BR102013026620B1 - processo de separação do glicomacropeptídeo do soro de leite por adsorção em hidroxiapatita - Google Patents

Abstract

processo de separagao do glicomacropeptideo do soro de leite por adsorgéo em hidroxiapatita. a presente invengéo apresenta um novo método para separagzéo do glicomacropeptideo (gmp) presente no soro de leite, por cromatografia de adsorgéo em leito expandido utilizando hidroxiapatita (ca5(po4)3oh) como adsorvente. devido a sua alta afinidade por proteinas, a hidroxiapatita pode ser empregada como adsorvente de baixo custo e néo téxico para separagao e purificação destas biomoléculas. a principal vantagem da utilizagéo da adsorgéo em leito expandido, sobre a adsorgéo em leito fixo, é que a coluna pode ser alimentada com solugéo contetendo material particulado, por ser um sistema de porosidade global mais elevada.

Description

PROCESSO DE SEPARAÇÃO DO GLICOMACROPEPTÍDEO DO SORO DE LEITE POR ADSORÇÃO EM HIDROXIAPATITA

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção, objeto de pedido de patente na área de processos de separação de biomoléculas, trata de um processo para separação da proteína glicomacropeptídeo (GMP) presente no soro de leite, utilizando coluna cromatográfica de hidroxiapatita. Esta invenção poderá ser utilizada principalmente pelas indústrias de laticínios para recuperar o GMP presente no soro de leite.

ESTADO DA TÉCNICA

O soro de leite é o subproduto mais abundante da indústria de laticínios e é rico em proteínas que desempenham várias propriedades valiosas quer em termos de atividade biológica ou da funcionalidade tecnológica.

A necessidade do desenvolvimento de técnicas de separação para o reaproveitamento das proteínas do soro de leite é reforçada ao considerar o crescimento da indústria de laticínios, com consequente aumento do volume de soro produzido, tanto no Brasil quanto no mundo, aliado à preocupação com a poluição do meio ambiente.

A quantidade de soro gerado depende do tipo de queijo produzido e do processo de produção. Na produção de 1 kg de queijo são utilizados aproximadamente 10 litros de leite e, dependendo do tanto de água, há uma produção de soro que varia de 9 a 12 litros. A produção de soro de leite aumentou acentuadamente nas últimas décadas, juntamente com a produção de queijo, sendo estimada na ordem dos 160 milhões de toneladas por ano.

O soro de leite, quando lançado em cursos d’água, apresenta potencial poluidor aproximadamente 100 vezes maior que o do esgoto doméstico. Cada vez mais, portanto, a legislação ambiental exige das indústrias de laticínios um plano de tratamento ou reaproveitamento deste subproduto.

Devido à abundância deste bioproduto, com o foco em sustentabilidade, as indústrias procuram uma forma atrativa economicamente de reaproveitá-lo. As

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indústrias de alimentos tem grande interesse econômico no reaproveitamento do soro por ser uma fonte de proteínas que oferecem diversos benefícios tecnológicos e funcionais. Apesar da literatura apresentar estudos sobre a separação de proteínas de soro, é constante a busca por processos alternativos e de custo mais baixo para separação e purificação das mesmas.

As principais proteínas do soro são: a-lactalbumina, β-lactoglobulina, imunoglobulina e glicomacropeptideo (GMP). O GMP, encontrado no soro doce, é um componente biologicamente ativo liberado a partir da κ-caseína pela ação da quimosina no elo peptídico Phe105-Met106, durante a fabricação do queijo. O GMP está presente no soro em concentrações de 1,2 a 1,5 g L‘¹. Devido às suas funções biológicas, aplicações tecnológicas e valores nutricionais, grande atenção tem sido dada às técnicas de isolamento e purificação desse peptideo, sendo considerado um ingrediente potencial para o desenvolvimento de alimentos funcionais. Como o GMP não contém aminoácidos aromáticos, também pode ser utilizado em alimentos para o tratamento da fenilcetonúria, pois o GMP é uma das únicas proteínas naturais livres deste aminoácido. Entre as atividades biológicas e fisiológicas potenciais relacionadas ao GMP têm-se: contribuir para reduzir desordens estomacais ao possibilitar a regulação de respostas imunológicas bem como prevenir a azia por levar à diminuição da secreção gástrica; minorar o risco de ataques cardíacos ao induzir à inibição da agregação de plaquetas; diminuir o apetite ao estimular a liberação de colecistoquina, um hormônio que promove a sensação de saciedade; inibir a adesão de microrganismos em polímeros, sugerindo o uso do GMP como inibidor de placas bacterianas e de cáries dentárias.

