BR102013001892B1 - Peptídeo sintético antimicrobiano e uso - Google Patents
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Abstract
peptídeo sintético antimicrobiano e uso. a presente invenção, objeto de pedido de patente, trata-se de um peptídeo sintético antimicrobiano inédito produzido por meio de sintetizador automático de peptídeos, empregando a estratégia de síntese denominada "fmoc". tal produto tem aplicação na área de microbiologia, uma vez que inibe o crescimento de bactérias das seguintes espécies: staphylococcus aureus, escherichia coli, salmonella choleraesuis e listeria innocua. pode ser utilizado para prevenção da proliferação de doenças causadas pelas bactérias citadas acima, podendo ser utilizado pela indústria farmacêutica e áreas afins, para o controle e combte de doenças infecciosas. pode ainda ser utilizado pela indústria de alimentos, como aditivo conservante de produtos alimentícios, no controle do crescimento e/ou inibição dessas bactérias, visando garantir segurança microbiológica aos consumidores e extensão da vida de prateleira desses produtos, uma vez que tais bactérias são amplamente reconhecidas como micro-organismos patogênicos, causadores de intoxicações e infecções alimentares.
Description
A presente invenção, objeto de pedido de patente, consiste em um produto de inibição do crescimento das bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella Choleraesuis e Listeria innocua e a consequente prevenção da proliferação de doenças causadas por tais bactérias, inclusive aquelas veiculadas por alimentos contaminados, resultando em maior segurança microbiológica geral e alimentar. O peptídeo sintético antimicrobiano pode ser utilizado pela indústria farmacêutica e áreas afins, para o controle e combate de doenças infecciosas, causadas pelas bactérias citadas acima. Essa invenção pode, ainda, ser utilizada pela indústria de alimentos, como aditivo conservante de produtos alimentícios, no controle do crescimento e/ou inibição dessas bactérias, visando garantir segurança microbiológica aos consumidores e extensão da vida de prateleira desses produtos, uma vez que tais bactérias são amplamente reconhecidas como micro-organismos patogênicos, causadores de intoxicações e infecções alimentares.
Micro-organismos patogênicos são facilmente encontrados no solo, água, ar e em alimentos, sendo, portanto, uma ameaça constante à saúde da população. Assim, a utilização de compostos antimicrobianos para o controle desses agentes causadores de doenças é uma ferramenta fundamental na garantia de saúde e qualidade de vida.
Muitos destes compostos antimicrobianos têm sido utilizados na prevenção de doenças causadas por micro-organismos patogênicos, por exemplo, os antibióticos e as bacteriocinas (peptídeos antimicrobianos sintetizados por bactérias). Além das bacteriocinas, peptídeos provenientes de outras fontes (fungos, insetos, anfíbios, vertebrados e até mamíferos) têm demostrado grande atividade antimicrobiana.
Mais recentemente, têm sido realizados estudos com o objetivo de se desenvolver peptídeos antimicrobianos sintéticos, uma vez que estes têm demostrado grande efeito inibitório contra várias espécies bacterianas.
A eficiência desses peptídeos têm sido demostrada em estudos científicos. P. APPENDINI e J. H. HOTCHKISS (Antimicrobial activity of a 14- residue peptide against Echerichia coli O157:H7. Journal of Applied Microbiology, v. 87, p. 750-756, no ano de 1999) avaliaram os efeitos inibitórios de um peptídeo antimicrobiano sintético, contendo 14 resíduos de aminoácidos, sobre o crescimento de culturas puras de E. coli O157:H7. Esse peptídeo apresentou atividade bactericida contra E. coli O157:H7 suspendidas em tampão em concentrações de apenas 3 μg*mL‘1, e em concentrações de 25 μg»mL'1 a redução na contagem microbiológica chegou a 7 ciclos log.
Por meio de buscas de anterioridades em bancos nacional e internacionais de patentes, foram encontrados alguns documentos que serão apresentados a seguir a título de exemplificação e diferenciação.
O pedido de patente PI0100379-8 trata-se de um peptídeo sintético antimicrobiano de uso terapêutico contra infecções causadas por bactérias gram-negativas do gênero Neisseria, sendo sua atividade bactericida comprovada por métodos bioquímicos e celulares. No caso desse pedido, o peptídeo sintético antimicrobiano foi testado apenas no combate a infecções causadas por bactérias gram-negativas do gênero Neisseria, enquanto que o peptídeo sintético do presente pedido de patente é efetivo no controle de bactérias gram-negativas e gram-positivas de quatro gêneros, a saber: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella Choleraesuis, e Listeria innocua.
