar das grandes vantagens clínicas observadas para os lipossomas carregados com doxorrubicina, o elevado custo de produção desses sistemas e os problemas tecnológicos, como o uso de solventes, por exemplo, tem motivado a busca por sistemas carreadores alternativos.

[017] Nesse contexto, as nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) e carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) configuram-se como alternativas interessantes (Müller, R.H., Mãder, K., Gohla, S. Solid lipid nanoparticles (SLN) for controlled drug delivery - a review of the State of the art, European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, v. 50, p. 161-177, 2000; Mehnert, W., Mãder, K. Solid lipid nanoparticles: production, characterization and applications. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 47, p. 165-196, 2001; Radtke, M., Souto, E., Müller, R.H. Nanostructured Lipid Carriers: a Novel Generation of Solid Lipid Drug Carriers. Pharmaceutical Technology Europe, v. 17(4), p. 45-50, 2005).

[018] As NLS e os CLN podem ser produzidos com o uso de homogeneizador de alta pressão, similar àqueles usados na fabricação em larga escala de emulsões para nutrição parenteral, o que representa uma vantagem quando se compara com a fabricação dos sistemas poliméricos e lipossomais (MEHNERT e MÃDER, 2001).

[019] Os CLN compartilham as vantagens das NLS como, fácil escalonamento, constituintes compatíveis para administração parental e de baixa toxicidade, excelente estabilidade física, proteção da degradação de fármacos incorporados, liberação controlada de fármacos (rápida ou prolongada) dependendo do modelo de incorporação e direcionamento do fármaco para regiões específicas, mas ainda possuem alguns maiores benefícios, como maior capacidade de carga de fármaco e melhor estabilidade física devido à menor expulsão do fármaco da matriz durante armazenamento. (MÜLLER et ai, 2000; MEHNERT e MADER, 2001; Wissing, S.A., Kayser, O.; Müller, R.H. Solid lipid nanoparticles for parenteral drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 56, p. 1257-1272, 2004; Brioschi, A.; Zenga, F.; Zara, G.P.; Gasco, M.R.; Ducati, A.; Mauro, A. Solid lipid nanoparticles: could they help to improve the efficacy of pharmacologic treatments for brain tumors? Neurologycal Research, v. 29, p. 324-330, 2007) .

[020] Os CLN consistem de uma matriz lipídica resultante de uma mistura de lipídeos sólidos e líquidos que é sólida nas temperaturas ambiente e corporal. Os lipídeos líquidos estão distribuídos espacialmente, resultando numa estrutura com imperfeições na estrutura cristalina que pode acomodar maior quantidade de fármaco. Apesar da presença de lipídios líquidos, a matriz permite ainda um controle da liberação de fármacos, possibilitando uma maior retenção quando comparada com nanoemulsões (NE) (MEHNERT e MÃDER, 2001; Müller, R.H., Radtke, M., Wissing, S.A. Nanostructured lipid matrices for improved microencapsulation of drugs. International Journal of Pharmaceutics, v. 242, p. 121-128, 2002; WISSING et ai, 2004).

[021] Diante do exposto, pode-se concluir que não há descrito no Estado da Técnica composição de carreadores lípídicos nanoestruturados contendo a combinação proposta. A presente invenção propõe a formação de um carreador lipídico nanoestruturado co-encapsulando doxorrubicina (como um par iônico, formado in situ ou não com o ácido oleico) e o ácido docosahexaenóico (DHA), na forma de triglicerideo, podendo ressaltar as seguintes vantagens dessa tecnologia: i) o par iônico é formado no momento de preparo da formulação, sem uso de solventes orgânicos e sem uso de compostos com potencial de toxicidade; ii) O DHA na forma de triglicerideo é líquido a temperatura ambiente è faz parte da matriz lipídica, resultando na formação do CLN, e é mais estável do que a forma ácida; iii) a formulação desenvolvida apresenta ainda retenção na matriz lipídica em pH fisiológico e liberação aumentada em pH ácido, o que é interessante no tratamento de tumores sólidos; iv) aumento da citotoxicidade, em comparação com as formas de doxorrubicina empregadas na clínica, cloridrato de doxorrubicina e doxorrubicina fipossomal, possivelmente pela co-entrega temporal intracelular da doxorrubicina e do ácido docosahexaenóico (que possui atividade antitumoral) devido à co-encapsulação desses dois fármacos no carreador.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[022] Figura 1 - Diagrama esquemático representativo dos CLN após o preparo (A). Reações propostas para a formação in situ do par iônico entre doxorrubicina e ácido oleico (B).

[023] Figura 2 — Perfil de liberação da doxorrubicina em meio de cultura através do método de diálise, utilizando uma membrana de éster de celulose com cut off para peso molecular de 100 KDa. N = 3; Média ± DP. * p < 0,05.

[024] Figura 3 - Avaliação da citotoxicidade em monocamada do CLN branco, doxorrubicina livre (DOX livre), doxorrubicina + DHA livres (DOX+DHA livres), CLN 0,4% e CLN-DHA 0,4% avaliada em (A) MDA-MB-231, (B) MCF-7, (C) MCF-7/ Adr após 24 h de incubação. N = 3; Média ± DP. *p < 0,05.

[025] Figura 4 — Avaliação da internalização da doxorrubicina livre ou encapsulada em CLN combinada ou não com DHA por meio de análises das intensidades médias de fluorescência (IMF) das células de três linhagens de câncer humano após incubação por 2 h com diferentes tratamentos, equivalentes a 16 μΜ de doxorrubicina. As análises foram realizadas por citometria de fluxo com fluorescência no canal FL-2. N = 3; Média ± DP; *p < 0,05.

[026] Figura 5 - Avaliação da liberação de LDFI a partir de esferóides incubados por 48 h com o equivalente a 100 μΜ de doxorrubicina e 700 pM de DHA.

[027] Figura 6 - Avaliação da penetração da doxorrubicina nos esferóides por microscopia confocal após 2 h de incubação com diferentes tratamentos.

