BR102013028943A2 - linhagem geneticamente modificada de penicillium griseoroseum produtora de fitase, cassete e vetor de expressão para a construção da linhagem, preparação enzimática e uso - Google Patents

Abstract

linhagem geneticamente modificada de penicillium griseoroseum produtora de fitase, cassete e vetor de expressão para a construção da linhagem, preparação enzimática e uso. a presente invenção refere-se à linhagem recombinante geneticamente modificada penicililum griseoroseum t73 com maior produção de fitase, ao cassete e vetor de expressão, à preparação enzimática contendo a fitase. a presente aplicação provê o cassete e o vetor de expressão para alto nível de expressão da fitase e para a construção da linhagem recombinante. a presente aplicação provê ainda a preparação enzimática contendo a fitase com pi básico e ativa em ph ácido e temperatura entre 30 e 70 °c proveniente de peniciiiium chiysogenum cct1273 produzida por peniclllium griseoroseum geneticamente modificado. a presente invenção pode ser adicionada à ração animal para o incremento dos níveis de fósforo e moléculas inorgânicas e orgânicas na dieta de animais monogástricos

Description

RELATÓRIO DESCRITIVO LINHAGEM GENETICAMENTE MODIFICADA DE PeniciUium griseoroseum PRODUTORA DE FITASE, CASSETE E VETOR DE EXPRESSÃO PARA A CONSTRUÇÃO DA LINHAGEM, PREPARAÇÃO ENZIMÁTICA E USO.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito ao cassete e vetor de expressão, incluindo o polinucleotídeo que codifica fitase, a linhagem de PeniciUium griseoroseum geneticamente modificada por compreender o cassete e o vetor de expressão, a preparação enzimática que contém fitase e seu uso. Fitases hidrolisam as ligações éster da molécula de ácido fítico e tem potencial de aplicação na indústria de nutrição animal.

ESTADO DA TÉCNICA

Até 90% do fosfato inorgânico em cereais como milho, sorgo e trigo encontram-se sob a forma de ácido fítico. Esses cereais são a base da dieta de animais monogástricos como suínos e aves domésticas. O ácido fítico atua como fator anti-nutricional ao complexar com cátions divalentes e trivalentes, amido, proteínas e lipídeos.

Fitases (E.C. 3.1.3.8/E.C 3.1.3.26/E.C. 3.1.3.72) hidrolisam ligações éster da molécula de ácido fítico liberando uma molécula de inositol e seis fosfatos ou, quando da hidrólise parcial, gera intermediários mono-, di-, tri-, tetra- ou pentafosfatos de mio-inositol. É sabido que fitases são produzidas por plantas, animais e micro-organismos e têm sido isoladas de bactérias, leveduras e fungos filamentosos. É notório que fitases são aplicadas na indústria química, moagem úmida de milho, indústria de cuidados pessoais, processamento de tecidos, alimentação humana, mas principalmente na indústria de alimentação animal (US7022371B2). Fitases movimentam 60% do mercado de enzimas aplicadas para nutrição animal. 70% da ração utilizada para alimentação de animais monogástricos contém fitase em sua formulação.

Animais monogástricos produzem pouca ou não produzem fitase ao longo do trato gastrointestinal. A alimentação de animais monogástricos deve ser suplementada com fósforo inorgânico. A suplementação com fósforo inorgânico deve ser feita de forma racional, pois além de responder por cerca de 50% a 75% do custo da mistura de minerais, o excesso é excretado por meio das fezes no meio-ambiente, o que pode desencadear o processo de eutrofização em corpos de água doce.

Fitases incrementam a biodisponibilidade do fósforo e outras moléculas na ração para animais monogástricos, como ilustra a patente de invenção EP0619369A1. As preparações comerciais com atividade de fitase são obtidas principalmente a partir de Escheríchia coli, Aspergillus niger e Peniophora lycii como se pode verificar nos documentos de patente EP2497373, US7611701 e W02000/043503, respectivamente. As invenções citadas descrevem enzimas com atividade de fitase, genes que codificam essas enzimas, sistemas de expressão para esses genes, linhagens recombinantes com maior expressão de fitases, processo de produção da enzima e métodos para aplicação de fitase em grânulos de ração animal.

