BR102013032750A2 - processo de obtenção de óleo essencial antimicrobiano de cymbompogon densiflorus, óleo obtido, formulações farmacêuticas e/ou cosméticas nanoemulsionadas e seu uso - Google Patents

Abstract

processo de obtenção de óleo essencial antimicrobiano de cymbompogon densiflorus, óleo obtido, formulações farmacêuticas e/ou cosmeticas nanoemulsionadas e seu uso. o processo objeto da presente invenção fornece um óleo essencial com atividade antimicrobiana, notadarnente contra bactérias gram positivas, gram negativas e fungos, a partir de folhas e/ou inflorescências de cymbompogon denstflorus com constituintes majoritários pinocarveol, limoneno, trans-p-menta-2,8-dienol e 5 - isopropenil-2- metileneciclohexanoi para o óleo da inflorescéncia e trans-p-menta-2,8-dienol, biciclo [3.3 .o]oct-2-en-7-ona 6-metil, 3,9-epoxi-p-menta-i ,8(10)-dieno e 5 -isopropenil-2- metilenociclohexanol para o óleo da folha. estes compostos apresentam relevância de aplicação na indústria farmacêutica, química, cosmética, na produção de perfumes e aromas e de domissanitários. o processo objeto da presente invenção também fornece a obtenção de nanoemulsões, contendo óleo essencial de cymbompogon densiflorus tornando possível sua utilização mantendo sua atividade antimicrobiana.