[028] Figura 7 - Avaliação do volume tumoral em função do tempo, calculado por meio de medidas dos diâmetros e altura, utilizando paquímetro. Os animais foram divididos em três grupos: 1 - sem tratamento (Controle), 2 - tratados com solução de doxorrubicina (DOX livre) e 3 - tratados com doxorrubicina + DHA co-encapsulados em CLN (CLN-DHA 0,4%). O tratamento constituiu-se de 4 doses de 2,2 mg/kg. N = 6; Média ± DP. * p < 0,05.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[029] A presente invenção descreve carreadores lipídicos nanoestruturados formados por uma matriz constituída de uma mistura de lipídeos sólidos e líquidos; uma amina hidrofílica ou lipofílica; par iônico, formado in situ ou não, por meio da reação entre a antraciclina, preferencialmente doxorrubicina, e um ácido graxo, preferencialmente ácido oleico; co-encapsulação de um ácido graxo poliinsaturado dotado de atividade antitumoral, preferencialmente ácido docosahexaenoico (DHA), ácido oleico e ácido linoléicona forma de triglicerídeo; tensoativos; e excipientes farmaceuticamente aceitáveis. A invenção propõe também o processo de obtenção desses carreadores e composições farmacêuticas contendo os mesmos, bem como o uso dessas composições no tratamento quimioterápico antitumoral.

[030] O processo para produção dos carreadores apresenta as seguintes etapas básicas: a. Pesar, aquecer e homogeneizar a Fase Oleosa (FO), consistindo de cloridrato de doxorrubicina, DHA (triglicerídeo), polissorbato 80, óleo de amendoim, behenato de glicerila, ácido oléico, trietanolamina, com o fármaco antitumoraí (antraciciina) até fusão dos lípides, mantendo-se a temperatura de 50 a 100°C;b. Pesar e aquecer a Fase Aquosa (FA), consistindo de EDTA e água purificada , em outro recipiente, de 50 a 100°C; c. Verter lentamente a FA sobre a FO e homogeneizar por ultrassom ou homogeneizador de alta pressão de média e grande escala; d. Resfriar a mistura até atingir preferencialmente a temperatura entre 10 e 40 °C; e. Acertar o pH para entre 6 e 8 preferencialmente entre 7,0 e 7,5 com HCI ou NaOH, preferencialmente 1 mol/L. A preparação deverá ser armazena ao abrigo da luz e mantida sob temperatura, preferencialmente, entre 0 e 20 °C.

[031] A Fase Oleosa (FO) é composta por cloridrato de doxorrubicina, DHA (triglicerídeo), polissorbato 80, óleo de amendoim, behenato de glicerila, ácido oléico, trietanolamina. A Fase Aquosa (FA) é composta por EDTA e água purificada. O aquecimento dos componentes da FO e da FA deve ocorrer paralelamente e, preferencialmente, a uma temperatura de 75° a 85° C. A FA deve ser vertida sobre a FO de forma lenta e, sob agitação durante o tempo de 30 segundos a 10 min. A transferência da emulsão formada para o ultrassom pode ocorrer a uma amplitude de 21% e a homogeneização deve durar entre 2 e 20 min. O resfriamento da mistura pode ser feito em banho de água, sob agitação, até atingir a temperatura entre 10 e 40 °C. O pH deverá ser acertado com HCI ou NaOH, preferencialmente a 1 mol/L até alcançar, preferencialmente, 7,0-7,5. O produto deverá ser mantido a temperatura entre 0 e 20 °C, preferencialmente, 4 °C.

[032] As composições podem ser administradas via intramuscular, intranasal, inalatória (pulmonar), oral, preferencialmente intravenosa.

[033] Na composição, as concentrações das antraciclinas podem variar entre 0,01 a 5% p/v, preferencialmente entre 0,01 a 3% p/v; as concentrações do ácido graxo podem variar entre 0,005 a 10% p/v, preferencialmente entre 0,005 a 5% p/v; as concentrações de ácido graxo poliinsaturado, na forma de triglicerídeo podem variar entre 0,01 a 20% p/v, preferencialmente entre 0,01 a 8% p/v; as concentrações de amina hidrofílica ou lipofílica podem variar entre 0,01 a 5% p/v, preferencialmente entre 0,01 a 3% p/v; as concentrações da matriz lipídica podem variar entre 0,5 a 40% p/v, preferencialmente entre 0,5 a 25% p/v; e as concentrações de tensoativo podem variar entre 0,01 a 30% p/v, preferencialmente entre 0,01 a 20% p/v.

[034] Na obtenção da matriz lipídica podem ser utilizados lipídeos sólidos como triglicerídeos (tricaprina, trilaurina, trimiristína, tripaimitina, tristearina, não limitantes), diglicerídeos (behenato de glicerila, não limitante), monoglicerídeos (monoestearato de glicerila, não limitante), ácidos graxos (ácido esteárico, não limitante), esteroides (colesterol, não limitante) e ceras (palmitato de cetila, não limitante); e lipídeos líquidos (óleo de soja, óleo de algodão, óleo de sésamo, óleo de milho, óleo de amendoim e triglicerídeos de ácidos graxos poliinsaturados (ácido alfa-linoleico, ácido estearidonico, ácido eicosatrienoico, ácido eicosatetraenoico, ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenoico, ácido clupanodonico, ácido docosahexaenoico, ácido tetracosapentaenoico, ácido tetracosaexaenoico, não limitantes).

[035] Os tensoativos podem compreender ésteres de sorbitano, polissorbatos, ésteres de sorbitano etoxilado, lecitinas, co-polímeros de poli-óxido de propileno com poli-óxido de etileno (poloxamers), colato de sódio, giicocolato de sódio, não limitantes.

