BR102013027648B1 - Polinucleotídeo, polipeptídeo com atividade imunossupressora, cassete de expressão, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, métodos para produzir um polipeptídeo com atividade imunossupressora e para prevenir ou tratar condições que necessitam de imunossupressão, e, uso de um polipeptídeo - Google Patents

Abstract

POLINUCLEOTÍDEO, POLIPEPTÍDEO COM ATIVIDADE IMUNOSSUPRESSORA, CASSETE DE EXPRESSÃO, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO COM ATIVIDADE IMUNOSSUPRESSORA E PARA PREVENIR OU TRATAR CONDIÇÕES QUE NECESSITAM DE IMUNOSSUPRESSÃO, E, USO DE UM POLIPEPTÍDEO. A presente invenção refere-se ao poIinucleotídeos e polipeptídeos não imunogênicos e não hemorrágicos. que possuem atividade imunossupressora seletiva sobre a produção de anticorpos a antígenos de natureza diversas. Os poIipeptídeos descritos na presente invenção são úteis para preparar composições farmacêuticas para a prevenção ou tratamento de condições que necessitam de imunossupressão, preferencialmente, doenças inflamatórias, autoimunes, alérgicas, infecciosas e rejeição a órgãos trans-plantados.

Description

[001] A presente invenção refere-se ao campo da imunologia e da biotecnologia. Particularmente, a presente invenção refere-se a polipeptídeos úteis na prevenção e tratamento de condições que necessitam de imunossupressão, preferencialmente, doenças inflamatórias, autoimunes, alérgicas, infecciosas e rejeição a órgãos transplantados.

Estado da técnica

[002] O sistema imunológico mantém a integridade física e a homeostase do organismo, sendo essencial na defesa contra agentes estranhos, exógenos ou endógenos, como por exemplo, patógenos e células neoplásicas, senescentes e imunologicamente autorreativas, e sendo de fundamental importância para a sobrevivência do indivíduo. A falha de um ou mais componentes do sistema imunológico pode levar a desordens sérias ou até mesmo fatais.

[003] A resposta imune pode ser dividida, didaticamente, em imunidade inata e imunidade adquirida, as quais são ativadas por diferentes estímulos, apresentam características próprias e estão sob controles genéticos independentes, mas funcionalmente integrados. A resposta imune inata corresponde a um conjunto de elementos que desenvolve resposta rápida a padrões moleculares reconhecidos como estranhos. É responsável pela resposta imune inicial, envolve o sistema complemento, as células natural killer e as células do sistema fagocítico-mononuclear, além das barreiras físico-químicas.

[004] A resposta imune adquirida é específica ao agente estranho e caracteriza-se pelo estabelecimento de memória. São responsáveis por essa resposta as células T e B, portadoras de receptores com regiões variáveis de reconhecimento específico capazes de distinguir diferentes moléculas e desenvolver uma resposta complexa, envolvendo a produção de anticorpos (imunidade humoral) e/ou a ativação de linfócitos T efetores (imunidade celular).

[005] As respostas imunológicas inata e adquirida são os componentes de um sistema integrado de defesa do organismo no qual várias células e moléculas funcionam em cooperação. Nas fases iniciais há um predomínio da resposta inata que, por sua vez, estimula e influencia a natureza das respostas adquiridas. Por outro lado, as respostas adquiridas utilizam muitos mecanismos efetores da imunidade inata, geralmente, ampliando os seus mecanismos de defesa.

[006] A regulação do sistema imunológico se dá pela interação de diversos mecanismos de controle, uma vez que seu repertório é complexo e diversificado. Imunorreguladores como citocinas, células supressoras e células efetoras, determinam o equilíbrio entre a ativação e supressão da resposta imune. Quando há inibição dos mecanismos de imunossupressão, ocorre a perda da capacidade de discriminar o próprio do não-próprio e, consequentemente, desenvolvem-se respostas autoimunes, além de respostas imunológicas exacerbadas, levando a danos celulares irreversíveis. Por outro lado, a deficiência ou anergia das células e mecanismos responsáveis pela regulação da ativação do sistema imune dá origem à imunossupressão, aumentando a vulnerabilidade do organismo, por exemplo, às infecções e desenvolvimento de neoplasias.

[007] A supressão do sistema imunológico pode ser de origem natural, como nas imunodeficiências congênitas e adquiridas ou ainda, induzidas, por meio de compostos imunossupressores.

[008] A indução da imunossupressão é utilizada no tratamento de doenças inflamatórias, autoimunes, alérgicas, infecciosas, com o objetivo de diminuir os sinais clínicos das doenças, assim como em pacientes transplantados, com a finalidade de prevenção e tratamento de rejeição a órgãos transplantados. Estas substâncias podem ser agentes sintéticos ou biológicos.

[009] O arsenal terapêutico atual de imunossupressores inclui moléculas pequenas (inibidores do alvo da rapamicina, agentes antimetabólicos e inibidores da calcineurina), proteínas recombinantes, glicocorticoides, proteínas indutoras de depleção ou não depleção de linfócitos (anticorpos monoclonais) e imunoglobulina endovenosa.

[0010] Os imunossupressores inibem, direta ou indiretamente, as células imunocompetentes ativadas, podendo atuar sobre o sistema imunológico de formas distintas, por exemplo, interferindo em receptores de superfície celular que participam do reconhecimento antigênico, bloqueando a expressão de citocinas ou de seus receptores, destruindo ou inibindo a atividade proliferativa das células responsáveis pela reação imunológica indesejada.

[0011] A principal desvantagem no uso de imunossupressores é a sua ação inespecífica sobre a redução das respostas imunológicas, aumentando a vulnerabilidade do organismo às infecções oportunistas e ao aparecimento de neoplasias. Além disso, outros efeitos adversos dos imunossupressores atuais podem ser destacados como, por exemplo, nefrotoxicidade crônica, hepatotoxicidade, hipertensão, dislipidemia, entre outros.

[0012] Com relação aos efeitos adversos, vale ressaltar alguns agentes imunossupressores pelo seu uso e sua abrangência. Os glicocorticoides suprimem a fase inicial da resposta imune e apresentam efeitos adversos graves como síndrome de Cushing, ulceração gastrointestinal, atraso na cicatrização de feridas, atrofia de músculos e pele, e efeitos diabetogênicos. Assim, o uso de glicocorticoides requer interrupções periódicas no tratamento. Os citostáticos, devido às suas ações antiproliferativas, levam a efeitos adversos graves como, alterações na hematopoiese, sintomas gastrointestinais e perda de apetite, não sendo possível a sua utilização por longos períodos. A ciclosporina A deprime tanto a resposta imune humoral quanto a celular, principalmente pela inibição da secreção de interleucina-1 (IL-1) pelos monócitos e pela secreção de IL-2 pelos linfócitos T auxiliares (T helper - Th) na fase inicial da resposta imune. Um efeito adverso relevante deste composto é a deterioração renal dose-dependente. Outros efeitos adversos são distúrbios hepáticos, cardiotoxicidade, tremores, hirsutismo, hipertrofia gengival e edema. Os anticorpos monoclonais induzem efeitos adversos como febre, dispneia e sintomas gastrointestinais. Além disso, nos casos em que os anticorpos não são de origem humana, como os quiméricos ou murinos, pode haver perda de eficiência da resposta, devido à formação de anti-anticorpos quiméricos/murinos humanos.

[0013] Na tentativa de minimizar os efeitos adversos, o espectro de ação dos imunossupressores tem sido controlado através da combinação de diferentes agentes supressores.

[0014] Novos compostos com efeito supressor mais seletivo e, portanto, com efeitos adversos reduzidos, têm sido investigados. No entanto, ainda é possível afirmar que a prevenção ou tratamento de condições que se beneficiam do efeito de imunossupressão, tais como doenças inflamatórias, autoimunes, alérgicas, infecciosas e rejeição a órgãos transplantados, costuma ser difícil e habitualmente desapontadora.

[0015] Sabe-se que as peçonhas das serpentes contêm um diversificado número de substâncias com diferentes propriedades bioquímicas e farmacológicas, sendo que mais de 90% do peso seco dos venenos são de proteínas, dentre essas, enzimas, toxinas e pequenos peptídeos. Outras substâncias como carboidratos, lipídios, metais, aminas biogênicas, nucleotídeos e aminoácidos livres, representam as frações não proteicas.

[0016] Stephano et al. (PI0502080-8, 2005) observaram a produção reduzida de anticorpos neutralizantes contra o veneno de serpentes do gênero Lachesis em equinos sugerindo que algum fator neste veneno interferia na resposta imune eficaz nesses animais. Por meio de cromatografia de exclusão molecular, o veneno total de Lachesis muta foi separado em seis frações distintas, sendo que duas frações apresentaram efeito sobre a produção de anticorpos (então designadas como frações IV e V).

[0017] O documento PI0502080-8 descreve o processo de obtenção de soro equino anti-laquético em que a retirada dessas frações do veneno total e, subsequente imunização de cavalos, possibilitou a obtenção efetiva de anticorpos neutralizantes para uso terapêutico, sendo observado um aumento de oito vezes na eficiência de neutralização do veneno.

[0018] Neste contexto, a presente invenção descreve polipeptídeos com atividade imunossupressora, seletivos e sinal dependentes, inibindo a produção de anticorpos com uma menor dosagem e ausência dos efeitos adversos frequentemente observados para os imunossupressores conhecidos do estado da técnica. Estas e outras vantagens da invenção, bem como as características inventivas adicionais unidas ao mesmo conceito inventivo, serão evidentes na descrição da invenção fornecida neste documento.

Sumário da invenção

[0019] Em um aspecto, a presente invenção provê um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade imunossupressora, selecionado do grupo que consiste de: (a) polinucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeos como apresentado na SEQ ID NO: 1; (b) ácidos nucléicos que hibridizam sob condições estringentes com o ácido nucleico da SEQ ID NO: 1; (c) polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo que é pelo menos 70% idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2; (d) polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo que é pelo menos 70% idêntico à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3; (e) polinucleotídeos que codificam um polipeptídeo que é pelo menos 70% idêntico às sequências de aminoácidos das SEQ ID Nos: 4-15; e (f) sequências degeneradas de nucleotídeos de (a) - (e).

[0020] Em uma concretização, o polinucleotídeo é um cDNA, DNA genômico, DNA sintético ou RNA.

[0021] Em um outro aspecto, a invenção provê um cassete de expressão que compreende um polinucleotídeo como acima definido operacionalmente ligado a um promotor e a um terminador de transcrição.

[0022] Em um outro aspecto, também é provido um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo ou um cassete de expressão como acima descritos.

[0023] Em um outro aspecto, a invenção provê uma célula hospedeira compreendendo um cassete de expressão ou um vetor de expressão compreendendo dito polinucleotídeo.

[0024] Em um outro aspecto, é provido um polipeptídeo com atividade imunossupressora, selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 3; (c) um polipeptídeo compreendendo quaisquer uma das sequências apresentada na SEQ ID Nos: 4-15; (d) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido tendo pelo menos 70% de identidade com as sequências de quaisquer uma das SEQ ID Nos: 2-15.

[0025] Em uma concretização, o polipeptídeo é útil para prevenção ou tratamento de condições que necessitam de imunossupressão. Em uma concretização adicional, as condições que necessitam de imunossupressão são selecionadas do grupo que consiste de doenças inflamatórias, autoimunes, alérgicas, infecciosas e rejeição a órgãos transplantados.

[0026] Em um outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende um polipeptídeo da invenção, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Em uma concretização, a composição é combinada com um agente terapêutico adicional.

[0027] Em um aspecto adicional, é provido o uso de um polipeptídeo imunossupressor, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, na manufatura de um medicamento para prevenção ou tratamento de condições que necessitam de imunossupressão. Em uma concretização, as condições que necessitam de imunossupressão são selecionadas do grupo que consiste de doenças inflamatórias, autoimunes, alérgicas, infecciosas e rejeição a órgãos transplantados.

[0028] Em um outro aspecto, a invenção provê um método para produzir um polipeptídeo com atividade imunossupressora, compreendendo as etapas de: (a) fornecer uma célula hospedeira transformada; (b) cultivar dita célula em condições conducentes para a produção do polipeptídeo; e (c) isolar dito polipeptídeo de dita célula ou do meio de cultura circundando dita célula. Em uma concretização, o polipeptídeo a ser produzido é fornecido com uma etiqueta.