Description

“PROCESSO DE OBTENÇÃO DE ÓLEO ESSENCIAL ANTIMICROBIANO DE Cymbompogon demiflorm, ÓLEO OBTIDO, FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS E/OU COSMÉTICAS NANOEMULSIONADAS E SEU USO”. 1) As plantas medicinais têm sido utilizadas tradicionalmente na medicina popular, com finalidade terapêutica para o tratamento de várias enfermidades. Geralmente, são administradas oralmente na forma de chás, infusões, elixires e extratos (FOGLIO et ai, 2006). 2) As espécies vegetais são fontes de matéria-prima em diversas indústrias, como a farmacêutica, cosmética, alimentícia, química e também para a agricultura e horticultura. Substâncias químicas específicas presentes em espécies vegetais possuem ação terapêutica e são utilizadas como princípios-ativos de produtos farmacêuticos. O uso da matéria-prima vegeta] na elaboração de fitoterápicos por indústrias de medicamentos está aumentando nos últimos anos (FLORES et al., 2011). 3) O potencial da biodiversidade de gerar benefícios econômicos tem sido cada vez mais valorizado pelos meios acadêmico e industrial, uma vez que esta pode ser fonte de matéria-prima para a medicina e diversos setores da indústria, como o farmacêutico, cosmético, alimentício, químico, de aditivos e também para a agricultura. 4) A biodiversidade vegetal é enorme e ainda não foi totalmente pesquisada, estima-se que apenas 10% da biodiversidade vegetal mundial tenham sido estudadas. Entretanto, nesta pequena porcentagem, aproximadamente 140 mil metabólitos secundários provenientes de plantas já foram isolados e caracterizados. Na Terapêutica moderna estima-se que cerca de 40% dos medicamentos disponíveis tenham sido desenvolvidos a partir de fontes naturais, sendo 25% provenientes de plantas, 13% de micro-organismos e 3% de animais (CAL1XTO, 2000). 5) Em Minas Gerais, há o domínio de três biomas brasileiros: o cerrado, a mata atlântica e a caatinga. O domínio do cerrado, localizado na porção centro-ocidental, ocupa cerca de 57% da extensão territorial do Estado, o domínio da mata atlântica, localizado na porção oriental, é de cerca de 41% da área do Estado. O domínio na caatinga, restrito ao norte do Estado, ocupa cerca de 2% do território mineiro (IEF, 2013). Esta biodiversidade nos permite a obtenção de uma gama de matérias-primas para a produção de produtos farmacêuticos e cosméticos. Entretanto, pouco desta foi estudada quanto à sua ação e eficácia. 6) O gênero Cymbopogon Sprengel pertence à família Poaceae, subfamília Panicoideae e compreeende espécies em toda a região tropical e subtropical, principalmente na Ásia e na África. As espécies do gênero Cymbopogon encontradas no Brasil foram introduzidas, onde se naturalizaram, com exceção de C. citratus (DC.) Stapf, conhecida como “capim-cidreira”, que no Brasil produz flores raras e estéreis. 7) A espécie Cymbopogon densflorus (Steud.) é originária da África e é popularmente conhecida como “capim-caboclo” e suas folhas apresentam cheiros característicos de limão. Essa espécie vegetal é de interesse medicinal, e industrial e existem poucos estudos sobre os constituintes dos óleos essenciais destas espécies. 8) Cymbopogon densiflorus (Anexo 1) é uma espécie cespitosa, anual, com lâminas foliares planas e glabras, colmos eretos, de 70-200 cm, levemente pêndulo devido à densa inflorescência que é abundantemente ramificada. Óleos essenciais 9) Óleos essenciais (OE) são derivados orgânicos de estrutura química heterogênea que se apresentam, em certos gêneros de plantas superiores e inferiores, bem como em microrganismos. São líquidos viscosos e podem ou não exalar odor. O termo óleo essencial foi definido no século XVI por Paracelso, médico e alquimista suíço. 10) O termo “óleo volátil” tem sido mais usado devido à relação com as propriedades físico-químicas da planta, uma vez que “óleo essencial” pode designar também outros produtos odorantes, não provindos de origem vegetal, que são as “essências heterosídicas”, obtidas através da hidrólise enzimática de heterosídeos. 11) Os OEs são originados do metabolismo secundário das plantas e possuem composição química complexa. São compostos de hidrocarbonetos terpênicos, alcoóis simples e terpenos, aldeídos, cetonas, fenóis, ésteres, óxidos, peróxidos, furanos, ácidos orgânicos, lactonas, cumarinas e compostos contendo enxofre, apresentando diferentes concentrações. Entre esses compostos destacam-se os fenilpropanóides, preponderando os terpenóides. 12) Estes materiais também são conhecidos por óleos etéreos e são líquidos oleosos, aromáticos obtidos a partir de material vegetal (flores, brotos, sementes, folhas, galhos, cascas, ervas, madeira, frutas e raízes). Esses podem ser extraídos de plantas através da técnica de arraste a vapor, na grande maioria das vezes, e também pela prensagem do pericarpo de frutos cítricos, que no Brasil dominam o mercado de exportação. 13) Os óleos essenciais obtidos por destilação por arraste a vapor e seus derivados podem ser utilizados como repelentes e são considerados como uma alternativa aos convencionais pesticidas químicos sintéticos, devido ao reduzido risco à saúde e da sua biodegradabilidade. 14) Geralmente, são considerados óleos líquidos aqueles de aparência oleosa a temperatura ambiente e, por apresentarem volatilidade, recebem ainda o nome óleos voláteis; são chamados de essenciais devido ao aroma agradável e intenso da maioria de seus representantes. A denominação óleos etéreos é referente ao fato dos mesmos serem solúveis em solventes orgânicos apoiares, como éter. 15) Como características dos óleos essenciais podem ser citadas: 16) Sabor; geralmente acre e picante. 17) Cor: quando recentemente extraídos os óleos essenciais são geralmente incolores ou ligeiramente amarelados. 18) Estabilidade: normalmente os óleos essenciais são instáveis, principalmente na presença de ar, luz, calor, umidade e metais. 19) índice de refração e opticamente ativos, A maioria dos óleos possui índice de refração e são opticamente ativos, propriedades estas usadas na sua identificação e controle de qualidade. 20) O ambiente no qual o vegetal se desenvolve e o tipo de cultivo influi na composição química dos óleos essenciais. A temperatura, umidade relativa do ar, duração total da exposição ao sol e o regime de ventos exercem influência direta, principalmente nas espécies que possuem estruturas histológicas de estocagem de óleos na superfície. A variabilidade na produção e teor de óleos essenciais é conhecida por ser afetada por fatores ambientais tais como: luz, disponibilidade de nutrientes, estação do ano, período do dia, ciclo e parte da planta. 21) Estima-se que 3000 OEs são conhecidos, dos quais cerca de 300 são importantes comercialmente, destinados principal mente para o mercado de flavorizantes e fragrancias. (BURT, 2004). Atualmente, os óleos essenciais além de serem utilizados como conservantes naturais e fragrâncias em produtos cosméticos, novas aplicações como conservantes de alimentos, promotores de crescimento em gado, pesticidas naturais em Agricultura Orgânica e inseticidas estão surgindo. Tais aplicações são possíveis devido às propriedades químicas e biológicas que esses óleos apresentam (RODRÍGUEZ-ROJO et al, 2012). 22) O uso terapêutico de óleos essenciais tem se expandido por todo o mundo, sendo amplamente utilizados contra doenças inflamatórias, alérgicas, reumáticas e artrite. Esses tratamentos são reconhecidos através de experimentações clinicas, em especial por aplicação tópica, via massagens. São poucos os estudos científicos sobre as ações biológicas dos OEs. Até então, tem sido estabelecido, cientificamente, que cerca de 60% dos óleos essenciais possuem propriedades antifúngicas e 35% exibem propriedades antibacterianas (OLIVEIRA et al., 2006). 23) Os OEs, por serem, naturais e biodegradáveis, podem atuar sobre várias moléculas-alvo ao mesmo tempo, quando comparado aos fármacos sintéticos, sendo assim, tornam-se substâncias chaves para a pesquisa de novos medicamentos. Os OEs são voláteis, ou seja, durante o preparo de formulações é necessário encontrar a sua concentração ideal com intuito de minimizar a evaporação e proteger o óleo da luz, oxidação e altas temperaturas. Para obter esse resultado, as emulsões óleo-água (O/A) são uma das formulações preferidas para os OEs.

