BR102012013631A2

BR102012013631A2 - processo isolamento e criopreservação de células-tronco pós-natais adultas de pequenos e grandes animais, oriundas de nichos de polpa de dente, objetivando um método para o tratamento autólogo, heterólogo ou alogênico, e/ou prevenção de doenças e banco de células-tronco

Info

Publication number: BR102012013631A2
Application number: BR102012013631A
Authority: BR
Inventors: Valverde Wenceslau Cristiane; Jardim Clemente E Santos Enrico
Original assignee: Celltrovet Atividades Veterinarias Ltda Me
Priority date: 2012-06-06
Filing date: 2012-06-06
Publication date: 2018-09-11

Abstract

processo isolamento e criopreservação de células-tronco pós-natais adultas de pequenos e grandes animais, oriundas de nichos de polpa de dente, objetivando um método para o tratamento autólogo, heterólogo ou alogênico, e/ou prevenção de doenças e banco de células-tronco. a presente invenção refere-se a um processo de obtenção de células-tronco adultas de pequenos animais, cães e gatos, e grandes animais, equinos, bovinos, suínos, ovinos e caprinos a partir de nichos de células-tronco presentes na polpa dentária. as células-tronco obtidas por este processo apresentam inúmeras possibilidades de aplicação dentre as quais terapêutica (transplante autólogo, heterólogo ou alogênico), farmacêutica e biotecnológica.

Description

(54) Título: PROCESSO ISOLAMENTO E CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO PÓS-NATAIS ADULTAS DE PEQUENOS E GRANDES ANIMAIS, ORIUNDAS DE NICHOS DE POLPA DE DENTE, OBJETIVANDO UM MÉTODO PARA O TRATAMENTO AUTÓLOGO, HETERÓLOGO OU ALOGÊNICO, E/OU PREVENÇÃO DE DOENÇAS E BANCO DE CÉLULAS-TRONCO (51) Int. Cl.: C12N 5/074; A61K 35/32; A61K 48/00; A61L 27/38 (73) Titular(es): CELLTROVET ATIVIDADES VETERINÁRIAS LTDA ME (72) Inventor(es): ENRICO JARDIM CLEMENTE E SANTOS; CRISTIANE VALVERDE WENCESLAU (85) Data do Início da Fase Nacional:

06/06/2012 (57) Resumo: PROCESSO ISOLAMENTO E CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO PÓS-NATAIS ADULTAS DE PEQUENOS E GRANDES ANIMAIS, ORIUNDAS DE NICHOS DE POLPA DE DENTE, OBJETIVANDO UM MÉTODO PARA O TRATAMENTO AUTÓLOGO, HETERÓLOGO OU ALOGÊNICO, E/OU PREVENÇÃO DE DOENÇAS E BANCO DE CÉLULAS-TRONCO. A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de célulastronco adultas de pequenos animais, cães e gatos, e grandes animais, equinos, bovinos, suínos, ovinos e caprinos a partir de nichos de células-tronco presentes na polpa dentária. As células-tronco obtidas por este processo apresentam inúmeras possibilidades de aplicação dentre as quais terapêutica (transplante autólogo, heterólogo ou alogênico), farmacêutica e biotecnológica.

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PROCESSO ISOLAMENTO E CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULASTRONCO PÓS-NATAIS ADULTAS DE PEQUENOS E GRANDES ANIMAIS, ORIUNDAS DE NICHOS DE POLPA DE DENTE, OBJETIVANDO UM MÉTODO PARA O TRATAMENTO AUTÓLOGO, HETERÓLOGO OU ALOGÊNICO, E/OU PREVENÇÃO DE DOENÇAS E BANCO DE CÉLULAS-TRONCO.

Apresentação da Invenção

A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de células-tronco adultas de pequenos animais, cães e gatos, e grandes animais, equinos, bovinos, suínos, ovinos e caprinos a partir de nichos de células-tronco presentes na polpa dentária. As células-tronco obtidas por meio deste processo apresentam inúmeras possibilidades de aplicação dentre as quais terapêuticas (transplante autólogo, heterólogo ou alogênico), farmacêuticas e biotecnológicas.