O pedido de patente PI9407770-3 discorre sobre a invenção de peptídeos antimicrobianos sintéticos de elevado peso molecular que possuem atividade contra fungos e bactérias. Segundo seus inventores, esses compostos poderiam ser utilizados nas áreas medicinais, alimentares e de higiene oral. Essa patente trata-se de peptídeos sintéticos antimicrobianos de elevado peso molecular, diferentemente do atual pedido de patente, que se trata se um peptídeo de cadeia extremamente curta e por isso, baixo peso molecular, consequentemente de produção mais simples e menor custo.
O documento de patente US7071293 relata o desenvolvimento de peptídeos antimicrobianos sintéticos derivados da proteína SMAP 29 com efeito bactericida. Tal patente americana relata o desenvolvimento de peptídeos derivados de uma proteína, diferentemente do presente pedido de patente, cujo peptídeo sintético antimicrobiano não tem nenhum composto de origem, isto é, não é derivado de nenhum outro composto natural. Sendo assim, não necessita de nenhuma “fonte” do qual se origina, podendo ser produzido sinteticamente.
A patente US7674771 reporta o desenvolvimento de peptídeos antimicrobianos sintéticos derivados da Laminina. Esses peptídeos possuem até 100 resíduos de aminoácidos e representam efeito antimicrobiano contra pelo menos uma espécie bacteriana e uma espécie fúngica. Já o presente pedido de patente relata o desenvolvimento de um peptídeo sintético antimicrobiano específico para quatro bactérias patogênicas de grande preocupação para a saúde da população em geral, uma vez que tais bactérias são causadoras de casos e surtos de intoxicação e infecção.
O documento de patente CZ20090000083 trata-se do desenvolvimento de peptídeos antimicrobianos sintéticos com fórmulas similares a peptídeos isolados de fontes naturais. Os inventores ressaltam que tais peptídeos poderiam ser utilizados no tratamento de doenças causadas por micro- organismos e até mesmo para o tratamento de câncer. Esse pedido de patente refere-se a peptídeos sintéticos antimicrobianos similares a peptídeos naturais, com possível utilização no tratamento de câncer, enquanto que o peptídeo sintético antimicrobiano do presente pedido de patente não deriva de nenhum composto natural e tem aplicação contra bactérias encontradas em alimentos.
O documento de patente JP03323226 refere-se ao desenvolvimento de peptídeos antimicrobianos sintéticos de curta cadeia polimérica, mas com elevada eficiência antimicrobiana, podendo ser utilizados como aditivo em produtos alimentícios, com o objetivo de inibir o crescimento de bactérias e assim garantir alimentos seguros sob ponto de vista microbiológico. O pedido de patente citado acima, diferentemente da presente invenção, trata-se de peptídeos cujas sequências de aminoácidos são distintas da sequência do presente pedido de patente, e além disso, não possui o grupamento carboxila terminal (-COOH) convertido em amida terminal (-CONH2). A formação desta amida terminal aumenta a carga positiva dos peptídeos devido à eliminação do grupo carboxílico negativamente carregado e, portanto, reduz a repulsão eletrostática entre os peptídeos e os fosfolipídeos, também negativamente carregados, presentes na membrana celular bacteriana. Além disso, oferece uma proteção adicional contra enzimas (caboxipeptidases), com consequente aumento dó tempo de vida útil destes peptídeos.
O documento de patente JP8134096 trata-se do desenvolvimento de peptídeos antimicrobianos sintéticos contendo apenas nove resíduos de aminoácidos, mas com elevada eficácia antimicrobiana, e que pode ser obtido de forma relativamente simples, sob ponto de vista de síntese e com custo relativamente baixo. Deve-se salientar, entretanto, que esta patente japonesa, embora se trate de um peptídeo antimicrobiano, tem como função principal inibir o crescimento de certos micro-organismos, destacando-se algumas espécies de fungos, enquanto que o peptídeo sintético antimicrobiano do presente pedido de patente, diferentemente da patente japonesa citada acima, tem como objetivo inibir o crescimento de bactérias patogênicas específicas, a saber, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella Choleraesuis e Listeria innocua. Essas bactérias são reconhecidas como micro-organismos causadores de intoxicações e infecções, sendo amplamente encontradas em alimentos, e por isso, representam grande ameaça à saúde da população em geral. Além disso, tal patente japonesa trata-se de peptídeos sintéticos antimicrobianos de nove resíduos de aminoácidos, ou seja, maior quantidade de resíduos que o peptídeo desenvolvido no presente pedido de patente. Como para produção é necessário uma etapa na reação para cada aminoácido, o peptídeo do presente pedido é mais simples de ser produzido e consequentemente menor custo. Além disso, pode ser utilizado para controle de bactérias contaminantes de produtos alimentícios.