O desenvolvimento de novos produtos, com benefícios adicionais à saúde, é o grande objetivo da indústria de alimentos atualmente. As características do GMP permitem não somente aplicações medicinais e dietéticas, mas também que seja utilizado como um potencial agente estruturante de alimentos, desde que a estrutura glicosídica sugere propriedades emulsificantes e de formação de espuma.

Assim, muito esforço tem sido dedicado ao desenvolvimento de novos processos de produção de GMP em larga escala, e que sejam capazes de manter

3/9 as propriedades nutricionais e biológicas desta biomolécula. As resinas de troca iônica utilizadas na cromatografia de adsorção e a ultrafiltração são os principais métodos para se obter o GMP do soro de leite.

As operações de adsorção são utilizadas em muitos processos industriais, incluindo o fracionamento das misturas complexas de proteínas. Os processos cromatográficos se destacam devido à sua eficiência na separação e ao seu elevado poder de resolução que levaram ao aumento do seu emprego em larga escala e principalmente por não ocorrer desnaturação dos biocompostos. Dentre as diferentes técnicas cromatográficas, a cromatografia de troca iônica e a cromatografia de exclusão molecular são os processos de separação e purificação de proteínas mais comumente empregados. No entanto, os procedimentos atuais têm como limitante o alto custo das resinas e o alto custo da operação da cromatografia posto que o material alimentado contém diversos componentes além das proteínas alvo o que reduz o tempo de vida útil das colunas pela contaminação paralela.

As membranas de ultrafiltração, designadas para diafiltração e concentração, também são muito utilizadas em escala industrial. No entanto, o processo requer uma extensiva quantidade de água para separar efetivamente as moléculas. A recuperação do produto é dependente do volume de tampão usado, dispondo de grande quantidade deste. A pureza do produto também pode ser comprometida em partes porque a ultrafiltração falha ao distinguir moléculas com tamanhos hidrodinâmicos similares.

O atual pedido diferencia-se de outros pedidos de patentes já encontrados por usar a hidroxiapatita como adsorvente alternativo aos adsorventes tradicionais utilizados nas colunas cromatográficas. Também é um processo que utiliza coluna de leito expandido, diferentemente dos outros processos já citados que utilizam colunas de leito fixo.

São várias as vantagens apresentadas pelo presente pedido de patente. Os valores da quantidade adsorvida são maiores que os encontrados para resinas de troca iônica comerciais. Além disso, no processo proposto, a proteína é separada com a utilização de uma única resina, ao contrário de outras patentes que utilizam mais de uma resina de troca iônica em série. Na maioria das

4/9 patentes encontradas são necessárias mais de uma etapa cromatográfica para separação da proteína usando diferentes resinas. Outras vantagens são que a hidroxiapatita é mais barata que a grande maioria das resinas comerciais e pode ser facilmente sintetizada por reações de precipitação em via úmida.

A hidroxiapatita é um constituinte mineral natural encontrado nos ossos e nos dentes, de fórmula molecular Ο3₅(ΡΟ₄)₃ΟΗ. Devido a sua alta afinidade por proteínas, a hidroxiapatita pode ser empregada como adsorvente para separação e purificação destas biomoléculas. É um adsorvente de baixo custo, não tóxico e que pode ser preparado em laboratório através de simples operações. O mecanismo de ação pode ser por troca catiônica que ocorre entre amino grupos e as cargas negativamente carregadas de fosfato. Os amino grupos são similarmente repelidos pelos sítios de cálcio. A ligação depende dos efeitos combinados destas interações. Estas interações iônicas podem ser desfeitas pela adição de sais neutros como NaCI ou espécies tamponantes como fosfato na fase móvel. A troca aniônica, que ocorre das interações de resíduos carregados negativamente na superfície da proteína com os grupos cálcio, oferece uma contribuição menos significante.

Em outros estudos, a hidroxiapatita tem demonstrado ter alta performance e características necessárias para efetivo aumento de escala na indústria. Já é relatada a separação de proteínas do soro em geral, como alfa-lactalbumina e beta-lactoglobulina, no entanto a aplicação da coluna de hidroxiapatita para separação específica do GMP é inédita. A alta pureza obtida em uma simples etapa faz desta técnica altamente atrativa quando comparada a outras metodologias já publicadas na área.