Enzimas com atividade de fitase oriundas de fungos filamentosos pertencentes ao gênero Penicillium sp. são aplicadas na ração animal para incrementar a biodisponibilidade do fósforo para nutrição animal (PI0214800, PI0013549-6, FR283327). A fitase oriunda de Penicillium oxalicum KCTC 3440 produzida por Pichia pastoris apresenta maior atividade em pH ácido e 50 °C (WO 2005056835). A sequência de polinucleotídeo que codifica uma proteína com atividade sobre o ácido fítico oriunda de Penicillium chrysogenum, bem como a célula hospedeira, o método de cultivo da célula hospedeira e o método de recuperação da proteína com atividade de fitase estão descritos na patente de invenção WO 03/038111.

As características físico-químicas relevantes e desejáveis para fitases do ponto de vista industrial são: alta atividade específica em pH estomacal; termoestabilidade; estabilidade durante armazenamento; peletização e passagem pelo trato gastrointestinal.

Apesar das vantagens da aplicação de fitase na indústria de ração animal, algumas desvantagens incluem o alto custo de produção e baixa atividade e estabilidade a condições de pH e temperatura durante o processamento da ração ou trato gastrointestinal. É desejável a descoberta de novas fitases com características desejáveis e a obtenção de linhagens recombinantes com alta expressão dessa enzima.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS A presente invenção é ilustrada por meio de referência às Figuras anexas: A FIGURA 1 mostra o vetor pAN-52-1 -phy contendo o cassete de expressão com o gene phy sob controle do promotor gpdA de Aspergillus nidulans. A FIGURA 2 mostra o gel de agarose com as respectivas bandas da amplificação do gene phy a partir do DNA genômico de Penicillium chrysogenum CCT1273, vetor pAN-52-1 e do vetor pAN-52-1 -phy. A FIGURA 3 ilustra a estimativa do número de cópias do gene phy integradas no genoma da linhagem recombinante Penicillium griseoroseum T73 por hibridização. A FIGURA 4 representa o efeito do tempo de cultivo na atividade de fitase no sobrenadante da cultura da linhagem recombinante P. griseoroseum T73. A linhagem recombinante P. griseoroseum T73 foi cultivada em meio contendo citrato de sódio como agente tamponante suplementado com sacarose 1%. Os resultados representam as médias aritméticas de três repetições. A FIGURA 5 mostra a atividade relativa de fitase, presente no sobrenadante da cultura da linhagem de P. griseoroseum T73, em diferentes pHs da reação enzimática. A FIGURA 6 mostra a estabilidade de fitase, presente no sobrenadante da cultura da linhagem de P. griseoroseum T73, em diferentes soluções tamponantes. A FIGURA 7 ilustra a atividade relativa de fitase, presente no sobrenadante da cultura da linhagem de P. griseoroseum T73, em diferentes temperaturas da reação enzimática. A FIGURA 8 mostra a estabilidade de fitase, presente no sobrenadante da cultura da linhagem de P. griseoroseum T73, em diferentes temperaturas de incubação.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO O objetivo da presente invenção consiste em apresentar uma linhagem geneticamente modificada, a produção de uma enzima de origem microbiana, uma preparação enzimática e suas aplicações. O micro-organismo eucarioto geneticamente modificado expressa o gene que codifica fitase, ou suas variantes, sob condições adequadas. A preparação enzimática inclui uma fitase ou suas variantes podendo ser aplicada na indústria de nutrição animal, para aumento da biodisponibilidade de fósforo, cátions divalentes e trivalentes, amido, proteínas e lipídeos em ração animal.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se à linhagem geneticamente modificada Penicillium griseoroseum T73, caracterizada por apresentar aumento na atividade de fitase e possuir pelo menos uma cópia do gene phy em pelo menos três sítios heterólogos do genoma.

Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor de expressão incluindo um cassete de expressão, compreendendo o gene phy que codifica uma fitase e a sequência de uma região regulatória que possibilita a expressão constitutiva da fitase em P. griseoroseum T73, em que a região reguladora constitutiva se encontra ligada ao gene que codifica a fitase.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma preparação enzimática que compreende o sobrenadante da cultura de P. griseoroseum T73 incluindo uma fitase ou suas variantes, produzida pelo sistema de produção de fitase descrito na presente invenção.

Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se ao uso da preparação enzimática, que compreende o sobrenadante de cultivo da linhagem P. griseoroseum T73, incluindo uma fitase ou suas variantes, produzida pelo sistema de produção de fitase descrito na presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO O micro-organismo hospedeiro O organismo eucariótico, que é um micro-organismo geneticamente modificado, sendo este um fungo filamentoso. O fungo filamentoso pode incluir sem limitações espécies, fungos miscroscópicos que crescem em forma de filamentos multicelulares. As células de fungos filamentosos incluem, sem limitações, várias espécies dos gêneros Fusaríum, Aspergillus, Acremonium, Humicola, Neurospora, Trichoderma e Penicillium. O gênero Penicillium apresenta uma estrutura característica com conidióforo e estipe terminando em uma estrutura denominada “penicifli”. A forma desta estrutura determina a divisão taxonômica primária do gênero Penicillium em quatro subgêneros: Aspergilloides, Furcatum, Biverticillium e Penicillium. A maioria das colônias de Penicillium é caracterizada pela produção de grande número de conidióforos, cuja cor geralmente varia de cinza a azul esverdeada, o que morfologicamente faz a colônia apresentar-se esverdeada. No aspecto nutricional, esses fungos são pouco exigentes em relação à fonte de carbono, nitrogênio e outros elementos, que podem ser mobilizados a partir de fontes inorgânicas, e crescem em uma ampla faixa de temperatura, pH, atividade de água e potencial redox. Quanto à temperatura de crescimento, a maioria das espécies cresce bem entre 20 e 30°C. O gênero Penicillum é um dos mais diversos em relação ao habitat, compreendendo, sem limitações, espécies oportunistas e saprófitas encontradas principalmente no solo, associadas à senescência e morte de algumas plantas. O micro-organismo eucarioto hospedeiro é um fungo filamentoso mitospórico, multinucleado e caracterizado por ser a espécie Penicillium gríseoroseum, isolada na Universidade Federal de Viçosa e depositada na Fundação Tropical de Tecnologia e Pesquisa André Tosello, Campinas, São Paulo, Brasil, sob o código de registro CCT6421 (Baracat et al., 1989, Biotechnological Letters, 11 (2): 899-902).

Em outra forma de realização a célula eucariota hospedeira é uma linhagem mutante auxotrófica P. gríseoroseum PG63, deficiente no gene niaD, incapaz de sintetizar a nitrato redutase, e portanto, incapaz de crescer em meio de cultura contendo nitrato como única fonte de nitrogênio. P. gríseoroseum PG63 é uma linhagem derivada da linhagem P. gríseoroseum CCT6421. O fungo filamentoso P. griseoroseum PG63 possui uma deleção de 122 pb no gene niaD, que codifica a nitrato redutase e apresenta-se parte de um sistema desenvolvido para transformação homóloga. A linhagem geneticamente modificada P. griseoroseum T73 para produção de fitase foi obtida a partir da linhagem mutante P. griseoroseum PG63. A sequência completa do gene niaD foi utilizada como complementação do gene niaD' na linhagem P. griseoroseum PG63 por meio da técnica de transformação conhecidas no estado da arte (Canadian Journal of Microbiology 50(11):891-900, 2004). O vetor de expressão de fitase O cassete e o vetor de expressão de fitase foram construídos a partir de: 1. O plasmídeo pAN52-1-GFP (6,4kb), que contém o gene que codifica a proteína verde fluorescente GFP da hidromedusa Aequorea victoria (SGFP-TYG), sob o controle do promotor forte e constitutivo do gene da gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (gpdA) e a região de terminação do gene da triptofano sintetase (trpC), oriundos de A. nidulans (Punt et ai, 1998, Gene 69:49-57); e 2. A região codificadora do gene de fitase, que compreende um fragmento de DNA (1,5 Kb) correspondente ao gene phy do fungo filamentoso Penicillium chrysogenum CCT1273. Para propagação dos plasmídeos foi utilizada a bactéria E. coli K12 linhagem DH5a. A construção do cassete e do vetor de expressão se baseou na substituição da região codificadora do gene gfp pela região codificadora do gene phy, e para tal, foram desenhados oligonucleotídeos específicos para a introdução de um sítio de restrição para a enzima Nco\ imediatamente antes do códon de início da tradução ATG e para introdução de um sítio de restrição para a enzima BamH\ imediatamente após o códon de término da tradução do gene phy. O fragmento de DNA do gene phy, gerado pela amplificação, foi clivado com as enzimas de restrição Ncol e BamHI e usado na reação de ligação juntamente com fragmento de DNA do plasmídeo pAN52-1-GFP clivado com as mesmas enzimas de restrição para a liberação do gene GFP. O vetor de expressão abrange um cassete de expressão, incluindo a sequência aberta de leitura do gene phy, que codifica uma fitase, e a sequência da região regulatória do gene gpdA que possibilita a expressão da fitase na linhagem geneticamente modifica P. griseoroseum T73, em que a região reguladora se encontra ligada ao gene que codifica a fitase (FIGURA 1). O cassete de expressão tem a sequência do gene phy apresentada na listagem de sequência SEQ ID N° 1, sob o controle do promotor forte e constitutivo do gene gpdA e da região terminadora do gene trpC de A. niduíans. O vetor de expressão de fitase, que contém o cassete de expressão compreendendo o gene phy e região regulatória que possibilita a expressão do gene phy, foi denominado pAN-52-1 -phy (FIGURA 2).