[0029] Em um outro aspecto, é provido um método para prevenir ou tratar condições que necessitam de imunossupressão, compreendendo administrar uma quantidade terapeuticamente efetiva do polipeptídeo imunossupressor a um indivíduo em necessidade da dita prevenção ou tratamento. Em uma concretização, as condições que necessitam de imunossupressão são selecionadas do grupo que consiste de doenças inflamatórias, autoimunes, alérgicas, infecciosas e rejeição a órgãos transplantados. Em concretizações adicionais, as doenças inflamatórias são selecionadas do grupo consistindo de doenças inflamatórias idiopáticas, crônicas e agudas; as doenças autoimunes são selecionadas do grupo consistindo de artrite reumatoide crônica, artrite reumatoide juvenil, lúpus eritematoso sistêmico, esclerodermia, doença de Crohn, doença mista do tecido conjuntivo, dermatomiosite, síndrome de Sjogren, doença de Bechet, esclerose múltipla, mixedema primário, doença de Hashimoto, psoríase, anemia perniciosa, trombocitopenia púrpura idiopática, vasculite, trombocitopenia induzida por heparina, uveíte, anemia hemolítica, púrpura trombocitopênica, pênfigo vulgar, vasculite causada por anticorpos citoplasmáticos antineutrófilos, síndrome de Goodpasture, febre reumática aguda, miastenia gravis, hipertireoidismo, diabetes insulino resistente, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, glomerulonefrite pós-estreptocócica, doença do soro e sepse e as doenças alérgicas são selecionadas do grupo consistindo de dermatite atópica, asma, bronquite, rinite, febre do feno, urticária, angioedema, dermatite de contato, gastroênteropatia alérgica, anafilaxia, anemia hemolítica ou doença hemolítica do recém nascido, sinusite, febre reumática pneumonite hipersensível, glomerulonefrite espreptocócica e alveolite alérgica.

Breve Descrição das figuras

[0030] Figura 1: Perfil cromatográfico da primeira etapa de purificação do fator inibidor de resposta imune humoral a antígenos heterólogos de Lachesis muta em coluna de exclusão molecular (superose 12), em sistema FPLC.

[0031] Figura 2: Perfil cromatográfico da purificação do fator inibidor de resposta imune humoral a antígenos heterólogos de Lachesis muta em coluna Wide-Pore Butyl C18 em sistema HPLC.

[0032] Figura 3: Análise da pureza do fator inibidor de resposta imune humoral a antígenos heterólogos de Lachesis muta por SDS-PAGE. Amostras de 1 (A), 2 (B) e 3 ug (C) do fator foram analisadas.

[0033] Figura 4: Análise de identidade do fator inibidor de resposta imune humoral a antígenos heterólogos de Lachesis muta. Em destaque estão as sequências peptídicas do fator purificado idênticas à LHF-II.

[0034] Figura 5: Produtos de PCR obtidos durante procedimento de clonagem. (A) controle negativo; (B) produto da primeira reação de PCR; (C) produto da segunda reação de PCR, utilizando como molde o produto de PCR obtido na primeira reação.

[0035] Figura 6: Análise de restrição enzimática dos produtos de PCR clonados. 1 - Padrão de peso molecular - DNA do fago Lambda digerido com Hind III; 2 a 20 - Clones digeridos com a enzima de restrição EcoR-I.

[0036] Figura 7: Sequência de cDNA obtida do clone produtor do polipeptídeo recombinante de SEQ ID NO: 2.

[0037] Figura 8: Alinhamento da sequência peptídica do polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 2) da invenção com proteínas da família das reprolisinas.

[0038] Figura 9: Análise das etapas de purificação do polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 3). Quantidade por amostra - 20ug; (A) Eluato; (B) Tampão de equilíbrio (Na3PO4 0,002M, NaCl 0,5M, pH 7,8); (C) Tampão de lavagem (Na3PO4 0,002M, NaCl 0,5M, pH 6,0); (D) Tampão de lavagem com imidazol 30 mM; (E) Tampão de lavagem com imidazol 60 mM; (F) Tampão de lavagem com imidazol 400 mM.

[0039] Figura 10: Análise do polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 3) por focalização isoelétrica em eletroforese bidimensional.

[0040] Figura 11: Predição da estrutura secundária do polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 2).

[0041] Figura 12: Predição da estrutura terciária do polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 2).

[0042] Figura 13: Ensaio fibrinogenolítico. (A) Fibrinogênio; (B) Fibrinogênio + veneno; (C) Fibrinogênio + polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 3).

[0043] Figura 14: Avaliação da clivagem do componente C3. (A) C3 humano; (B) C3 humano + veneno; (C) C3 humano + polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 3).

[0044] Figura 15: Avaliação da atividade hemorrágica (polipeptídeo recombinante SEQ ID NO: 3).

[0045] Figura 16: Atividade imunossupressora do polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 3) sobre a produção de anticorpos contra antígeno particulado.

[0046] Figura 17: Atividade imunossupressora do polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 3) sobre a produção de anticorpos contra antígeno solúvel.

[0047] Figura 18: Efeito imunossupressor do polipeptídeo P6 (SEQ ID NO: 9) e polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 3).

[0048] Figura 19: Representação gráfica do efeito imunossupressor dos polipeptídeos P6 (SEQ ID NO: 9) e P2 (SEQ ID NO: 5) após 7, 13 e 36 dias pós-tratamento.

Definições

[0049] Para garantir um melhor entendimento do escopo da invenção, sem que seja um fator limitante, os termos técnicos das áreas de tecnologia relacionadas, como usados na presente invenção, são definidos a seguir.

[0050] Os termos “ácido nucleico” e polinucleotídeo” são usados de forma intercambiável, e referem-se a RNA e DNA. Os polinucleotídeos podem ser simples ou dupla fita. Exemplos não limitantes de polinucleotídeos incluem genes, fragmentos de genes, exons, introns, RNA mensageiro, siRNA, miRNA, DNA complementar, DNA genômico, DNA sintético, DNA recombinante, cassetes, vetores, sondas e primers. O termo “DNA recombinante” refere-se a qualquer sequência nucleotídica artificial que resulta da combinação de sequências de DNA de diferentes origens.

[0051] O termo “sequência de nucleotídeos degenerada” denota uma sequência de nucleotídeos que inclui um ou mais códons degenerados quando comparada com uma molécula de ácido nucleico de referência que codifica um dado polipeptídeo. Códons degenerados contêm diferentes tripletes de nucleotídeos, mas codificam o mesmo resíduo de aminoácido (p.ex., GAU e GAC ambos codificam Asp).

[0052] O termo “quantidade terapeuticamente efetiva” refere-se a uma quantidade de proteínas ou polipeptídeos que fornece atividade imunossupressora, quando administrada de acordo com a dose e via de administração apropriada.

[0053] O termo “sal farmaceuticamente aceitável” inclui os sais usualmente utilizados para formar sais de metal ou sais de adição de ácidos. A natureza do sal não é crítica desde que seja farmaceuticamente aceitável. Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos polipeptídeos da invenção podem ser obtidos a partir de ácidos ou bases orgânicos ou inorgânicos. Ditos sais podem ser obtidos por métodos convencionais bem conhecidos na técnica.

[0054] O termo “condições que necessitam de imunossupressão” refere-se a quadros clínicos onde se verifica uma resposta imunológica inadequada, seja na sua intensidade (por exemplo, reações de hipersensibilidade) ou especificidade (por exemplo, doenças autoimunes). Nesses casos, a condição clínica se beneficia dos efeitos da imunossupressão, que impede ou reduz a progressão da resposta imunológica inadequada, evitando danos celulares, teciduais, além de outros prejuízos que possam estar relacionados.

[0055] O termo “carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis” refere-se a ingredientes compatíveis com outros ingredientes contidos em preparações farmacêuticas e que não apresentam efeito terapêutico e não são prejudiciais a seres humanos ou animais.

[0056] O termo “indivíduo” refere-se a seres humanos e animais. Preferencialmente o indivíduo é um ser humano.

[0057] O termo “fragmento” refere-se a uma região específica da sequência nucleotídica ou polipeptídica correspondente às sequências indicadas nesta invenção que exercem a função imunossupressora desejada.

[0058] O termo “homologia” refere-se aos casos em que a identidade entre as sequências leva a implicação de ancestralidade comum entre elas.

[0059] O termo “identidade” é definido como o grau de igualdade entre sequências de DNA ou de aminoácidos quando comparados nucleotídeo por nucleotídeo ou aminoácido por aminoácido com uma sequência de referência.

[0060] O termo “similaridade” é definido como o grau de igualdade entre duas ou mais sequências de DNA ou de aminoácidos quando comparados nucleotídeo por nucleotídeo ou aminoácido por aminoácido.

[0061] O termo “porcentagem de identidade de sequências” refere-se a comparações entre polinucleotídeos ou polipeptídeos e é determinado por duas sequências idealmente alinhadas, sob determinados parâmetros de comparação. Este alinhamento pode compreender gaps (espaços), gerando intervalos quando comparadas à sequência de referência, que facilitam uma comparação adequada das mesmas. De maneira geral, o cálculo da porcentagem de identidade considera o número de posições onde o mesmo nucleotídeo ou aminoácido ocorre nas sequências comparadas à sequência referência, sendo realizado através de diversos algoritmos de comparação de sequências e programas conhecidos no estado da arte. Tais algoritmos e programas incluem, mas não são limitados a, TBLASTN, BLASTP, FASTA, TFASTA, CLUSTALW, FASTDB.

[0062] A similaridade é estimada nesta invenção através de métodos e parâmetros de comparação equivalentes àqueles utilizados para estimar a porcentagem de identidade de sequências, sem, no entanto, realizar a comparação em relação a uma sequência referência. Para a estimativa da porcentagem de similaridade as comparações entre polinucleotídeos ou polipeptídeos são realizadas entre duas ou mais sequências idealmente alinhadas.

[0063] Para propósitos da presente invenção, o termo “complementar” é definido como a habilidade da fita senso (sentido 5’^ 3’) de um segmento nucleotídico se hibridizar com uma fita anti-senso (sentido 3’^ 5’) de outro segmento nucleotídico, sob condições apropriadas, para formar uma dupla hélice.

[0064] O termo “Reação da Polimerase em Cadeia” ou da sigla em inglês, PCR, refere-se a um método no qual um fragmento de ácido nucleico é amplificado como descrito na patente US 4.683.195. Geralmente, a informação contida nas extremidades 5’ e 3’ da sequência de interesse é utilizada para o desenho dos oligonucleotídeos iniciadores ou primers que abrangem, em torno de 8 nucleotídeos sintéticos. Estes primers apresentam sequências complementares à sequência a ser amplificada. A PCR pode ser utilizada para amplificar sequências de RNA, DNA ou cDNA.

[0065] Um “cassete de expressão” refere-se a uma construção de ácido nucleico compreendendo uma região codificante e uma região reguladora, ligadas de modo operacional que, quando introduzida em uma célula hospedeira, resulta na transcrição e/ou tradução de um RNA ou polipeptídeo, respectivamente. Geralmente, um cassete de expressão é constituído ou compreendido por um promotor que permite iniciar a transcrição, um ácido nucleico de acordo com a invenção, e terminador de transcrição. A expressão “ligada de maneira operacional” indica que os elementos são combinados de modo que a expressão da sequência codificante esteja sob controle do promotor transcricional e/ou peptídeo sinal. Tipicamente, a sequência do promotor é colocada a montante do gene de interesse, a uma distância deste compatível com o controle da expressão. Do mesmo modo, a sequência de peptídeo sinal é fusionada geralmente a montante da sequência do gene de interesse, e em fase com este, e a jusante de qualquer promotor. Sequências de espaçamento podem estar presentes, entre os elementos reguladores e o gene, dado que não impedem a expressão e/ou a triagem. Em um modo de realização, o referido cassete de expressão compreende pelo menos uma sequência ativadora “enhancer” ligada de maneira operacional ao promotor.

[0066] O termo “vetor” refere-se a moléculas de ácidos nucléicos projetadas para transportar, transferir e/ou armazenar material genético, bem como expressar e/ou integrar o material genético ao DNA cromossomal da célula hospedeira, como por exemplo, os plasmídeos, cosmídeos, cromossomos artificias, bacteriófagos e outros vírus. O vetor geralmente é composto por, no mínimo, três unidades básicas, a origem de replicação, um marcador de seleção e o sítio múltiplo de clonagem.

[0067] Os vetores utilizados nesta invenção apresentam preferencialmente pelo menos um “marcador de seleção”, que é elemento genético que permite a seleção dos organismos/células geneticamente modificados. Esses marcadores incluem genes de resistência a antibióticos tais como, mas não limitados a ampicilina, cloranfenicol, tetraciclina, kanamicina, higromicina, bleomicina, fleomicina, puromicina e/ou genes de complementação de fenótipo, tais como, mas não limitados a metotrexato, dihidrofolato redutase, ampicilina, neomicina, ácido micofenólico, glutamina sintetase.

[0068] O termo “vetor de expressão” refere-se a qualquer vetor que seja capaz de transportar, transferir e/ou armazenar material genético, e que, uma vez na célula hospedeira, seja utilizado como fonte de informação genética para produção de um ou mais produtos gênicos (expressão gênica).