[036] Ademais, a composição antitumoral da presente invenção caracteriza-se pelo uso da mistura de excipientes farmaceuticamente aceitáveis, combinados a antraciclinas, aminas iipofílicas ou hidrofílicas, seus sais farmaceuticamente aceitáveis incluídas em CLN e, no mínimo, um outro composto farmacologicamente ativo incluído ou não em CLN. Podem ser preparadas composições com um excipiente ou mistura desses. Exemplos de excipientes incluem água, solução salina, soluções tamponadas com fosfato, solução de Ringer, solução de dextrose, solução de Hank, soluções salinas biocompatíveis contendo ou não polietilenoglicol. Veículos não aquosos, como óleos fixos, óleo de sesame, etil-oleato ou triglicerídeo também podem ser usados. Outras formulações úteis incluem agentes capazes de aumentar a viscosidade, como carboximetilceíulose de sódio, sorbítol ou dextran para a obtenção dos géis ou formulações mucoadesivas que facilitam muito a sua aplicação.

[037] Os excipientes também podem conter quantidades menores de aditivos, como substâncias que aumentam a isotonicidade e estabilidade química de substâncias ou tampões. Exemplos de tampões incluem tampão fosfato, tampão bicarbonato e tampão Tris. Exemplos de conservantes incluem timerosal, m-cresol ou o-cresol, formalina e benzil-álcool. As composições padrões podem ser líquidas ou sólidas. Desta forma, em uma composição não líquida, o excipiente pode incluir dextrose, albumina de soro humano, conservantes, entre outros, para qual a água ou solução salina estéril pode ser acrescentada antes da administração.

[038] A presente invenção pode ser melhor entendida através dos seguintes exemplos, não limitantes. EXEMPLO 1 - Preparação dos carreadores lipídicos nanoestruturados [039] Os CLN foram preparados pelo método de homogeneização a quente, utilizando o agitador Ultra Turrax T-25 (Ika Labortechnik, Alemanha) e aparelho de homogeneização de uítrassom com sonda de alta potência (CPX 500, Cole Parmer, Vernon. Hills, IL, EUA). A preparação da composição se deu através das seguintes etapas: a. Pesagem e aquecimento dos componentes da Fase Oleosa (FO) e homogeneização da mesma até a completa dispersão da antraciclina e fusão dos lípides, mantendo-se a temperatura; b. Paralelamente, realizar a pesagem e aquecimento da Fase Aquosa (FA), em outro recipiente, à mesma temperatura da FO; c. Verter lentamente a FA sobre a FO, sob agitação, por aproximadamente 2 minutos; d. Transferir a emulsão formada para uítrassom a uma amplitude de 21% e homogeneizar por aproximadamente 5 minutos; e. Resfriar a mistura em banho de água, sob agitação, com bastão de vidro, até temperatura ambiente, entre 10 e 40 °C; f. Acertar o pH para 7,0-7,5 com HCI ou NaOH 1 mol/L; g. Armazenar a preparação ao abrigo da iuz e manter sob a temperatura de 4 °C.

[040] A composição dos CLN está descrita na tabela 1.

Tabela 1. Exemplo de composição das formulações (% p/v) CLN CLN CLN-DHA

Componentes branco 0,4% 0,4% Cloridrato de doxorrubicina 0,1 0,1 (FO) DHA (triglicerídeo) (FO) - - 0,4 Polissorbato 80 (FO) 1,0 1,0 1,0 Oléo de amendoim (FO) 0,4 0,4 Behenato de glicerila (FO) 1,1 1,1 1,1 Ácido oleico (FO) 0,1 0,1 0,1 Trietanoiamína (FO) 0,06 0,06 0,06 EDTA (FA) 0,02 0,02 0,02 Água purificada (FA) q.s.p,* q.s.p.* q.s.p.* FO- fase oleosa FA- Fase aquosa [041] O CLN “branco” corresponde ao carreador lipídico nanoestruturado com os mesmos componentes dos demais CLN, exceto os fármacos; o CLN 0,4% corresponde ao CLN sem a adição de DHA e, finalmente, o CLN-DHA 0,4% representa o carreador proposto para utilização no tratamento quimioterápico.

[042] A formação do par iônico para aumentar a encapsulação da doxorrubicina foi realizada utilizando ácido oleico numa relação molar de 1:2, respectivamente. O ácido graxo poliinsaturado foi incorporado como triglicerídeo. O óleo de amendoim foi utilizado como referência de lipídios de baixa atividade antitumoral, uma vez que sua composição contempla lipídeos de baixa insaturação, sendo a grande maioria triglicerídeos do ácido oieico. O CLN foi armazenado ao abrigo da luz e mantida sob refrigeração, a 4°C.

[043] Durante o preparo, a ordem de adição e concentração dos componentes foi definida a fim de favorecer a formação in situ do par iônico entre a doxorrubicina e o ácido oieico, mas ela não é limitante. As reações químicas propostas estão descritas na Figura 1. Para a conversão do cloridrato de doxorrubicina em doxorrubicina base livre, é adicionada uma amina hidrofílica ou lipofílica; a doxorrubicina na forma de base livre é a molécula que reagirá com o ácido graxo, para formação do par iônico. EXEMPLO 2 - Caracterização dos carreadores iipídicos nanoestruturados [044] Os carreadores obtidos foram caracterizados quanto ao tamanho, potencial Zeta, eficiência de encapsulação e carga de fármaco.

[045] O diâmetro das partículas e o potencial Zeta foram obtidos utilizando-se o Zetasízer 3000 MHS.

[046] O diâmetro hidrodinâmico das partículas foi determinado pelo método de espalhamento dinâmico da luz (EDL). Para a realização das medidas, os CLN foram diluídos em solução NaCI 1mM. As medidas foram efetuadas a temperatura de 25°C e em ângulo de 90°. Os resultados foram apresentados como a média das triplicatas, sendo que em cada análise foram realizadas 10 medições.

[047] Já para a determinação do Potencial Zeta foi empregada a análise da mobilidade eletroforética das vesículas e do espalhamento dinâmico de luz das partículas. As medidas foram feitas em triplicata em alíquotas diluídas em solução NaCI 1 mM, na temperatura de 25°C, a um ângulo de 90°.

