BR102012030155A2 - aditivo À base de extrato alcaloÍdico de vagens de algaroba (prosopis juliflora) em raÇÕes, utilizando como modificador da fermentaÇço ruminal para a melhoria do desempenho animal e mitigaÇço da emissço de gases entÉricos de efeito estufa - Google Patents

Abstract

ADITIVO Á BASE DE EXTRATO ALCALOÍDICO DE VAGENS DE ALGAROBA (PROSOPIS JULIFLORA) EM RAÇÕES, UTILIZANDO COMO MODIFICADOR DA FERMENTAÇçO RUMINAL PARA A MELHORA DO DESEMPENHO ANIMAL E MITIGAÇçO DA EMISSçO DE GASES ENTÉRICOS DE EFEITO ESTUFA. A presente patente de invenção (PI) refere-se a um aditivo à base de extrato alocaloídico, rico em compostos alcaloides, obtido a partir do fruto (vagens) de algarova (prosopis juliflora) que quando incorporado em rações pode ser utilizado como modificador da fermentação de ruminantes com a função de melhorar o desempenho animal e mitigação da emissão de gases entéricos. O presente aditivo é obtido a partir da extração etanólica das vagens secas e pulverizadas, seguida de fracionamento em ácido-base, obtendo-se assim diferentes extratos. O extrato clorofórmico básico possui uma atividade antimicrobiana comprovada e permite a redução da emissão de metano (CH~ 4~) por animais ruminantes, trazend o benefícios ao pecuarista, ao consumidor e ao meio ambiente, visto que se trata de um produto de origem natural com efeitos positivos para a diminuição do efeito estufa, problema este que envolve tanto países desenvolvidos quanto países em desenvolvimento.

Description

ADITIVO À BASE DE EXTRATO ALCALOÍDICO DE VAGENS DE ALGAROBA (Prosopis jufíflora) EM RAÇÕES, UTILIZADO COMO MODIFICADOR DA FERMENTAÇÃO RUMINAL PARA A MELHORIA DO DESEMPENHO ANIMAL E MITIGAÇÃO DA EMISSÃO DE GASES ENTÉRICOS DE EFEITO ESTUFA

Campo da invenção

A presente patente de Invenção (PI) diz respeito a um aditivo à base de extrato alcaloídico, rico em compostos alcalóides, obtido a partir do fruto (vagens) de 10 algaroba (Prosopis jufíflora) que quando incorporado em rações pode ser utilizado como modificador da fermentação de ruminantes, com a função de melhorar o desempenho animal e mitigação da emissão de gases entéricos. O presente aditivo descrito neste documento possui uma atividade antimicrobiana comprovada e permite a redução da emissão de metano (CH4) por animais ruminantes, trazendo 15 benefícios ao pecuarista, ao consumidor e ao meio ambiente, visto que se trata de um produto de origem natural com efeitos positivos para a diminuição do efeito estufa, problema este que envolve tanto países desenvolvidos quanto países em desenvolvimento.

Fundamentos da invenção Desde o século passado, o aumento das concentrações atmosféricas de

metano (CH4) tem sido relatado e isso tem despertado interesse mundial em reduzir as emissões de gases entéricos de efeito estufa na atmosfera. O aumento da concentração desses gases provoca o aquecimento da superfície terrestre e destruição da camada de ozônio na estratosfera. Os países mais desenvolvidos têm sido 25 apontados como os principais responsáveis pela situação atual da atmosfera do planeta. No entanto, as estimativas realizadas nos países em desenvolvimento, localizados na região tropical, também os classifica como importantes emissores de gases de efeito estufa, uma vez que as condições climáticas dessa região aumentam em muito o potencial de emissão de gases como o CH4, que já contribui com 15% 30 para o forçamento radiativo global [PRIMAVESI, O. et al., - Metano entérico de bovinos leiteiros em condições tropicais brasileiras - Pesquisa Agropecuária Brasileira, 2004\. Aproximadamente 15% do total das emissões de CH4 são produzidos por ruminantes domésticos durante a sua fermentação digestiva e liberados no meio ambiente por eructação, sendo considerada como a terceira maior fonte em escala global.

É importante destacar que a produção de CH4 é parte do processo biológico 5 digestivo dos herbívoros ruminantes e ocorre no rúmen. A fermentação que ocorre durante o metabolismo dos carboidratos do material vegetal ingerido é um processo anaeróbio efetuado pela população microbiana ruminal, que converte os carboidratos celulósicos em ácidos graxos de cadeia curta, principalmente ácidos acético, propiônico e butírico. Nesse processo digestivo, parte do carbono é 10 concomitantemente transformada também em CO2. A emissão de CH4 varia entre 4% e 9% da energia bruta do alimento ingerido, e a média encontrada é de 6% [LIMA, M. A.; CABRAL, O. M. R.; MIGUEZ, J. D. G. - Mudanças climáticas globais e a agropecuária brasileira - Embrapa Meio Ambiente, 2001], Tipicamente, os ruminantes perdem entre 2-12% da ingestão de energia bruta durante este processo e, 15 também por esta razão, aditivos alimentares, tais como os ionóforos são usados para melhorar a eficiência da conversão alimentar, por inibição da produção de ácido acético e butírico em favor de ácido propiônico, que é mais energeticamente eficiente e reduz as emissões de CH4 entérico, porém, por se tratar de uma classe especial de antibióticos, seu uso está proibido pelas agências de vigilância de alguns países.

Ressalta-se ainda que por muitos anos diversos experimentos foram

conduzidos visando à redução da produção de CH4 em ruminantes, sendo que, inicialmente, estes eram apenas de interesse nutricional, ou seja, o objetivo estava restrito ao aumento da eficiência alimentar através da redução da parte energética dos alimentos perdida na forma de CH4 jBENCHAAR C.; POMAR, C.; CHIQUETTE, J. 25 - Evaluation of dietary strategies to reduce methane production in ruminants. a modeling approach - Journal of Animal Science, 2001], Atualmente, o interesse global na redução da emissão de CH4 por ruminantes está relacionado à associação deste gás como um potente causador do efeito estufa, contribuindo assim, para a mudança climática e o aquecimento global.

Os melhoradores de desempenho animal são classificados pelo Ministério da

Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) como antimicrobianos, também chamados de antibióticos, e como anticoccidianos, também denominados de ionóforos, que varia de acordo com o seu mecanismo de ação contra os microrganismos nocivos e patogênicos. Cita-se que alguns produtos, como lasalocida, monensina e salinomicina, são classificados nos dois grupos. Apesar de os ionóforos terem sido utilizados inicialmente em aves, como anticoccidianos, atualmente são os aditivos mais pesquisados em dieta de ruminantes.

É importante destacar que os antibióticos ionóforos têm sido utilizados na alimentação de bovinos há mais de 50 anos, notadamente nos Estados Unidos, Austrália, Nova Zelândia e América Latina. Na Europa, o uso de ionóforo para bovinos nunca foi expressivo, principalmente devido às restrições impostas pelas 10 agências de vigilância dos países europeus. Na Nova Zelândia, esse medicamento é utilizado com o propósito de aumentar a produção de leite e edema da glândula mamária, mas só com prescrição de médicos veterinários. Para vacas lactantes, a agência Food and Drug Administration (FDA) ainda não aprovou o uso de ionóforos. A atuação dos ionóforos consiste na redução das perdas metabólicas 15 geradas pela ineficiência do processo fermentativo dos microrganismos ruminais, diminuindo tanto a produção de CH* como as perdas de nitrogênio amoniacal, potencializando desta forma o desempenho dos ruminantes.