Os oligonucleotídeos iniciadores específicos para introdução de sítios de restrição do gene phy estão representados em SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4. O micro-organismo - a invenção O micro-organismo geneticamente modificado, um dos objetos da presente invenção é representado pela linhagem geneticamente modificada P. griseoroseum T73, caracterizada pelo aumento na produção de uma fitase de origem microbiana quando comparada à linhagem P. griseoroseum PG63, cultivadas em condições adequadas para a produção de fitase. O micro-organismo recombinante geneticamente modificado P. griseoroseum T73 foi obtido conforme descrito no item “O micro-organismo hospedeiro”, pela técnica de co-transformação com os plasmídeos pAN-52-1 -phy e pNPG1, segundo metodologia descrita por Queiroz et al. (Canadian Journal of Microbiology 44:1-3, 1998). O plasmídeo pNPG1 contém o gene niaD que codifica a proteína nitrato redutase de P. griseoroseum e foi utilizado como marcador para a seleção dos transformantes crescidos em meio de cultura contendo nitrato como única fonte de nitrogênio. O micro-organismo, linhagem geneticamente modificada P. griseoroseum T73, contém cópias integradas no genoma do vetor de expressão pAN-52-1 -phy e do vetor de complementação e seleção pNPG1. O vetor de expressão pAN-52-1-phy compreende o cassete de expressão que contem a sequência SEQ ID N° 1 e a sequência da região regulatória do gene gpdA que possibilita a expressão constitutiva da fitase na linhagem recombinante P. griseoroseum T55, como descrito no item anterior. A linhagem recombinante P. griseoroseum T73 foi submetida à purificação monospórica e à avaliação da estabilidade mitótica. A estabilidade mitótica da linhagem recombinante com relação ao gene niaD foi avaliada por meio de sucessivas transferências da cultura entre placas de Petri contendo meio completo sólido durante 5 semanas, sendo repicadas uma vez a cada semana e seguida da transferência da cultura para meio mínimo sólido contendo nitrato como única fonte de nitrogênio. A estabilidade mitótica com relação ao gene phy foi realizada por meio da detecção da atividade de fitase produzida pela linhagem recombinante P. griseoroseum T73 em meio líquido mineral tamponado durante o período de 12 meses. A linhagem se mostrou estável em ambas as análises. A linhagem recombinante P. griseoroseum T73 foi submetida à análise quanto ao número de cópias do gene phy, sob o controle do promotor do gene gpdA de A. nidulans. A extração e a hibridização do DNA total das linhagens P. chrysogenum CCT1273, mutante P. griseoroseum PG63 e recombinante P. griseoroseum T73, foi realizada seguindo metodologia descrita no estado da técnica. O DNA total das linhagens foi clivado com a enzima de restrição EcoRI, que não cliva a região codificadora do gene phy, e com a enzima Ncoi, que cliva uma vez na região codificadora do gene phy. Os fragmentos de DNA foram separados por eletroforese em gel de agarose a 0,8%. O gel foi tratado sequencialmente com solução de desnaturação e de neutralização por uma hora, seguindo-se a transferência do DNA para membrana de nitrocelulose por 24 horas e hibridização com a sonda, contendo a região codificadora do gene phy. Após detecção e revelação, os resultados obtidos indicaram que a linhagem recombinante P. griseoroseum T73 apresenta integração do gene phy em pelo menos três sítios heterólogos do genoma (FIGURA 3). A linhagem P. griseoroseum T73 apresenta um aumento de pelo menos cinco vezes na atividade de fitase em relação à linhagem P. griseoroseum PG63. Além disso, os resultados mostram que o promotor do gene gpdA de A. nidulans é compatível com os fatores de transcrição basais envolvidos na expressão gênica em P griseoroseum.