[048] No que diz respeito a Eficiência de Encapsulação (EE): considerando que a doxorrubicina pode ser encontrada no CLN nas seguintes situações, [DOX total] = [DOX precipitada] 4- [DOX solúvel] -f- [DOX encapsula-da] onde, a fração DOX precipitada (DOX do filtrado) é relativa ao fármaco não encapsulado e não solúvel na fase aquosa, sendo a fração solúvel e não encapsulada a DOX solúvel (DOX do ultrafiltrado). A DOX encapsulada é a fração retida na matriz lipídica, a EE nos CLN foi calculada utilizando o método de filtração e ultrafíltração e a porcentagem de EE foi obtida utilizando a seguinte fórmula: [049] A Carga de Fármaco (CF), que é o peso de doxorrubicina (mg) por peso total das partículas (g), foi calculada pela fórmula: [050] Onde a fração Peso total dos lipídeos das partículas é somatório de behenato de glicerila e ácido oleico. A fração DOX encapsulada é referente à quantidade de doxorrubicina encapsulada calculada com os valores obtidos de EE.

[051] Considerando que a doxorrubicina tem potencial para se adsorver nos dispositivos de filtração e ultrafíltração foi necessária a realização do procedimento denominado “passivação”. Este procedimento tem por objetivo reduzir ou eliminar essa adsorção.

[052] Esses carreadores lipídicos nanoestruturados devem apresentar tamanho médio inferior a 500 nm e ídealmente entre 50 e 150 nm (não limitante). Os valores obtidos nos procedimentos acima descritos estão compilados na Tabela 2.

Tabela 2: Dados do tamanho das partículas, o índice de polidispersividade, eficiência de encapsulação e carga de fármaco para diferentes formulações. CLN 0,4% 76 ±0 0,19 ±0,01 - 40 ± 3 99 ± 0 31 ± 0 CLN-DHA 0,4% 86 ± 7 0,13 ±0,04 - 36 ± 3 99 ± 0 31 ± 0 N = 3; Média ± DP; IP = índice de polidispersividade; EE = eficiência de encapsulação; CF = carga de fármaco [053] Os tamanhos variaram entre 76 e 86 nm e os valores IP foram iguais ou menores do que 0,22, sugerindo monodispersão dos diâmetros médios das partículas. Os valores do potencial zeta foram negativos para todas as formulações e variaram entre -32 e -40 mV. Os resultados da avaliação da EE da doxorrubicina demonstraram que praticamente todo o fármaco adicionado foi encapsulado, com valores próximos a 100%. Os valores de CF foram iguais para todas as formulações carregadas com doxorrubicina, equivalentes a 31 mg/ g. EXEMPLO 3 - Estabilidade do CLN em presença de proteínas [054] Considerando que o pedido se refere a uma nova composição contendo doxorrubicina para administração endovenosa, a estabilidade do CLN-DHA 0,4% em soro fetal bovino (SFB) foi investigada para verificar uma possível agregação das partículas em presença de proteínas. A estabilidade do CLN na presença de proteínas foi avaliada através da incubação das partículas com soro SFB 1:1 a 37° C sob agitação constante (250 rpm) por até 24 h. As amostras foram coletadas, diluídas em água purificada e as medidas de diâmetro médio e potencial zeta das partículas foram realizadas utilizando o equipamento Zeta Plus.

[055] Os resultados dessa avaliação estão descritos na Tabela 3. Os tamanhos foram de aproximadamente 70 nm após incubação com SFB por até 24 h. As alterações de IP foram muito pequenas e variaram de 0,15 a 0,18. As alterações de potencial zeta foram mínimas e variaram de -32 a -37 mV. Dessa forma, a CLN-DHA 0,4% demonstrou ser estável após incubação com proteínas e sugere que não haverá agregação das partículas após uma eventual administração endovenosa.

Tabela 3. Estabilidade da formulação CLN-DHA 0,4% em SFB por até 24 h.

Tempo Tamanho Potential zeta IP (h) (nm) (mV) 0 68 ±1 0,16 ±0,01 - 34 ± 1 4 70 ±0 0,18 ±0,01 - 32 ± 1 8 70 ±0 0,15 ±0,00 - 34 ± 1 24 70 ±1 0,16 ±0,01 - 37 ± 2 N = 3; Média ± DP EXEMPLO 4 - Estudos de liberação da doxorrubicina [056] A liberação da doxorrubicina foi conduzida através de diálise após diluição das nanopartículas (1:2) em meio de cultura (DMEM) completo (10% de SFB) (adaptado de Elbayoumi e Torchilin, 2008). As membranas de diálise utilizadas foram com tamanho de cutoff de 100 KDa (membrane de ester de cellulose, Spectrum Laboratories; Rancho Dominguez, EUA). Os valores foram plotados como porcentagem acumulada de liberação de doxorrubicina.

[057] O cálculo da liberação foi realizado pela equação: [058] Onde, DOX liberada = concentração de doxorrubicina medida no meio fora da bolsa de diálise, DOX total = concentração teórica total de doxorrubicina (10 pg/ mL) considerando a diluição de 1 mL da solução ou formulação em 50 mL de meio de cultura (3 mL + 47 mL).

[059] A Figura 2 mostra o perfil de liberação da doxorrubicina obtido por diálise a partir das formulações diluídas em meio de cultura. A liberação de doxorrubicina a partir da CLN-DHA 0,4% foi 5 ± 1% nos primeiros 30 min e aumentou para 14 ± 1%, 23 ± 0% e 30 ± 1% em 1 h, 2 h e 4 h, respectivamente. Após esse período não houve mais liberação por até 48 h.