Os ionóforos são compostos de baixo peso molecular que afetam certos microrganismos seletivamente pela alteração da passagem de íons através dos canais da membrana de bactérias Gram-positivas. De forma bastante resumida, sua ação no rúmen leva ao aumento da população de bactérias Gram-negativas elevando a produção de ácido propiônico e à diminuição da degradabilidade ruminal de proteína. O ácido propiônico aumenta o aporte total de energia para o animal hospedeiro, enquanto a diminuição da degradabilidade ruminal da proteína aumenta o fluxo de proteína metabolizável para o intestino delgado. Essas ações resultam em maior eficiência no aproveitamento tanto da energia quanto da proteína da dieta. O aumento na eficiência de aproveitamento dos nutrientes resulta em redução no consumo de matéria seca em até 16% em dietas ricas em concentrado; aumento no consumo de dietas ricas em forragem; e diminuição na produção de CH4 como resultado da inibição de bactérias produtoras de hidrogênio. Devido ao fato de antibióticos ionóforos não inibirem crescimento de arqueas metanogênicas, a menor produção de CH4 provavelmente deve-se à redução nos precursores (H2 e formato). Isto é suportado pela observação de que quando substratos (CO2 e H2) foram fornecidos, ionóforos não afetaram a produção de CH4. Entretanto, destaca-se que a monensina inibiu a metanogênese a partir de formato.

Relata-se ainda que os efeitos de ionóforos, como a monensina, sobre a digestão de fibra têm sido estudados com ensaios in vitro e in vivo. Geralmente os estudos in vitro tem demostrado uma inibição que varia de moderada a elevada, sendo que alguns fatores como o tipo de forragem e a fonte de inóculo ruminal, se proveniente de animais adaptados ou não, afetam a inibição da degradação da fibra. Entretanto, é importante destacar uma das desvantagens apresentadas pelo uso de ionóforos é que estes não podem ser adicionados em ração comercial, isso porque a má homogeneização à ração pode causar intoxicação. Além disso, essas substâncias são pouco metabolizadas em novilhos por não serem absorvidos no trato gastrintestinal, podendo assim causar contaminação ambiental. Outro aspecto negativo apresentado pelos ionóforos é a pequena margem de segurança entre a dose terapêutica e a dose letal. Devido a isso existem vários relatos na literatura de envenenamento em aves, bovinos, ovinos, suínos, cães e eqüinos, que apresentam entre todas as espécies a maior susceptibilidade, que foram administrados com ionóforos.

Com base no exposto, a utilização de substâncias do tipo ionóforos na alimentação animal, contraria as premissas para segurança alimentar do mercado consumidor, que tem exigido produtos com rigoroso controle sanitário pelas agências de vigilância nacionais e internacionais. Dessa forma, o uso de antibióticos ionóforos na alimentação de bovinos tem sido questionado em virtude da possibilidade de indução de resistência bacteriana, liberação de contaminantes para o ambiente, e o risco de resíduos de antibióticos em produtos de origem animal, o que gera uma grande ameaça à saúde humana. Por estas razões tem havido um crescente interesse na avaliação do potencial antimicrobiano de produtos naturais, tais como extratos de plantas, que podem alterar a fermentação microbiana no rúmen, sem causar prejuízos à saúde humana, podendo assim representar uma alternativa viável ao uso dos ionóforos na dieta de bovinos, sem ou com mínima queda nos índices zootécnicos. Além disso, podem abrir novos mercados para a carne brasileira, uma vez que a utilização de produtos naturais tende a reduzir as limitações impostas por mercados mais exigentes em sanidade, a exemplo da União Européia.

Apesar dos efeitos benéficos associados aos ionóforos, no que diz respeito à diminuição da produção de CH4 pelos ruminantes, recentemente, com base nos riscos de resistência aos antibióticos em seres humanos, e a ocorrência de resíduos em 5 alimentos de origem animal, a União Européia proibiu o uso de antibióticos na pecuária como aditivos alimentares, encerrando quase 50 anos de uso de antibióticos para fins não terapêuticos. Assim, existe uma procura real e crescente por novos aditivos em alimentos para substituir estes compostos. Dentro deste contexto, a comunidade científica iniciou esforços para explorar produtos naturais como aditivos 10 alimentares, uma vez que muitos compostos naturais e extratos de plantas compartilham alguns dos benefícios dos antibióticos.

A implementação de práticas de manejo na pecuária visando melhorar a produtividade animal, como por exemplo, a redução da emissão de CH4, é de grande relevância para os sistemas de produção animal e preservação do meio ambiente. O uso de leguminosas na dieta visando redução da produção de CH4 no rúmen tem sido pesquisado com estudos in vivo e in vitro em ruminantes consumindo baixos ou moderados teores de taninos [PUCHALA, R. et al. - The effect of a condensed tannin-containing forage on methane emission by goats - Journal of Animal Science, 2005]. Leveduras também são relacionadas à redução da produção de CH4 no rúmen por promover aumento da competição entre bactérias acetonogênicas e arqueas metanogênicas [POSSENTI, R. A et al. - Efeitos de dietas contendo Leucaena leucocephala e Saccharomyces cerevisiae sobre a fermentação ruminal e a emissão de gás metano em bovinos - Revista Brasileira de Zootecnia, 2008]. Todos estes estudos têm sido desenvolvidos com 0 objetivo principal de encontrar uma substância de origem natural que possa substituir o uso de antimicrobianos sintéticos como aditivos de rações de animais, utilizados também como promotores do crescimento e que promovam a redução da emissão de CH4 pelos ruminantes. Entretanto, é importante destacar que nenhum estudo técnico ou científico encontrase disponível na literatura que utiliza o extrato alcaloídico de vagens de algaroba (Prosopis jufíflora) como aditivo da alimentação desses animais para a diminuição da emissão de gás CH4, escopo tecnológico que essa patente visa proteção.

A algarobeira (Prosopis jufíflora (Sw.) D.C.) é uma leguminosa aibórea, não oleaginosa, da família Fabaceae, a qual foi introduzida no Brasil há mais de 50 anos, estando bastante difundida na região Nordeste, em populações cultivadas e subespontâneas, sendo considerada atualmente como planta invasora do bioma Caatinga. Prosopis juliflora ocorre naturalmente no México, América Central e norte 5 da América do Sul (Peru, Equador, Colômbia e Venezuela). Além das regiões de origem, foi introduzida para cultivos de forragem e madeira no Brasil, Sudão, Sahel Africano, África do Sul e índia.

Prosopis juliflora pode atingir até 18 m de altura e apresenta um sistema radicular axial ou pivotante, capaz de alcançar grandes profundidades em busca de 10 água e nutrientes. O caule é retorcido, espinhoso e de ritidoma (casca) grossa e coloração pardo-avermelhado. As folhas são compostas bipinadas, inflorescências em espigas axilares, hermafroditas, de coloração branca-esverdeada, medindo cerca de 14 cm de comprimento [NASCIMENTO, C. E. S. - Comportamento invasor da algarobeira Prosopis juliflora (Sw) DC. nas planícies aluviais da caatinga 15 Universidade Federal de Pernambuco, 2008]. Os frutos, denominados de vagens são secos, indeiscentes e variam muito quanto à forma, peso e tamanho. A vagem apresenta exocarpo delgado, mesocarpo camoso, endocarpo fibroso e sementes duras. A polpa possui cerca de 40% de sacarose e o endocarpo, 41% de celulose. As vagens, quando maduras, são amarelas e caem ao solo, ocasião em que apresentam 20 cerca de 10% de umidade. Cada fruto possui, em média, 20 sementes. As sementes são de acentuada dureza e protegidas por um invólucro fibroso, achatadas, ovaladas, lustrosas e marrom-claras [OLIVEIRA, M. R. et al. - Study the Conditions of Cultivation of the Algaroba and Jurema Preta and Determination Calorific Power Revista de Ciência & Tecnologia, 1999].