[0069] Além disso, os vetores de expressão desta invenção podem incluir uma ou mais sequências nucleotídicas regulatórias para controle da replicação gênica, transferência, transporte, armazenamento e expressão do material genético, como por exemplo, origem de replicação, marcador de seleção, sítio múltiplo de clonagem, promotor (por exemplo, T7 pol, pL e pR fago lambda, SV40, CMV, HSV tk, pgk, T4 pol, ou EF-1 alfa e seus derivados), sítio de ligação ao ribossomo, sítio para splice de RNA, sítio de poliadenilação, peptídeo sinal para secreção e sequência de terminação de transcrição gênica. No entanto, os vetores de expressão dessa invenção não estão limitados a elas. A técnica de incorporação das sequências controle num vetor encontra-se bem caracterizada no estado da técnica.

[0070] O vetor de expressão utilizado nesta invenção também poderá ter sequências “enhancer”, também denominados elementos “cis” que podem influenciar positiva ou negativamente a expressão gênica dependente do promotor.

[0071] Uma “sequência codificadora” refere-se a uma sequência nucleotídica que é transcrita em mRNA (RNA mensageiro) e traduzida em um polipeptídeo quando estiver sob o controle de sequências regulatórias adequadas. Os limites da sequência codificadora são determinados por um códon de iniciação de tradução na extremidade 5’da fita senso de DNA e por um códon de terminação de tradução na extremidade 3’ da fita senso de DNA. Como resultado da degeneração do código genético, diferentes sequências de DNA podem codificar uma mesma sequência polipeptídica. Por isso, considera-se que tais substituições degeneradas na região codificante estejam inseridas nas sequências descritas nesta invenção.

[0072] O termo “promotor” é uma sequência mínima de DNA suficiente para direcionar a transcrição gênica, isto é, uma sequência que direciona a ligação da enzima RNA polimerase promovendo assim a síntese do RNA mensageiro. Promotores podem ser específicos para o tipo de célula, tipo de tecido e espécie, além de serem modulados, em determinados casos, por elementos regulatórios em resposta a algum agente externo físico ou químico denominado indutor.

[0073] Os termos “transformação” e “transfecção” referem-se ao ato de se inserir um vetor ou outro veículo carreador de material genético exógeno em uma célula hospedeira, procariótica ou eucariótica, para transporte, transferência, armazenamento e/ou expressão gênica do material genético de interesse.

[0074] O termo “expressão recombinante” refere-se à expressão do polipeptídeo recombinante em células hospedeiras.

[0075] O termo “célula hospedeira” refere-se à célula que irá receber o material genético através de um vetor e/ou células que já receberam o material genético através de um vetor (células transformadas ou transfectadas). Essas células hospedeiras podem ser tanto de origem procariótica (micro-organismos procarióticos) como eucariótica (células ou micro-organismos eucarióticos).

[0076] No presente pedido, os termos “peptídeo”, “polipeptídeo” ou “proteína” podem ser utilizados intercambiavelmente, e fazem referência a um polímero de aminoácidos conectado por ligações peptídicas, independentemente do número de resíduos de aminoácido que constituem esta cadeia. Os polipeptídeos, como aqui usados, incluem “variantes” ou “derivados” dos mesmos, que se referem a um polipeptídeo que inclui variações ou modificações, por exemplo, substituição, deleção, adição ou modificações químicas em sua sequência de aminoácido em relação ao polipeptídeo de referência, desde que o polipeptídeo derivado apresente atividade imunossupressora, estabilidade, meia vida, características farmacocinéticas e/ou características físico-químicas iguais ou superiores à inicialmente observada para o polipeptídeo original. Exemplos de modificações químicas são glicosilação, PEGlação, PEG alquilação, alquilação, fosforilação, acetilação, amidação, etc. Os aminoácidos dos polipeptídeos da invenção, dependendo da orientação do grupo amino do átomo de carbono alfa pode pertencer à série L ou D. O polipeptídeo pode ser produzido artificialmente a partir de sequências nucleotídicas clonadas através da técnica de DNA recombinante (“polipeptídeo recombinante”) ou pode ser preparado através de uma reação de síntese química conhecida (“polipeptídeo sintético”).

[0077] O termo “substituições de aminoácidos” refere-se à substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido de polipeptídeos visando à produção de derivados com atividade imunossupressora, estabilidade, meia vida, características farmacocinéticas e/ou características físico-químicas iguais ou superiores à inicialmente observada para os polipeptídeos originais. Os aminoácidos substituintes podem ser naturais, modificados ou incomuns.

[0078] A este respeito, o termo “substituição conservativa de aminoácidos” refere-se à substituição de aminoácidos em um polipeptídeo por aqueles com cadeias laterais similares e, portanto, com propriedades físico- químicas muito próximas. Por exemplo, a troca de uma alanina por uma valina ou leucina ou isoleucina é considerada conservativa, já que os aminoácidos envolvidos possuem como característica comum uma cadeia lateral alifática. O grupo que contém como característica uma cadeia lateral básica é composto por lisina, arginina e histidina. O grupo que contém enxofre na cadeia lateral abrange os aminoácidos cisteína e metionina. Os aminoácidos fenilalanina, tirosina e triptofano contêm uma cadeia lateral aromática. A asparagina e a glutamina fazem parte dos aminoácidos com cadeia lateral contendo amida, já a serina e a treonina contém uma hidroxila ligada a sua cadeia lateral alifática. Outros exemplos de substituição conservativa incluem a substituição de um aminoácido apolar ou hidrofóbico como isoleucina, valina, leucina ou metionina por outro também apolar. Da mesma forma, a invenção aqui descrita contempla a substituição de aminoácidos polares ou hidrofílicos como arginina por lisina, glutamina por asparagina e treonina por serina. Adicionalmente, a substituição entre aminoácidos de caráter básico como lisina, arginina ou histidina ou a substituição entre aminoácidos de caráter ácido como ácido aspártico ou ácido glutâmico também é contemplada. Exemplos de substituição conservativa de aminoácidos são as seguintes: valina por leucina ou por isoleucina, fenilalanina por tirosina, lisina por arginina, alanina por valina e asparagina por glutamina. Nesta invenção, matrizes de substituição utilizadas no alinhamento de aminoácidos de proteínas como BLOSUM62 também podem ser utilizadas para determinar quais aminoácidos apresentam maior probabilidade de substituir outro resíduo numa dada sequência peptídica (Henikoff & Henikoff. 1992 PNAS, 89:10915-10919).

[0079] Além disso, exemplos ilustrativos de aminoácidos modificados ou incomuns incluem ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta- alanina, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 6- aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3- aminoisobutírico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-diaminobutírico, desmosina, ácido 2,2’-diaminopimélico, ácido 2,3- diaminopropiônico, N-etilglicina, N-etilasparagina, hidroxilisina, alo- hidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, aloisoleucina, N-metil glicina, N-metil isoleucina, 6-N-metil-lisina, N-metil valina, norvalina, norleucina, ornitina, etc.

[0080] Os objetos da presente invenção serão melhor compreendidos a partir da descrição detalhada da invenção e das reivindicações anexas.

Descrição detalhada da invenção

[0081] A presente invenção refere-se a um polinucleotídeo recombinante, ilustrado, mas não limitado à sequência mostrada na SEQ ID NO: 1, e inclui as sequências de ácido nucleico compreendendo a SEQ ID NO: 1, as sequências que codificam do aminoácido 85 ao aminoácido 117 da SEQ ID NO: 2, e as sequências que codificam os polipeptídeos das SEQ ID Nos: 2-15. Também estão inclusas as variantes da SEQ ID NO: 1, com uma ou mais bases deletadas, substituídas, inseridas ou adicionadas ou modificadas quimicamente, compreendendo bases não naturais ou nucleotídeos modificados compreendendo, por exemplo, uma ligação modificada, uma base de purina ou pirimidina modificada, ou um açúcar modificado, ditas variantes codificantes para os polipeptídeos tais como aqui definidos. A presente invenção também provê polinucleotídeos que sejam pelo menos 70% idênticas (tais como pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% idênticas) a uma molécula de ácido nucleico mostrada na SEQ ID NO: 1.

[0082] O polinucleotídeo de acordo com a invenção pode ser deduzido da sequência do polipeptídeo de acordo com a invenção como definidos nas SEQ ID Nos: 2-15, e o uso dos códons pode ser adaptado de acordo com a célula hospedeira na qual o ácido nucleico deve ser transcrito. Estas etapas podem ser realizadas de acordo com métodos bem conhecidos do versado na técnica e dos quais alguns são descritos no manual de referência Sambrook et al. (Sambrook et al, 2001).

[0083] Neste sentido, diferentes espécies podem exibir um “códon usage” preferencial. Vide Grantham et al., Nuc. Acids Res. 8:1893 (1980), Haas et al.Curr. Biol. 6:315 (1996), Wain-Hobson et al., Gene 13:355 (1981), Grosjean and Fiers, Gene 18:199 (1982), Holm, Nuc. Acids Res. 14:3075 (1986), Ikemura, J. Mol. Biol. 158:573 (1982), Sharp and Matassi, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:851 (1994), Kane, Curr. Opin. Biotechnol. 6:494 (1995), and Makrides, Microbiol. Rev. 60:512 (1996). Como usado aqui, o termo “códon usage preferencial”, ou “códons preferenciais” é um termo usado na arte referindo-se a códons que são mais frequentemente utilizados em células de certas espécies. Por exemplo, o aminoácido treonina (Thr) pode ser codificado por ACA, ACC, ACG, ou ACT, mas em células de mamífero, o ACC é o códon mais comumente utilizado. Em outras espécies, por exemplo, diferentes códons Thr podem ser preferenciais. Códons preferenciais para uma espécie em particular podem ser introduzidos nos polinucleotídeos da presente invenção por uma variedade de métodos conhecidos na arte. A introdução de sequências de códons preferenciais em um DNA recombinante pode, por exemplo, aumentar a produção do polipeptídeo ao tornar a tradução mais eficiente em um determinado tipo de célula. Assim, as sequências de polinucleotídeo da invenção podem ser otimizadas para diferentes espécies.

[0084] Os ácidos nucleicos desta invenção são obtidos por métodos já conhecidos no estado da técnica, como aqueles descritos por Sambrook et al. (2001). Por exemplo, sequências adicionais podem ser identificadas e funcionalmente anotadas por comparação de sequências. Portanto, um técnico no assunto pode prontamente identificar uma sequência funcionalmente equivalente às moléculas da presente invenção em um banco de dados adequado como, por exemplo, GenBank, usando programas de análise de sequências e parâmetros publicamente disponíveis.

[0085] Adicionalmente, por exemplo, toda ou porções da molécula de DNA podem ser obtidas. Por exemplo, toda ou porções da molécula compreendendo a sequência mostrada na SEQ ID NO: 1 pode ser usada como sonda de hibridização para rastrear uma biblioteca genômica ou uma biblioteca de cDNA, por exemplo, de serpentes do gênero Lachesis, através da hibridização em condições estringentes de sondas de ácido nucleico marcadas com radioisótopos com ácidos nucleicos imobilizados em membranas de nylon ou de nitrocelulose. As sequências nucleotídicas da biblioteca de genômica ou de cDNA que se hibridizam à sonda específica poderão então ser subclonadas em vetor adequado, e sequenciadas para análise e obtenção de regiões codificantes dos polipeptídeos imunossupressores da invenção.

[0086] O termo “condições estringentes” denota parâmetros com os quais a arte é familiar. A estringência de uma hibridização reflete o grau de identidade de sequências dos ácidos nucleicos envolvidos, de forma que quanto maior a estringência, mais idênticas são as duas fitas de polinucleotídeo. A estringência é influenciada por uma variedade de fatores, incluindo o número de incubações, temperatura, concentração de sal e composição, aditivos orgânicos e inorgânicos, solventes, etc. As condições estringentes são exemplificadas por uma temperatura de cerca de 5°C a 20°C mais baixa que a temperatura de fusão (Tm) para a sequência específica, a uma força iônica e pH definidos. O Tm é a temperatura na qual 50% da sequência alvo hibridiza com uma sequência complementar, sob condições de força iônica e pH definidos. Moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições estringentes tipicamente irão hibridizar com um ácido nucleico baseado tanto no cDNA inteiro quanto porções selecionadas do mesmo. Mais preferivelmente, “condições estringentes” referem-se a parâmetros com os quais a arte é familiar, tais como hibridização em 3.5xSSC, 1xsolução de Denhardt, 25 mM tampão fosfato de sódio (pH 7,0), 0,5% SDS, e 2 mM EDTA por 18 horas a 65°C, seguida por 4 lavagens da membrana a 65°C por 20 minutos, em 2xSSC e 0,1% SDS, e uma lavagem final por até 20 minutos em 0,5xSSC e 0,1% SDS ou 0,3xSSC e 0,1% SDS para maior estringência, e 0,1xSSC e 0,1% SDS para estringência ainda maior. As condições podem ser modificadas, desde que o grau de estringência seja igual ao aqui provido. Para a identificação de sequências menos proximamente relacionadas, as lavagens podem ser realizadas em uma temperatura mais baixa, por exemplo, 50°C. Em geral, a estringência é aumentada aumentando-se a temperatura de lavagem ou diminuindo a concentração de SSC.