Antecedentes da Invenção

As células-tronco constituem uma população de células com características singulares extremamente atrativas para a medicina regenerativaL Podem ser definidas como células primordiais indiferenciadas com capacidade de auto-renovação, podendo se diferenciar em diversos tipos celulares quando reintroduzidas no organismo de forma a adquirir a funcionalidade de qualquer tecido, apresentando assim, forte potencial em processos de regeneração tecidual (Caplan, 2000, 2003).

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A formação de órgãos e tecidos ocorre de forma natural durante o desenvolvimento pré-natal do organismo e é mantida durante toda a vida do indivíduo através de processos de reparação celular, que são iniciados em casos de trauma ou doença. Porém a capacidade das células de regenerar órgãos e tecidos em adultos é limitada. O desenvolvimento, crescimento e reparação de órgãos estão baseados na diferenciação celular, que inclui a proliferação e a capacidade de se diferenciar para várias linhagens celulares especificas. As células que promovem a manutenção contínua e o reparo de órgãos após o nascimento não são diferenciadas, e são denominadas de células de reserva ou células-tronco pós-natais adultas demonstrando assim o seu enorme potencial na medicina (Caplan, 1991).

Apresentação dos Problemas Existentes

As células-tronco são encontradas em todos os órgãos do organismo, sendo responsáveis pela sua manutenção durante toda a vida. Essa manutenção ocorre graças à sua plasticidade, capacidade de auto-renovação e atividade de um grande número de moléculas bioativas, que atuam modulando a resposta inflamatória, angiogênese e mitose das células envolvidas no processo de reparação tecidual (Wan et al., 2008; Caplan, 2009).

Devido a sua capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares, quando reintroduzidas no organismo e adquirir a funcionalidade de qualquer tecido, estas células apresentam um forte potencial nos processos de regeneração tecidual (Caplan, 2000, 2003).

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Desta forma, as células-tronco têm despertado um grande interesse na medicina regenerativa.

Embora existam no mercado diversos bancos humanos de células-tronco, conhecidos como banco de cordão umbilical (Crypraxis 5 www.cryopraxis.com.br, Cordivida - www.cordivida.com.br, Cordcell - www.cordcell.com.br, Criogenesis - www.criogenesis.com.br, Hemocord - www.hemocord.com.br, BCU Brasil - www.bcubrasil.com.br), estes se restringem ao armazenamento apenas de células-tronco derivadas do cordão umbilical humanas.

As células-tronco derivadas do cordão umbilical permitem que sejam efetuados dois tipos de transplante, o transplante autólogo e o alogênico.

No transplante autólogo, também conhecido como transplante autogenico, as células-tronco transplantadas são do próprio indivíduo, ou seja, apresentam a mesma composição genética.

No transplante alogênico, as células-transplantadas são de um doador diferente do receptor, que tenha uma composição genética similar ao do pacientes, ou seja, um parente próximo como irmão ou irmã.

Um bom exemplo são os pacientes com linfoma que após serem submetidos ao tratamento de quimioterapia objetivando a eliminação das células neoplásicas, são submetidos ao transplante com células-tronco obtidas e armazenadas anteriormente a partir do próprio indivíduo ou de indivíduos com composição genética similar ao do paciente, deforma a recuperar a medula destruída pelo tratamento.

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O armazenamento das células-tronco derivadas do cordão umbilical apresentam limitações dentre as quais temos: 1 - A possibilidade de se obter as células-tronco do cordão umbilical, objetivando a sua criopreservação, se restringe ao momento do nascimento do indivíduo. Tal fato inviabiliza um possível desejo posterior de armazenar as células-tronco do indivíduo. 2 - A quantidade de células-tronco obtidas a partir do cordão umbilical é baixa, estando na proporção de aproximadamente 1 célula-tronco para cada 10 milhões de células mononucleares obtidas a partir do procedimento, 3 Inviabiliza o transplante heterólogo, ou seja, de indivíduos de composição genética totalmente distinta. 4 - As células-tronco obtidas por meios dos processos conhecidos tem demonstrado uma limitada capacidade de diferenciação, ou seja, baixa plasticidade, pois as linhagens obtidas pelas técnicas conhecidas apresentam a capacidade de se diferenciarem apenas para um número restrito de tipos celulares (Murry et. al, 2004).