As vagens (frutos) da Prosopis juliflora apresentam toxinas e fatores anti

nutricionais, tais como os compostos polifenólicos, alcalóides, lectinas e aminoácidos não-proteicos que podem limitar sua utilização como ração animal. Numerosos componentes químicos pertencentes às classes de flavonoides, alcalóides piperidínicos e glicosídeos de ácido elágico foram isolados de Prosopis juliflora, notadamente das suas raízes, caules e folhas.

Alcalóides são substâncias de caráter alcalino, derivados principalmente de plantas, cuja fórmula contém basicamente, nitrogênio, oxigênio, hidrogênio e carbono, podendo existir no estado livre, como sais ou como óxidos. Este grupo corresponde aos principais terapêuticos naturais que possuem ação anestésica, analgésica, psico-estimulante e neurodepressora. No grupo de alcalóides encontrados na Prosopis juliflora destacam-se como componentes principais a julifloricina, 5 juliprosopina (núcleo piperidínico com atividade tóxica) e ainda juliprosina, juliprosineno, juliflorinina (presente apenas nas folhas) e isojuliprosina [TABOSA,

I. M.; PAMPLONA, F. V.; QUINTANS-JÚNIOR, A. - Isolamento e identificação de juliprosopina, um dos constituintes tóxicos da Prosopis juliflora -Revista Brasileira de Farmacognosia, 2000],

As vagens (frutos) de algaroba apresentam baixos níveis de tanino tóxico ao

animal [SAWAL, R. K.; RAM, R.; YADAV, S. B. S. - Mesquite (Prosopis juliflora) pods as a feed resource for livestock - A review - Journal Animal Science, 2004\. No entanto, substâncias alcalóides, foram isoladas como 3’-oxo-juliprosopina, secojuliprosopinal, uma mistura de 3-oxo- e 3’-oxo-juliprosina [NAKANO, H. S. et al. - Growth inhibitory alkaloids from mesquite (Prosopis juliflora (Sw.) DC.) Ieaves

- Phytochemistryt 2004], além da juliprosina e juliprosopina que são inibidoras de crescimento de plantas [NAKANO, H. et al. - Structure-activity relationships of alkaloids from mesquite (Prosopis juliflora (Sw) D.C.) - Plant Growth Regulation, 2004]. Outro alcalóide isolado da Prosopis juliflora denominado julifloricina exerce 20 atividade antimicrobiana significante principalmente sobre bactérias Gram-positivas. Este efeito foi comparado à ação da benzil penicilina, gentamicina e trimetropina [AQEEL, A. et al. - Antimicrobial activity of julifloricine isolated from Prosopis juliflora - Arzneimittelforschungt1989].

Alguns estudos científicos revelam que extratos e alcalóides piperidínicos 25 obtidos a partir de folhas de algaroba mostraram exibir atividade antimicrobiana contra várias bactérias Gram-positivas e alguns tipos de fungos. Destaca-se que apenas quatro estudos fítoquímicos da casca de algaroba estão disponíveis, e apenas um relata avaliação antimicrobiana de seus extratos. Em relação aos estudos e utilização das vagens de algaroba, apenas três trabalhos fítoquímicos foram 30 encontrados na literatura [BATATINHA, M. J. M. - Investigations on toxic influences of Prosopis juliflora D.C. (Algarobeira) on cell cultures as well as on ruminal fermentation in cattle (in vitro) - Veterinaty Medicine Universityt 1997], [TABOSA, I. M. et al. - Neuronal vacuolation of the trigeminal nuclei in goats caused by ingestion of Prosopis juliflora pods (mesquita beans) - Veterinary & Human Toxicology, 2000] e [HUGHES, J. B. et al. - Cytotoxicity effect of alkaloidal extract from Prosopis juliflora Sw. D.C. (Algaroba) pods on glial cells - Brazilian 5 Journal of Veterinary Research and Animal Science, 2006]. Entretanto, nenhum deles relatou qualquer avaliação antimicrobiana de seus extratos e de seu uso como aditivo em rações de ruminantes visando o melhor aproveitamento de energia com redução da produção de CH4 no rúmen.

Devido ao fato da invasão da algaroba (Prosopis juliflora) ocupar milhões de 10 hectares na África do Sul, Austrália, litoral da Ásia e norte da índia e do Sudão e na região nordeste do Brasil, a exploração racional dessa espécie como fonte de vagens, recurso natural renovável, possui um impacto triplo. Relaciona-se com a (i) produção de aditivo nutricional, o qual é considerado como um bioproduto inserido no escopo de uma tecnologia verde, (ii) atua como um ingrediente em formulações para o 15 arraçoamento animal e como (iii) biomassa para produção de combustível (etanol), que é extremamente sustentável. Ressalta-se ainda que, além de controlar a invasão da algaroba (Prosopis juliflora), propicia agregação de valor à cadeia produtiva algaroba-pecuária com a vantagem de contribuir com a redução da emissão de gases entéricos de efeito estufa (CH4) pelos ruminantes.

Em suma, a Prosopis juliflora é uma espécie invasora de cultivos e áreas

úmidas, de baixio, formando aglomerados e excluindo outras espécies por sombreamento, impedindo o desenvolvimento da mata ciliar. Exporta, por transpiração, entre 30 e 75 litros de água por dia constituindo sério problema para os recursos hídricos [Instituto Hórus de Desenvolvimento e Conservação Ambiental, 25 2008]. No entanto, considerando o alto custo para a sua erradicação, esta patente de invenção descreve a tecnologia associada à utilização do extrato alcaloídico de vagens de algaroba (Prosopis juliflora) como aditivo da alimentação de ruminantes para a diminuição da emissão de gás CH4. Diante do exposto, vale salientar que a transferência de tecnologia para a cadeia produtiva da algaroba (Prosopis juliflora) 30 em regiões semiáridas do nordeste brasileiro e de outras regiões do planeta é imediata, tendo em vista a ampla distribuição de Prosopis juliflora. Destaca-se ainda o interesse global dos países industrializados e em desenvolvimento pela redução de gases que provocam o efeito estufa.

Técnica relacionada

A literatura técnica especializada revela documentos de patentes relacionadas a substâncias de origem sintética e/ou natural, bem como seus produtos, que atuam 5 na diminuição da emissão de gases promotores do efeito estufa, como o CH4, por ruminantes. Entretanto, nenhuma delas diz respeito à tecnologia de que trata esta invenção, ou seja, a utilização do extrato alcaloídico de vagens de algaroba (Prosopis juliflora) como aditivo da alimentação de animais ruminantes para a diminuição da emissão de gás CH4, e que possui atividade antimicrobiana.

O documento de patente coreano KR 20110119370 se refere a uma

composição alimentar contra gases de efeito estufa produzidos pelo rúmen de ruminantes e o método para criação de ruminantes. De acordo com os inventores, a utilização da composição alimentar e do método de criação é possível reduzir a quantidade de dióxido de carbono e de CH4 gerado pelos ruminantes. A composição 15 alimentar é constituída de 35-45% de forragem concentrada, 35-45% do “timothy grass” e 10-30% de palha de arroz. O método de criação dos ruminantes consiste na utilização dessa composição para a alimentação em dois momentos diários (9:00 horas e 17:00 horas).