[0087] Em outro exemplo, as moléculas de ácido nucleico da invenção podem ser obtidas através de uma reação de transcrição-reversa seguida por uma amplificação por PCR. Tanto primers oligo-dT como randômicos podem ser empregados na reação de transcrição reversa para preparar cDNAs de fita simples, a partir do RNA isolado da serpente L. muta, que contêm as sequências de interesse. O RNA pode ser isolado por métodos conhecidos como o uso do reagente Trizol (GIBCO-BRL/Life Technologies, Gaithersburg, Maryland).

[0088] Gobinda et al. (PCR Methods Applic. 2:318-22, 1993), descreve “PCR de sítio de restrição (“restriction-site PCR”) como um método direto que utiliza primers universais para obter sequências desconhecidas adjacentes a um locus conhecido. Primeiramente, o DNA genômico é amplificado na presença de um adaptador-primer, que é homólogo a uma sequência adaptadora ligada às extremidades dos fragmentos de DNA genômico, e na presença de um primer específico para uma região conhecida. As sequências amplificadas são submetidas a uma segunda rodada de PCR com o mesmo adaptador-primer e outro primer específico, interno ao primeiro. Os produtos de cada rodada de PCR são transcritos com uma RNA polimerase adequada e sequenciada usando uma transcriptase reversa.

[0089] Ainda de forma ilustrativa, o PCR inverso permite a obtenção de sequências desconhecidas começando com primers baseados em uma região conhecida (Triglia, T. et al., Nucleic Acids Res 16:8186, 1988). O método utiliza várias enzimas de restrição para gerar um fragmento na região conhecida do gene. O fragmento é então circularizado por ligação intramolecular e usado como molde para PCR. Primers divergentes são desenhados a partir da região conhecida.

[0090] Além disto, é conhecido que sequências com graus reduzidos de identidade também podem ser obtidos com o auxílio de primers degenerados e metodologias baseadas em PCR.

[0091] Tipicamente, a sequência de ácido nucleico de um primer útil para amplificar moléculas de ácido nucleico por PCR pode ser baseada nas sequências de aminoácidos dos polipeptídeos da invenção representadas, por exemplo, pelas SEQ ID Nos: 2 ou 3.

[0092] A presente invenção refere-se, além disso, a um cassete de expressão compreendendo um ácido nucleico de acordo com a invenção ligado de maneira operacional às sequências necessárias à sua expressão. Tipicamente, as regiões codificantes e reguladoras são heterólogas entre si.

[0093] A presente invenção refere-se, além disso, a um vetor de expressão compreendendo um ácido nucleico ou um cassete de expressão de acordo com a invenção.

[0094] Este vetor de expressão pode ser utilizado para transformar uma célula hospedeira e permitir a expressão do ácido nucleico de acordo com a invenção na referida célula.

[0095] Com vantagem, o vetor de expressão compreende elementos reguladores que permitem a expressão do ácido nucleico e elementos que permitem a sua seleção na célula hospedeira de acordo com a invenção. Os métodos para selecionar estes elementos em função da célula hospedeira na qual a expressão é desejada, são bem conhecidos do versado na técnica e amplamente descritos na literatura.

[0096] Os vetores podem ser construídos por técnicas clássicas de biologia molecular, bem conhecidas do versado na técnica. Exemplos não limitantes de vetores de expressão adequados para expressão em células hospedeiras são plasmídeos e vetores virais ou bacterianos.

[0097] A presente invenção refere-se à utilização de um ácido nucleico, um cassete de expressão ou um vetor de expressão de acordo com a invenção para transformar ou transfectar uma célula. A célula hospedeira pode ser transformada/transfectada de maneira transitória ou estável e o ácido nucleico, o cassete ou o vetor pode estar contido na célula sob a forma de epissoma ou sob forma cromossômica.

[0098] O ácido nucleico, cassete de expressão ou o vetor é inserido em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas competentes. Os clones recombinantes são selecionados e então, submetidos à análise por enzimas de restrição e sequenciamento de DNA, possibilitando a confirmação da sequência clonada, utilizando-se para isso métodos, kits e equipamentos amplamente conhecidos por um técnico no assunto.

[0099] Assim, os polipeptídeos da invenção podem ser preparados usando tecnologia de DNA recombinante, em que um cassete ou vetor de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico da invenção, por exemplo, que codifica qualquer um dos polipeptídeos de SEQ ID Nos: 2-15, é operacionalmente ligada a um promotor. As células hospedeiras são cultivadas em condições apropriadas e o polipeptídeo é expresso. A célula hospedeira pode ser uma célula de bactéria, fungo, planta ou animal. O polipeptídeo é recuperado a partir da cultura, em que a recuperação pode incluir uma etapa de purificação do polipeptídeo. O polipeptídeo recombinante obtido é analisado e tratado de modo a solubilizá-lo, quando pertinente. O polipeptídeo solubilizado é, então, purificado e caracterizado bioquimicamente, utilizando-se, por exemplo, métodos comuns ao campo da bioquímica, como HPLC, SDS-PAGE, Western Blotting, focalização isoelétrica com gradiente de pH, dicroísmo circular. Por meio desses métodos, é possível determinar características como, por exemplo, o rendimento da expressão do polipeptídeo recombinante; a determinação das características das estruturas secundárias, além de outras características cuja determinação é importante para o desenvolvimento de um fármaco biotecnológico.

[00100] Os polipeptídeos podem ser expressos “fusionados” à uma etiqueta. O termo “etiqueta” ou o termo em inglês “tag” refere-se a sequências codificadoras incorporadas próximas ao sítio múltiplo de clonagem de um vetor de expressão, possibilitando a sua tradução concomitante e adjacente à sequência do polipeptídeo recombinante clonada. Assim, a etiqueta é expressa fusionada ao polipeptídeo recombinante. Tais etiquetas são bem conhecidas no estado da técnica e incluem compostos e peptídeos como poli-histidina, poli-arginina, FLAG, glutationa-S-transferase, proteína ligante a maltose (MBP), domínio ligante a celulose (CBD), Beta-Gal, OMNI, tioredoxina, NusA, mistina, domínio ligante a quitina, cutinase, compostos fluorescentes (como GFP, YFP, FITC, rodamina, lantanídeos), enzimas (como peroxidase, luciferase, fosfatase alcalina), compostos quimioluminescentes, grupos biotinila, epítopos reconhecidos por anticorpos como zíper de leucina, c-myc, domínios ligantes a metais e sítios de ligação para anticorpos secundários.

[00101] Os polipeptídeos também podem ser obtidos sinteticamente usando métodos conhecidos na arte. Síntese direta dos polipeptídeos da invenção pode ser realizada usando síntese em fase sólida, síntese em solução ou outros meios convencionais, utilizando geralmente grupos de proteção do α-aminogrupo, da α-carboxila e/ou dos grupos funcionais das cadeias laterais dos aminoácidos. Por exemplo, na síntese em fase sólida, um resíduo de aminoácido adequadamente protegido é ligado através do seu grupo carboxila a um suporte polimérico insolúvel, tais como uma resina reticulada de poliestireno ou poliamida. Métodos de síntese em fase sólida incluem tanto métodos BOC e FMOC, que utilizam tert-butiloxicarbonil, e 9- fluorenilmetiloxicarbonila como grupos protetores α-amino, respectivamente, ambos bem conhecidos pelos técnicos no assunto (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Nova Iorque, 1995).

[00102] Os seguintes grupos protetores podem ser utilizados para a síntese dos polipeptídeos da invenção: 9-fluorenilmetiloxicarboil (Fmoc), tert- butiloxicarbonil (Boc), carbobenziloxi (Cbz), 2-cloro-3-indenilmetoxicarbonil (Climoc), benz(f)indeno-3-il-metóxicarbonil (Bimoc), 1,1- dioxobenzo[b]tiofeno-2-il-metoxicarbonil (Bsmoc), 2,2,2- tricloroetóxicarbonil (Troc), 2-(trimetilsilil)etoxicarbonil (Teoc), homobenziloxicarbonil (hZ), 1,1-dimetil-2,2,2-tricloroetóxicarbonil (TCBoc), 1-metil-1 (4-bifenil)etoxicarbonil (Bpoc), 1-(3,5-di-t-butilfenil)-1- metiletoxicarbonil (t-Bumeoc), 2-(2’- or 4’-piridil)etoxicarbonil (Pyoc), viniloxicarbonil (Voc),1-isopropilaliloxicarbonil (Ipaoc), 3-(piridil)alil- oxicarbonil (Paloc), p-metoxibenziloxicarbonil (Moz), p-nitrocarbamato (PNZ), 4-azidobenzyloxycarbonyl (AZBZ), Benzil (Bn) MeO, BnO, Metoximetil (Mom), metiltiometil (MTM), fenildimetilsililmetoximetil (SMOM), t-butildimetilsilil (TBDMS), benziloximetil (BOM), p- metoxibenziloximetil (PMBM), nitrobenziloximetil (NBOM), p- anisiloxymetil (p-AOM), pBuOCH2O-, 4-penteniloximetil (POM), 2- metoxietóximetil (MEM), 2-(trimetilsilil)etoximetil (SEM), mentoximetil (MM), tetrahidropiranil (THP), -OCOCOph, Acetil, ClCH2CO2-, - CO2CH2CCl3, 2-(Trimetilsilil)etil (TMSE), 2(p-toluenosulfonil)etil (Tse). (Greene T.W. Wuts P.G.M., Protective groups in organic synthesis, 3rd ed., John Wiley & Sons, INC, Nova York, EUA, 1999).

[00103] Os polipeptídeos da presente invenção são pelo menos 70, mais preferivelmente pelo menos 80% a 85%, preferivelmente pelo menos 90% e mais preferivelmente pelo menos 95 a 99% idênticos às sequências de polipeptídeos mostradas nas SEQ ID Nos: 2 ou 3.

[00104] Além disto, os polipeptídeos da presente invenção podem ser de qualquer tamanho. Por exemplo, podem apresentar um tamanho menor ou igual a 300, 200, 100, 50, 25, 10, 5 ou 2 aminoácidos. O tamanho adequado dos polipeptídeos poderá ser determinado pelo técnico no assunto. Mais preferivelmente, o polipeptídeo compreende as sequências de aminoácidos conforme descritos nas SEQ ID Nos: 2 ou 3, ou fragmentos dos mesmos dotados de atividade imunossupressora.

[00105] É entendido que um fragmento dotado de atividade imunossupressora é um fragmento que, embora não compreenda a sequência de aminoácidos das SEQ ID Nos: 2 ou 3 em seu comprimento total, ainda compreende aquelas regiões que são capazes de apresentar uma atividade imunossupressora em um indivíduo. Tal fragmento pode ter de 2 a 40, mais preferivelmente, de 3 a 30 aminoácidos contíguos das sequências descritas nas SEQ ID Nos: 2 ou 3.

[00106] Para a delimitação de potenciais fragmentos úteis do presente pedido, os modelos teóricos da estrutura secundária e terciária dos polipeptídeos da invenção são obtidos e utilizados para a delimitação e desenho de fragmentos úteis, com probabilidade de apresentar atividade imunossupressora. Mais preferivelmente, obtêm-se e avaliam-se os modelos teóricos do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2.

[00107] Para fins desta invenção, as regiões que estariam expostas na estrutura secundária do polipeptídeo recombinante (como estabelecido nos estudos de modelagem) foram identificados e avaliados. Considerando-se que os inventores observaram que os polipeptídeos recombinantes apresentam baixa imunogenicidade e alta atividade supressora da produção de anticorpos, sendo essas características funcionais mantidas mesmo após a sua desnaturação por aquecimento (100°C/ 2 h) ou tratamento com ureia (3 M/ 72 h e, posterior, aquecimento a 100°C / 2 h), a hipótese é que a atividade imunossupressora seja determinada pela sequência primária dos polipeptídeos.

[00108] Assim, são fornecidos os fragmentos aqui denominados P1 a P12, que são polipeptídeos imunossupressores consistindo das sequências de aminoácidos SEQ ID NOs: 4 a 15 estabelecidos a partir da análise estrutural da sequência do polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 (Tabela 1).

[00109] Tabela 1 - Sequência de aminoácidos dos polipeptídeos imunossupressores da presente invenção.

[00110] Os fragmentos polipeptídicos desta invenção não precisam ser necessariamente idênticos às sequências descritas em SEQ ID NOs: 4 a 15, contanto que apresentem a função imunossupressora.

[00111] Assim, os fragmentos polipeptídicos da invenção podem ser derivados das SEQ ID NOs: 4 a 15 por deleção, substituição, adição ou modificação química de um ou mais aminoácidos. Os fragmentos podem compreender substituição conservativa de aminoácidos baseados na sequência de aminoácido das SEQ ID NOs: 4 a 15. Adicionalmente, os fragmentos apresentam pelo menos 70% de identidade de sequência de aminoácidos com as SEQ ID NOs: 4 a 15. Mais preferivelmente, os fragmentos apresentam 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência de aminoácidos com as SEQ ID NOs: 4 a 15. Além disto, o técnico no assunto poderá determinar as regiões correspondentes às SEQ ID Nos: 4 a 15 em outros polipeptídeos idênticos ao polipeptídeo de SEQ ID Nos: 2 ou 3 da invenção.