Com essas considerações, a linhagem P griseoroseum PG63 pode ser caracterizada como um hospedeiro eficiente para a produção de fitase heteróloga. O processo de produção da enzima O micro-organismo da presente invenção pode ser cultivado em meio de cultura adequado sob condições adequadas para a expressão da fitase ou suas variantes. O primeiro aspecto para o processo de produção de fitase pela linhagem recombinante geneticamente modificada P. gríseoroseum T73 é a obtenção do inóculo, por meio do cultivo da linhagem recombinante em placas de Petri contendo meio BDA sólido pelo período de cinco a sete dias de incubação a 25°C. Após o período de incubação, os conídios são raspados utilizando-se uma alça de repicagem e colocados em uma solução estéril de Tween 80 a 0,1%. Os conídios são contados em câmara de contagem de células - câmara de Neubauer - e adicionados ao meio de cultivo para produção de fitase. O cultivo da linhagem P. gríseoroseum T73 para produção de fitase é feita em fermentação submersa, podendo ser realizado em biorreatores como frascos Erlenmeyer e fermentadores de pequena e larga escala. O meio de cultivo compreende, em diferentes concentrações, fonte de carbono, nitrogênio e fósforo, ácidos orgânicos e sais orgânicos, como exemplificado a seguir: sacarose, sulfato de amônio, ácido cítrico, citrato de sódio, fosfato de sódio e sulfato de magnésio. A atividade de fitase da linhagem recombinante T73, cultivada na condição descrita acima, é maior do que a detectada para a linhagem hospedeira de P. gríseoroseum PG63 nas mesmas condições de produção, que pode ser visualizado na TABELA 1. A produção de massa micelial é quantificada pela coleta do micélio em peneira de 400 malhas/polegada2 (37 pm de poro), seguida por lavagem com água destilada, acondicionamento em cadinho de papel alumínio e secagem a 105 °C até obtenção de massa constante.

Outro aspecto do cultivo do fungo filamentoso P. gríseoroseum é o tempo de crescimento para produção de fitase. A produção de fitase é variável conforme o período de cultivo da linhagem P. gríseoroseum T73 durante a fermentação. O período de fermentação para produção da enzima pode ser pelo menos um dia ou variar de um a cinco dias, preferencialmente produzida no segundo dia de cultivo. A FIGURA 4 mostra a atividade de fitase produzida pela linhagem recombinante P. griseoroseum Τ73 em diferentes dias de cultivo (24-120 h), cultivada em frascos Erlenmeyer de 125 ml_ contendo 50 ml_ de meio citrato de sódio. TABELA 1. Atividade específica de fitase e massa micelial seca de P. chrysogenum, P. griseoroseum PG63 e linhagem recombinante P. griseoroseum T73 após 72 horas de cultivo em meio citrato de sódio.

Linhagem Atividade específica Massa (U pg~1 proteína) micelial seca (g l-1) P. chrysogenum 1,35 ± 0,2 7.4 ± 0.9 PG63 0,56 ± 0,2 9.7 ± 0.3 T73 2,86 ±0,4 10.0 ±1.1 Em outro aspecto, o micro-organismo linhagem recombinante P. griseoroseum T73 cresce e produz fitase em meio de cultivo com alta concentração de íons fosfato, pois apresenta expressão constitutiva de fitase. A atividade enzimática da fitase expressada pela linhagem recombinante P. griseoroseum T73 pode ser determinada usando métodos conhecidos no estado da arte. A atividade de fitase tem sido determinada por meio da quantificação do fosfato inorgânico liberado durante a hidrólise pela enzima. A fitase é uma fosfatase. A atividade de fosfatase é dosada por meio da quantitificação de fosfato inorgânico liberado a partir da ação da enzima sobre o substrato p-nitrofenil fosfato. Fitases hidroiisam preferencialmente ácido fítico quando comparado ao p-nitrofenil fosfato. A enzima fitase A atividade de fitase tem sido determinada por meio da quantificação do fosfato inorgânico liberado a partir do ácido fítico durante a hidrólise pela enzima. A caracterização parcial da fitase no sobrenadante da cultura foi feita determinando-se o efeito do pH e temperatura na atividade e estabilidade da enzima, e estabilidade térmica às temperaturas de armazenamento. A fitase produzida pela linhagem recombinante P. griseoroseum T73 é codificada pelo gene phy, sendo denominada PHY (SEQ 1D N° 2). Essa enzima apresenta características diferenciais para aplicação industrial: 1. Alta atividade entre valores de pH de 2,0 e 5,0 (FIGURA 5); 2. Máxima estabilidade entre valores de pH de 3,0 a 8,0 (FIGURA 6); 3. Alta atividade a temperaturas entre 40 e 70 °C (FIGURA 7); 4. Estável a temperaturas de 70 e 80 °C (FIGURA 8); 5. Alta estabilidade de armazenamento mantendo 75%, 66% e 68% da atividade após armazenamento durante quatro semanas a -20 °C, 8 °C e 25 °C, respectivamente; 6. Ponto isoelétrico de 7,6 (básico) da proteína PHY (SEQ ID N° 2), deduzida a partir da sequência de nucleotídeos dos gene phy (SEQ ID N° 1). 7. Eficiente liberação de íons fosfato a partir de cereais base da dieta de animais monogástricos (TABELA 2). TABELA 2. Liberação de fosfato inorgânico por PHY produzida pela linhagem recombinante P. griseoroseum T73 a partir de cereais.