O processo, objeto de pedido de patente, é conduzido em coluna de leito expandido, que oferece outras vantagens em relação ao leito fixo que é comumente relatado em outras patentes. Uma desvantagem da adsorção em leito fixo, geralmente utilizado para purificação de proteínas, é que a fase móvel (fluido contendo os solutos de interesse) deverá estar livre de qualquer material particulado antes de percolar o leito de adsorção, para que não haja obstrução do meio poroso da coluna cromatográfica. A principal vantagem da utilização da adsorção em leito expandido, sobre a adsorção em leito fixo, é que a coluna pode

5/9 ser alimentada com solução contendo material particulado, por ser um sistema de porosidade global mais elevada. Assim, as proteínas podem estar presentes em meio liquido contendo partículas sólidas em suspensão (fragmentos de células) ou em meio líquido complexo, como é o caso do soro de leite. Dessa forma, temse redução de uma operação unitária preliminar para separação dos contaminantes particulados, tais como a filtração, a centrifugação ou a sedimentação dos materiais particulados, que geralmente elevam os custos operacionais do processo e ainda podem causar perdas na quantidade de proteínas a ser purificada.

Existem outras patentes para o fracionamento do GMP. Um processo de purificação de GMP foi proposto no documento de patente WO 1998014071. O processo consiste do uso de uma resina de troca iônica. Em pH 5,1, a eluição foi de 91% de GMP. No entanto essa invenção utiliza uma coluna de leito fixo e apresenta custo mais alto que a coluna de hidroxiapatita.

O documento de patente US 5968586 apresenta um processo para produzir GMP com propriedades nutracêuticas usando dois trocadores aniônicos de polaridades opostas em série. Sendo assim, duas resinas seriam necessárias para completa purificação o que eleva o custo total do processo. O documento de patente US 6168823 se baseia na cromatografia de afinidade, imobilizando a proteína em ânions metálicos. No entanto, é bem conhecido que a cromatografia de afinidade apresenta um alto custo.

Doultani e colaboradores (DOULTANI, S.; TURHAN, K.N.; ETZEL, M.R. Whey protein isolate and glycomacropeptide recovery from whey using ion exchange chromatography. Journal of Food Science, v.68, n.4, p. 1389-1395, 2003) também demonstraram o uso de dois trocadores aniônicos simultâneos para recuperação de GMP de isolado proteíco de soro. Para purificar o GMP de uma solução de caseinato hidrolisado por quimosina, Nakano e Ozimek (NAKANO, T.; OZIMEK, L. Purification of glycomacropeptide from caseinate hydrolysate by gel chromatography and treatment with acidic solution. Journal of Food Science, v.65, n.4, p.588-590, 2000.) usaram um processo envolvendo a) cromatografia de exclusão molecular com Sephacryl S-200 em pH 7,0; b) adição de solução ácida, pH 3,5 para precipitar proteínas contaminantes e c)

6/9 cromatografia usando coluna Sephacryl S-200 em pH 3,5. Tolkach e Kulozik (TOLKACH, A.; KULOZIK, U. Fractionation of whey proteins and caseinomacropeptide by means of enzymatic crosslinking and membrane separation techniques. Journal of Food Engineering, v.67, p. 13-20, 2005.) incluíram um pré-tratamento de concentrado proteico de soro com a enzima tranglutaminase seguida por microfiltração. Assim seriam necessários o uso de enzima que provavelmente dificulte a implementação deste processo em larga escala além do uso da membrana de microfiltração.

A presente invenção, objeto de pedido de patente, refere-se a um processo de separação do glicomacropeptídeo do soro de leite utilizando hidroxiapatita. O processo é realizado envolvendo as etapas de passagem do soro do leite sobre uma coluna de adsorção de leito expandido empacotada com hidroxiapatita e eluição da fração retida por uma solução aquosa salgada. O objetivo neste caso é obter uma fração proteica rica em glicomacropeptídeo.

A hidroxiapatita oferece um custo de produção mais baixo do que o dos adsorventes comerciais tradicionalmente empregados na cromatografia.