[00112] A partir da identificação e desenho das sequências polipeptídicas com potencial atividade imunossupressora, os fragmentos da presente invenção são sintetizados por métodos bem conhecidos no estado da arte como, síntese química e tecnologia do DNA recombinante. A síntese química de polipeptídeos pode ser realizada em fase líquida ou sólida, segundo revisão de Shin et al. (J. Biochem Molec Biol, 38(5):517-525, 2005), utilizando geralmente grupos de proteção do α-aminogrupo, da α-carboxila e/ou dos grupos funcionais das cadeias laterais dos aminoácidos.

[00113] Os fragmentos polipeptídicos ou seus derivados úteis podem também ser obtidos a partir do polipeptídeo de SED ID Nos: 2 ou 3 purificado, produzido por DNA recombinante, por métodos que incluem a digestão com enzimas, tais como a pepsina ou papaína. Alternativamente, os fragmentos compreendidos pela presente invenção podem ser sintetizados usando um sintetizador de peptídeos automáticos, ou ser produzidos manualmente, usando técnicas bem conhecidas na arte (Geysen et al., J. Immunol. Methods 102: 259, 1978). Adicionalmente, quando sintetizados por tecnologia do DNA recombinante, a mutagênese sítio-dirigida pode ser utilizada para o preparo de substituições de aminoácidos na sequência dos fragmentos da invenção. Este método é bem conhecido no estado da técnica e há kits comerciais disponíveis que facilitam sua realização.

[00114] Os polipeptídeos da invenção podem ainda ser covalentemente ligados a polietilenoglicol através dos grupos amino ou carboxila livres presentes nos aminoácidos. Outros fragmentos derivados incluem polipeptídeos glicosilados ou não glicosilados. A glicosilação pode melhorar a meia-vida dos fragmentos peptídicos circulantes, e permitir a modulação das características imunossupressoras dos fragmentos derivados. A glicosilação pode ser biológica ou não biológica. Por exemplo, carboidratos N- ou O-ligados biologicamente relevantes são aqui antecipados. Outros derivados, tais como um succinato, são também contemplados.

[00115] Os polipeptídeos da presente invenção podem ainda existir como estereoisômeros ou misturas de estereoisômeros; por exemplo, os aminoácidos que os compõem podem apresentar configuração L-, D-, ou ser racêmicos DL- independentemente um do outro. Portanto, é possível obter misturas isoméricas assim como racêmicas ou misturas diastereoméricas, ou diastereoisômeros puros, dependendo do número de carbonos assimétricos e de que isômeros ou misturas isoméricas estejam presentes. Assim, enquanto os resíduos de aminoácidos das sequências polipeptídicas indicadas como SEQ ID NOs: 4 a 15 se encontram todos na forma isomérica L, resíduos na forma isomérica D podem substituir quaisquer aminoácidos da sequência na forma L, contanto que essa substituição conserve a função imunossupressora dos polipeptídeos da invenção. A substituição de aminoácidos L por D é conhecida no estado da técnica e visa proteger os polipeptídeos dessa invenção da degradação proteolítica. Assim, os polipeptídeos sintéticos da presente invenção são caracterizados pelo fato de que os resíduos de aminoácidos das SEQ ID NOs: 4 a 15 se encontram na forma isomérica L ou na forma isomérica D ou na forma racêmica DL.

[00116] É possível utilizar aqui sais farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, sais de ácidos minerais, como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos, e análogos; e os sais de ácidos orgânicos, como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, e análogos. Assim, em uma forma de concretização, os polipeptídeos da invenção podem também ser preparados e estocados na forma de sal. Várias formas de sal dos polipeptídeos podem ser formadas ou intermodificadas por qualquer método conhecido na arte. Contra-íons catiônicos que podem ser usados nas composições incluem, mas não são limitados a íons amônio, íons metálicos, especialmente íons monovalentes, divalentes, ou trivalentes de metais alcalinos incluindo sódio, potássio, lítio, césio, metais alcalinos terrosos incluindo cálcio, magnésio, bário, metais de transição tais como ferro, magnésio, zinco, cádmio, molibdênio; outros metais como alumínio, e possíveis combinações dos mesmos. Contra íons catiônicos que podem ser usados nas composições incluem cloreto, fluoreto, acetato, trifluoroacetato, fosfato, sulfato, carbonato, citrato, ascorbato, sorbato, glutarato, cetoglutarato, e possíveis combinações destes.

[00117] Após a reação química, os polipeptídeos podem ser separados e purificados por um método de purificação conhecido. Um exemplo de tais métodos de purificação pode incluir uma combinação de extração por solvente, destilação, cromatografia por coluna, cromatografia líquida, recristalização e similares.

[00118] Uma vez que o polipeptídeo de interesse é similar a uma proteína de veneno de serpente (LHFII) que possui propriedades indesejáveis para um fármaco em desenvolvimento, como, por exemplo, atividades proteolítica e hemorrágica, é de grande importância investigar se os polipeptídeos da presente invenção apresentam tais propriedades.

[00119] O efeito proteolítico é verificado por meio de espectrofluorímetro utilizando-se o método de FRET (do inglês Fluorescence Ressonance Energy Transfer) com substrato de fluorescência apagada, no qual a atividade proteolítica com a hidrólise do substrato é revelada pelo surgimento da fluorescência. Outra possibilidade é a verificação da capacidade de hidrólise em substratos conhecidos. As enzimas proteolíticas dos venenos viperídeos possuem, por exemplo, a capacidade de hidrolisar o fibrinogênio e o componente C3 do sistema complemento humano, sendo a verificação desse efeito uma forma de averiguar a atividade proteolítica.

[00120] Para a determinação da atividade hemorrágica dos polipeptídeos, e do veneno de L. muta, utiliza-se o método de Kondo et al. (1960, Jpn. J. Med. Sci. Biol. 13: 43-52).

[00121] Os polipeptídeos descritos na presente invenção são caracterizados pela ausência de efeitos proteolíticos e hemorrágicos.

[00122] Em um aspecto adicional da invenção verificam-se as propriedades imunossupressoras dos polipeptídeos da invenção, bem como se assegura de que todos estes não apresentam potencial imunogênico por meio de modelos experimentais de supressão induzida e de imunização, respectivamente.

[00123] Para a análise da atividade imunossupressora dos polipeptídeos da invenção, camundongos constitutivamente bons respondedores para a produção de anticorpos da Linhagem HIII são inoculados, pela via intraperitoneal, e imunizados com antígenos estruturalmente complexos e altamente imunogênicos, como por exemplo, eritrócitos de carneiro, um antígeno particulado. O soro dos animais é então analisado quanto à sua atividade hemaglutinante, sendo que quanto menor efeito hemaglutinante observado, maior a capacidade imunossupressora do composto avaliado. A atividade imunossupressora também pode ser avaliada frente a um antígeno solúvel, como por exemplo, gamaglobulina humana (GGH) adsorvida em hidróxido de alumínio, sendo os títulos de anticorpos determinados por ELISA.

[00124] A imunogenicidade é a capacidade que uma substância tem de induzir uma resposta imunológica. Para avaliar o potencial imunogênico dos polipeptídeos da presente invenção a produção de anticorpos é determinada através do doseamento do título de anticorpos por ELISA após a administração dos polipeptídeos da presente invenção em adjuvantes potentes.

[00125] Os polipeptídeos da presente invenção não são imunogênicos, não induzem imunossupressão generalizada e não são tóxicos ou interferem em qualquer outra função fisiológica do organismo, como comprovado pelo acompanhamento da longa sobrevida de animais que receberam doses intraperitoniais dos polipeptídeos, o que caracteriza grande vantagem em relação às drogas imunossupressoras de uso difundido.

[00126] Os polipeptídeos da presente invenção agem de forma seletiva e multi-específica, diminuindo a produção de anticorpos contra antígenos de estrutura e natureza diversas como proteínas, polipeptídeos biologicamente ativos, toxinas e vacinas viróticas ou bacterianas. São efetivos ante um primeiro sinal e apresentam ação prolongada. Mesmo após uma segunda administração do mesmo imunógeno mantém-se o efeito supressor, ocorrendo diminuição da resposta imune, medida pela produção de anticorpos.

[00127] A presente invenção refere-se ainda a um método de produção do polipeptídeo de acordo com a invenção com atividade imunossupressora compreendendo a inserção de um ácido nucleico, um cassete ou um vetor de expressão de acordo com a invenção em um sistema de expressão in vivo e a coleta do polipeptídeo produzido pelo referido sistema. Numerosos sistemas de expressão in vivo, compreendendo o uso de células hospedeiras adequadas, estão disponíveis no comércio e a utilização destes sistemas é bem conhecida do versado na técnica.

[00128] Sistemas de expressão particularmente adequados incluem microorganismos, como bactérias transformadas com vetores de expressão de DNA recombinante de bacteriófago, plasmídeo ou cosmídeo; levedura transformada com vetores de expressão de levedura; sistemas de células de insetos infectadas com vetores de expressão de vírus (por exemplo, baculovírus); sistemas de células de plantas transformados com vetores de expressão de vírus (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV [cauliflower mosaic virus]; vírus do mosaico do tabaco, TMV [tobacco mosaic virus]) ou com vetores de expressão bacterianos (por exemplo, plasmídeos Ti ou pBR322); ou sistemas de células animais. Também é possível empregar sistemas de tradução isentos de células para produzir os polipeptídeos da invenção.

[00129] A introdução de moléculas de ácido nucleico que codificam um polipeptídeo da presente invenção em células hospedeiras pode ser realizada por meio de métodos descritos em muitos manuais de laboratório padrão, como Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986) e Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989).

[00130] A célula hospedeira transformada ou transfectada descrita acima é depois cultivada em um meio nutriente adequado sob condições conducentes que permitam a expressão dos polipeptídeos imunossupressores da invenção. O meio usado para cultivar as células pode ser qualquer meio convencional adequado para desenvolver as células hospedeiras, tal como meio mínimo ou complexo contendo suplementos apropriados. Os meios adequados estão disponíveis a partir de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com receitas publicadas (por exemplo, nos catálogos da American Type Culture Collection). Os polipeptídeos da invenção produzidos pelas células podem ser depois recuperados da célula ou do meio de cultura por procedimentos convencionais incluindo separar as células hospedeiras do meio pela centrifugação ou filtração, precipitando os componentes aquosos de proteína do sobrenadante ou filtrado por meio de um sal, por exemplo, sulfato de amônio, purificação por uma variedade de procedimentos cromatográficos, por exemplo cromatografia por troca iônica, cromatografia por exclusão, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia por filtração em gel, cromatografia por afinidade ou similares, dependente do tipo de polipeptídeo em questão.

[00131] De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecido um método para produzir um polipeptídeo com atividade imunossupressora de acordo com a invenção compreendendo: (a) transferir para uma célula hospedeira um polinucleotídeo da presente invenção para obter uma célula hospedeira transformada ou transfectada; (b) cultivar a célula hospedeira transformada ou transfectada para obter uma cultura de células; (c) expressar o polinucletídeo da presente invenção em uma célula hospedeira transformada ou transfectada para produzir um polipeptídeo; e (e) Isolar o polipeptídeo da presente invenção da célula ou da cultura de célula.

[00132] Em um aspecto particular da invenção, a célula hospedeira é um micro-organismo procariótico ou uma célula ou micro-organismo eucariótico.

[00133] Em um aspecto particular da invenção, dito polipeptídeo é fornecido com uma “tag”.

[00134] Em um outro aspecto, é aqui fornecida uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um polipeptídeo com atividade imunossupressora de acordo a invenção, ou seus sais ou derivados farmaceuticamente aceitáveis, e pelo menos um carreador ou um excipiente farmaceuticamente aceitáveis. De forma mais preferencial, um ou mais polipeptídeos que compreenda(m) a sequência de aminoácidos da SEQ ID Nos: 2-15, ou que apresente pelo menos 70% de identidade à SEQ ID NO: 2-15. O polipeptídeo pode ser um derivado conforme definido acima, ou compreender uma etiqueta fusionada a sua extremidade amino- ou carboxi-terminal.