No campo da medicina-veterinãria, ainda não existe um processo que possibilite a obtenção de células-tronco de pequenos e grandes animais, a partir de diferentes nichos teciduais, neste caso nichos presentes na polpa dentária, para a sua posterior criopreservação e aplicação terapêutica, seja ela autóloga, alogênica ou heteróloga.

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Apresentação da Solução em Linhas Gerais

Tendo em vista as limitações apresentadas pelo banco de células-tronco de cordão umbilical, assim como ausência do mesmo no campo da medicina-vetreinária, foi desenvolvido um processo visando à obtenção e criopreservação de células-tronco pós-natais adultas de pequenos e grandes animais derivadas de nichos de polpa dentária objetivando um método para o tratamento autólogo, heterólogo ou alogênico, e/ou prevenção de doenças e banco de células-tronco. Desta forma, será suprida uma necessidade atualmente presente no mercado veterinário.

A característica mais importante da polpa dentária como fonte de células-tronco é que seu isolamento não apresenta um grande risco para a saúde animal, uma vez que o procedimento pode ser feito no momento da troca dentária do animal ou mesmo em um processo de tratamento dentário. Ao mesmo tempo, permite a obtenção de grandes quantidades de células-tronco, que poderão ser processadas e criopreservadas. Desta forma, permitem sua pronta utilização quando requeridas pelo proprietário ou Médico Veterinário.

O processo desenvolvido visa ã obtenção de células-tronco pós-natais adulta a partir de nichos presentes na polpa dentária. A utilização destas fontes permite que as células-tronco possam ser obtidas, para a sua posterior criopreservação, durante a troca do dente decíduo do animal ou durante um processo que permita a obtenção da polpa de um dente adulto. Desta forma, fica excluída a limitação característica das células-tronco derivadas do cordão umbilical, ou seja,

6/25 a restrição de apenas poder ser obter as células-tronco no momento do nascimento do indivíduo.

As células-tronco podem ser obtidas em grandes quantidades, devido ao seu alto potencial de proliferação, a partir de um pequeno fragmento de polpa dentária.

As células-tronco pós-natais adultas obtidas a partir da polpa dentária apresentam a característica de não serem reconhecidas pelo sistema imune do receptor quando obtidas a partir de cultura de células-tronco homogenias. Uma vez que elas atuam como imunomodulatores e imunossupressores, não ocorre a indução da resposta imunológica e à sua rejeição por parte do organismo recipiente. Tal fato, diferentemente das células-tronco obítas do cordão umbilical, possibilita a sua utilização terapêutica a nível heterõlogo quando em seu estado homogênio, ou seja, de indivíduos com composição genética totalmente distinta.

Diferentemente das células-tronco derivadas do cordão umbilical, as células obtidas da polpa dentária demonstraram possuir uma ampla capacidade de diferenciação, ou seja, alta taxa de plasticidade. Tal fato permite que estas células-tronco se diferenciem para um grande número de tipos celulares comprovando assim a sua possível utilização terapêutica em doenças que acometem diferentes órgãos.

Devido ao grande crescimento da clinica médica-veterinãria a terapia celular pode ser inserida como uma nova terapia para o tratamento ou melhoria da qualidade de vida para diversas doenças que atingem os pequenos e/ou grandes animais. Sendo assim, faz-se

7/25 necessário ol desenvolvimento de métodos eficientes de isolamento de populações homogênias de células-tronco.

O processo desenvolvido no invento pelo Depositante permite a realização de um procedimento de isolamento de populações homogênias de células-tronco adultas a partir da polpa dentária com capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares com ou sem a presença de indutores. Tal resultado possibilita a utilização das célulastronco em tratamentos autólogos, alogenícos e heterólogos com ou sem a presença de agentes indutores e/ou biomateriais.