Cereais Tempo Milho (mm/g) Soja (mm/g) Trigo (mm/g) (min) Ί) 4,9+ 0,1 8,8 + 0,2 85Ã 180 6,4 + 0,4 20,0 + 0,2 107,3 + 7,3 A preparação enzimática A preparação enzimática representa o produto da invenção e é constituída pelo próprio sobrenadante da cultura, que contem fitase, outras proteínas e metabólitos secretados pela linhagem recombinante P. griseoroseum T73. A preparação enzimática pode ser isolada da cultura do micro-organismo utilizando métodos padrões descritos no estado da arte incluindo, sem limitações, filtração, centrifugação, precipitação, extração ou evaporação. A preparação enzimática da invenção se caracteriza, portanto, pela alta atividade de fitase.

EXPERIMENTOS DE DEMONSTRAÇÃO

Serão apresentadas, a seguir, formas ilustrativas da obtenção da linhagem recombinante P. griseoroseum T73, do processo de produção de fitase, da preparação enzimática compreendendo uma fitase e da enzima fitase e suas características físico-químicas para a aplicação industrial. Todavia, as formas ilustrativas não se limitam às aqui apresentadas.

Exemplo 1 Obtenção da linhagem recombinante Penicillium griseoroseum T73 com maior produção de fitase. O DNA total do fungo P. chrysogenum CCT1273 foi extraído segundo Specht et ai. (Analytical Bíochemistry, 1982, 119 (1):158-163). A sequência de DNA que codifica a proteína fitase foi amplificada por meio da técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando como molde o DNA total de P. chrysogenum CCT1273. Os oligonucleotídeos iniciadores P1 e P2 (respectivamente, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4) foram baseados nas sequências genômicas disponíveis nos bancos de dados, que codificam proteínas fitase de fungos filamentosos. Nas extremidades dos oligonucleotídeos iniciadores P1 e P2 foram introduzidos sítios de restrição para as enzimas BamH\ e Nco\, respectivamente. A PCR foi conduzida com uma desnaturação inicial de 94 °C por um minuto, seguida por desnaturação a 94 °C por trinta segundos, anelamento a 61 °C por um minuto, e extensão a 72 °C por dois minutos. O ciclo de desnaturação, anelamento e extensão se repetiram por 35 vezes. A extensão final foi realizada a 72 °C por 10 minutos. A sequência obtida - 1452 pares de base -do gene que codifica fitase {phy) foi clivado com as enzimas de restrição Nco\ e BamH\, purificada e usada na reação de ligação juntamente com fragmento de DNA do plasmídeo pAN52-1- clivado com as mesmas enzimas, resultando no vetor pAN-52-1 -phy compreendendo o cassete de expressão identificado na SEQ ID N° 1. O produto de ligação foi introduzido na bactéria E. coli K12 linhagem DH5a. A obtenção da linhagem P. griseoroseum T73 baseou-se na co-transformação da linhagem mutante P. griseoroseum PG63 com os plasmídeos pAN-52-1-p/7y, que contém o cassete de expressão de fitase e pNPG1, que contém o gene niaD para a seleção dos transformantes. A obtenção de protoplastos para serem utilizados na co-transformação foi feita a partir do micélio fresco, crescido sobre meio BDA contendo papel celofane na superfície. O micélio foi incubado em KCI a 0,6 mol L*1; tampão fosfato, 10 mmol. L"1 e “Lysing Enzymes” L1412 (SIGMA®) a 30 °C sob agitação de 80 rpm. Os protoplastos obtidos foram lavados duas vezes em Sorbitol, 1 M; Tris-HCI, 100 mM (ST) e uma vez em Sorbitol, 1 M; Tris-HCI, 100 mM; CaCfe, 50 mM (STC), centrifugados e o sedimento ressuspendido em STC para uma concentração de 107 protoplastos.mL'1. Os protoplastos foram misturados ao DNA do plasmídeo pNPG1, ao DNA do plasmídeo recombinante pAN-52-1-p/iy e a uma solução de polietilenoglicol 6000 (PEG 6000) 50% (p/v) e incubados em gelo. Adicionou-se novamente PEG 50% (p/v) e manteve-se a mistura à temperatura ambiente. Os protoplastos foram plaqueados em meio mínimo com estabilizador osmótico e incubados a 25 °C durante 5 dias.