[060] A solução de doxorrubicina foi avaliada como controle e em até 2 h, mais de 90% do fármaco foi medido no líquido receptor (meio de cultura), o que sugere uma condição sink para a doxorrubicina. Dessa forma, a formulação CLN-DHA 0,4% demonstrou capacidade de controlar a liberação de doxorrubicina. EXEMPLO 5 - Estudos de atividade in vitro [061] A composição obtida demonstrou bons resultados com relação à sua atividade antitumoral. 5.1 Células em monocamada 5.1.1 Cultivo Celular [062] Os estudos in vitro foram conduzidos com as linhagens de adenocarcinomas mamários humanos sensíveis (MCF-7 e MDA-MB-231; ATCC, Manassas, EUA) e resistente (MCF-7/ Adr; National Institute of Healthy - NIH, Frederick, Maryland, EUA).

[063] Para o cultivo, alíquotas de células foram retiradas de um estoque em nitrogênio líquido, descongeladas rapidamente a 37°C e adicionadas em meio de cultura DMEM/ F12 completo (suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de antibiótico). Em seguida, as células foram centrifugadas, ressuspendidas em meio de cultura, transferidas para um frasco de cultura de células de 25 ou 75 mL e incubadas em estufa úmida a 37°C e 5% de CO2. A cada 48 horas o meio de cultura foi substituído por um novo.

[064] As diluições dos fármacos livres e formulações foram realizadas em meio de cultura imediatamente antes do tratamento. Excepcionalmente, o DHA foi solubilizado inicialmente em etanol absoluto e, em seguida, no meio de cultura. 5.1.2 Viabilidade celular, avaliação da citotoxicidade induzida por diferentes formulações [065] A viabilidade celular das células em monocamada após incubação com os tratamentos foi avaliada utilizando o CelITiter-Blue® Cell Viability Assay kit (CTB) de acordo com o protocolo do fabricante. Células de MDA-MBA-231, MCF-7 e MCF-7/ Adr foram plaqueadas em placas cultivo de 96 poços, com 5χ103 células/ poço por aproximadamente 24 h antes da incubação com os fármacos.

[066] A Figura 3 mostra os dados da citotoxicidade induzida pelos CLN avaliada em cultura de monocamada para as três linhagens. Para a MDA-MB-231 (Figura 3-A), com 2 pM de doxorrubicina (equivalente a 14 μΜ de DHA), a viabilidade para as células incubadas com doxorrubicina livre e doxorrubicina + DHA livres foi de 49 ± 5% e 44 ± 4%, respectivamente. Nessa concentração dos fármacos, os CLN 0,4% e CLN-DHA 0,4% resultaram em diminuição significativa de viabilidade celular, com valores de 38 ± 1% e 32 ± 2%, respectivamente. Dessa forma, 2 μΜ de doxorrubicina + 14 pM de DHA (relação 1:7) foram as concentrações mínimas para se obter algum benefício após a encapsulação dos fármacos. Todas as demais concentrações superiores dos fármacos, o CLN-DHA 0,4% exibiu aumento significativo da citotoxicidade em comparação com os outros tratamentos. Para as maiores concentrações avaliadas (16 pM de doxorrubicina + 112 pM de DHA), a viabilidade foi de 21 ± 0%, 20 ± 0%, 17 ± 1%, 9 ± 2% para doxorrubicina livre, doxorrubicina e DHA livres, CLN 0,4% e CLN-DHA 0,4%, respectivamente.

[067] Para a MCF-7 (Figura 3-B), com 2 pM de doxorrubicina + 14 pM de DHA, a viabilidade para as células incubadas com doxorrubicina livre, doxorrubicina e DHA livres, CLN 0,4% e CLN-DHA 0,4% foi de 39 ± 8%, 37 ± 8%, 31 ± 1%, 31 ± 1% para respectiva mente. As diferenças entre os tratamentos não foram estatisticamente significativas. A maior citotoxicidade para CLN-DHA 0,4% foi observada com 16 pM de doxorrubicina + 112 pM de DHA, onde a viabilidade celular foi de 18 ± 1%, 17 ± 2%, 14 + 0%, 12 ± 0% para doxorrubicina livre, doxorrubicina e DHA livres, CLN 0,4% e CLN-DHA 0,4%, respectivamente.

[068] A Figura 3-C mostra os dados da citotoxicidade induzida pelos CLN e fármacos livres para a linhagem resistente MCF-7/ Adr. A citotoxicidade induzida pelos CLN 0,4% e CLN-DHA 0,4% foi significativamente maior do que aquela observada os fármacos livres. As concentrações mínimas para verificar esse efeito foram 2 pM de doxorrubicina e 14 pM de DHA. Nesta condição, a viabilidade celular foi de 62 ± 8%, 63 ± 2%, 37 ± 2%, 30 ± 1% para doxorrubicina livre, doxorrubicina e DHA livres, CLN 0,4% e CLN-DHA 0,4%, respectivamente. A maior citotoxicidade para os CLN foi verificada com 16 μΜ de doxorrubicina + 112 μΜ de DHA, onde os valores de viabilidade celular foram 59 ± 2%, 61 ± 5%, 20 ± 1% e 7 ± 0% para doxorrubicina livre, doxorrubicina + DHA livres, CLN 0,4% e CLN-DHA 0,4%, respectivamente. O aumento da concentração dos fármacos livres não induziu aumento da citotoxicidade e as diferenças entre doxorrubicina livre e doxorrubicina + DHA livres não foram estatisticamente significativas. Deve ser enfatizado que a citotoxicidade induzida pelo CLN-DHA 0,4% foi significativamente maior do que aquela observada pelo CLN 0,4%, demonstrando a importância da combinação da doxorrubicina + DHA e suas respectivas co-encapsulações no CLN. Além disso, em nenhuma das linhagens a formulação CLN branco apresentou citotoxicidade. 5.1.3 Internalização da doxorrubicina [069] Para investigar a influência dos carreadores lipídicos nanoestruturados sobre a internalização da doxorrubicina, em comparação com os fármacos livres, foi utilizado o método de citometría de fluxo.