A separação do GMP a partir do soro de leite aplicando uma coluna de adsorção em hidroxiapatita é inovadora e terá impacto positivo como um método alternativo, de baixo custo, que pode ser aplicado em escala contínua, de fácil aumento de escala e com obtenção de frações proteicas com grau de pureza elevado, pois a maioria dos processos de separação destas proteínas geram frações com níveis de pureza baixos e são de difícil aumento de escala.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A presente invenção é ilustrada por meio de Figuras, nas quais:

As Figuras 1A e 1B ilustram a curva de ruptura de GMP puro, na concentração inicial de 10 mg mL'¹, em hidroxiapatita, representada como Absorvância x tempo (Figura 1 A) e como C/Co x tempo (Figura 1B).

Figura 1A: Curva de ruptura do GMP em hidroxiapatita (Co=1O mg mL'¹, pH 6,0, 25 °C). A linha sólida representa a absorvância UV a 210 nm.

Figura 1B: Curva de ruptura do GMP em hidroxiapatita (Co=1O mg mL'¹, pH 6,0, 25 °C).

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A Figura 2 mostra um cromatograma do eluente oriundo da etapa de dessorção das proteínas, representada como Absorvância x tempo e como Condutividade x tempo. A linha sólida representa a absorvância UV a 210 nm. A linha tracejada representa a condutividade (mS/cm).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

O presente pedido de patente relata um processo para recuperar o glicomacropeptídeo presente no soro de leite.

Uma coluna cromatográfica de vidro é empacotada com hidroxiapatita, preferencialmente de 80 pm de diâmetro, e conectada a um cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC) com detector UV na saída, para a identificação das proteínas eluídas do sistema. O material da coluna permite a inspecção visual do leito além conferir resistência química. A coluna é dotada de pistão móvel na parte superior permitindo os ajustes da altura do leito expandido. Em um primeiro momento, a coluna é equilibrada com a fase móvel tampão fosfato, 0,03 mol L'¹, pH 6,0 (tampão A), em temperatura ambiente (25 ±2°C), numa vazão entre 0,5 e 3,0 mL min'¹.

Em seguida, para a condução do método de adsorção, a mesma fase móvel (tampão A) contendo ainda NaCI 0,06 mol L‘¹ e o isolado proteico de soro (WPI, com no mínimo 95% pureza), numa concentração entre 2 e 4% m/v, é bombeada em fluxo ascendente para a coluna até a obtenção das curvas de rupturas, sendo que a absorbância é registrada na faixa de UV (205 a 280 nm). Após a saturação, é realizada a limpeza do leito com a fase móvel inicial (tampão A) para retirada das proteínas não adsorvidas presentes no sistema. Posteriormente, o escoamento é interrompido para sedimentação do leito.

A dessorção é alcançada pela introdução de um gradiente crescente de concentração salina. O fluxo pela coluna é invertido e a eluição das proteínas é efetuada de modo descendente usando-se tampão fosfato, 0,03 mol L*¹, contendo 1,0 mol L’¹ de NaCI, pH 8,0 (tampão B) numa vazão entre 1 e 2 mL miri¹ em gradiente linear crescente (0, 70 e 100%).

Após a eluição, são registrados três picos. Nos dois primeiros são quantificados em maior quantidade β-lactoglobulina e a-lactalbumina. O GMP está

8/9 presente em maior quantidade no terceiro pico coletado. A terceira fração proteica obtida, rica em GMP, pode ser dessalinizada pela injeção diretamente em uma coluna de exclusão molecular. As frações devem ser coletadas após cada injeção em um coletor de frações. As frações contendo a proteína devem ser congeladas e então liofilizadas.

EXPERIMENTO DE DEMONSTRAÇÃO

Em experimentos conduzidos no Departamento de Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de Viçosa observou-se a eficiência dos processos de adsorção da hidroxiapatita por meio da obtenção de isotermas de adsorção do GMP sob diferentes condições de pH, temperatura e concentração salina. Após obtenção das melhores condições de pH, temperatura e concentração de NaCl para adsorção de GMP foi realizado o experimento de adsorção em coluna.

Uma coluna de vidro de 20 cm de altura e 1,6 cm de diâmetro interno e dotada de pistão móvel na parte superior foi empacotada com hidroxiapatita (tamanho de partícula de 80 pm) e conectada a um cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC) com detector UV na saída. Logo após, a coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de tampão fosfato, 0,03 mol L'¹, pH 6,0 (tampão A), numa vazão de 3,0 mL.min’¹.

Em seguida, para a condução do método de adsorção, a mesma fase móvel (tampão A) contendo ainda NaCl 0,06 mol L*¹ e o isolado proteico de soro (WPI, com no mínimo 95% pureza), numa concentração entre 2 e 4% m/v, foi bombeada em fluxo ascendente para a coluna até a obtenção das curvas de rupturas (Figuras 1A e 1B), sendo que a absorbância foi registrada na faixa de UV.