Os 91 transformantes obtidos tiveram o DNA total extraído segundo Specht et al. (Analytlcal Biochemistry, 1982, 119 (1):158-163) para PCR com os oligonucleotídeos iniciadores P1 e P2 (respectivamente, SEQ ID N° 3 e SEQ ID N° 4), conforme descrito no estado da arte, e P3 e P4 (respectivamente, SEQ ID N°5e SEQ ID N° 6) baseados na sequência do promotor gpdA de A. nidulans terminador frpC de A. nidulans. O fragmento amplificado pela PCR com os oligonucleotídeos iniciadores P3 e P4 - 1849 pares de base - foi utilizado para confirmar a integração do vetor pAN-52-1 -phy no genoma das linhagens transformantes. Vinte e três linhagens transformantes apresentaram amplificação do tamanho esperado. A linhagem recombinante P. griseoroseum T73 foi selecionada e cultivada a 28 °C em uma mesa de agitação rotativa (150 rpm) em frascos Erlenmeyer de 125 mL contendo 50 mL de meio tamponado citrato de sódio (MSC), pH 6,2, com a composição a seguir (g.L'1): citrato de sódio, 29,4; ácido cítrico, 19,2; sacarose, 10; KH2PO4, 0,2; (NH4)2S04, 3,0; MgS04.7H20, 0,5.

Exemplo 2 Processo para a produção de fitase pela linhagem recombinante P. griseoroseum T73 em cultivo submerso. O transformante P. griseoroseum T73 foi selecionado após amplificação de um fragmento de 1849 pares de bases por meio de PCR, o que confirmou a integração do plasmídeo pAN-52-1 -phy no genoma da linhagem transformante. A linhagem recombinante P. griseoroseum T73 foi cultivada durante sete dias em meio BDA em incubadora a 25 °C. Os esporos foram utilizados para inocular meio citrato de sódio descrito no Exemplo 1 na concentração final de 106esporos.mL'1. Foi observado aumento de 5,1 vezes na atividade de fitase no sobrenadante da cultura da linhagem recombinante P. griseoroseum T73, em relação à linhagem controle PG63 nia~, quando ambas foram cultivadas em meio citrato de sódio durante o período de 72 horas (TABELA 1). A atividade de fitase do sobrenadante da cultura foi avaliada em intervalos de 24 horas (FIGURA 4), para produção de fitase, pela detecção da atividade enzimática como descrito a seguir. O inóculo foi obtido conforme o processo de produção da enzima.

Para detecção da atividade de fitase, uma solução do substrato fitato de sódio foi preparada a 5 Mm em tampão acetato de sódio, 100 mM, pH 5,0. Cinquenta microlitros do sobrenadante da cultura da linhagem recombinante P. griseoroseum T73 foram adicionados à solução contendo o substrato. A reação foi feita durante 30 minutos a 50 °C. A reação foi paralisada pela adição de molibdato de amônio: ácido sulfúrico: acetona (1:1:2) e a medida da liberação de fósforo inorgânico foi feita em espectrofotômetro a 355 nm. Uma unidade de atividade de fitase é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 pmol de fosfato inorgânico, min'1. mL"1 sob as condições da reação. Uma curva padrão com várias concentrações de KH2PO4 é feita (Heinonem e Lahti, 1981, Analytical Biochemistry 113: 313-317).

Exemplo 3 Preparação enzimática obtida a partir do sobrenadante da cultura da linhagem recombinante Penicillium griseoroseum T73. O sobrenadante da cultura da linhagem recombinante P. griseoroseum T73 apresentou atividade de fitase com aumento de 5,1 vezes em relação à linhagem controle PG63 nia após 72 horas de cultivo em condições descritas no Exemplo 1.

Exemplo 4 Características físico-químicas de fitase, produzida pela linhagem recombinante P. griseoroseum T73.