O documento de patente norte-americano US 2011152375 descreve um 20 método para reduzir o nível de gás CH4 e aumentar o rendimento total de gás na alimentação animal. A proposta desta invenção é promover a utilização de pelo menos um material de estrutura porosa formado por um íon metálico (Mg) e dois compostos orgânicos. Em relação aos compostos orgânicos, um é obtido a partir do ácido fórmico e o outro obtido a partir de ácido acético, utilizados com a finalidade 25 de reduzir o nível de CH4 produzido pelos animais ruminantes.

O documento de patente coreano KR 20110036470 faz referencia a uma composição alimentícia e o método para reduzir o gás CH4 produzido pelos animais ruminantes através da utilização de alho como ingrediente principal. A composição alimentícia animal é constituída por palhas de arroz e ração concentrada, incorporada 30 com 0,01-0,5% de alho, em forma de pó seco, o que corresponde à quantidade total de forragem concentrada.

O documento de patente chinês CN 101904418 trata de um método para reduzir a geração de CH4 no rúmen de animais utilizando um componente denominado de “gipenosidé\ empregado como aditivo alimentar. O aditivo pode ser incorporado em qualquer ração e a quantidade adicionada varia de 0,05-0,30 gramas para cada quilo do animal. Entretanto, o aditivo só reduz a produção de CH4 dos 5 rúmens de caprinos, possuindo um mecanismo de ação através da redução do número de bactérias produtoras desse gás.

O documento de patente WO 2010071222 refere-se a um inibidor de emissão de CH4 para ruminantes que se caracteriza pelo fato de compreender o peróxido de hidrogênio como um ingrediente ativo.

O documento de patente WO 2011045418 descreve um método para reduzir a

produção de CH4 a partir das atividades digestivas de ruminantes, utilizando como composto ativo, pelo menos um ácido alcanóico e/ou seu derivado, que é administrada ao animal em conjunto com a alimentação. A invenção também se relaciona com a utilização destes ingredientes em alimentos para animais e aditivos, tais como pré-mistura e concentrados alimentares.

O documento de patente europeu EP 1673983 faz referência a um aditivo, descrito com uma bacteriocina resistente à protease, que é isolada a partir de bactérias ácido láticas, que quando incorporada a uma composição alimentar para ruminantes promove a diminuição de CH4 do rúmen de alguns animais, como bovinos.

O documento de patente europeu EP 1630226 trata de um inibidor da produção de CH4 e composição alimentícia para ruminantes. O inibidor inserido na composição alimentar é um microrganismo que contém ativa a nitrito redutase ativa, sendo selecionado a partir do grupo de bactérias intestinais.

A partir da busca realizada nas bases de dados onde estão disponíveis as

informações tecnológicas referentes à tecnologia pesquisada, pode-se afirmar que a patente de invenção proposta neste documento, possui o parâmetro de novidade, pois até o presente momento nenhum trabalho técnico ou científico foi encontrado no estado da arte que possui a mesma funcionalidade de promover a redução de emissão 30 CH4 por animais ruminantes com o mesmo escopo de atividade apresentado pelo aditivo à base de extrato alcaloídico de vagens de algaroba (Prosopis juliflora). Além do parâmetro de novidade, a presente patente de invenção possui os critérios de atividade inventiva e aplicação industrial.

Assim, a invenção agora proposta é uma nova opção de aditivo para ser incorporado em composições alimentares e rações para animais, com a função de modificar o processo de fermentação ruminal, promovendo assim a diminuição da emissão de gases entéricos de efeito estufa, como o CH4, a base de extrato alcaloídico de vagens de algaroba (Prosopis juliflora). Os benefícios apresentados por esta invenção são inúmeros, principalmente quando comparados aos trabalhos técnicos encontrados na literatura especializada, visto que se trata de um produto natural e de baixo custo. Além disso, a Prosopis juliflora é uma espécie invasora de cultivos e a destinação de suas vagens para a obtenção de um extrato alcaloídico, com função de promover a redução de CH4 no meio ambiente, promove agregação de valor à cadeia produtiva algaroba-pecuária, e conseqüente, benefícios para o pecuarista e meio ambiente. Destaca-se ainda que por se tratar de um produto de origem natural, a ser adicionado na alimentação animal, a segurança alimentar para o consumidor também é uma das vantagens apresentadas por essa nova tecnologia. Sumário da invenção

A presente patente de Invenção (PI) tem como objetivo fornecer o detalhamento do processo de obtenção do extrato alcaloídico de vagens (frutos) de Prosopis juliflora, considerada atualmente como uma espécie invasora de cultivos, 20 bem como descrever seu potencial antimicrobiano e sua ação na diminuição da emissão de CH4. Ressalta-se que este aditivo pode ser incorporado em rações para ruminantes, visto que a presença de alcalóides no extrato clorofórmico básico promove a redução da emissão de gases entéricos de efeito estufa, através da modificação do processo de fermentação ruminal,

Descrição detalhada da invenção

Para que o processo da invenção possa ser mais bem compreendido e avaliado, sua descrição detalhada será feita a seguir.

As vagens (frutos) de Prosopis juliflora podem ser coletadas de qualquer região que contenha essa leguminosa arbórea, manualmente ou com a utilização de algum maquinário. A exsicata utilizada para a realização dos testes e descrição de atividades foi alojada no Herbário da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), em Itabuna, Bahia, Brasil, sob o código RG-14.435. A primeira etapa para o desenvolvimento do aditivo consiste na obtenção de um pó amarelado e seco das vagens de Prosopis juliflora:

Deve ser realizada a secagem do material vegetal (vagens de Prosopis juliflora) em uma faixa de temperatura de 35 a 40°C, em uma área bem ventilada, 5 podendo ser ao ar livre, ou utilizando estufa, dessecador ou desidratador com circulação de ar, por um período de aproximadamente 24 horas. Em seguida, o material vegetal seco foi pulverizado em moinho de facas para obtenção de um pó amarelado e seco. A pulverização pode também ser feita de maneira manual, ou seja, utilizando pistilo e almofariz de vidro, porcelana e/ou plástico, bem como, utilização 10 de outros tipos de trituradores mecânicos.