O tratamento utilizando um concentrado heterólogo de células-tronco pós-natais adultas apresenta um grande potencial, uma vez que eliminam a necessidade de submeter um paciente já debilitado a um procedimento de retirada de tecido de onde serão isoladas as células-tronco.

bom o transcorrer da idade o número de células-tronco presentes nos nichos dos tecidos tende a decair o que diminui o potencial de regeneração tecidual. Tal fato pode ser comprovado por meio da comparação do processo de recuperação de uma mesma fratura ocorrida em uma criança de 12 anos de idade e um homem de 70 anos de idade. A queda no número de células-tronco no transcorrer da vida de um indivíduo é um fator determinante no processo de recuperação da lesão.

Desta forma, se estabelece as condições para a criação de um banco de heterólogo e de um banco autólogo de células-tronco originárias da polpa dentária tanto de origem animal como humana.

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Descrição das Figuras

A figura 1 mostra a polpa dentária da qual é processada em laboratório de forma a se isolar uma cultura de células-tronco.

A figura 2 mostra uma cultura de células-tronco isolada da polpa dentária, em crescimento (aumento de lOx).

A figura 3 mostra a curva de crescimento de uma cultura de células-tronco isolada da polpa dentária. Neste gráfico, uma colônia de células-tronco foi expandida até atingir a concentração 10⁵ células. Esta foi repicada diariamente até o 14° dia com um crescimento exponencial demonstrando o alto potencial de crescimento destas células.

A figura 4 mostra a diferenciação das células-tronco isolada da polpa dentária em células do tecido ósseo comprovada pelas regiões mineralizadas. Marcação com Von Kossa demonstrando a calcificação da matéria extracelular após 21 dias de diferenciação (aumento de lOx).

A figura 5 mostra a diferenciação das células-tronco isolada da polpa dentária em células do tecido adiposo comprovada pelas regiões de gordura marcadas com Oil Red O (aumento de lOx).

A figura 6 mostra a metacromasia observada nas célulastrono isoladas a partir da polpa de dente após a indução da diferenciação condrogênica. Coloração com azul de toluidina (aumento de 40 x).

A figura 7 mostra a marcação por imunofluorescência com a expressão de Oct-4 e vimentina nas células-tronco isoladas a partir da polpa de dente, passagem 5. (A) Marcação para OCT-4 (anticorpo 1/100); (B) Confocal; (C) Marcação com vimentina (anticorpo 1/500); (D) Marcação dupla OCT-4/ Vimentina.

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A figura 8 mostra a marcação por Imunofluorescência com a expressão de Sox-2 e DAPI das células-tronco isoladas a partir da polpa dentária (A) Marcação para Sox-2 (anticorpo 1/100); (B) Núcleo marcado com DAPI (azul); (C) Marcação dupla Sox-2/DAPI.

A figura 9 mostra a marcação para osteocalcina (LF32, LF126 e Sialoproteína). LF32 (A = Marcação nuclear com DAPI; B = Marcação com osteocalcina e C = Sobreposição das duas imagens), LF126 (D = Marcação nuclear com DAPI; E = Marcação com osteocalcina e F = Sobreposição das duas imagens) e Sialoproteína (G = Marcação nuclear com DAPI; H = Marcação com osteocalcina e I = Sobreposição das duas imagens).

A figura 10 mostra a marcação por imunofluorescência para agrecan (A=Marcação nuclear com DAPI; B=Marcação com agrecan e C= sobreposição das duas imagens), colãgeno tipo II (D=Marcação nuclear com DAPI; E=Marcação para colãgeno tipo II e F=Sobreposíção das duas imagens) e proteoglicana (G=Marcação nuclear com DAPI; H=Marcação para proteoglicana e I=Sobreposição das duas imagens).

A figura 11 mostra a similar morfologia das células-tronco isoladas da polpa dentária antes (A) e após (B) serem expostas ao processo de criopreservação (aumento de lOx).

A figura 12 mostra o gráfico representativo do potencial proliferativo das células-tronco isoladas da polpa dentária antes e após o congelamento durante 27 dias (10 passagens)

A figura 13 mostra a diferenciação osteogênica das célulastronco isoladas a partir da polpa dentária antes (A) e após (B) serem submetidas ao processo de criopreservação (aumento de 20x). Marcação

10/25 com Von Kossa demonstrando a calciíicação da matéria extracelular após 21 dias de diferenciação.