Emulsões 24) Emulsões são sistemas heterogêneos, definidos como a mistura íntima de dois líquidos imiscíveis, um dos quais está disperso no outro na forma de glóbulos ou gotículas.De acordo com a hidrofilia ou lipofilia da fase dispersante, estes sistemas classificam-se em óleo em água (O/A) ou água em óleo (A/O). Em geral, são compostas por três fases: fase aquosa, fase oleosa e fase emulgente. a. Quando a emulsão que possui gotículas com diâmetro entre 20 e 500 nm, essas são denominadas nanoemulsões que são considerados sistemas metaestáveis, cuja estrutura é dependente do processo utilizado em sua preparação. São passíveis de sofrerem diluição, mantendo a sua estrutura inicial, principalmente em relação ao tamanho dos glóbulos e não requerem altas concentrações de tensoativos (entre 3,0 a 10,0%) comparado às microemulsões na qual a concentração destes pode chegar a 20,0%. b. As nanoemulsões possuem várias aplicações em áreas como a indústria cosmética, farmacêutica, veterinário ou domissanitários. Estes sistemas possuem propriedades particulares devido à sua granulometria, pois objetos destas dimensões possuem propriedades físicas completamente diferentes de seus análogos macroscópicos, permitindo, assim, novas aplicações. O tamanho reduzido previne o fenômeno da coalescência, pois esses glóbulos não são facilmente deformáveis, conferindo uma elevada estabilidade ao sistema; além disto, a espessura do filme interfacial (relativo ao tamanho do glóbulo) previne que a diminuição natural do mesmo não seja significativa, o que levaria ao rompimento do glóbulo. c. Os óleos essenciais são voláteis, ou seja durante o preparo de formulações é necessário encontrar a sua concentração ideal com intuito de minimizar a evaporação e proteger o óleo da luz, da oxidação, e de altas temperaturas. Para obter esse resultado, as emulsões óleo-água (O / A) são uma das formulações preferidas OE. d. A natureza da fase oleosa pode ter grande influência na estabilidade do sistema. Apesar de óleos minerais produzirem sistemas mais estáveis do que óleos vegetais, devido à possibilidade de haver maior interação entre os tensoativos e os óleos vegetais, que apresentam composição mais complexa. Outra vantagem é que estes óleos vegetais constituem-se, por si só, princípios ativos de interesse dos mais variados segmentos, como indústrias cosméticas, farmacêuticas, veterinárias ou domissanitárias.

Estado da técnica Métodos de obtenção de óleos essenciais 25) Os OEs podem ser obtidos através de diferentes processos, dependendo da localização no vegetal, quantidade e das características requeridas para o produto final. Os processos usuais são: prensagem ou expressão, destilação por arraste a vapor, extração com solventes orgânicos (extração por Soxhlet) e com Gás Carbônico (CO2) supercrítico. Dentre as técnicas citadas, destacam-se a destilação por arraste a vapor e extração com solventes orgânicos, por serem de extrema simplicidade e reduzido custo. 26) O método de prensagem faz uso de prensas hidráulicas. Após a extração por prensagem é necessária a utilização de solventes orgânicos para separar o óleo presente na torta obtida após a prensagem. Os solventes mais utilizados são éter etílico, diclorometano e hexano, porém esses solventes também extraem outros compostos lipofílicos, além dos OEs. É necessário ressaltar que mesmo após a separação do solvente do óleo pode ser encontrado resíduos de solvente contaminando o mesmo. a. O processo de extração de OEs por arraste a vapor é o mais utilizado. Tal método consiste em colocar o material vegetal em ura compartimento o qual pode ser uma dorna ou um balão de fundo redondo. O vapor de água ao passar pelo material vegetal extrai os compostos voláteis da planta. O vapor condensa ao chegar ao sistema de condensação sendo possível coletar o óleo extraído no sistema de decantação. O óleo essencial, assim que obtido é colocado em funil de decantação para que haja uma separação minuciosa da água através da diferença de densidade e imiscibilidade das fases. O método de extração utilizando o aparelho de Clevengeré um exemplo de processo de arraste a vapor. 27) A extração por CO2 supercrítico tem elevado custo devido ao fato de trabalhar com altas pressões. Para a extração, o CO2 é liquefeito através de compressão e em seguida aquecido a 31°C . Quando é aquecido a essa temperatura, 0 CO2 atinge um estado no qual sua viscosidade é semelhante à de um gás, mas a capacidade de dissolução é parecida com a de um líquido. Após a extração, é realizada a conversão do CO2 ao estado gasoso novamente, 0 que resulta em sua total eliminação. Como vantagens da extração por CO2 supercrítico pode-se notar a não utilização de solventes orgânicos, sendo assim 0 produto final obtido é mais puro já que não há traços de solvente após a extração. a. Na extração por Soxhlet são utilizados solventes orgânicos para extração preferencialmente apoiares. A desvantagem é que os solventes apoiares podem extrair também outros compostos lipofílicos além do OE. Na extração, 0 solvente passa através de um cartucho ou compartimento contendo 0 vegetal, produzindo uma solução e levando-a consigo até o balão de aquecimento. Ocorre a concentração do soluto com a destilação do solvente. Tal método é útil quando a diferença de solubilidade do soluto em ambos os solventes não é muito grande. b. Em artigo publicado por Chisowa (1997), os óleos obtidos a partir da destilação de folhas e inflorescências de C. densiflorus coletadas em Zambia, a composição encontrada foi para as inflorescências: limoneno (52,1%), trans-p-menta-2,8-dien-l-ol (10,0%), verbenol (9,7%) e álcool perílico (7,2%), enquanto as folhas apresentaram como componentes majoritários trans-p-menta-2,8 dien-l-ol (22,4%), verbenol (18,0%), álcool perílico (17,2%) e cis-p-menta-l(7), 8dien-2-ol (11,1%). c. Takaisi-Kikuni et al. (2000) relatam a produção de óleo essencial de C. densiflorus coletadas na República Democrática do Congo através de hidrodestilação, com rendimento bruto de 10 ml/kg (1,0%) e composição majoritária de limoneno, cimeneno, p-cimeno, cise trans-carveol, carvona, iso-piperitenona, p-mentha-l(7), 8-dien-ol e p-menta-2, 8-dien-l-ol. Este óleo foi avaliado como antibacteriano, apresentando atividade contra bactérias Gram positivas e negativas, sendo mais ativo contra as Gram positivas. Não foi demonstrada a utilização do material como produto antifúngico, tampouco sua avaliação de atividade contra fungos filamentosos e leveduras, especialmente de interesse médico/farmacêutico/veterinário como Condida albicans, Cryptococcus neoformans, Aspergylus sp, etc. d. As nanoemulsões são produzidas através da redução dos glóbulos formados inicialmente, e essa redução é gerada com métodos que utilizam alta ou baixa energia para emulsificação. e. Métodos de alta energia fazem uso de equipamentos como homogeneizadores de alta pressão, microfluidizadores e ultrasom. A natureza e quantidade dos tensoativos, monômeros e óleo utilizados determinam a distribuição de tamanho das estruturas e estabilidade das nanopartículas ou nanoemulsões resultantes. As patentes PI04G4595-5 e PI0100335-6 descrevem uma nanoemulsão para aplicação cosmética, formada com a mistura da fase aquosa e oleosa em um homogeneizador de alta pressão. Porém, essa técnica de produção envolve a utilização de equipamentos específicos, de custo elevado, que consomem grande quantidade de energia e, quando a proposta é encapsular moléculas frágeis como peptídeos, proteínas e ácido nucléico, podem levar ao aquecimento excessivo dos produtos, aumentando a degradação/desnaturação do fármaco ou a perda de atividade durante o processo, propiciando a degradação de substâncias sensíveis, f. Emulsificação espontânea por difusão em solvente orgânico (descrito no documento PI0016767-7) ou por inversão de fases (descrita no documento W02009/121069) são os métodos que fazem uso de baixa energia. Nesses casos, as propriedades físico-químicas intrínsecas dos tensoativos, óleos e excipientes que compõem a formulação são de extrema importância. A principal vantagem é que o método de inversão de fases não faz uso de solvente orgânico.