[070] As intensidades médias de fluorescências (IMF) foram analisadas no canal FL-2 e foram considerados 10.000 eventos por análise. O experimento foi realizado em triplicata.

[071] A Figura 4 mostra os dados de internalização da doxorrubicina avaliada por citometría de fluxo. As linhagens sensíveis MDA-MB-231 e MCF-7 apresentaram o mesmo perfil de internalização da doxorrubicina, onde as intensidades médias de fluorescência (IMF) para as células incubadas com os fármacos livres (DOX livre e DOX+DHA livres) foram maiores do que aquelas Incubadas com os fármacos encapsulados (CLN 0,4% e CLN-DHA 0,4%). Não houve diferença estatística entre as IMF para as células incubadas com doxorrubicina livre e doxorrubicina + DHA livres. Em contrapartida, a atividade citotóxica do CLN-DHA 0,4% foi significativamente maior do que aquela observada para o CLN 0,4%. Para a linhagem MCF-7/Adr, o comportamento foi diferente daquele observado para as células sensíveis. Os valores de IMF para as células incubadas com os CLN foram maiores do que aqueles observados para os fármacos livres e as diferenças foram estatisticamente significantes. Os valores de IMF foram aproximadamente 2,6 * maiores para a doxorrubicina encapsulada em CLN do que a forma livre. Entretanto, não foram observadas diferenças significativas entre os CLN 0,4% e CLN-DHA 0,4%, bem como entre a doxorrubicina livre e doxorrubicina + DHA livres. Deve ser ressaltado que não houve fluorescência significativa para células incubadas com a formulação CLN branco. 5.2 Esferóides 5.2.1 Obtenção dos esferóides [072] A linhagem MCF-7/Adr, resistente à quimioterapia, foi utilizada para preparar os esferóides. O método de obtenção foi o de sobreposição líquida, conforme previamente descrito por PERCHE et ai. (2012). 5.2.2 Citotoxicidade [073] A citotoxicidade dos tratamentos foi medida utilizando o CytoTox® 96 Non-Radioactive Cytotoxicity kit (Promega; Fitchburg, EUA). Após 48 h de incubação com o equivalente a 100 uM de doxorrubicina, foram quantificadas as lactato desidrogenases (LDH) liberadas no meio de cultura (LDH do meio) e aquelas contidas nas células associadas à estrutura dos esferóides (LDH do lisado).

[074] A Figura 5 mostra os dados relativos à avaliação da citotoxicidade em esferóides dos fármacos livres e encapsulados em CLN. As concentrações equivalentes de doxorrubicina e DHA foram 100 μΜ e 700 μΜ, respectivamente. A incubação dos esferóides com CLN-DHA 0,4% resultou em 93 ± 6% de LDH liberado no meio de cultura e esse valor foi significativamente maior do que aqueles observados para os outros grupos. Para CLN 0,4%, a doxorrubicina lipossomal (Lipodox®), doxorrubicina+DHA livres e doxorrubicina livre os valores foram 51 ± 13%, 44 ± 5%, 35 ± 10% and 25 ± 9%, respectivamente. Portanto, a citotoxicidade induzida pelo CLN-DHA 0,4% foi muito maior do que aquela observada para os outros grupos. Não houve diferença significativa entre DOX livre x DOX+DHA livres, DOX+DHA livres x Lipodox® e Lipodox® x CLN 0,4%. Em contrapartida, a liberação do LDH foi significativamente maior a partir do Lipodox® e CLN 0,4% em comparação com DOX livre e DOX+DHA livres. Por outro lado, seria importante mencionar que os esferóides incubados com CLN-DHA 0,4% apresentaram completa desestruturação, com células desagregadas e espalhadas pelo poço, após 48 h de incubação. Este fenômeno não foi observado para os outros grupos. Além disso, a incubação com CLN branco e meio de cultura (Controle) não resultou em liberação significativa de LHD (valores menores do que 2%). 5.2.3 Penetração da doxorrubicina na estrutura tridimensional [075] A fim de determinar o potencial das composições na penetração na estrutura sólida de um tumor avascular, a distribuição da doxorrubicina no esferóide foi avaliada por microscopia confocal. A penetração da doxorrubicina livre ou encapsulada na estrutura tridimensional dos esferóides foi analisada explorando a fluorescência natural da molécula.

[076] A Figura 6 mostra as imagens obtidas. Da esquerda para a direita, as imagens representam cortes seccionais em profundidade em direção ao centro do esferóide. Podemos verificar que há uma redução da fluorescência para os esferóides incubados com todos os tratamentos. Entretanto, é possível visualizar uma diferença entre esses grupos e eles podem ser organizados em ordem decrescente de fluorescência da seguinte forma: CLN-DHA 0,4% > CLN 0,4% > Lipodox® > doxorrubicina + DHA livres = doxorrubicina livre. Considerando a camada mais profunda dessa sequência de imagens (70 μΜ) é possível verificar que os esferóides incubados com CLN-DHA 0,4% apresentam uma intensidade de fluorescência muito maior do que aquela observada para os outros grupos, tanto na região periférica quanto na central. Essa avaliação sugere que a doxorrubicina carreada por essa formulação resultou em maior penetração e maior difusão pela estrutura tridimensional. Seria interessante observar que este efeito foi maior do que aquele observado para a CLN 0,4% demonstrando as vantagens devido à combinação com o DHA. Os esferóides incubados com a formulação sem fármaco (CLN branco) e com meio de cultura (Controle) não demonstraram qualquer fluorescência. EXEMPLO 6 - Estudos de atividade in vivo [077] Para esse estudo, foram preparadas para os tratamentos uma solução de cloridrato de doxorrubicina a 0,5 mg/ ml_ para comparação com a composição CLN-DHA 0,4%, também contendo 0,5 mg/mL da antraciclina, conforme mencionado na Descrição Detalhada da Invenção. Também foram utilizadas: células 4T1, cultivadas em meio de cultura até fase logarítmica de crescimento, com mistura de DMEM e RPMI na proporção 1:1, completo com 10% de SFB e 1% de antibióticos; e dezoito Balb/c fêmeas com 7-8 semanas de vida (aproximadamente 20 g). As células foram suspensas e inoculadas no flanco esquerdo de cada animal e os animais foram acompanhados em relação ao aparecimento e medidas quantitativas do volume tumoral (SOUZA, 2013).