Compostos antimicrobianos inéditos representam um atrativo para indústrias relacionadas à microbiologia geral, e mais especificamente à microbiologia de alimentos, uma vez que além de possuírem elevada eficácia antimicrobiana, representam uma interessante alternativa à crescente resistência de micro-organismos aos compostos antimicrobianos convecionais.
Diante disso, objetivou-se com este trabalho desenvolver um peptídeo sintético de elevado efeito antimicrobiano que fosse eficaz no combate a bactérias deterioradoras e patogênicas encontradas em produtos alimentícios, como forma alternativa de controle microbiológico, uma vez que tem havido crescente resistência de bactérias aos conservantes tradicionalmente utilizados em alimentos. Além disso, esses peptídeos são eficazes em baixas concentrações, resultando em menor ingestão de aditivos alimentares por parte dos consumidores, não comprometendo a vida de prateleira e a segurança microbiológica do produto.
O peptídeo sintético antimicrobiano identificado como SEQ ID NO 1- Arg Arg Trp Tyr Arg Trp Trp Arg - é formado por uma pequena cadeia de resíduos de aminoácidos unidos covalentemente. Este tipo de ligação, também denominada ligação peptídica, é formada pela reação entre o grupo carboxílico de um aminoácido (aminoácido A) com um grupo amino de outro (aminoácido B), com eliminação de uma molécula de água. Tal reação é feita em presença de agentes protetores, para prevenir a reação entre dois aminoácidos A (ou dois aminoácidos B) e também para proteger as cadeias laterais dos aminoácidos contra possíveis ataques químicos. Para que a síntese química ocorra, é necessária a presença de um agente ativador (ou acilante) do grupo carboxílico e de um agente acoplador do grupo amino (a formação da ligação peptídica é conhecida comumente como acoplamento).
A síntese do peptídeo, SEQ ID NO 1, foi realizada utilizando-se um sintetizador de peptídeos. A reação ocorre da seguinte maneira: inicialmente o grupo carboxílico (R-COOH, também denominado de agente doador de acila) interage com o agente ativador N,N-diisopropiletilamina (DIPEA), juntamente com N-[( 1 H-benzotriazol-1-yl)(dimetilamina)metileno]-N-metilmetanamina-hexafluorofosfato-N-óxido (HBTU) em N,N- dimetilformamida (DMF). Após sua ativação, o grupo carboxílico sofre o ataque nucleofílico de um grupo amino de outro aminoácido (H2N-R, também denominado de receptor de acila), que sob ação de ésteres de pentafluorofenol (OPfp), agentes acopladores, e sob catálise com 1-hidroxibenzotriazol anidro (HOBt), resulta na formação da ligação peptídica. Neste caso, todos os outros grupos funcionais reativos, que não estão diretamente envolvidos na formação da ligação peptídica, devem ser previamente protegidos ou bloqueados. Durante a síntese, foi utilizado excesso do aminoácido que estava sendo acoplado. Todos os reagentes foram utilizados em excesso.
A estratégia de síntese é a “Fmoc” em que se emprega a 9- fluorenilmetoxicarbonila (Fmoc), estável ao ácido trifluoroacético (TFA) e lábil à bases orgânicas, como protetor do grupo a-amino dos doadores de acila, que têm as suas cadeias laterais reativas protegidas por grupos estáveis à base empregada na síntese peptídidica e lábeis ao TFA. Esses protetores de cadeia lateral incluem a t-butiloxicarbonila, 0 tritil e a t-butila. No caso da síntese em solução, as carboxilas C-terminais dos receptores de acila são geralmente esterificadas ou amidadas (estáveis à base e lábeis ao TFA).