Descrição detalhada da invenção Obtenção do óleo essencial 28) Plantas adultas de Cymbopogon denstflorus foram coletadas na cidade de Ouro Preto-MG, Brasil, em local de crescimento natural (não cultivado) dentro do Campus Universitário Morro do Cruzeiro da Universidade Federal de Ouro Preto-UFQP. Foram separadas, para processamento, as folhas e as influorescências. O material foi submetido à extração por arraste forçado de vapor de água, utilizando-se o sistema de caldeira aquecida no qual o material vegetal foi colocado em uma dorna para ocorrer a extração em um hidrodestilador. Depois da condensação, a mistura de cada óleo essencial foi recebida em coletores comunicantes e separados por decantação. 29) Como pontos críticos do processo destacamos que as porções do vegetal coletada devem permanecer em local arejado, sem incidência de luz solar direta, em temperaturas entre 2 a 50°C, preferencialmente entre 4 a 45 °C, por um período entre 30 minutos e 7 dias, preferencialmente entre 1 a 72 horas antes de ser utilizada. A temperatura da dorna de destilação deve ser regulada para a produção de fluxo contínuo de vapor, com temperatura entre 100 e 130 °C. A condensação do óleo é feita através de condensador resfriado a temperatura entre 2 e 20 °C.

Preparo das nanoemulsões por inversão de fases 30) A técnica de inversão de fases consistiu-se em aquecer as fases aquosa e oleosa separadamente até dada temperatura, entre 35 e 98°C, preferencialmente entre 40 e 90°C, em seguida verteu-se a fase aquosa sobre a fase oleosa sob agitação constante entre 50 a 1500 rotações por minuto (rpm), preferencialmente entre 60 e 1300 rpm, até resfriamento à temperatura ambiente. Após a produção, as nanoemulsões são caracterizadas e acondicionadas em frascos com tampa que permita a vedação, impedindo contato com o ar e protegidos da incidência de luz.

Fase oleosa 31) Como fase oleosa para as nanoemulsões produzidas por inversão de fases, podem ser utilizados óleos vegetais fixos (preferencialmente) e/ou óleos essenciais. A estes óleos foi adicionado o óleo essencial da folha e/ou inflorescência de Cymbopogon densiflorus, obtidos conforme descrito anteriormente. 32) Como indicativo de óleo vegetal a ser utilizado temos: óleo de alcatrão vegetal ou óleo de abacate, açafrão, alcarávia, alecrim, alfazema, algodão, alho, amêndoa doce, amêndoas, amendoim, amyris, andiroba, arnica, anis, anis estrelado, arroz, arruda, aveia, bacuri, bálsamo, basilicão, benjoim, bergamota, bétula, breu, buriti, cabreuva, cacau, cajepute, cálamo, calêndula, camomila, canela, cânfora, canola, capim-limão, cardamomo, carqueja, cartamo, carnaúba, castanha de caju, castanha do Brasil, castanha do Pará, cedro, cenoura, cipreste, citronela, colza, coco babaçu, coco palmiste, coentro, cominho, copaíba, cravo, cumaru, cupuaçu, dendê, erva cidreira, eucalipto, funcho doce, gálbano, gengibre, gerânio, gergelim, germe de trigo, girassol, hortelã pimenta, jasmim, jojoba, laranja, lavanda, lima, limão, linhaça, louro, mamona, manjericão, manjerona, maracujá, marmeleiro, mate-verde, melaleuca, melissa, menta arvensis, milho, mirra, mostarda, murumuru, nabo, neem, oiticica, olíbano, oliva, orégano, palma, patauá, patchouli, pau-rosa, pimenta, pinho, pitanga, pracaxi, priprioca, puxuri, rícino, rosa, rosa mosqueta, salsa, sálvia, sândalo, semente de uva, soja, tangerina, tomilho, tucum, tucumã, tungue, ucuuba, uricuri, urucum, verbena, vetiver, virola. A concentração de óleos nas nanoemulsões situa-se na faixa de 1,0 a 40,0% na composição total, preferencialmente entre 1,0 a 30,0%.