A segunda etapa para o desenvolvimento do aditivo é a obtenção dos extratos alcaloídicos das vagens de Prosopis juliflora:

O pó farelado de vagens de algaroba, obtidos na etapa anterior, aproximadamente 2,6 kg, deve ser percolado com 8-12 litros de etanol. É importante ressaltar que neste estudo utilizou preferencialmente o etanol como solvente extrator, entretanto, outros solventes alcóolicos e não alcóolicos podem ser utilizados, como éter de petróleo, clorofórmio, metanol, butanol, hexano, entre outros. O processo extrativo deve ser realizado preferencialmente a temperatura ambiente entre 25 a 30°C. Em seguida, a solução obtida deve ser concentrada em rotavapor, ou outro equipamento de concentração, preferencialmente à vácuo, para a obtenção do extrato etanólico (EE) bruto das vagens de Prosopis juliflora. Utilizando-se inicialmente uma massa de 2,6 kg de pó farelado das vagens de algaroba, obtém-se no final do processo aproximadamente 870 g de extrato etanólico (EE) bruto. Após essa etapa deve ser realizado o tratamento ácido-base, segundo metodologia padrão para isolamento de alcalóides [OTT-LONGONI, R.; VISWANATHAN, N.; HESSE, M. Die konstitution des Alkaloides Juliprosopin aus Prosopis juliflora A. DC. Helvetica Chimica Acta, 1980],

A terceira etapa para o desenvolvimento do aditivo consiste na obtenção da Solução Aquosa Ácida I:

Parte do extrato etanólico bruto das vagens de Prosopis juliflora,

aproximadamente 570 g, deve ser fracionado em 500 ml de solução aquosa de ácido acético a 10% (v/v). Esta solução deve ser filtrada preferencialmente em funil de Büchner, e o resíduo obtido deve ser lavado com solução aquosa de ácido acético , fornecendo assim a solução aquosa ácida I. Destaca-se que a solução aquosa ácida I foi extraída com clorofórmio CHCl3 (a extração é realizada duas vezes, utilizando-se um volume de 300 ml de CHCI3 para cada extração). Em seguida, a fração orgânica 5 obtida deve ser lavada em solução aquosa de bicarbonato de sódio NaHCOj 5% (m/v) (a lavagem é realizada duas vezes, utilizando-se um volume de 300 ml de NaHCO3 5% para cada lavagem) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio NaCl na proporção de 1:1 . Por fim, a solução obtida é seca com sulfato de sódio NajSO4 anidro.

A quarta etapa para o desenvolvimento do aditivo, consiste na obtenção da

Solução Aquosa Ácida Π e extrato clorofórmico ácido:

A solução obtida no processo anterior deve ser colocada em rotavapor, ou outro equipamento de concentração, preferencialmente à pressão reduzida, para a eliminação CHCI3, obtendo-se assim a solução aquosa Ácida Π e extrato clorofórmico ácido.

A quinta etapa para o desenvolvimento do aditivo, consiste na obtenção da solução aquosa neutra I e Π e extrato clorofórmico neutro:

A solução aquosa ácida Π deve ser neutralizada com NaHCO3 0,6M (a neutralização é realizada duas vezes, utilizando-se um volume de 300 ml de NaHCO3 20 0,6M para cada etapa), levando a obtenção da solução aquosa básica I que, por sua vez, deve ser extraída com CHCl3. A camada orgânica obtida deve ser lavada com solução aquosa saturada de NaCl e seca com NajSO4 anidro. O solvente deve ser eliminado preferencialmente em evaporador rotativo sob pressão reduzida, fornecendo solução aquosa neutra Π e extrato clorofórmico neutro.

A sexta etapa para o desenvolvimento do aditivo, consiste na obtenção da

solução aquosa básica I e Π e extrato clorofórmico básico (ECB):

A solução aquosa neutra, obtida da etapa anterior, teve seu pH elevado a 9,0, utilizando-se uma solução saturada de hidróxido de sódio NaOH 2M, denominada agora de solução aquosa básica I, que foi extraída com CHCl3. A camada orgânica 30 resultante deve ser lavada com solução saturada de NaCl, e seca com NaaSO4 anidro. O solvente deve ser eliminado preferencialmente sob pressão reduzida, fornecendo solução aquosa básica Π e extrato clorofórmico básico (ECB). Ao final desta etapa, obtém-se aproximadamente 19,1 g de extrato clorofórmico básico, cujo rendimento a partir de vagens integrais de algaroba moídas é de aproximadamente 1%. O extrato clorofórmico básico de peso conhecido ao ser submetido à purificação utilizando-se dissolução com clorofórmio e em seguida lavagem com solução aquosa de HCl 50%, a fração aquosa ácida de alcalóides obtida poderá ser liofilizada.

A sétima etapa para o desenvolvimento do aditivo, consiste na obtenção da solução aquosa básica III e extrato acetato básico (EAB).

A solução aquosa básica Π, obtida da etapa anterior, deve ser extraída com acetato de etila CH3COOCH2CH3, em seguida lavada com solução aquosa saturada de NaCl, e seca com NaaSO4 anidro. O solvente deve ser eliminado preferencialmente em evaporador rotativo sob pressão reduzida, fornecendo a solução aquosa básica IQ e o extrato acetato básico (EAB).

As sete etapas descritas anteriormente revelam a forma de obtenção de todos os extratos oriundos das vagens de Prosopis juliflora, agora, nessa fase do relatório 15 descritivo serão exemplificados e descritos as análises realizadas para a comprovação do potencial desse aditivo, ou seja, identificar a presença de alcalóides nos extratos, demonstrar a atividade antimicrobiana frente a alguns microrganismos, bem como a influência destes extratos sobre a digestão ruminal.

Para a identificação da presença de alcalóides nos extratos, houve a 20 preparação do reagente de Dragendorff, que foi adaptada de acordo com a metodologia encontrada na literatura científica [LI, J.; HOU, Y. M,; GE, F. H Studies on Chemical Constituents of supercritical CO2 extraction on Saussurea medusa Maxim - Journal Chinese Medicine Mater, 2002]. Nitrato básico de bismuto (Ig) foi dissolvido nos solventes pré-misturados (10 ml de ácido clorídrico 25 concentrado + 40 ml de água destilada). Em seguida, 5 g de iodeto de potássio foram completamente dissolvidos nesta solução, a qual foi então completada para 100 ml com água destilada e submetidos à detecção direta em Cromatografia em Camada Fina(CCF).

O extrato etanólico bruto (EE - obtido na segunda etapa) de vagens de algaroba exibiu manchas Dragendorff-positivas sob a análise por CCF (Cromatografia em Camada Fina) e, assim, o EE (extrato etanólico) foi submetido ao tratamento ácido-base, a fim de obter extratos enriquecidos com alcalóides, conforme descrito nas etapas 3 a 7 apresentadas anteriormente. É importante destacar que de todos os extratos obtidos a partir do EE (extrato etanólico) apenas o ECB (extrato clorofórmico básico) e o EAB (extrato acetato básico) demonstraram ser reativos com reagente de Dragendorff em Cromatografia em Camada Fina (CCF).

Uma análise do extrato alcaloídico de algaroba (extrato clorofórmico básico

ECB) foi realizado por ressonância magnética nuclear (RMN) de IH (400 MHz). O espectro de RMN IH do extrato mostrou sinais em δ 6,2 (s, H-7""), δ 3,9 (sl, H-3 e 3'), δ 3,7 (d, J = 11 Hz, H-5"" eq), δ 2,7 (m, H-6 e 6') e δ 1,3 (m, H-7 e H-7'), identificando assim a presença de juliprosopina, cuja estrutura química está 10 apresentada na Figura 1 deste documento de patente (conhecida também como juliflorina). O espectro de RMN IH de EAB (extrato acetato básico), por outro lado, não apresentou este perfil característico de alcalóides piperidínicos, sugerindo que tais alcalóides podem estar presentes em EAB como menores constituintes.

A atividade antimicrobiana foi avaliada do extrato clorofórmico básico (ECB 15 - obtido na sexta etapa) e do extrato acetato básico (EAB - obtido na sétima etapa), ambos obtidos a partir do fracionamento ácido-base do extrato etanólico (EE obtido na segunda etapa). Estes extratos alcaloídicos foram então testados contra quatro bactérias Gram-positivas, BaciUus subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans e Mierocoecus luteus, três bactérias Gram-negativas, 20 Eseheriehia coli, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella eholeaesuis, e contra três fungos, Aspergillus niger, Cladosporium cladosporioides e Candida albieans.