As características físico-químicas da fitase presente no sobrenadante de cultivo da linhagem P. griseoroseum T73 foram avaliadas utilizando-se diferentes pHs de reação enzimática e diferentes temperaturas de incubação e de armazenamento. A dependência da atividade de fitase produzida pela linhagem recombinante P. griseoroseum T73 ao pH da reação foi avaliada em uma ampla faixa de pHs (1,0-8,0) a 50 °C durante 30 minutos. Os resultados mostram que a fitase recombinante exibe maior atividade enzimática em pH 5,0; considerada como 100%, seguida por 74% em pH 2,0. Nenhuma atividade foi observada em pHs 1,0, 7,0 e 8,0 (FIGURA 5). A fitase apresentou máxima estabilidade após incubação durante duas horas à temperatura ambiente em pHs 3,0 a 8,0 (FIGURA 6). A fim de determinar a temperatura apropriada para a atividade de fitase produzida por linhagem recombinante P. griseoroseum T73, o sobrenadante da cultura foi incubado com as soluções de substrato em temperaturas entre 30 e 70 °C durante 30 minutos em pH 5,0. A maior atividade de fitase foi encontrada a 50 °C, considerada como 100%, seguida por 64% a 40° C (FIGURA 7). O sobrenadante da cultura foi incubado nas temperaturas de -20 °C (freezer) 8 °C (geladeira), 25 °C (bancada), durante um período de quatro semanas para determinação da estabilidade do armazenamento de fitase. Azida de sódio foi usada na concentração de 0,03% para inibir o crescimento de bactérias e fungos no sobrenadante armazenado a 8 e 25 °C. A enzima manteve 75%, 66% e 68% da atividade inicial após armazenamento por um período de quatro semanas a -20 °C, 8 °C e 25 °C, respectivamente.

Exemplo 5 Ensaio de liberação de fosfato inorgânico a partir de cereais base da dieta de animais monogástricos A habilidade de liberação de fosfato inorgânico a partir de fontes naturais pela fitase produzida pela linhagem recombinante P. gríseoroseum T73 foi avaliada. Cereais de milho, soja e trigo moídos foram autoclavados para inativação de quaisquer fitases endógenas. Os grãos moídos e autoclavados foram ressuspensos no sobrenadante da cultura de P. gríseoroseum T73 durante 180 minutos a 37 °C em mesa rotatória a 150 rpm. Após 180 minutos, as amostras foram centrifugadas e a quantificação do fosfato inorgânico liberado foi feito conforme Exemplo 2. Um aumento na concentração de fosfato inorgânico da ordem de 1,3 vezes, 2,5 vezes e 1,2 vezes foi observado para milho, soja e trigo, respectivamente, tratados com o sobrenadante da cultura da linhagem recombinante P. gríseoroseum T73.

Diante do exposto pode-se anuir que a presente invenção apresenta potencial para aplicação na indústria de nutrição animal.

REIVINDICAÇÕES

Claims (8)

1- Linhagem geneticamente modificada, caracterizada por apresentar um vetor de expressão de uma enzima fitase (E.C. 3.1.3.8).

2- Linhagem geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser preferencialmente Penicillium griseoroseum.

3- Linhagem geneticamente modificada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo vetor de expressão conter o cassete de expressão da enzima fitase e sequência regulatória que possibilite a expressão constitutiva da fitase em micro-organismo eucarioto.

4** Linhagem geneticamente modificada, de acordo com as reivindicações 1 e 3, caracterizada pelo cassete de expressão conter a sequência aberta de leitura que codifica a enzima fitase, preferencialmente obtida de Penicillium chrysogenum (SEQ ID N° 1), ou suas variantes.

5- Linhagem qoooti ca mente m^^dificada, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3 e 4, caracterizada pela sequência aberta de leitura que codifica a enzima fitase, ou suas variantes, ser integrada em pelo menos três sítios heterólogos do genoma de Penicillium griseoroseum.

6- Preparação enzimática, caracterizada por ser compreendida pelo sobrenadante da cultura da linhagem recombinante Penicillium griseoroseum, definida nas reivindicações 1, 2, 3, 4 e 5, obtido por meio de fermentação submersa.

7- Preparação enzimática, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada por compreender a enzima fitase, outras proteínas e metabólitos secretados pela linhagem recombinante.

8- Uso da preparação enzimática, definida nas reivindicações 6 e 7, caracterizado por ser para o incremento dos níveis de fosfato inorgânico e moléculas inorgânicas e orgânicas na ração fornecida a animais.