Fase aquosa 33) A fase aquosa das nanoemulsões foi constituída de água. A esta pode ser adicionada quaisquer materiais de interesse que sejam hidrossolúveis e termorresistentes, apresentando atividades adicionais como fármacos, agentes terapêuticos, protetores, antioxidantes, antimicrobianos, antivirais, antitumorais, corantes, pigmentos, polímeros espessantes, formadores de filme, etc.

Tensoativos 34) Como tensoativos podem ser empregados uma combinação de tensoativos aniônicos, catiônicos, anfóteros ou não iônicos, sendo preferencialmente os tensoativos não iônicos que podem ser alcanolamidas de ácidos graxos (como etanolamida, monoetanolamida, dietanolamida e trietanolamida de ácido graxo de coco, de babaçu ou de palma), ésteres de sorbitano (como monolaurato de sorbitano, monooleato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano, monoestearato de sorbitano, monoestearato-palmitato de sorbitano, sesquioleato de sorbitano, triestearato de sorbitano, trioleato de sorbitano) etoxilados ou não, ésteres de glicerila (como cocoato de glicerila, miristato de glicerila, monoestearato de glicerila, monoestearato de glicerina acetilado, monoestearato de poliglicerila, oleato de glicerila, poliricinoleato de poliglicerila, triacetato de glicerila, tricapril-caprato de glicerila, trioleato de glicerila) etoxilados ou não, ésteres de glicol (como dicaprilcaprato de propilenoglicol, diestearato de dietilenoglicol, diéster de ácidos graxos saturados de etilenoglicol, dioleato de propilenoglicol, monoestearato de dietilenoglicol, monoestearato de etilenoglicol, ésteres de ácidos graxos saturados de etilenoglicol, monoestearato de propilenoglicol) etoxilados ou não, alquilpoliglicosídeos (como decil e laurilpoliglicosídeo), alcoóis graxos etoxilados (como, álcool estearílico, álcool cetílico-estearOico, álcool cetílico, álcool cetearílico, álcool decílico, álcool isotridecílico) e nonilfenol etoxilados. A concentração de tensoativos nas nanoemulsões situa-se na faixa de 1,0 a 40,0% na composição total, preferencialmente entre 1,0 a 30,0%, compreendendo uma razão de fase oleosa/tensoativo entre 0,1 a 30, preferencialmente entre 0,1 a 20%.

Exemplo de concretização da invenção 35) Foram coletadas 555 g do material vegetal, em seguida as folhas e as inflorescências foram separadas do resto do material vegetal. As amostras foram rasuradas com ajuda de uma tesoura, pesadas em uma balança semi-analítica, sendo o material colocado no reservatório da dorna do mini-destilador. Foram utilizados 345,8g das folhas. O material vegetal, ao ser colocado na dorna entrou em contato com a água que ao ser aquecida realizou o processo de arraste do óleo. Os óleos essenciais foram condensados em um condensador, juntamente, com o vapor de água sendo recolhidos em um reservatório. A hidrodestilação foi realizada por 3 horas. O óleo foi separado da água através do próprio recipiente que permitiu a separação. O excesso de água foi retirado pela passagem do óleo essencial através de um filtro contendo agente secante (sulfato de sódio anidro). Foi obtido ao final da extração 28,50g (8,25%) de óleo essencial das folhas e 17,8 (8,5%) de óleo essencial das inflorescências. O percentual de óleo essencial extraído pode variar de 2 a 12 %. O óleo foi armazenado em frasco âmbar sob refrigeração (4°C). Os constituintes majoritários são Pinocarveol, Limoneno, trans-p-Menta-2,8-dienol e 5-Isopropenil-2-metileneciclohexanol para o óleo da inflorescência e trans-p-Menta-2,8-dienol, Biciclo[3.3.0]oct-2-en-7-ona 6-metil, 3,9-Epoxi-p-menta-l,S(10)-dieno e 5-Isopropenil-2-metilenociclohexanol para o óleo da folha. Ambos os óleos foram aplicados em testes de atividade antibacteriana e antifúngica.