Os resultados da Tabela 1 revelaram que o EAB (extrato acetato básico) não apresentou qualquer atividade antimicrobiana contra todos os microrganismos ensaiados (CEM - concentração inibitória mínima > 100 μg / ml). A ausência de 25 atividade antimicrobiana para EAB (extrato acetato básico) pode ser explicada, pelo menos em parte, pela baixa concentração de alcalóides neste extrato. Por outro lado, o extrato clorofórmico básico (ECB) demonstrou ser ativo contra M luteus (CIM = 25 μg/ml), S. aureus (CIM = 50 μg/ml) e S. mutans (CIM = 50 μg/ml), sendo M. luteus o microrganismo mais susceptível a este extrato.

A partir dos resultados expostos na Tabela 1 é possível aferir que o extrato

enriquecido de alcalóide (extrato clorofórmico básico - ECB) obtido de vagens de Prosopis juliflora mostrou exibir propriedades antimicrobianas contra bactérias Gram-positivas, grupo que compartilha semelhanças estruturais de invólucro celular com o domínio Archaea, por não apresentarem a membrana externa à parede celular, e que são os principais responsáveis pela produção indesejada de CO2 e CH4 durante a digestão ruminal, respectivamente.

Tabela 1. Concentração Inibitória Mínima (CIM, μg/ml) para extrato clorofórmico básico (ECB) e extrato acetato básico (EAB) de vagens de Prosopis juliflora sobre microrganismos, comparado a outros antimicrobianos.

Microrganismos ECB EAB Cloranfemcol Loprox M. luteus 25 >100 0,8 S. aureus 50 >100 6,3 S. mutans 50 >100 6,3 B. subtilis >100 >100 6,3 E. coli >100 >100 3,1 S. choleaesuis >100 >100 6,3 P. aeruginosa >100 > 100 100 A. Niger >100 >100 - 12,5 C. cladosporioides >100 >100 - 6,3 C. albicans >100 >100 - 6,3 Considerando que alcalóides de algaroba promove alteração de parâmetros

ruminais durante um estudo científico preliminar in vitro realizado por

BATATINHA [BATATINHA, M. J. M. - Ihvestigations on toxic influences of Prosopis juliflora D.C. (Algarobeira) on cell cultures as well as on ruminal fermentation in cattle (in vitro) - Veterinary Medicine University, 1997], a próxima 15 etapa deste estudo tecnológico foi avaliar e demostrar a influência do ECB (extrato clorofórmico básico) sobre a digestão ruminal in vitro de farelo de trigo (alimento utilizado em rações de ruminantes) por meio da análise da produção de gases, degradabilidade verdadeira da matéria seca e produção de massa microbiana por meio da técnica semi-automática de produção in vitro de gases [MAURÍCIO, R. M. 20 et al. - A semi-automated in vitro gas production technique for ruminants fedstuff evaluation - Animal Feed Science and Technology, 1999], e comparar seus efeitos com os de monensina, um ionóforo, antibiótico poliéter que inibe seletivamente o crescimento microbiano no rúmen. É importante salientar que o aditivo, o qual é requerido proteção neste documento de patente, pode ser incorporado em qualquer tipo de ração comercial, concentrada ou não, a base de farelo e outros cereais, como milho, soja, arroz, entre outros, visto que irá possuir o mesmo efeito quando incorporado a ração comercial a base de trigo.

A Figura 2 deste documento de patente demonstra a representação da

produção de gases não cumulativa como uma função de concentrações crescentes de ECB (extrato clorofórmico básico), ou seja, concentrações de, 0,25, 50, 100, 200 mg / L, por períodos de 6,12,18, 24 e 36 horas de incubação. De acordo com a equação obtida por regressão linear múltipla e gráficos correspondentes para a superfície de 10 resposta e curva de contorno, pode-se observar que a concentração de ECB (extrato clorofórmico básico) que leva à produção mínima de gases (6 ml/lOOmg) é aproximadamente 100 mg/L entre 30-32 horas de fermentação.

Além disso, como pode ser observado na Figura 3 deste documento de patente, tanto o antibiótico ionóforo monensina, quanto o ECB (extrato clorofórmico 15 básico) afetaram a produção de gases (P<0,05) observando uma variação cúbica entre 6-36 horas de incubação. No entanto, quando derivadas, as equações estimaram produção máxima de gases de 14,2 ml/100 mg de matéria seca em 15,3 horas para ECB 100 mg/L (extrato clorofórmico básico) e de 15,8 ml/100 mg de matéria seca em 17,3 horas para o antibiótico ionóforo monensina. Após 33,4 horas de incubação, 20 estimou-se uma produção mínima de gases para ECB 100 mg/L (extrato clorofórmico básico) de 6,6 ml/100 mg de matéria seca, ao passo que o valor foi de

11,7 ml/100 mg de matéria seca para monensina.

No que diz respeito à resposta cúbica, houve um aumento da produção de gases após 33 horas de incubação, devido à degradação de células microbianas que 25 foram lisadas após utilização completa do substrato. Finalmente, a Figura 3 também toma evidente que ECB 100 mg/L (extrato clorofórmico básico) provocou a menor produção de gases ao longo de todos os tempos estudados, inibindo significativamente (P<0,05) a produção de gases após 36 horas de fermentação.

A redução observada na produção de gases pelo extrato alcaloídico de vagem de algaroba (ECB - extrato clorofórmico básico) é entendida como um resultado da mudança na proporção de ácidos graxos voláteis (acetato / propionato), com um aumento na proporção molar de propionato durante a fermentação, e essa mudança pode ser atribuída à inibição de bactérias fermentadoras de celulose que produzem acetato e também formato e H2, que são os principais precursores para a biossíntese de CH4. Assim, este efeito promove, simultaneamente, um maior seqüestro de carbono no meio e uma menor produção de CO2 e CH4, melhorando a eficiência de 5 conversão alimentar e garantindo uma maior oferta de glicose para os ruminantes e a manutenção do efeito poupador de aminoácidos degradados para a produção de glicose, durante as fases críticas do seu metabolismo. Como CO2 e CH4 são os gases que mais contribuem para o aumento da pressão no ambiente de incubação, a redução de ambos podem facilmente explicar a redução do volume estimado dos 10 gases.

O mecanismo de ação dos alcalóides piperidínicos sobre bactérias Grampositivas é relatado por estar relacionado com a alta citotoxicidade gerados por bloqueio de canais de cálcio na membrana da célula, principalmente devido às características anfotéricas destes alcalóides, que lhes permitem interagir de forma 15 mais eficiente à membrana celular e inibir seus canais [CHOUDHARY D. et al. Expression pattems of mouse and human CYP orthologs (families 1-4) during development and in different adult tissues - Archives Biochemistry Biophysics 2005].

A partir dos resultados apresentados nesse documento de patente pode-se afirmar que a presença de extrato alcaloídico diminuiu a produção de gases ao longo 20 de 36 horas de incubação em comparação a monensina (Figura 3). Com isso, concluise que os alcalóides extraídos de vagens de Prosopis juliflora atenuam a produção de CH4 por desestabilizar as relações sintróficas entre comunidades microbianas metanogênicas (produtoras de metano) e bactérias fibrolíticas. A presença de metanogênicos no meio anaeróbico remove 0 hidrogênio e diminui a pressão parcial 25 deste gás, produzindo CH4 e, consequentemente, promovendo a regeneração de NAD (nicotinamida adenina dinucleotídeo) que é utilizado em outras rotas metabólicas, as quais podem variar dependendo das espécies fibrolíticas envolvidas. Assim, espécies envolvidas em relações sintróficas desenvolvem melhor na presença de microrganismos metanogênicos e, portanto, há aumento da massa microbiana.