A figura 14 mostra a diferenciação adipogênica das célulastronco isoladas a partir da polpa dentária antes (A) e após (B) serem submetidas ao processo de criopreservação. A marcação com OU Red O demonstra o acúmulo de gotas lipídicas (seta) nas culturas que forma expostas ao processo de diferenciação (aumento de 40x em contraste de fase).

A figura 15 mostra a diferenciação condrogênica induzida com TGFpl das células-tronco isoladas a partir da polpa dentária. Marcação positiva para azul de toluidina foi observada na cultura em pellet antes (A) e após (B) as células-tronco terem sido submetidas ao processo de criopreservação (aumento de 40 x).

A figura 16 mostra por meio do gel a integridade do RNA total extraído da amostra de células-tronco isolada a partira do tecido adiposo. M= marcador e P= Células-tronco isoladas a partir da polpa dentária.

A figura 17 mostra a expressão dos genes Nanog, Oct4 e Sox2 após a reação de RT-PCR feita a partir do RNA total obtido a partir das células-tronco isoladas a partir da polpa dentária. M= Marcador, PN= Expressão do gene Nanog a partir das células-tronco isoladas a partir da polpa dentária, PC)^- Expressão do gene Oct4 a partir das células-tronco isoladas a partir da polpa dentária e PS= Expressão do gene Sox2 a partir das células tronco isoladas a partir da polpa dentária.

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Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção destina-se a um processo de obtenção de células-tronco pós-natais adultas de pequenos e grandes animais a partir de nichos presentes na polpa dentária.

A presente invenção também trata do estabelecimento de um banco de células-tronco pós-natais adultas derivadas da polpa dentária de pequenos e grandes animais.

As células-tronco em questão demonstraram manter as suas características de proliferação e diferenciação mesmo após serem submetidas ao processo de criopreservação possibilitando desta forma o estabelecimentos de um banco de células-tronco pós-natais adultas derivadas da polpa dentária de pequenos e grandes animais

Tal invenção também objetiva viabilizar os tratamentos e/ou prevenção de doenças por meio da utilização de células-tronco autólogas, heterólogas ou alogênicas a partir de um banco de célulastronco autólogo e/ou heterólogo oriundo da polpa dentária.

Também trata-se na presente invenção da utilização das células-tronco pós-natais adultas derivadas da polpa dentária ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, em tratamentos preventivo e/ou curativo de doenças.

A presente invenção destina-se também a utilização das células-tronco heterólogas ou autólogas derivas da polpa dentária, submetidas ou não ao processo de criopreservação, seus concentrados, diferenciados ou não, modificados ou não de forma a poderem ser utilizados na engenharia tecidual, terapia gênica ou celular assim como

12/25 em estudos inuiLro envolvendo drogas ou produtos farmacêuticos e/ou bio tecnológicos.

A presente invenção também objetiva a criopreservação de fragmentos de polpa dentária antes do isolamento das células-tronco.

Descrição Detalhada da Invenção

A presente invenção tem como meta a obtenção de célulastronco pós-natais adultas oriundas a partir da polpa de dentes de leite ou adultos de pequenos e grandes animais. De acordo com a presente invenção as células-tronco são particularmente extraídas e isoladas a partir de nichos de células-tronco presentes na polpa dentária e armazenadas, na forma de culturas homogenías, ou pequenos fragmentos de polpa dentária, em botijões de nitrogênio líquido. De acordo com¹ a presente invenção a polpa dentaria poderá ser críopreservada antes de ser submetida ao processo visando o isolamento das células-tronco.

Sendo uma população de células-tronco homogênia, as células se diferenciam de forma uniforme para os diferentes tipos celulares o que possibilita uma efetiva e ampla substituição das populações de células deficientes e/ou danificadas presentes no tecido lesado.