Caracterização do óleo essencial 36) As amostras de óleos essenciais foram analisadas por CG/EM, em um sistema um GCMS-QP2010 Plus Shimadzu operando a 70 eV, equipado com uma coluna ZB-5HT (dimensões: 30 m x 0,25 mm x 0,10 μιη). A temperatura do forno a 40°C, mantida durante 5 minutos, então, ocorreu um aumento de 15 °C/min até a temperatura alcançar 220 °C, mantida durante 30 minutos. O gás de arraste foi o helio, fluxo: 1,01 mi/min, temperatura do injetor, 190 °C, modo de injeção splitless. Os espectros de massa foram tomados em 70 eV. Faixa de massa era de m / z 40-500. Os espectros de massas dos constituintes foram comparados com os padrões existentes na biblioteca NIST do computador no aparelho. Em seguida, foram feitas comparações visuais com espectros de massa de substâncias encontrados na literatura. Os resultados estão apresentados nas Tabelas 1 e 2. TABELA 1: Constituintes químicos majoritários do óleo essencial de obtidos das inflorescências de C. densiflorus. TABELA 2: Constituintes químicos majoritários do óleo essencial de obtidos das folhas de C. densiflorus. 37) As composições químicas dos óleos essenciais obtidos diferem das relatadas na literatura (estado da técnica) em virtude das condições de processamento particularmente utilizadas nesta invenção, além da forma/período/local de coleta. Ressalta-se que o material coletado foi obtido em crescimento natural (selvagem) no Brasil, (cidade de Ouro Preto). Atividade antimicrobiana 38) A atividade antimicrobiana foi verificada in vitro através do método de difusão em disco de papel (Bauer et al.. 1966). Os óleos essenciais foram testados frente aos seguintes microrganismos: Condida albicans, Staphylococcus aurens, Escherichia coli e Pseudomonas sp. Os microrganismos teste foram padronizados pela turvação equivalente ao tubo 0,5 da escala de McFarland em solução fisiológica (Barry, 1986; Koneman, 1997), correspondente a uma concentração de aproximadamente 107UFC/mL para leveduras e fungos e 108UFC/mL para bactérias. O meio de cultura utilizado foi o Agar Sabouraud para Candida albicans e Agar Mueller-Hinton para as bactérias. Apesar de apresentarem composição distinta, ambos os óleos demonstraram a mesma atividade antimicrobiana, conforme demonstrado na Tabela 3. TABELA 3: Atividade antimicrobiana qualitativa do óleo essencial das folhas de Cymbopogon densiflorus. * Diâmetro dos halos de inibição em cm. ** Tamanho dos discos: 0,6 cm. *** Controles positivos: E. coli (tetraciclina 50 qg/mL), S. aureus (tetraciclina 50 pg/mL), Pseudomonas sp (imoxifloxacina 20 pg/mL) e C. albicans (cetoconazol 60 pg/mL). **** Controle negativo: DMSO. 39) Ressalta-se que os resultados confirmam a atividade antibacteriana, anteriormente, relatada na literatura, com a adição de grande potencial de atividade antifúngica, o que ainda não tinha sido realizada para óleos da Cymhopogon demiflorus.

Obtenção da nanoemulsão 40) As nanoemulsões foram obtidas a partir da técnica descrita, anteriormente, utilizando os seguintes componentes: os tensoativos utilizados foram o Oleato de Sorbitano (Span 80) e o PEG-40 Óleo de Rícino Hidrogenado (Tabela 4). TABELA 4: Composição centesimal das nanoemulsões.

Componentes da formulação Porcentagem (%) Monooleato de Sorbitano 4,0 PEG-40 Hydrogenated Castor Oil 6,0 Óleo de soja 5,0 Óleo essencial de C. densiflorus 5,0 Água destilada 80,0 Análise macroscópica das formulações 41) A análise macroscópica (visual) foi realizada após vinte e quatro horas do preparo das formulações, onde foram avaliadas as características organolépticas e a homogeneidade das formulações. Após a análise macroscópica das formulações observou-se que não houve alterações como a separação de fases e as características organolépticas das formulações também não alteraram.

Determinação do tamanho das partículas 42) A determinação do tamanho das partículas foi realizada por espectrometria de correlação de fótons. Os resultados foram fornecidos como diâmetro efetivo (diâmetro médio avaliado pela intensidade) e índice de polidispersividade (IP), os quais expressam as medidas do tamanho e faixa de distribuição das partículas. O ângulo de incidência do laser na amostra foi de 90°. O tamanho das partículas é um parâmetro importante na avaliação de sistemas nanoemulsionados, devido ao fato de o tamanho das partículas serem o principal fator responsável pelo efeito promotor de permeação de componentes ativos nas camadas da pele (MEZADRI, 2010). Além do tamanho das partículas é fundamental conhecermos o índice de polidispersividade, uma vez que estes fatores somados exercem influência na estabilidade destes sistemas. 43) O resultado para o tamanho de partícula para a nanoemulsão produzida com o óleo essencial das inflorescências foi de 64,0 ± 0,98 nm com o índice de polidispersividade de 0,235 ± 0,079. Já para as nanoemulsões do óleo essencial das folhas, o resultado de tamanho de partícula foi de 53,0 ± 1,97 com o índice de polidispersividade de 0,282 ± 0,224. Ambas nanoemulsões apresentaram tamanho manométrico de partículas e índice de polidispersividade característico de sistemas monodispersos.

Teste preliminar de estabilidade 44) As emulsões classificadas, macroscopicamente, como estáveis, após 24 horas de sua manipulação foram submetidas ao teste preliminar de estabilidade. 45) Os testes utilizados foram: centrifugação, determinação de pH, viscosidade e comportamento reológico, atividade antimicrobiana das nanoemulsões.

Teste de centrifugação 46) Em um tubo cônico de 1,5 mL para centrífuga, foram adicionados lOOOpL de cada formulação e submetidas aos ciclos de 3000, 8000 e 13000 rpm durante dez minutos em cada rotação (FERRARI, 2002). Após cada ciclo foi avaliada a homogeneidade e a ocorrência de fases separadas no tubo. Foram consideradas pré-estáveis as formulações que não apresentaram separação de fases após o ciclo de 8000 rpm. Os resultados demonstraram que as nanoemulsões do presente estudo apresentaram-se fisicamente estáveis, sem separação de fases visível macroscopicamente.

Determinação do valor do pH 47) O peagâmetro foi previamente calibrado utilizando as soluções tampão padrões e o pH foi medido inserindo-se o eletrodo diretamente na amostra em temperatura ambiente de 25°C (ANVISA, 2004). O valor do pH foi de 4,4 para a nanoemulsão de óleo essencial das inflorescências e de 5,7 para a nanoemulsão de óleo essencial das folhas.