Após a saturação, foi realizada a limpeza do leito com o tampão A, numa quantidade igual a 4 volumes de coluna. Posteriormente, o escoamento foi interrompido para sedimentação do leito.

O fluxo pela coluna foi invertido e a eluição das proteínas efetuada de modo descendente usando-se tampão fosfato, 0,03 mol L'¹, contendo 1,0 mol L'¹

9/9 de NaCI, pH 8,0 (tampão B) numa vazão de 2 ml_ min'¹ em gradiente linear crescente (0, 70 e 100%).

Após a eluição, foram registrados três picos (Figura 2). O GMP está presente em maior quantidade no terceiro pico coletado.

A terceira fração proteica obtida, rica em glicomacropeptídeo, poderá ser dessalinizada pela injeção diretamente em uma coluna de exclusão molecular utilizando água como a fase móvel.

Assim, a presente proposta permite o enriquecimento da glicomacropeptídeo a partir de isolado proteico de soro de leite utilizando um 10 material adsorvente de custo mais baixo que resinas adsorventes comerciais comumente empregadas em cromatografia.

Claims (9)

1. PROCESSO DE SEPARAÇÃO DO GLICOMACROPEPTÍDEO caracterizado por separar a proteína glicomacropeptídeo presente no soro de leite por meio de cromatografia líquida de alta eficiência utilizando coluna cromatográfica empacotada com hidroxiapatita.

2. PROCESSO DE SEPARAÇÃO DO GLICOMACROPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela coluna cromatográfica ser de vidro e ser de leito expandido, com pistão móvel na sua parte superior.

3 PROCESSO DE SEPARAÇÃO DO GLICOMACROPEPTÍDEO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo cromatógrafo possuir detector de absorção ultra-violeta, na faixa de 205 a 280nm, na saída.

4. PROCESSO DE SEPARAÇÃO DO GLICOMACROPEPTÍDEO DO SORO DE LEITE, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar a hidroxiapatita, preferencialmente de 80pm de diâmetro, como material adsorvente do glicomacropeptídeo.

5. PROCESSO DE SEPARAÇÃO DO GLICOMACROPEPTÍDEO DO SORO DE LEITE de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender as etapas de equilíbrio da coluna, adsorção da proteína e eluição da proteína.

6. PROCESSO DE SEPARAÇÃO DO GLICOMACROPEPTÍDEO DO SORO DE LEITE, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela etapa de equilíbrio da coluna compreender:

a. Bombeamento da fase móvel (tampão fosfato, 0,03 mol L'¹, pH 6,0) para a coluna cromatográfica, em temperatura ambiente (25 ±2°C), numa vazão entre 0,5 e 3,0 mL min'¹, em fluxo ascendente.

7. PROCESSO DE SEPARAÇÃO DO GLICOMACROPEPTÍDEO DO SORO DE LEITE, de acordo com a reivindicação 5 e 6, caracterizado pela etapa de adsorção da proteína compreender:

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a. Preparo da fase móvel: tampão fosfato, 0,03 mol L'¹, pH 6,0, contendo cloreto de cálcio (NaCI) 0,06 mol.L’¹ e o isolado proteico de soro, com mínimo de 95% pureza e concentração entre 2 e 4% m/v;

b. Bombeamento da fase móvel em fluxo ascendente para a coluna 5 cromatográfica até a obtenção das curvas de rupturas, sendo a absorbância registrada na faixa de UV (205 a 280 nm);

c. Limpeza do leito com a fase móvel definida na reivindicação 6 (tampão fosfato, 0,03 mol L'¹, pH 6,0), após a saturação da coluna;

d. Interrupção do escoamento para sedimentação do leito.

10 8. PROCESSO DE SEPARAÇÃO DO GLICOMACROPEPTÍDEO DO SORO DE LEITE, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pela etapa de eluição compreender:

a. Bombeamento da fase móvel, tampão fosfato, 0,03 mol L’¹, contendo cloreto de sódio (NaCI) 1,0 mol L’¹, pH 8,0, numa vazão entre 1 e 2 mL miri¹ em

15 gradiente linear crescente (0, 70 e 100%) e em fluxo descendente;

b. Coleta da fração proteica rica em glicomacropeptídeo após cada injeção.