[078] No sétimo dia após o inóculo, quando os tumores atingiram aproximadamente 150 mm3, os animais foram divididos em três grupos com seis cada: Grupo 1 - animais sem tratamento (Controle), Grupo 2 - doxorrubicina livre (DOX livre), Grupo 3 - doxorrubicina e DHA co-encapsulados em CLN (CLN-DHA). O tratamento foi realizado com 4 doses, a cada 2 dias, com o equivalente a 2,2 mg de doxorrubicina/ kg/ dia (adaptado de ELBAYOUMI e TORCHILIN, 2009). O volume de formulação ou solução de doxorrubicina administrado foi de 100 pL, por via endovenosa, realizadas pela veia caudal utilizando seringas de insulina de 1 mL, [079] A partir do início do tratamento (Dia 0), os animais foram acompanhados a cada dois dias, em relação às medidas dos tumores utilizando um paquímetro [080] A relação entre o volume final do tumor no último dia analisado e o volume inicial, denominada Volume Relativo Tumoral (VRT), foi avaliada da seguinte forma (LEITE et ai, 2012): [081] Os valores de VRT obtidos foram utilizados para o cálculo do índice de Inibição do Crescimento (IC) do tumor (LEITE et ai, 2012): [082] O acompanhamento dos animais foi feito até o Dia 10 a partir do início do tratamento, correspondente ao 17° dia após inóculo das células. Nessa data, os animais foram eutanasiados e foram removidos os tumores e pulmões para análises histopatológicas.

[083] Os resultados mostrados na Figura 7 mostra a variação do volume do tumor em função do tempo para os diversos tratamentos. O volume do tumor dos animais não tratados (grupo controle) aumentou de forma contínua até o dia 8, com uma discreta estabilização até o dia 10, quando o valor foi 1303 ± 479 mm3. O grupo DOX livre demonstrou menor progressão do tumor quando comparado com o grupo Controle, com volume significativamente menor no dia 10, equivalente a 726 ± 220 mm3. Os animais tratados com o CLN-DHA apresentaram maior controle da progressão do tumor durante o tempo avaliado do que os outros grupos, com estabilização a partir do dia 4. O volume foi significativamente menor do que aquele observado para os demais grupos a partir do dia 6, com volume médio de 337 ± 32 mm3 no dia 10.

[084] Os dados encontrados com os cálculos de Volume Relativo Tumoral (VRT) e Inibição do Crescimento (IC) estão descritos na Tabela 6.

Tabela 6. Valores de Volume Relativo Tumoral (VRT) e Inibição do Crescimento (IC) dos grupos em função do tratamento.

Tratamento VRT (média ± DP) IC (%) Controle 5,9 ± 0,7 DOX livre 5,0 ±1,9 15 CLN-DHA 0,4% *2,7 ± 0,7 54 [085] A variação de peso dos animais em função do tempo para os diversos tratamentos também foi calculada. Pôde-se observar que os animais do grupo Controle apresentaram ganho de peso desde o dia 0 até o dia 10, o que também foi verificado para os animais tratados com o CLN-DHA. Entretanto, o peso dos animais do grupo DOX livre diminuiu significativamente em relação ao grupo Controle e CLN-DHA 0,4% desde o primeiro dia de tratamento e não houve recuperação até o dia 10.

[086] Através dos exemplos acima (estudos in vitro e in vivo) foram observadas diferenças significativas entre a formulação proposta (CLN-DHA 0,4%) e as demais formas presentes no mercado, cloridrato de doxorrubicina e solução injetável de doxorrubicina lipossomal.

[087] Foi possível obter para os CLN valores de encapsulação de doxorrubicina próximos a 100%, partículas com tamanho menores do que 100 nm e liberação da doxorrubicina retida em pH 7,4. Esse perfil de liberação, retida em pH fisiológico e maior em pH ácido pode ser interessante para uma entrega sítio-específica da doxorrubicina na região tumoral.

[088] O potencial citotóxico e de penetração associados à redução da vascularização e possível efeito “permeabilidade e retenção aumentada” (PRA), descrito na literatura (Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release, v. 65, p. 271-284, 2000; Torchilin, V. Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Advanced Drug Delivery Reviews, v. 63, p. 131-135, 2011) podem explicar a atividade antitumoral aumentada da CLN-DHA 0,4% em relação à doxorrubicina livre nos estudos in vivo.

[089] Esses achados associados ao potencial de redução de toxicidade elegem a composição CLN-DHA 0,4% como uma potencial alternativa terapêutica para a melhora da eficácia no tratamento do câncer.

REIVINDICAÇÕES

Claims (14)

1. Composição farmacêutica de carreadores lipídicos nanoestruturados, caracterizada por compreender matriz lipídica constituída de uma mistura de iipídeos sólidos e líquidos; uma amina hidrofíiica ou lipofílica; par iônico, formado in situ ou ex situ, por meio da reação entre um composto da classe das antraciclinas e um ácido graxo; co-encapsulação de ácido graxo poliinsaturado, dotado de atividade antitumoral, na forma de trigíicerídeo; tensoativos; e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

2. Composição farmacêutica de carreadores lipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender concentração de matriz lipídica entre 0,5 a 40% p/v, preferencialmente entre 0,5 a 25% p/v; concentração de amina hidrofíiica ou lipofílica entre 0,01 a 5% p/v, preferencialmente entre 0,01 a 3% p/v; concentração de um composto da classe das antraciclinas entre 0,01 a 5% p/v, preferencialmente entre 0,01 a 3% p/v; concentração de ácido graxo entre 0,005 a 10% p/v, preferencial mente entre 0,005 a 5% p/v; concentração de ácido graxo poliinsaturado, dotado de atividade antitumoral, na forma de trigíicerídeo entre 0,01 a 20% p/v, preferencialmente entre 0,01 a 8% p/v; e concentração de tensoativo entre 0,01 a 30% p/v, preferencialmente entre 0,01 a 20% p/v.