Viscosidade e comportamento reológico 48) A medida da viscosidade e do comportamento reológico foi feita em Reômetro tipo cone/placa, acoplado a um Software Rheocalc versão V 3.0. As medidas foram feitas utilizando Spindle CP40 a velocidades de rotação progressivamente mais altas, a serem determinadas, para obtenção da curva ascendente e o procedimento repetido no sentido inverso, para obtenção da curva descendente (SANTOS et al, 2005). A área sob a curva obtida através do reograma foi utilizada para o cálculo da área de histerese. O teste foi realizado em triplicata. Após a medida do comportamento reológico das formulações observou-se que apresentaram comportamento Newtoniano, ou seja, comportamento viscoso ideal.

Atividade antimicrobiana das nanoemulsões 49) A partir da realização da avaliação da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais das partes aéreas de Cymhopogon densiflorus foi determinada a atividade das nanoemulsões produzidas a partir destes. Com isso, para melhor representatividade desta atividade se fez necessário determinar a menor concentração deste óleo nas formulações que reproduzisse os mesmos resultados. 50) A avaliação da atividade antimicrobiana quantitativa foi realizada a partir da nanoemulsão contendo o óleo essencial de Cymhopogon densiflorus para comprovar a manutenção das suas propriedades antimicrobianas. O teste foi executado comparando-se o controle negativo e o controle positivo com a solução contendo a nanoemulsão. 51) O teste utilizou o caldo Mueller Hinton como meio. A preparação do inóculo foi realizada a partir da adição dos microrganismos em solução na salina, criando-se uma suspensão referente ao tubo 0,5 da escala Mac Farland (1 x 108 UFC/mL). Cada amostra foi preparada em duplicata. 52) Para o controle positivo foram adicionados 1 mL de caldo Mueller Hinton, 100 pL de inóculo e 100 pL de solução de antibiótico, conforme o tipo de microrganismo, em um tubo. Para a produção do controle negativo foram adicionados 1 mL de caldo Mueller Hinton e 100 pL de inóculo em um tubo. 53) As amostras foram preparadas por meio da adição de 1 mL de caldo Mueller Hinton em cinco tubos. Em seguida foi adicionado 1 mL de cada nanoemulsão no primeiro tubo, e foram feitas diluições sucessivas retirando-se um 1 mL de solução de cada tubo a partir do primeiro, descartando 1 mL do último tubo. Foram obtidas cinco concentrações diferentes da nanoemulsão: 1:2, 1:4,1:8,1:16 e 1:32. 54) Os tubos foram incubados em estufa a 35° C por um período de 24 a 48 horas. Após esse período foram realizadas as análises dos resultados. Como a nanoemulsão apresenta uma coloração característica, não foi possível avaliar o resultado, visivelmente, a partir somente da observação do crescimento bacteriano. Sendo assim, para uma verificação mais exata e uma maior reprodutibilidade dos resultados cada tubo foi repicado em uma placa petri contendo Agar Sabouraud para C. albicans e Agar Mueller-Hinion para as bactérias. As placas foram incubadas em estufa a 37° C por um período de 24 a 48 horas. Os resultados estão descritos na Tabela 5. 55) Diante dos resultados, conclui-se que os óleos essenciais de Cymbopogon densiflorus apresentam uma significativa atividade antimicrobiana. Além disso, também, foi possível comprovar que as nanoemulsões contendo este óleo e suas diluições também reproduziram a mesma eficácia da atividade antimicrobiana apresentada pelo óleo. Como a formulação da nanoemulsão contém 5% deste óleo essencial e foi realizada a diluição até 1:32, a menor concentração do óleo testada foi igual a 1,5625 mg/mL, apresentando eficácia. TABELA 5: Avaliação da atividade antimicrobiana quantitativa da nanoemulsão contendo óleo essencial das folhas de Cymbopogon densiflorus, frente a E. coli, S. aureus, Pseudomonas sp. e C. albicans.

Microrganismo CIM* E. coli 1/16 S. aureus 1/16 Pseudomonas sp. 1/4 Candida albicans 1/32 *CIM: Concentração inibitória mínima. 56) Através das características apresentadas, os produtos obtidos, nanoemulsões de óleo essencial de folhas e/ou inflorescências de Cymbopogon densiflorus podem ser utilizadas, diretamente, sobre a pele, ingeridas, aplicadas, topicamente, na cavidade oral (boca e garganta), órgãos genitais externos e canal auricular. Os produtos devem ser esterilizados através de filtração com membranas de tamanho de poro de 0,2um devido ao fato do tamanho de partícula ser menor que o poro. Após esterilização, os produtos podem ser utilizados em outras vias de administração como subcutânea, intravenosa, ocular, sem causar toxicidade/irritação. Notadamente, os produtos se destacam para uso em perfumaria; produtos cosméticos antissépticos e/ou antiacne e/ou anticaspa e/ou antiseborréia e/ou hidratante; produtos farmacêuticos antimicrobianos; produtos domissanitários e/ou saneantes perfumados e antissépticos desinfetantes; produtos para manutenção e higienização de couro, dentre outros.

REIVINDICAÇÕES

Claims (10)

1- Óleo essencial de Cymbompogon densiflorus caracterizado por ser obtido a partir da hidrodestilação de folhas e inflorescências, o qual possuí elevada atividade antimicrobiana, tanto contra bactérias quanto leveduras, e rico em Pinocarveol, Limoneno, trans-p-Menta-2,8-dienol e 5-Isopropenil-2-metileneciclohexanol para o óleo da inflorescência e trans-p-Menta-2,8-dienol, Biciclo[3.3.0]o ct-2-en-7-ona 6-metil, 3,9-Epoxi-p-menta-l,8(10)-dieno e 5-Isopropenil-2-metilenociclohexanol para o óleo da folha.