[00135] Os carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis são selecionados em função da apresentação final da composição da presente invenção que pode ser na forma de cápsulas, comprimidos ou solução para a administração oral, solução para administração nasal, solução injetável para administração intramuscular, intravenosa, cutânea ou sub-cutânea. Excipientes, carreadores ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis não apresentam toxicidade ao organismo receptor nas dosagens e concentrações empregadas e incluem tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes como ácido ascórbico e metionina; conservantes como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, álcool butílico, álcool benzílico, alquil parabenos como metil- e propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol; proteínas como albumina, gelatina ou imunoglobulinas; aminoácidos, monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos como glicose, manose, sucrose, manitol ou sorbitol; excipientes poliméricos como polivinilpirrolidonas, Ficoll®, dextrinas e polietileno glicóis; agentes de sabor; adoçantes; agentes anti-estáticos; agentes quelantes como EDTA ou EGTA; sais liberadores de íons como sódio; complexos metálicos; surfactantes não- iônicos como polissorbatos 20 e 80; lipídeos como fosfolipídeos, ácidos graxos e esteroides como colesterol. Métodos para preparação de várias composições farmacêuticas são bem conhecidos, ou serão aparentes à luz da presente invenção, pelo especialista da arte em tecnologia farmacêutica.

[00136] Além disto, as composições podem compreender aditivos com o objetivo de aumentar a facilidade de administração, a capacidade de serem estocadas, a resistência à degradação, a biodisponibilidade, a meia vida, prover preparações isotônicas, etc. Aditivos usais para a preparação de composições farmacêuticas são bem conhecidas na arte.

[00137] Além disto, os polipeptídeos da presente invenção podem ser usados em combinação com outros agentes terapêuticos, tais como corticosteroides, glicocorticoides, agentes citostáticos, agentes citotóxicos, anticorpos monoclonais, polipeptídeos recombinantes, análogos de nucleosídeos e antibióticos. Exemplos não limitantes dos agentes terapêuticos acima citados são: leflunomida, micofenolato de mofetila, clorambucil, ciclofosfamida, cladribina, fludarabina, azatioprina, metotrexato, ciclosporina, tacrolimo, prednisona, cortisona, hidrocortisona, talidomida e sirolimo,

[00138] As composições farmacêuticas devem compreender uma quantidade terapeuticamente efetiva do polipeptídeo, ou seus sais ou derivados farmaceuticamente aceitáveisda invenção. Para qualquer composto, a dose terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente, quer em ensaios de cultura de células, por exemplo, de células neoplásicas, quer em modelos animais, usualmente camundongos, coelhos, cães ou porcos. O modelo animal também pode ser usado para se determinar a faixa de concentração apropriada e a via de administração. Informação desse tipo pode então ser usada para se determinar doses úteis e vias para administração em humanos.

[00139] A composição farmacêutica de acordo com a presente invenção compreende de 0,1% a 99% p/p, preferivelmente 1% a 60% p/p, particularmente 10% a 50% p/p dos polipeptídeos da presente invenção, ou seus sais ou derivados farmaceuticamente aceitáveis.

[00140] Conforme a presente invenção, a administração das ditas composições farmacêuticas pode ser realizada pelas vias de administração: oral, sublingual, nasal, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intra-articular, subcutânea, cutânea, transdérmica, não sendo limitada a estas, e sendo a via de administração preferida a via oral.

[00141] Em um aspecto adicional da presente invenção são fornecidos polipeptídeos ou seus sais ou derivados farmaceuticamente aceitáveis, para uso na prevenção ou tratamento de condições que necessitam de imunossupressão. Preferivelmente, o polipeptídeo compreende qualquer uma das SEQ ID NO: 215, ou que apresentem pelo menos 70% de identidade às SEQ ID NO: 2-15, ou seus derivados ou sais farmaceuticamente aceitáveis. As condições que necessitam de imunossupressão podem ser selecionadas do grupo consistindo de doenças inflamatórias, autoimunes, alérgicas, infecciosas e rejeição a órgãos transplantados.

[00142] A presente invenção refere-se também ao uso dos polipeptídeos da invenção, ou seus sais ou derivados farmaceuticamente aceitáveis, na produção de um medicamento para prevenção ou tratamento de condições que necessitam de imunossupressão. Preferivelmente, o polipeptídeo compreende qualquer uma das SEQ ID NO: 2-15, ou que apresentem pelo menos 70% de identidade às SEQ ID NO: 2-15, ou seus derivados ou sais farmaceuticamente aceitáveis.

[00143] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um método de prevenção ou tratamento de condições que necessitam de imunossupressão, caracterizado por compreender a administração a um indivíduo em necessidade do dito tratamento, de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um polipeptídeo de acordo com a invenção, ou seus sais ou derivados farmaceuticamente aceitáveis. Preferivelmente, o polipeptídeo compreende qualquer uma das SEQ ID NO: 2-15, ou que apresentem pelo menos 70% de identidade às SEQ ID NO: 2-15, ou seus derivados ou sais farmaceuticamente aceitáveis.

[00144] Preferencialmente o indivíduo tratado é um ser humano que necessita de supressão da resposta imune.

[00145] As condições que necessitam de imunossupressão são selecionadas do grupo consistindo de doenças inflamatórias, autoimunes, alérgicas, infecciosas e rejeição a órgãos transplantados.

[00146] Na presente invenção, doenças inflamatórias podem ser selecionadas do grupo consistindo de doenças inflamatórias idiopáticas, crônicas e agudas. As doenças autoimunes incluem doenças causadas pela diminuição da tolerância imunológica aos componentes do próprio organismo, devido a uma alteração no processo de diferenciação entre antígenos externos e os do próprio organismo, podendo ser selecionadas do grupo consistindo de artrite reumatoide crônica, artrite reumatoide juvenil, lúpus eritematoso sistêmico, esclerodermia, doença de Crohn, doença mista do tecido conjuntivo, dermatomiosite, síndrome de Sjogren, doença de Bechet, esclerose múltipla, mixedema primário, doença de Hashimoto, psoríase, anemia perniciosa, trombocitopenia púrpura idiopática, vasculite, trombocitopenia induzida por heparina, uveíte, anemia hemolítica, púrpura trombocitopênica, pênfigo vulgar, vasculite causada por anticorpos citoplasmáticos antineutrófilos, síndrome de Goodpasture, febre reumática aguda, miastenia gravis, hipertireoidismo, diabetes insulino resistente, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, glomerulonefrite pós-estreptocócica, doença do soro e sepse. As doenças alérgicas podem ser definidas como reações de hipersensibilidade imunológica mediada por anticorpos, imunocomplexos (formados a partir da ativação do sistema complemento) ou células contra um antígeno estranho (alérgeno), manifestada por inflamação tissular ou disfunção de um órgão, podendo ser selecionadas do grupo consistindo de dermatite atópica, asma, bronquite, rinite, febre do feno, urticária, angioedema, dermatite de contato, gastroênteropatia alérgica, anafilaxia, anemia hemolítica ou doença hemolítica do recém nascido, sinusite, febre reumática pneumonite hipersensível, glomerulonefrite espreptocócica e alveolite alérgica.

[00147] A quantidade efetiva precisa para um indivíduo humano dependerá da gravidade do estado de doença, da saúde geral do indivíduo, da idade, do peso, e do sexo do sujeito, da dieta, do tempo e da frequência de administração, da combinação/combinações de drogas, das sensibilidades de reação, e da tolerância/resposta à terapia. Assim, doses a serem fornecidas dependem de um número de fatores que não podem ser mensuradas antes que os estudos de testes clínicos sejam feitos. O técnico no assunto, no entanto, sabe como chegar a doses adequadas para diferentes tratamentos.

[00148] Os exemplos citados a seguir são meramente ilustrativos, devendo ser empregados somente para uma melhor compreensão dos desenvolvimentos constantes na presente invenção, não devendo, contudo, serem utilizados com o intuito de limitar os objetos descritos.

Exemplo 1. Obtenção do fator inibidor de resposta imune humoral a antígenos heterólogos de LACHESIS MUTA.

[00149] O veneno de L. muta, fornecido pelo Laboratório de Processamento de Plasmas Hiperimunes da Divisão de Produção do Instituto Butantan, foi inicialmente submetido à cromatografia de exclusão molecular de acordo com Stephano et al. (PI0502080-8, 2005). A fração IV (F4) foi dializada, liofilizada, ressuspendida em tampão Tris-HCl e submetida à cromatografia em coluna de exclusão molecular (Superose® 12) em tampão Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, utilizando o fluxo de 24 mL/h. A fração F2 obtida (pico 2) (Figura 1) foi então submetida à cromatografia de fase reversa, utilizando uma coluna Wide-Pore Butyl C18, em sistema HPLC. As frações foram eluídas sob fluxo constante de 1,0 mL/min em gradiente linear de acetonitrila e ácido trifluoroacético 0,1 % (Figura 2). O pico 7 (Figura 2) apresenta o fator inibidor da resposta imune humoral a antígenos heterólogos, sendo imediatamente seco à vácuo para remoção da acetonitrila e estocado a - 20°C. Todas as etapas de purificação foram monitoradas em Abs280nm-

Exemplo 2. Caracterização do fator inibidor de resposta imune humoral a antígenos heterólogos de L. MUTA.

[00150] A análise eletroforética em gel SDS-PAGE (12,5%), realizada em condições redutoras e revelada com prata, demonstrou a pureza e a massa molecular aproximada de 23 KDa do fator inibidor da resposta imune humoral a antígenos heterólogos purificado (Figura 3, amostras A, B e C contendo concentrações crescentes da proteína, 1, 2 e 3 ug, respectivamente).

[00151] O fator proteico foi analisado por espectrometria de massas, por meio da técnica de peptide mass fingerprinting, apresentando similaridade significativa com a metaloproteinase de veneno de serpente (SVMP), a mutalisina-II, também denominada de Fator Hemorrágico de Lachesis muta (LHF-II; N° de acesso P22796).

[00152] A metaloproteinase LHF-II, da classe P-I das SVMPs, é uma endopeptidase dependente de zinco que possui efeito hemorrágico e alta atividade proteolítica, possuindo 200 aminoácidos, massa molecular de 22,5 KDa e ponto isoelétrico de 6,6. (FOX JW e SERRANO SM, 2005, Toxicon 8:969-85).

[00153] As SVMPs, classificadas de acordo com seus domínios estruturais (P-I, P-II, P-III e P-IV), estão inseridas no grupo das reprolisinas, e possuem tamanho entre 20 e 100 kDa. A sequência consenso “HEXXH”, no qual X representa qualquer resíduo de aminoácido, é comum, correspondendo ao motivo de ligação de um íon metálico (normalmente zinco), que é coordenado pelos resíduos de histidina e ácido glutâmico, fundamentais para o mecanismo de catálise. Agem diretamente nos componentes de matriz extracelular, sendo consideradas como os principais fatores envolvidos na hemorragia (FOX JW e SERRANO SM, 2005, Toxicon 8:969-85).

[00154] A Figura 4 apresenta a sequência de aminoácidos completa do LHF-II, sendo destacadas as sequências peptídicas do fator purificado idênticas à LHF-II.

Exemplo 3. Clonagem do cDNA que codifica os polipeptídeos recombinantes imunossupressores da presente invenção (SEQ ID NO: 2 e 3)

[00155] O RNA total da glândula de veneno de L. muta foi isolado, por meio da extração com o reagente Trizol® (Gibco-BRL Life Technologies; seguindo as instruções do fabricante), para a síntese do DNA complementar (cDNA) utilizando o cDNA Cycle KitTM (Invitrogen, EUA; seguindo as instruções do fabricante).

[00156] Na reação foram utilizados 5 μg do RNA total e 1 μg de primers randômicos, sendo a amostra submetida a um pré-tratamento de desnaturação a 65°C por 10 min, seguindo-se de 2 min à temperatura ambiente. Foram adicionados 10U de inibidor de RNase, 4 μL do tampão para Transcriptase Reversa (5X), 100 mM de dNTPs, 80 mM de pirofosfato de sódio, 11,5 μL de água destilada deionizada estéril tratada com DEPC (dietil-pirocarbonato) e 5U da enzima Transcriptase Reversa - AMV-RT, sendo a reação incubada por 1h a 42°C.

[00157] O cDNA obtido foi então submetido a duas reações sequenciais de PCR com primers degenerados (SEQ ID NO: 16 e 17), desenhados a partir das regiões amino- e carboxi-terminais conservadas da sequência obtida por análise de Peptide Mass Fingerprinting (Figura 4).

[00158] A amplificação resultou em dois fragmentos, um de 300 pares de bases (pb) e outro de 600 pb, aproximadamente (Figura 5; (A) controle negativo; (B) produto da primeira reação de PCR; (C) produto da segunda reação de PCR, utilizando como molde o produto de PCR obtido na primeira reação).

[00159] O maior fragmento obtido foi purificado conforme estabelecido por Ausubel et al. (1995) e ligado no plasmídeo pGEM® T easy (Promega) seguindo as instruções do fabricante.

[00160] Os produtos de ligação (DNA plasmidial recombinante) foram transformados em células Escherichia coli XL1 Blue competentes e 100 clones positivos foram selecionados com a utilização de IPTG/X-GAL. Após multiplicação dos clones selecionados, o DNA plasmidial recombinante de cada clone foi isolado e submetido à análise por restrição enzimática com a endonuclease EcoR-I para confirmar a presença do fragmento gênico de interesse (Figura 6. 1 - Padrão de peso molecular -DNA do fago Lambda digerido com Hind III; 2 a 20 - Clones digeridos com a enzima de restrição EcoR-I).