Isolamento e Armazenamento de Fragmentos da Polpa Dentária

Na presente inovação o processo de criopreservação do fragmento de polpa dentária retirado do animal ocorre quando o tecido é exposto a “meio apropriado”. Inicialmente a polpa dentária é lavada

13/25 em tampão salino Ix, com ou sem antibiótico, de forma a retirar debris e possíveis contaminantes ainda presentes na amostra (Figura 1). Após a lavagem a polpa pode ser fragmentada ou não, exposta a “meio apropriado”, inserida em criotubo e mantida criopreservada em nitrogênio. Na presente invenção, o meio de criopreservação pode conter soro fetal em uma concentração de 10% a 30% sendo utilizado preferencialmente à concentração de 20%. A concentração de meio, preferencialmente DMEM/F12, pode variar de 80% a 60% e a do criopreservador dimetilsulfóxido (DMSO) de 5% a 10%. Em ambos os casos a concentração preferencial é de 70% e 10% respectivamente. Posteriormente, a temperatura é gradualmente reduzida, aproximadamente 1°C por minuto até a temperatura de - 80°C, sendo transferida após 24 horas para um botijão de nitrogênio líquido. Posteriormente as células-tronco foram isoladas e testadas quanto a sua pluripotencialidade por meio das técnicas de curva de crescimento, expressão gênica e diferenciação in vitro.

Isolamento e Armazenamento das Células- Tronco A polpa dentária é retirada do animal e lavada em tampão salino acrescido ou não de antibiótico de forma a retirar debris e possíveis contaminantes ainda presentes na amostra (Figura 1). Após a lavagem e polpa é mantida preferencialmente em placas de Petri 35-mm sendo o tecido pulpar fragmentado. Após a fragmentação o tecido pulpar pode ou não ser exposto a digestão enzimática. No primeiro caso após a fragmentação é adicionado “meio apropriado” sendo o tecido pulpar posteriormente mantido a 37°C em 5% CO2 sendo o meio

14/25 trocado se necessário. No segundo caso, o tecido pulpar, após fragmentação ou não, é exposto a uma solução de tripisina (tripsina/EDTA ou Tryple-Express) e mantido em estufa úmida a 37°C, contendo 5% de CO2 por pelo menos 5 minutos. Após a ação enzimática, a tripsina é neutralizada com “meio apropriado” sendo posteriormente mantida a 37°C em 5% CO2 e o meio trocado se necessário. Após ocuparem 70% da área cultivável, o meio de cultivo é inicialmente descartado, sendo as células-tronco lavadas duas vezes com solução tampão PBS ou D-PBS (as soluções tampões utilizadas para lavagem das células podem ser phosphate-buffered saline (PBS 0,01M, ph= 7,4) e/ou phosphate-buffered saline A (PBS-A - 0,01M, ph= 7,4)), dissociadas na presença de uma solução de tripsina/EDTA, pelo menos 0,05%, (Life Technologies) ou Triple Express (Life Technologies), ressuspensas em meio de congelamento e posteriormente alíquotas. As células-tronco foram mantidas criopreservadas em nitrogênio líquido utilizando meio com crioprotetor - dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma Chemical, St Louis, MO, EUA). Posteriormente as células foram testadas quanto a sua pluripotencialidade por meio das técnicas de curva de crescimento, expressão gênica e diferenciação in uitro.

De acordo com a presente invenção, o “meio apropriado” da presente etapa refere-se a meios de cultura de células-tronco capazes de promover o isolamento de populações homogenias e puras de células-tronco como, por exemplo, o meio DMEM (Dulbecco's modified Eaglees's médium, Life Technologies), DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle Médium: Nutrient Mixture F-12, Life Technologies) e ALFA-MEM

15/25 (Minimum Essential Médium, Life Technologies)) acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos.

O meio em questão deve ser suplementado, de acordo com o processo, como variações de 10% a 20% de soro sendo preferencialmente utilizada à concentração de 15%. A presente invenção utiliza particularmente o soro de origem bovina (FSB, HyClone, Washington) não descartando porém a possível utilização de soros sintéticos ou não, humanos e de outros animais que possam ser empregados na presente inovação. A utilização de outros reagentes sintéticos ou não, que propiciem uma maior eficiência no processo de isolamento das células-tronco originarias da polpa dentária, inclusive associação dos mesmos, devem ser considerados na presente invenção, pois estão relacionados nas variações e aprimoramentos do processo como relatado anteriormente.