3. Composição farmacêutica de carreadores lipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pela matriz lipídica constituída de uma mistura de Iipídeos sólidos e líquidos compreender Iipídeos sólidos, puros ou combinados, preferencialmente triglicerídeos, diglicerídeos, monogíicerídeos, ácidos graxos, esteroides e ceras; e Iipídeos líquidos, preferenciaímente óleos e triglicerídeos de ácidos graxos poliinsaturados.

4. Composição farmacêutica de carreadores lipídicos nanoestruturados, de acordo com as reivindicações 3, caracterizada pelos Iipídeos sólidos serem preferencialmente triglicerídeos selecionados do grupo compreendendo tricaprina, trilaurina, trimiristina, tripalmitina, tristearina; diglicerídeos, preferencialmente behenato de glicerüa; monogíicerídeos, preferenciaímente monoestearato de glicerila; ácidos graxos, preferencialmente ácido esteárico; esteroides, preferencialmente colesterol; e ceras, preferenciaimente palmitato de cetila; e os lipídeos líquidos selecionados do grupo compreendendo óleo de soja, óleo de algodão, óleo de sésamo, óleo de milho, óleo de amendoim; triglicerídeos de ácidos graxos poliinsaturados selecionado do grupo compreendendo ácido alfa-linolênico (ALA), ácido estearidonico (STD), ácido eicosatrienoico (ETE), ácido docosahexaenoico (DHA), ácido eicosatetraenoico (ETA), ácido eicosapentaenoico (EPA), ácido docosapentaenoico (DPA), ácido clupanodonico, ácido tetracosapentaenoico, ácido tetracosaexaenoico, preferencialmente ácido docosaexanoico (DHA).

5. Composição farmacêutica de carreadores Iipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender amina hidrofílica ou lipofílica, selecionada do grupo compreendendo 4-fenilciclo-hexilamina, procaína, benzatina, dibenzilamina, benetamina, oleamina, dodecilamina, trietilamina, preferencialmente trietanolamina e estearilamina.

6. Composição farmacêutica de carreadores iipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender par tônico formado entre um composto da classe das antraciclinas selecionado do grupo contendo daunorrubicina, doxorrubicina, epirubicina, idarubicina, mitoxantrona, pixantrona, valrubicina, preferencialmente doxorrubicina e um ácido graxo selecionado do grupo compreendendo ácido butírico, ácido araquídico, ácido linolênico, ácido linoléico, ácido oléico, ácido esteárico, ácido margárico, ácido palmitoléico, ácido palmítico, ácido pentadecanóico, ácido miristolênico, ácido mirístico, ácido láurico, ácido cáprico, ácido caprílico, ácido capróico, preferencial mente ácido oleico,

7. Composição farmacêutica de carreadores iipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo ácido graxo poliinsaturado, dotado de atividade antitumoral, na forma de triglicerídeo ser preferencialmente selecionado entre ácido docosahexaenoico, ácido oléico e ácido linoléico.

8. Composição farmacêutica de carreadores Iipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelos tensoativos selecionados do grupo compreendendo ésteres de sorbitano, polissorbatos, ésteres de sorbitano etoxilado, lecitinas, co-polímeros de poli-óxido de propileno com poli-óxido de etileno (poloxamers), colato de sódio, glicocolato de sódio, preferencialmente polissorbatos e ésteres de sorbitano etoxilado.

9. Composição farmacêutica de carreadores lipídicos nanoestruturados, de acordo com as reivindicações 1 a 8, caracterizado por ser administrada via intramuscular, intranasal, inalatória (pulmonar), oral, preferencialmente intravenosa.

10. Processo para obtenção de carreadores lipídicos nanoestruturados, descritos nas reivindicações 1 a 9, caracterizado por ser constituído das seguintes etapas: a. Pesar, aquecer e homogeneizar a Fase Oleosa (FO); consistindo de uma mistura de lipídeos sólidos e líquidos, a amina hidrofílica ou lipofílica, o par iônico formado por um composto da classe das antraciclinas com um ácido graxo e de um ácido graxo poiiinsaturado dotado de atividade antitumoral, na forma de triglicerídeo e o tensoativo; até fusão dos lípídes, mantendo-se a temperatura de 50 a 100 °C; b. Pesar e aquecer a Fase Aquosa (FA), consistindo de EDTA e água purificada, em outro recipiente, de 50 a 100 °C; c. Verter a FA sobre a FO e homogeneizar; d. Resfriar a mistura até atingir preferencialmente a temperatura entre 10 e 40 °C; e. Acertar o pH da solução final para entre 6 e 8 preferencialmente entre 7,0 e 7,5., preferencialmente com HCi ou NaOH 1 mol/L.

11. Processo para obtenção de carreadores lipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 10, etapa a, caracterizado peia fase oleosa consistir preferencialmente de cloridrato de doxorrubicina, DHA (triglicerídeo), polissorbato 80, óleo de amendoim, behenato de glicerila, ácido oléico, trietanolamina, com o fármaco antitumoral antraciclina.

12. Processo para obtenção de carreadores lipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo aquecimento dos componentes da FO e FA, na etapa “a” e na etapa “b” ser preferencialmente a uma temperatura de 75 a 85 °C.

13. Processo para obtenção de carreadores iipídicos nanoestruturados, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por compreender na etapa “c”, homogeneização ser por meio de aparelho de ultrassom ou homogeneizador de alta pressão.

14. Uso da composição farmacêutica descrita nas reivindicações 1 a 9, caracterizado por ser na preparação de um aditivo, uma formulação ou um medicamento para prevenção e tratamento de lesões neoplásicas e/ou pré neoplásicas.