[00161] Os clones que possuíam insertos maiores ou iguais a 500 pb (24 dos 100 clones selecionados) foram submetidos a reações de sequenciamento de DNA (kit Big Dye, Applied Biosystems, EUA; sequenciador de DNA, modelo ABI PRISMTM 3100 de eletroforese capilar, Applied Biosystems, EUA; de acordo com as instruções do fabricante). Os iniciadores utilizados para o sequenciamento foram o T7 (SEQ ID NO: 20, 5’ taatacgactcactataggg 3’) e o SP6 (SEQ ID NO: 21, 5’ ttctatagtgtcacctaaat 3’), complementares às sequências do vetor pGEM-T que flanqueiam a região múltipla de clonagem, senso e anti-senso, respectivamente. O resultado do sequenciamento foi utilizado como molde para o desenho de primers específicos contendo os sítios de restrição Xho-I (SEQ ID NO: 18) e Nco-I (SEQ ID NO: 19) para subclonagem direcionada da sequência de interesse no vetor pRSET-A (Invitrogen, USA). A Figura 7 apresenta a sequência obtida através da análise de sequenciamento de DNA e a posição e sequência dos primers utilizados para a subclonagem do DNA complementar (SEQ ID NO: 1) que codifica o polipeptídeo recombinante de SEQ ID NO: 2.

[00162] O fragmento de DNA de interesse foi amplificado por PCR utilizando os primers específicos descritos acima (SEQ ID NO: 18 e 19) e como molde, o clone cujo resultado do sequenciamento gênico originou a sequência representada na Figura 7 (SEQ ID NO: 1). Os produtos amplificados foram novamente inseridos no vetor pGEM-T e em células hospedeiras procarióticas competentes (E.coli) para seu armazenamento e amplificação. Posteriormente, o vetor pGEM-T contendo o fragmento de DNA de interesse e o vetor de expressão pRSET-A foram clivados com as endonucleases Xho-I e Nco-I. O fragmento de DNA de interesse e o vetor de expressão clivado foram submetidos a uma reação de ligação com a enzima T4 ligase. Os produtos de ligação foram transformados em células Escherichia coli XL1 Blue competentes e selecionados pelo sistema IPTG/X-gal para extração do DNA plasmidial. Em seguida, foi realizada a análise de restrição, utilizando-se as enzimas NcoI e XhoI empregadas na subclonagem para confirmar o tamanho e a orientação correta do inserto.

[00163] A construção final compreendeu o vetor pRSET-A e o DNA complementar de SEQ ID NO: 1, codificando um polipeptídeo recombinante de SEQ ID NO: 3.

Exemplo 4. Análise de similaridade da SEQ ID NO: 1 e 2.

[00164] A sequência SEQ ID NO: 1 foi submetida à análise de similaridade utilizando o programa BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), disponível interativamente no endereço http://www.ncib.nlm.nih.gov. A sequência SEQ ID NO: 1 foi traduzida através da ferramenta TRANSLATE TOOL (http://www.expasy.ch); e analisada manualmente utilizando-se o programa BioEdit (HALL, T.A. 1999, Nucl. Acids. Symp. Ser., 41:95-98). Foi empregada a matriz BLOSUM 62 (Blocks Substitution Matrix) (HENIKOFF & HENIKOFF. 1992, PNAS, 89:10915-10919). A sequência deduzida de aminoácidos SEQ ID NO: 2, foi submetida à análise no banco de sequências de proteína (CDD), para determinação de possíveis domínios conservados (MARCHLER-BAUER et al., 2005, Nucleic Acids Res. 33:D192-6). Através do programa rpsBlast, fez-se um alinhamento múltiplo entre a sequência deduzida do polipeptídeo recombinante e as demais sequências polipeptídicas presentes em seu acervo, já divididas em famílias e respectivas funções biológicas.

[00165] O resultado do alinhamento no banco de proteínas CDD revelou que a sequência do clone produtor do polipeptídeo recombinante de SEQ ID NO: 2 apresenta regiões de aminoácidos comuns a outras reprolisinas (M12B). A Figura 8 ilustra o alinhamento da sequência deduzida de aminoácidos SEQ ID NO: 2 com a sequência consenso do alinhamento de 9 representantes do banco de proteínas cujas identidades variam de 57 a 81%, mas com o motivo catalítico conservado em todas elas. Mostra, ainda, o motivo catalítico “HEXXH” presente em todos os membros da família das metaloproteinases, sendo “X” um aminoácido qualquer. É importante salientar que uma característica comum da família das reprolisinas é a atividade proteolítica e em alguns casos, como a LHFII e a Fibrolase, apresentam também efeitos hemorrágicos. No entanto, como será demonstrado no exemplo 8, apesar da semelhança com a família dessas metaloproteinases, os polipeptídeos recombinantes da presente invenção surpreendentemente, não apresentam tal efeito proteolítico, nem hemorrágico.

Exemplo 5. Expressão do polipeptídeo imunossupressor recombinante (SEQ ID NO: 3).

[00166] A construção final apresentando o vetor de expressão (pRSET-A) e a sequência de cDNA obtida a partir do RNA de L. muta (SEQ ID NO: 1) foi transformada inicialmente, em células competentes de E. coli BL21(DE3) (Invitrogen) e posteriormente em células competentes Origami(DE3)pLys (Novagen).

[00167] O polipeptídeo recombinante produzido a partir da construção final apresentou, adicionalmente à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 2, seis resíduos de histidina, a porção derivada da proteína 10 do fago T7 e um sítio de clivagem para enteroquinase (7,87 kDa), resultando em um polipeptídeo de massa molecular aproximada de 30 kDa (SEQ ID NO: 3).

[00168] O polipeptídeo recombinante solúvel só foi obtido após a otimização dos protocolos de expressão utilizando a cepa bacteriana Origami(DE3)pLys com indução com 1 mM de IPTG por 72 h a 20°C; agitação branda e tampão de lise Tris-HCl 48 mM, SDS 70 mM, pH 6,8.

Exemplo 6. Purificação e caracterização bioquímica do polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 3).

[00169] Amostras do sobrenadante do lisado bacteriano, onde a expressão do polipeptídeo recombinante foi induzida, foram submetidas à cromatografia de afinidade em coluna de Ni++ acoplada à sefarose, sendo a polipeptídeo recombinante eluído e submetida à análise por SDS-PAGE. A Figura 9 mostra a resultado da eletroforese (SDS PAGE - gel 12,5%, condições redutoras e coloração por prata) de amostras coletadas durante a cromatografia de afinidade para a purificação do polipeptídeo recombinante revelando a presença de duas bandas, ambas correspondendo ao polipeptídeo recombinante produzido (Figura 9 - quantidade por amostra - 20ug; Legenda: (A) Eluato; (B) Tampão de equilíbrio (Na3PO4 0,002M, NaCl 0,5M, pH 7,8); (C) Tampão de lavagem (Na3PO4 0,002M, NaCl 0,5M, pH 6,0); (D) Tampão de lavagem com imidazol 30 mM; (E) Tampão de lavagem com imidazol 60 mM; (F) Tampão de lavagem com imidazol 400 mM).

[00170] Uma amostra contendo 60 μg do polipeptídeo recombinante produzido foi submetida à focalização isoelétrica em gradiente linear de pH variando de 3 a 10 e a segunda dimensão realizada em SDS-PAGE 12,5%; o gel foi corado com prata revelando um polipeptídeo com massa molecular de aproximadamente 30 kDa e pI de 6,2 (Figura 10). O rendimento da expressão do polipeptídeo recombinante foi de cerca de 2 mg/L

Exemplo 7. Modelagem teórica do polipeptídeo recombinante imunossupressor (SEQ ID NO: 2) e desenho dos fragmentos polipeptídicos (SEQ ID NOs: 4 a 15).

[00171] A partir da análise da sequência deduzida do polipeptídeo recombinante obtido, modelos teóricos da estrutura secundária (Figura 11) e terciária (Figura 12) do polipeptídeo foram gerados para identificação das regiões com maior probabilidade de estarem envolvidas com a atividade imunossupressora. A predição da estrutura secundária foi realizada com os programas PSIPRED (Position Specific Interated Prediction) (JONES, 1999, J Mol Biol., 292:195-202) e GOR4 (Secondary structure prediction) (GARNIER et al., 1990, Biochem Soc. Symp., 57:11-24), que fazem comparação das sequências de aminoácidos alvo com os bancos de dados de estruturas secundárias estabelecidas experimentalmente (Figura 11).

[00172] Os dados obtidos por dicroísmo circular para o polipeptídeo recombinante mostram que os elementos da estrutura secundária (Tabela 2) estão de acordo com o modelo teórico predito através das ferramentas computacionais acima citadas.

[00173] Tabela 2 - Determinação das estruturas secundárias.

[00174] A análise de dicroísmo circular foi realizada em espectropolarímetro JASCO-810 acoplado a um sistema Peltier de controle da temperatura, no comprimento de onda entre 190 e 260 nm, 100 mdeg de sensibilidade, 0,2 nm de resolução, tempo de resposta de 8 segundos a uma velocidade de 200 nm/min. A estimativa dos elementos estruturais secundários foi obtida usando o programa de deconvolução de proteínas CDNN (N. Sreerama and R.W. Woody (1993) A self consistent method for the analysis of protein secondary structure from circular dichroism. Anal. Biochemistry, p. 209).

[00175] Os parâmetros físico-químicos da sequência deduzida do polipeptídeo foram calculados utilizando-se o programa ProtParam Tool (GASTEIGER et al., 2005, Hatfield: Humana Press, p. 571-607).

[00176] Os modelos tridimensionais do polipeptídeo recombinante foram construídos através de modelagem comparativa a partir da busca por proteínas cujas estruturas secundárias fossem similares à estrutura secundária predita, utilizando os programas SWISS-MODEL, ESyPred3D e SDSC1.

[00177] A qualidade do modelo tridimensional construído foi avaliada com os seguintes programas VERIFY 3D (LUTHY et al., 1992, Nature, 356: 83-5), WHATIF (VRIEND, 1990,J Mol Graph., 8:52-6; HOOFT et al., 1996, Proteins, 26: 363-76) e PROCHECK (LASKOWSKI et al., 1998, Curr Opin Struct Biol., 8:631-9). Os parâmetros testados por esses programas foram os comprimentos das ligações, ângulos das ligações, planos das ligações peptídicas e dos anéis das cadeias laterais, quiralidade, ângulos torcionais da cadeia principal e das cadeias laterais, além dos impedimentos estéricos entre pares de átomos não ligados; e os programas VERIFY 3D e WHATIF realizam, com alta resolução, as comparações entre os modelos obtidos e as proteínas resolvidas.

[00178] O modelo estrutural construído e validado para o polipeptídeo recombinante é mostrado na Figura 12, onde os cilindros representam α- hélices e as setas representam as fitas β, enquanto os loops estão representados por um traço contínuo.

[00179] Observa-se que o motivo catalítico encontra-se em um bolsão de ligação na extremidade carboxi-terminal envolvendo uma alfa-hélice e uma conexão (aminoácidos 130 a 195). A análise preditiva identifica nessa região do polipeptídeo a existência de pontes disulfeto entre as cisteínas 157-162, 155-179 e 115-195 (Figura 12), provavelmente envolvidas na manutenção da estrutura tridimensional responsável pela formação do bolsão de ligação que contém o motivo “HEXXH” observado.

[00180] A região amino-terminal do polipeptídeo (aminoácido 1 a 84) apresenta poucas regiões de conexão (loops), locais, provavelmente, mais expostos na superfície do polipeptídeo e com maior probabilidade de se relacionarem a atividade imunossupressora descrita.

[00181] Baseado nessas informações estruturais, a região do polipeptídeo recombinante escolhida para a síntese dos fragmentos polipeptídicos ocorre do aminoácido 85 até o aminoácido 113 e apresenta uma localização mais favorável na estrutura tridimensional predita devido a existência de um maior número de conexões e ausência de estruturas alfa-hélice e domínios catalíticos já descritos. Desta forma, todos os fragmentos polipeptídicos sintetizados encontram-se nessa região (SEQ ID NOs: 4 a 15).

Exemplo 8: Análise da atividade proteolítica e do potencial hemorrágico do polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 3).

[00182] A possível atividade proteolítica do polipeptídeo recombinante foi avaliada em espectrofluorímetro, utilizando o substrato de fluorescência apagada (FRET) Abz-FRSSRQ-EDDnp, sensível a hidrólise por serino e metaloproteinases. Como controle negativo, foi utilizado tampão PBS.

[00183] Observa-se a ausência de atividade proteolítica do polipeptídeo recombinante sobre o substrato FRET, mesmo utilizando 10 μg do polipeptídeo e acompanhando a fluorescência por 1h.