O	meio	para cultivo	de	células-tronco pode ser
suplementado	como	antibiótico,	em	particular penicilina e
estreptomicina,	e/ou	aminoãcidos como,	por exemplo, glutamina e

outros aminoãcidos não-essenciais ou o conjunto dos mesmos.

Na presente inovação o processo de criopreservação das células-tronco oriundas da polpa dentária ocorre quando as células são ressupensas em meio apropriado. Na presente invenção, o meio de criopreservação pode conter soro fetal em uma concentração de 10% a 30% sendo utilizado preferencialmente à concentração de 20%. A concentração de DMEM/F12 ou DMEM pode variar de 80% a 60% e a do criopreservador dimetilsulfóxido (DMSO) de 5% a 10%. Em ambos os casos a concentração preferencial é de 70% e 10% respectivamente.

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Após as células-tronco serem ressupensas em meio de criopreserva.ção apropriado, as mesmas são armazenadas em criotubos

I em concentrações que podem variar de 5 x 10⁵ a 3 x 10⁶ células-tronco por ml. A temperatura é gradualmente reduzida, aproximadamente 1°C por minuto até a temperatura de - 80°C, sendo transferida após 24 horas para um botijão de nitrogênio líquido.

Para descongelar as células, os criotubos são colocados em banho-maria e mantidos por 2 minutos, sendo posteriormente adicionado meio contendo 20% de soro fetal bovino e 80% de DMEM/F12 ou DMEM e este introduzido em garrafa de cultivo T25. No dia seguinte o meio é substituído pelo “meio apropriado”.

Expansão, Proliferação e Diferenciação

As células-tronco isoladas a partir de nichos da polpa dentária de pequenos e grandes animais, por meio da presente invenção, são capazes de se auto-renovar, proliferar continuamente e se diferenciarem em tipo celulares derivados de diferentes folhetos embrionários como, por exemplo, mesoderma (gordura, osso e cartilagem} e ectoderma (neurônios).

Expansão das Células-Tronco

A cultura de células-tronco da presente invenção permite o repique, por meio de dissociação celular, contínua, sendo a cultura da presente invenção mantida constantemente semiconfíuente de modo a prevenir a diferenciação celular espontânea por parte das células-tronco em questão. Entende-se por cultivo “semiconfíuente” o cultivo que não

17/25 esteja tão denso de forma que se caracterize como culturas confluentes de alta densidade.

As células-tronco em cultura são dissociadas por meio do seguinte processo. O meio de cultivo é inicialmente descartado sendo as células-tronco, lavadas duas vezes com solução tampão PBS ou D-PBS, dissociadas na presença de uma solução de tripsina/EDTA, pelomentos 0,05% (Life Technologies) ou Triple Express (Life Technologies) e transferidas da garrafa para um tubo falcon, centrifugadas à 500g por 5 minutos, onde o pellet é posteriormente ressuspendido em 2ml de meio basal e lml transferido para uma nova garrafa de cultura sendo o outro lml para outra garrafa de 25 cm², a cada uma das garrafas acrescentase 4ml do meio de cultura basal, podendo também se transferir 2ml para uma garrafa de 75 cm² acrescentando-se lOml do meio basal.

Curva de Proliferação de Células-Tronco

Uma das características principais das células-tronco é o seu crescimento exponencial, após sucessivos repiqueis. A partir de uma amostra de polpa dentária obtivemos a concentração de lxlO⁵células-tronco. O gráfico (Figura 3) demonstra que as células-tronco obtidas a partir de uma célula-tronco isolada de uma colônia de células, têm o seu crescimento exponencial após o 5 repiques os quais foram feitos diariamente. Este resultado demonstra o alto potencial do crescimento destas células com a possibilidade produzir quantidade suficiente para sucessivas aplacações na terapia celular.

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Estes dados são extremamente importantes devido ao foto de que os últimos achados na área de terapia celular demonstram que a quantidade de células é um fator crucial para o sucesso da terapia.

As células-tronco isoladas a partir de nichos do tecido pulpar, foram também analisadas quanto ao seu potencial proliferativo antes e após serem submetidas ao processo de criopreservação. Diferentemente da análise proliferativa anterior, está é feita a cada três dias mantendo como base de crescimento sempre a concentração de 1 x 105 e não o número total de células-tronco do cultivo anterior (Figura 12).