2- Formulação nanoemulsionada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser produzida a partir do produto obtido e possuir tamanho de partícula entre 40 e 300 nm, alta estabilidade físico química, característica de fluído newtoniano e valor de ph compatível com a aplicação humana e/ou veterinária.

3- Produto, de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizado por compreender como fase aquosa a água purificada na faixa de 40,0 a 95,0% na composição total.

4- Produto, de acordo com as reivindicações 1, 2 e 3, caracterizado por empregar óleo de origem vegetal, selecionado do grupo de óleos fixos e essenciais e que pode apresentar ou não propriedades farmacológicas, podendo ser alcatrão vegetal ou óleo de abacate, açafrão, alcarãvia, alecrim, alfazema, algodão, alho, amêndoa doce, amêndoas, amendoim, amyris, andiroba, arnica, anis, anis estrelado, arroz, arruda, aveia, bacuri, bálsamo, basilicão, benjoim, bergamota, bétula, breu, buriti, cabreúva, cacau, cajepute, cálarno, calêndula, camomila, canela, cânfora, canola, capim-limão, cardamomo, carqueja, cartamo, carnaúba, castanha de caju, castanha do Brasil, castanha do Pará, cedro, cenoura, cipreste, citronela, colza, coco babaçu, coco palmiste, coentro, cominho, copaíba, cravo, cumaru, cupuaçu, dendê, erva cidreira, eucalipto, funcho doce, gálbano, gengibre, gerânio, gergelim, germe de trigo, girassol, hortelã pimenta, jasmim, jojoba, laranja, lavanda, lima, limão, linhaça, louro, mamona, manjericão, manjerona, maracujá, marmeleiro, mate-verde, melaleuca, melissa, menta arvensis, milho, mirra, mostarda, murumuru, nabo, neem, oiticica, olíbano, oliva, orégano, palma, patauá, patchouli, pau-rosa, pimenta, pinho, pitanga, pracaxi, priprioca, puxuri, rícino, rosa, rosa mosqueta, salsa, sálvia, sândalo, semente de uva, soja, tangerina, tomilho, tucum, tucumã, tungue, ucuuba, uricuri, urucum, verbena, vetiver, virola.

5- Produto, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3 e 4, caracterizado por empregar óleo essencial das folhas e/ou inflorescências Cymbompogon densiflorus na faixa de 1,0 a 40,0% na composição total.

6- Produto, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4 e 5, caracterizado por empregar tensoativos lipofílicos, preferencialmente derivados de polióis, com valores de EHL entre 4,0 e 6,5 e tensoativos hidrofílicos, preferencialmente derivados etoxilados do óleo de rícino hidrogenado ou não, com diferentes graus de etoxilação e valores de EHL entre 13,0 e 18,0.

7- Produto, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 e 6, caracterizado por empregar uma combinação de tensoativos aniônicos, catiônicos, anfóteros ou não iônicos, sendo preferencialmente os tensoativos não iônicos que podem ser alcanolamidas de ácidos graxos (como etanolamida. monoetanolamida, dietanolamida e trietanolamida de ácido graxo de coco, de babaçu ou de palma), ésteres de sorbitano (como monolaurato de sorbitano, monooleato de sorbitano, monopalmitato de sorbitano, monoestearato de sorbitano, monoestearato-palmitato de sorbitano, sesquioleato de sorbitano, triestearato de sorbitano, trioleato de sorbitano) etoxilados ou não, ésteres de glicerila (como cocoato de glicerila, miristato de glicerila, monoestearato de glicerila, monoestearato de glicerina acetilado, monoestearato de poliglicerila, oleato de glicerila, poliricinoleato de poliglicerila, triacetato de glicerila, tricapril-caprato de glicerila, trioleato de glicerila) etoxilados ou não, ésteres de glicol (como dicaprilcaprato de propilenoglicol, diestearato de dietilenoglicol, diéster de ácidos graxos saturados de etilenoglicol, dioleato de propilenoglicol, monoestearato de dietilenoglicol, monoestearato de etilenoglicol, ésteres de ácidos graxos saturados de etilenoglicol, monoestearato de propilenoglicol) etoxilados ou não, alquilpoliglicosídeos (como decil e laurilpoliglicosídeo), alcoóis graxos etoxilados (como, álcool estearílico, álcool cetílico-estearílico, álcool cetílico, álcool cetearílico, álcool decílico, álcool isotridecílico) e nonilfenol etoxilados, sendo estes empregados na faixa de 1,0 a 30,0% na composição total.

8- Produto, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, caracterizado por possuir atividade alta antimicrobiana, principalmente contra leveduras, bactérias Gram positivas e bactérias Gram negativas.

9- Produto, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8, caracterizado pelo uso opcional de fármacos, compostos ativos cosméticos, vitaminas, antioxidantes, corantes, conservantes, emolientes e outros excipientes fisiologicamente aceitáveis, os quais são compatíveis com a atividade antimicrobiana intrínseca do produto.

10- Uso do produto obtido, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, e 9, em perfumaria; produtos cosméticos antissépticos e/ou antiacne e/ou anticaspa e/ou antiseborréia e/ou hidratante; produtos farmacêuticos antimicrobianos; produtos domissanitários e/ou saneantes perfumados e antissépticos desinfetantes; produtos para manutenção e higienização de couro.