A síntese peptídica é caracterizada pela ligação covalente inicial entre 0 carbono da carbonila terminal em um suporte sólido (resina), constituída de ácido 4-hidroximetilfenoxiacético/polietileno glicol (PEG)Zresina de poliestireno (PS), sendo esse suporte protetor deste grupo carboxila durante toda a síntese química. Posteriormente, há a etapa de “desproteção” do grupo a-amino desse mesmo aminoácido (covalentemente ligado à resina pelo grupo carboxila), em que o agente protetor desse grupo é removido pela lavagem intensa da resina com 20% de piperidina em DMF. O segundo aminoácido pode então ser acoplado ao primeiro, a resina é novamente lavada e assim esse procedimento é repetido até que toda a sequência seja montada. Quando toda a sequência estiver pronta, 0 peptídeo é liberado da resina. Nesse caso, a síntese ocorre sempre na direção C->N-terminal. Se necessário, purificações adicionais podem ser obtidas utilizando-se cromatografia líquida de alto eficiência (CLAE).
O suporte sólido é então removido por filtração, sendo o filtrado concentrado sob pressão reduzida e os peptídeos precipitados com dietil éter. Posteriormente, os peptídeos são purificados por cromatografia líquida de alta eficência (CLAE) em fase reversa, utilizando-se coluna Shim-pack ODS 5 (4,6μm, 4,6 x 150 mm), por meio de eluição isocrática de água e acetonitrila adicionadas de 0,1% TFA, com detector de luz UV operando em comprimento de onda de 254 nm.
Experimentos conduzidos no Laboratório de Embalagens de Alimentos 10 do Departamento de Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal de Viçosa permitiram verificar e avaliar a ação antimicrobiana do peptídeo antimicrobiano sintético sobre as seguintes espécies baterianas: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella Choleraesuis e Listeria innocua. Conforme já citado, essas bactérias são patogênicas e portanto, 15 agentes causadores de doenças, principalmente infecções e intoxicações alimentares.
O peptídeo antimicrobiano sintético foi testado sobre culturas puras de Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella Choleraesuis, e Listeria innocua, utilizando-se o método de macrodiluição em caldo, de acordo com a 20 norma dos testes de sensibilidade a agentes antimicrobianos por diluição para bactéria de crescimento aeróbio (CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically, 2003).
Na Tabela 1 são apresentadas as concentrações inibitórias mínimas 25 (CIM) em μg*mL*1 do peptídeo para as bactérias citadas acima. Os valores de CIM expressam as concentrações mínimas de agentes antimicrobianos que são necessárias para completa inibição do crescimento bacteriano, sendo o principal teste para indicar a eficácia destes agentes. Dessa forma, quanto menor o valor de CIM, mais eficaz é o agente antimicrobiano, uma vez que 30 menores concentrações são necessárias para inibir o crescimento de micro- organismos. Tabela 1. Valores das concentrações inibitórias mínimas (CIM) do Peptídeo 1 (SEQ ID NO 1) para os micro-organismos avaliados.
O peptídeo antimicrobiano sintético desenvolvido nesse trabalho possui grande potencial de aplicação, uma vez que possui ação efetiva e comprovada contra várias espécies bacterianas patogênicas.
Verifica-se muitos compostos antimicrobianos, e dentre eles, alguns sãosintéticos. Entretanto, o peptídeo antimicrobiano sintético apresentado se destaca pela maior eficiência antimicrobiana quando comparado a diversos outros compostos antimicrobianos, sendo uma importante ferramenta no controle de doenças, especialmente aquelas veiculadas por alimentos.
Claims (4)
1. Peptídeo sintético antimicrobiano, caracterizado por ser a SEQ ID NO 1- Arg Arg Trp Tyr Arg Trp Trp Arg.
2. Peptídeo sintético de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por inibir o crescimento de bactérias patogênicas, mais especificamente as pertencentes ao grupo compreendido por Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella Choleraesuis e Listeria innocua.
3. Uso do peptídeo sintético, definido nas reivindicações 1 e 2, caracterizado por ser para preparar medicamentos para o controle e combate de intoxicações e infecções causadas por bactérias patogênicas, mais especificamente as espécies Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella Choleraesuis e Listeria innocua.
4. Uso do peptídeo sintético, definido nas reivindicações 1 e 2, caracterizado por ser para preparar aditivo conservante de produtos alimentícios para a inibição do crescimento de bactérias, mais especificamente as espécies Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Salmonella Choleraesuis e Listeria innocua.Petição 870210058167, de 28/06/2021, pág. 7/9
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