Os resultados referentes à degradabilidade verdadeira da matéria seca

(DVMS) e produção de massa seca microbiana (PMM) do tratamento controle em comparação com os de amostras contendo monensina (5 μΜ) ou concentrações crescentes em mg/L de ECB (extrato clorofórmico básico) após 18 e 36 horas de incubação são apresentados nas Tabelas 2 e 3, para a melhor exemplificação dos resultados.

O valor mais baixo de DVMS (degradabilidade verdadeira da matéria seca) 5 foi observado em amostras contendo ECB 200 mg/L (extrato clorofórmico básico) após 18 horas de incubação. Também foi observado que a monensina e ECB 200 mg/L (extrato clorofórmico básico) reduziram significativamente a DVMS em comparação com o controle (ECB 0 - extrato clorofórmico básico) e para os outros tratamentos ECB (25, 50 e 100 mg/L) a 18 horas de incubação, enquanto que em 36 10 horas somente monensina proporcionou menor DVMS (degradabilidade verdadeira da matéria seca) comparada aos demais tratamentos.

Tabela 2. Degradabilidade verdadeira da matéria seca (DVMS, g/100 g MS) de amostras contendo concentrações crescentes em mg/L de ECB (extrato clorofórmico básico) ou monensina (Mon, 5μΜ), após incubação de 18 e 36 horas.

Tratamento DVMS (g/100 g de MS) 18 h 36 h ECBO 69,25 ±0,81 72,72 ±0,34 ECB 25 70,61 ±0,63 71,77 ±1,34 ECB 50 69,54 ±0,65 73,07 ±0,11 ECB 100 69,15 ±0,64 72,38 ±0,35 ECB 200 65,73 ±0,42 71,41 ±0,04 Mon 57,04 ±0,23 62,21 ±0,58 ECB a 200 mg/L (extrato clorofórmico básico) e monensina mostraram reduzir significativamente a DVMS (degradabilidade verdadeira da matéria seca) em comparação com os outros tratamentos após 18 horas (Tabela 2). Este fato pode ser 20 explicado pela inibição seletiva de ECB (extrato clorofórmico básico) sobre microrganismos fibrolíticos, resultando em menor degradação dos componentes fibrosos do farelo de trigo.

A partir dos resultados apresentados na Tabela 3 relativo à produção de massa seca microbiana (PMM), é possível constatar que a utilização de ECB (extrato clorofórmico básico) a 50, 100 e 200 mg/L proporcionaram PMM (produção de massa seca microbiana) significativamente menor do que o controle, ECB 25 mg/L (extrato clorofórmico básico) e monensina no período de 18 horas de incubação, ao passo que a monensina só diferiu significativamente do controle no tempo de 36 horas. Além disso, pode também ser notado que a monensina só aumentou 5 significativamente este parâmetro em 36 horas de incubação, quando comparado com o controle e os outros tratamentos.

Tabela 3. Produção de massa microbiana seca (PMM, mg/1 OOmg de MS degradável) de amostras contendo concentrações crescentes em mg/L de ECB (extrato clorofórmico básico) ou monensina (Mon, 5 μΜ), após incubação de 18 e 36 horas.

Tratamento PMM (mg/100 mg de MS degradável) 18 h 36 h ECBO 16,08 ±0,72 7,69 ±0,62 ECB 25 18,85 ± 1,38 8,46 ±0,33 ECB 50 12,50 ±0,05 8,40 ±0,24 ECBlOO 12,32 ±0,70 8,71 ± 1,95 ECB 200 11,81 ±0,10 10,93 ± 2,06 Mon 23,90 ±0,64 18,01 ± 1,64 É extremamente importante destacar que, além de ECB 100 mg/L (extrato clorofórmico básico) apresentar mais eficiência do que a monensina em provocar 15 uma menor produção de gases total ao longo do período de incubação de 36 horas, também causou maior degradação de matéria seca, ambos desejáveis para ruminantes, ao considerar que a fração fibrosa do farelo de trigo representa 44,3% da matéria seca. Em adição, é muito interessante para os animais que a fermentação possa gerar máxima síntese microbiana, produção elevada de ácidos graxos voláteis, 20 especialmente propionato, com menor perda de gases e de calor.

Assim, tendo em vista que Prosopis juliflora é uma planta bastante disponível na natureza, sendo ainda considerada como uma invasora do bioma Caatinga, o presente documento de patente evidencia que o ECB (extrato clorofórmico básico) pode ser utilizado como um aditivo alternativo para reduzir a produção de CiU e CO2 durante a digestão ruminal. A utilização deste extrato, considerado como um extrato natural possui baixo custo e é um substituto bastante eficiente dos ionóforos na redução de produção de gases do efeito estufa, como o CH4. A adição desse extrato alcaloídico em rações para animais ruminantes promove inúmeros benefícios para a cadeia produtiva da pecuária, bem como para o consumidor. Ressalta-se ainda que a 5 descrição que se fez até aqui se refere a uma de suas concretizações preferidas. Deve, entretanto, mais uma vez ficar claro, que a invenção não está limitada à concretização revelada, pois aqueles com habilidades na técnica irão imediatamente perceber que alterações e substituições podem ser feitas dentro deste conceito inventivo aqui descrito. Desta forma, não pode de forma alguma ser considerada 10 como limitante da invenção, a qual está limitada ao escopo das reivindicações que seguem.

Claims (9)

REENVINDICAÇÕES

1. ADITIVO À BASE DE EXTRATO ALCALOÍDICO DE VAGENS DE ALGAROBA (Prosopis juliflora) EM RAÇÕES, UTILIZADO COMO MODIFICADOR DA FERMENTAÇÃO RUMINAL PARA A MELHORIA DO DESEMPENHO ANIMAL E MITIGAÇÃO DA EMISSÃO DE GASES ENTERICOS DE EFEITO ESTUFA caracterizado nor ser obtido através da secagem do material vegetal (vagens de Prosopis juliflora) em uma faixa de temperatura de 25 a 30°C, em uma área bem ventilada, podendo ser ao ar livre, ou utilizando estufa, dessecador ou desidratador com circulação de ar, por um período de aproximadamente 24 horas; seguida por tríturação do material vegetal seco em moinho de facas para obtenção de um pó amarelado e seco, onde a pulverização pode também ser feita de maneira manual, ou seja, utilizando pistilo e almofariz de vidro, porcelana e/ou plástico, bem como, utilização de outros tipos de trituradores mecânicos; e obtenção do extrato alcaloídicos das vagens de Prosopis juliflora por meio da percolação do pó farelado (aproximadamente 2,6 kg) em 8-12 litros, preferencialmente de etanol, entretanto, outros solventes alcóolicos e não alcóolicos podem ser utilizados, como éter de petróleo, clorofórmio, metanol, butanol, hexano, entre outros, em temperatura de 25 a 30°C; e concentração da solução obtida em rotavapor, ou outro equipamento de concentração, preferencialmente à vácuo, para a obtenção do extrato etanólico (EE) bruto das vagens de Prosopis juliflora.