[00184] Para confirmar a ausência de atividade enzimática, um ensaio fibrinogenolítico foi realizado. Amostras contendo 30 μg de fibrinogênio humano foram incubadas com 5 μg do polipeptídeo recombinante purificado por 5h a 37°C. Segundo a legenda da Figura 13, temos que: (A) Fibrinogênio; (B) Fibrinogênio + veneno; (C) Fibrinogênio + polipeptídeo recombinante. As amostras foram submetidas a analise por SDS-PAGE (10 %) em condições redutoras e o gel foi corado com Coomassie blue. A Figura 13 mostra que o polipeptídeo recombinante não foi capaz de hidrolisar o fibrinogênio. Já o controle positivo utilizado, veneno total de L. muta, provocou uma visível degradação do fibrinogênio.

[00185] Outro substrato testado quanto a possível atividade proteolítica do polipeptídeo recombinante foi o componente C3 do sistema complemento humano. Amostras contendo 9 μg do componente C3 humano purificado foram incubadas com 5 μg do polipeptídeo recombinante purificada por 5h a 37°C. Segundo a legenda da Figura 14, temos que: (A) C3 humano; (B) C3 humano + veneno; (C) C3 humano + polipeptídeo. As amostras foram submetidas à análise por SDS-PAGE (10%) em condições redutoras, e o gel foi corado com Coomassie blue. A Figura 14 demonstra que o polipeptídeo recombinante não foi capaz de clivar o componente C3.

[00186] A atividade hemorrágica do polipeptídeo recombinante foi avaliada segundo o método descrito por Kondo et al. (1960, Jpn. J. Med. Sci. Biol., 13:43-52). Grupos (5 animais/grupo) de camundongos da linhagem BALB/c (18-22 g) foram injetados, pela via intradérmica, com 4 μg de veneno de L. muta ou 50 μg polipeptídeo recombinante; o grupo utilizado como controle negativo recebeu apenas tampão fosfato salino (PBS). Após 2 horas, os animais foram submetidos à eutanásia e as peles removidas para avaliação da presença de hemorragia. A Figura 15 demonstra a atividade hemorrágica do veneno de L. muta (painel B) em relação ao animal controle não inoculado (Painel A) e em relação ao polipeptídeo recombinante (painel C), que não apresenta atividade hemorrágica, mesmo numa concentração 12,5 vezes superior à do veneno bruto.

Exemplo 9: Análise da imunogenicidade.

[00187] Anticorpos anti- polipeptídeo recombinante foram dosados por ELISA. Amostras contendo o polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 3) foram utilizadas para sensibilizar as placas de ELISA (1 μg/poço), as quais foram incubadas com diluições crescentes dos soros dos animais imunizados com o polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 3). As reações foram reveladas pela adição do conjugado anti-IgG de camundongo marcado com peroxidase (1:7.500), seguida da adição de OPD (o-Phenylenediamine dihydrochloride) e H2O2. A leitura das reações foi realizada a X492 nm em um espectrofotômetro de placas. Os títulos foram estabelecidos como a maior diluição dos soros experimentais cujas densidades ópticas fossem três vezes superiores às obtidas para o soro normal na mesma diluição. Os dados correspondem a valores obtidos de dois experimentos independentes. A significância entre os diferentes grupos (6 animais/grupo) foi p<0,01.

[00188] A análise dos resultados demonstrou que o polipeptídeo recombinante apresenta baixíssimo ou nenhum potencial imunogênico, uma vez que não foi capaz de induzir a produção de anticorpos específicos.

[00189] O polipeptídeo P6 (SEQ ID NO: 9) também não apresentou imunogenicidade, sendo incapaz de induzir a produção de anticorpos (ELISA realizado conforme descrição acima; polipeptídeo de SEQ ID NO: 9 utilizado para sensibilização das placas e imunização dos animais).

[00190] O protocolo de imunização utilizado nos experimentos descritos acima foi: grupos de camundongos bons respondedores para a produção de anticorpos, da linhagem HIII (6 animais/grupo) foram injetados, pela via intraperitoneal, com o polipeptídeo P6 (3 μg) ou polipeptídeo recombinante de SEQ ID NO: 3 (50 μg). Um grupo foi utilizado como controle positivo, recebendo gamagloblulina humana (GGH). A sangria foi realizada sete dias após a imunização e a produção de anticorpos foi avaliada por ELISA. Os valores obtidos para os tratamentos com o polipeptídeo recombinante de SEQ ID NO: 3 e polipeptídeo P6 foram significativamente distintos (teste paramétrico t de Student - p<0,001) daqueles obtidos com os animais imunizados com GGH.

Exemplo 10: Análise da atividade imunossupressora.

[00191] Para avaliar a atividade imunossupressora do polipeptídeo recombinante, grupos de camundongos da linhagem HIII (6 animais/grupo) foram inoculados ou não com 50 μg do polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 3), pela via intraperitoneal, 72 h antes da imunização com eritrócitos de carneiro (ES) na concentração de 1x108 células/animal (intervalo no qual o efeito imunossupressor foi mais intenso). Um grupo não tratado foi utilizado como controle positivo, recebendo apenas ES. Amostras de 50 μL de ES (2% v/v) foram incubadas com 50 μL dos soros dos animais imunizados (diluídos em série) em placas de 96 poços de fundo em U por 8 h à temperatura ambiente. Como controle negativo da reação, ES foram incubados com PBS. Os títulos de anticorpos foram aqueles cujas maiores diluições dos soros promoveram aglutinação dos eritrócitos. Os dados são representativos de três experimentos independentes. A significância entre os diferentes grupos foi de p<0,01 (Figura 16).

[00192] Os soros dos animais tratados apenas uma vez ou não tratados com o polipeptídeo recombinante imunossupressor, foram utilizados para avaliação da resposta de anticorpos. A Figura 16 demonstra claramente que os soros dos animais previamente inoculados com o polipeptídeo recombinante, assim como os do controle negativo, foram incapazes de promover hemaglutinação, diferentemente dos soros dos animais não tratados e inoculados com ES, que apresentaram alta capacidade hemaglutinante, comprovando assim a atividade imunossupressora dos polipeptídeos recombinantes da presente invenção.

[00193] A atividade imunossupressora do polipeptídeo recombinante também foi testada para antígenos solúveis. Grupos de camundongos da linhagem HIII (6 animais/grupo) foram tratados, via intraperitoneal, com 50 μg do polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 3) e após 0, 24 ou 72 h, imunizados, via intraperitoneal, com gamagloblulina humana (GGH) adsorvida em Al(OH)3 (10 μg/animal); o grupo não tratado foi utilizado como controle positivo, recebendo apenas GGH. Os títulos foram determinados por ELISA e calculados considerando-se a maior diluição dos soros experimentais cujas D.O. (densidade óptica) foram cinco vezes superiores às obtidas para o soro normal na mesma diluição. A significância entre os diferentes grupos foi p<0,05 (Figura 17).

[00194] Os resultados obtidos mostram que a supressão da produção de anticorpos anti-GGH foi induzida de forma profilática e antígeno-específica, até 24 h após o tratamento com os polipeptídeo recombinantes purificados (Figura 17).

[00195] Os fragmentos polipeptídicos sintetizados quimicamente também foram testados quanto à possível ação imunossupressora.

[00196] A avaliação da atividade imunossupressora foi testada utilizando- se camundongos da linhagem HIII (6 animais/grupo) inoculados com o polipeptídeo denominado P6 (SEQ ID NO: 9; 3 μg/animal) ou com o polipeptídeo recombinante de SEQ ID NO: 3 (50 μg/animal) e, após 24 h, inoculados pela via intradérmica com a gamagloblulina humana (GGH) em Al(OH)3. A Figura 18 demonstra a inibição da produção de anticorpos anti- GGH promovida pelo P6, assim como observado para o polipeptídeo recombinante (SEQ ID NO: 3).

[00197] A atividade imunossupressora dos polipeptídeos sintéticos, P2 (SEQ ID NO: 5) e P6 (SEQ ID NO: 9), foi avaliada frente a GGH, levando em consideração o tempo de imunossupressão após o tratamento preventivo e inoculação do antígeno. Em todos os protocolos, os animais receberam uma dose única dos polipeptídeos testados. Neste experimento, camundongos da linhagem HIII (5 animais/grupo) foram tratados, pela via intraperitoneal, com 3 μg de P6 ou 3 μg de P2 e, 24 h após, imunizados, pela via intraperitoneal, com GGH adsorvida em Al(OH)3 (10 μg/animal); o grupo não tratado foi utilizado como controle positivo, recebendo apenas GGH. Outro controle positivo foi de um grupo que recebeu uma dose de 3 μg do polipeptídeo cuja sequência, “NH2-SerAnsGlnAspLeuIleAnsValGlnSerArgArgArgAsp - COOH” (SEQ ID NO: 22), não representa os polipeptídeos reivindicados nesta invenção, e, 24 h após, foram imunizados, pela via intraperitoneal, com GGH adsorvida em Al(OH)3 (10 μg/animal). O controle negativo foi representado pelo grupo denominado soro normal, isto é, soro de animais não tratados e não imunizados. Os valores de D.O. obtidos na diluição de 1:500 foram aqui apresentados como média + desvio padrão e foram analisados estatisticamente pelo teste t de Student. Foram considerados significativos os valores quando p<0,0001 (***); p<0,005 (**); p<0,05 (*) em relação ao controle positivo, ou seja, animais apenas imunizados com GGH. Assim os grupos de camundongos HIII receberam os polipeptídeos SEQ ID NO: 22, P2 e P6. Os resultados obtidos mostram que após 7, 13 e 36 dias a supressão da produção de anticorpos anti- GGH foi induzida após o tratamento com o P2 e P6 (Figura 19).

Claims (11)

1. Cassete de expressão caracterizado pelo fato de compreender um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 1 ou degenerados do mesmo que codificam um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é conforme estabelecida nas SEQ ID NO: 2 a 15, operacionalmente ligado a um promotor heterólogo e a um terminador de transcrição.

2. Vetor de expressão caracterizado pelo fato de compreender um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos como apresentada na SEQ ID NO: 1 ou degenerados do mesmo que codificam um polipeptídeo cuja sequência de aminoácidos é conforme estabelecida nas SEQ ID NO: 2 a 15, ligado a um promotor heterólogo ou um cassete de expressão como definido na reivindicação 1.

3. Célula hospedeira microbiana caracterizada pelo fato de compreender um cassete de expressão como definido na reivindicação 1, ou um vetor de expressão como definido na reivindicação 2.

4. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 3; e (c) um polipeptídeo compreendendo qualquer uma das sequências apresentada na SEQ ID Nos: 4 a 15, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitável, exceto água.

5. Uso de um polipeptídeo, ou os seus sais farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para prevenção ou tratamento de condições que necessitam de imunossupressão, em que o polipeptídeo é selecionado do grupo que consiste de: (a) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo compreendendo a sequência de aminoácido como apresentada na SEQ ID NO: 3; e (c) um polipeptídeo compreendendo qualquer uma das sequências apresentada na SEQ ID Nos: 4 a 15.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as condições que necessitam de imunossupressão são selecionadas do grupo que consiste de doenças inflamatórias, autoimunes, alérgicas, infecciosas e rejeição a órgãos transplantados.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as doenças inflamatórias são selecionadas do grupo consistindo de doenças inflamatórias idiopáticas, crônicas e agudas.

8. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as doenças autoimunes são selecionadas do grupo consistindo de artrite reumatoide crônica, artrite reumatoide juvenil, lúpus eritematoso sistêmico, esclerodermia, doença de Crohn, doença mista do tecido conjuntivo, dermatomiosite, síndrome de Sjogren, doença de Bechet, esclerose múltipla, mixedema primário, doença de Hashimoto, psoríase, anemia perniciosa, trombocitopenia púrpura idiopática, vasculite, trombocitopenia induzida por heparina, uveíte, anemia hemolítica, púrpura trombocitopênica, pênfigo vulgar, vasculite causada por anticorpos citoplasmáticos antineutrófilos, síndrome de Goodpasture, febre reumática aguda, miastenia gravis, hipertireoidismo, diabetes insulino resistente, anemia perniciosa, poliarterite nodosa, glomerulonefrite pós- estreptocócica, doença do soro e sepse.

9. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que as doenças alérgicas são selecionadas do grupo consistindo de dermatite atópica, asma, bronquite, rinite, febre do feno, urticária, angioedema, dermatite de contato, gastroênteropatia alérgica, anafilaxia, anemia hemolítica ou doença hemolítica do recém-nascido, sinusite, febre reumática pneumonite hipersensível, glomerulonefrite espreptocócica e alveolite alérgica.

10. Método para produzir um polipeptídeo com atividade imunossupressora caracterizado pelo fato de que compreende: (a) fornecer uma célula hospedeira como definida na reivindicação 3; (b) cultivar dita célula em condições conducentes para a produção do polipeptídeo; e (c) isolar dito polipeptídeo de dita célula ou do meio de cultura circundando dita célula.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que dito polipeptídeo é fornecido com uma etiqueta.

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