2. ADITIVO À BASE DE EXTRATO ALCALOÍDICO DE VAGENS DE ALGAROBA (Prosopis juliflora) EM RAÇÕES, UTILIZADO COMO MODIFICADOR DA FERMENTAÇÃO RUMINAL PARA A MELHORIA DO DESEMPENHO ANIMAL E MITIGAÇÃO DA EMISSÃO DE GASES ENTÉRICOS DE EFEITO ESTUFA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por obter uma solução ácida (denominada de solução ácida I) a partir do extrato etanólico bruto das vagens de Prosopis juliflora, utilizando-se aproximadamente 570 g desse extrato, fracionando-o em 500 ml de solução aquosa de ácido acético a 10% (v/v), submetido ao processo de filtração, preferencialmente utilizando o funil de Büchner, e o resíduo obtido ser lavado com solução aquosa ácida, fornecendo assim a solução aquosa Ácida I, que deve ser extraída com clorofórmio CHCI3, realizada duas vezes, utilizando-se um volume de 300 ml de CHCI3 para cada extração, e em seguida, a fração orgânica obtida deve ser lavada em solução aquosa de bicarbonato de sódio NaHCO3 5% (m/v), onde a lavagem deve ser realizada duas vezes, utilizando-se um volume de 300 ml de NaHCO3 5% para cada lavagem e solução aquosa saturada de cloreto de sódio NaCl na proporção de 1:1 e por fim, a solução obtida deve ser seca com sulfato de sódio NajSO4 anidro.

3. ADITIVO À BASE DE EXTRATO ALCALOÍDICO DE VAGENS DE ALGAROBA (Prosopis juliflora) EM RAÇÕES, UTILIZADO COMO MODIFICADOR DA FERMENTAÇÃO RUMINAL PARA A MELHORIA DO DESEMPENHO ANIMAL E MITIGAÇÃO DA EMISSÃO DE GASES ENTÉRICOS DE EFEITO ESTUFA, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a solução ácida I deve ser colocada em rotavapor, ou outro equipamento de concentração, preferencialmente à pressão reduzida, para a eliminação CHCl3, obtendo-se assim a solução aquosa Ácida Q e extrato clorofórmico ácido.

4. ADITIVO À BASE DE EXTRATO ALCALOÍDICO DE VAGENS DE ALGAROBA (Prosopis juliflora) EM RAÇÕES, UTILIZADO COMO MODIFICADOR DA FERMENTAÇÃO RUMINAL PARA A MELHORIA DO DESEMPENHO ANIMAL E MITIGAÇÃO DA EMISSÃO DE GASES ENTÉRICOS DE EFEITO ESTUFA, de acordo com a reivindicação 1 ou 3, caracterizado por a solução aquosa ácida Π deve ser neutralizada com NaHCO3 0,6M, realizada duas vezes, utilizando-se um volume de 300 ml de NaHCO3 0,6M para cada etapa, levando a obtenção da solução aquosa básica I que, por sua vez, deve ser extraída com CHCl3 e a camada orgânica obtida deve ser lavada com solução aquosa saturada de NaCl e seca com Na2SO4 anidro, onde o solvente deve ser eliminado preferencialmente em evaporador rotativo sob pressão reduzida, fornecendo solução aquosa neutra Π e extrato clorofórmico neutro.

5. ADITIVO À BASE DE EXTRATO ALCALOÍDICO DE VAGENS DE ALGAROBA (Prosopis juliflora) EM RAÇÕES, UTILIZADO COMO MODIFICADOR DA FERMENTAÇÃO RUMINAL PARA A MELHORIA DO DESEMPENHO ANIMAL E MITIGAÇÃO DA EMISSÃO DE GASES ENTÉRICOS DE EFEITO ESTUFA, de acordo com a reivindicação 1 ou 4, caracterizado por elevar para 9,0 o pH da solução aquosa neutra II, utilizando-se uma solução saturada de hidróxido de sódio NaOH 2M, denominada agora de solução aquosa básica I, que deve ser extraída com CHCfe, onde, a camada orgânica resultante deve ser lavada com solução saturada de NaCl, e seca com NajSO4 anidro e o solvente eliminado preferencialmente sob pressão reduzida, fornecendo solução aquosa básica II e extrato clorofórmico básico (ECB).

6. ADITIVO À BASE DE EXTRATO ALCALOÍDICO DE VAGENS DE ALGAROBA (Prosopis juliflora) EM RAÇÕES, UTILIZADO COMO MODffICADOR DA FERMENTAÇÃO RUMINAL PARA A MELHORIA DO DESEMPENHO ANIMAL E MITIGAÇÃO DA EMISSÃO DE GASES ENTÉRICOS DE EFEITO ESTUFA, de acordo com a reivindicação 1 ou 5, caracterizado por a solução aquosa básica Π deve ser extraída com acetato de etila CH3COOCH2CH3, e em seguida lavada com solução aquosa saturada deNaCl, e seca com NajSO4 anidro, onde o solvente deve ser eliminado preferencialmente em evaporador rotativo sob pressão reduzida, fornecendo a solução aquosa básica IQeo extrato acetato básico (EAB).

7. ADITIVO À BASE DE EXTRATO ALCALOÍDICO DE VAGENS DE ALGAROBA (Prosopis juliflora) EM RAÇÕES, UTILIZADO COMO MODIFICADOR DA FERMENTAÇÃO RUMINAL PARA A MELHORIA DO DESEMPENHO ANIMAL E MITIGAÇÃO DA EMISSÃO DE GASES ENTÉRICOS DE EFEITO ESTUFA» de acordo com a reivindicação 1 ou 6, caracterizado por incorporar o ECB (extrato clorofórmico básico), considerado como aditivo alcaloídico de vagens de algaroba (Prosopis juliflora), em qualquer tipo de ração comercial, concentrada ou não, a base de farelo e outros cereais, como trigo, milho, soja, arroz, entre outros, visto que irá possuir o mesmo efeito quando incorporado a ração comercial a base de trigo.

8. ADITIVO À BASE DE EXTRATO ALCALOÍDICO DE VAGENS DE ALGAROBA (Prosopis juliflora) EM RAÇÕES, UTILIZADO COMO MODffICADOR DA FERMENTAÇÃO RUMINAL PARA A MELHORIA DO DESEMPENHO ANIMAL E MITIGAÇÃO DA EMISSÃO DE GASES ENTÉRICOS DE EFEITO ESTUFA, de acordo com a reivindicação 1 ou 6, caracterizado por incorporar o ECB (extrato clorofórmico básico) purificado e liofilizado, considerado como aditivo alcaloídico de vagens de algaroba (Prosopis juliflora), em qualquer tipo de ração comercial, concentrada ou não, a base de farelo e outros cereais, como trigo, milho, soja, arroz, entre outros, visto que irá possuir o mesmo efeito quando incorporado a ração comercial a base de trigo.

9. ADITIVO À BASE DE EXTRATO ALCALOÍDICO DE VAGENS DE ALGAROBA (Prosopis juliflora) EM RAÇÕES, UTILIZADO COMO MODIFICADOR DA FERMENTAÇÃO RUMINAL PARA A MELHORIA DO DESEMPENHO ANIMAL E MITIGAÇÃO DA EMISSÃO DE GASES ENTÉRICOS DE EFEITO ESTUFA, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado nor o aditivo a base de extrato alcaloídico (extrato clorofórmico básico) de vagens de algaroba (Prosopis juliflora) possuir uma função de modificar a fermentação ruminal, diminuindo a emissão de gases de efeito estufa, como o CH4 e melhorando o desempenho animal, quando adicionado em rações destinadas a alimentação dos ruminantes.