As células-tronco isoladas a partir da polpa dentária apresentaram tanto antes como após o processo de criopreservação um significativo declínio a partir da sexta passagem na curva de proliferação

Foi observado que o pico de crescimento das células-tronco em ambos os casos, antes e após o processo de criopreservação, ocorreu na quinta passagem. Este dado sugere que as células-tronco a serem utilizadas na terapia devem estar no máximo no sexto repique.

Diferenciação Osteogênica

As células-tronco isoladas a partir de nichos da polpa dentária foram capazes de se diferenciar para osteoblastos uma vez que também apresentaram sinais de mineralização (Figura 4 e 13).

As células-tronco isoladas a partir de nichos da polpa dentária foram cultivadas em meio (DMEM/F12 + 10 % de Soro Fetal Bovino + 1% de L/glutamina + 1% de Streptomicina/Penicilina) durante

19/25 o período de 24 horas na concentração inicial de lxlO⁵ células. Após as 24 horas o meio foi trocado para o de diferenciação osteogênica (DMEMLG (low glucose) + 1% de 10 ⁵M de dexamethasone + 1% 5 mM de acido ascórbico + 10% de soro fetal bovino + 1% Streptomicina/Penicilina). A trocar o meio foi feita a cada 3 ou 4 dias. No dia 10 foi adicionado 1% de 200 mM de β-glicerolfosfato ao meio de cultura e nas trocas subsequentes. As células foram mantidas em cultura até o 21° dia de diferenciação. A caracterização das células foi feita por meio da coloração de Von Kossa (Figura 4 e 13) e imunoflurecência (Figura 9). O cultivo controle foi mantido em meio durante todo experimento (DMEM + 10 % de Soro Fetal Bovino + 1% de L/glutamina + 1% de Streptomicina / Penicilina).

Na técnica de Von Kossa as células foram lavadas com solução tampão fosfato salina PBSA lx por 2 minutos e fixadas com 5 mL de solução de paraformaldeído a 4% em PBSA, por 1 hora. A seguir as células foram expostas à luz UV em presença de uma solução de nitrato de prata 1% por 45 minutos. As células forma lavadas lx com agua destilada aplicando posteriormente solução de Tiossulfato de sódio 3% por 5 minutos sendo novamente lavandas com água destilada.

Aplicou-se o corante de Von Gieson (1% de fucsina, 49% de ácido pícrico saturado e 50% de água destilada) por 5 minutos utilizando álcool 70% para remoção do corante sendo as imagens capturadas sob o microscópio Nikon Eclipse Ti-S, Japan. Os dados demonstraram que as células-tronco pós-natais adulas provenientes de nichos de polpa dentária são capazes de gerar osso “in vitro”.

20/25

Diferenciação Adipogênica

As células-tronco pós-natais adulas isoladas a partir de nichos de polpa dentária foram capazes, através do protocolo descrito a seguir, de se diferenciarem em adipócitos (Figura 5 e 14).

Para induzir a diferenciação adipogênica cultivamos lxlO⁵ células-tronco em meio de cultivo (DMEM + 10 % de Soro Fetal Bovino + 1% de L/glutamina + 1% de Streptomicina/Penicilina) durante 24 horas. Em seguida o meio basal foi trocado para o meio de diferenciação (DMEM + 0,25M Isobutilmetilxantina + 10 μΜ Insulina + 10% de Soro Fetal Bovino + 1% Streptomicina/ Penicilina). A troca do meio foi realizada a cada 3 ou 4 dias. As células foram mantidas em cultura até o 21° dia. Após este período, as células foram fixadas por 60 minutos a temperatura ambiente com paraformaldéido 4% e lavadas 3 vezes com etanol 70%. Para serem coradas, as células foram encubadas a temperatura ambiente por 5 minutos com Oil Red O sendo posteriormente lavadas 3 vezes com água destilada (DMEM + 10 % de Soro Fetal Bovino + 1% de L/ glutamina + 1 % de

Streptomicina/Penicilina). Os dados demonstraram que as células20 tronco pós-natais adulas provenientes de nichos de polpa dentária são capazes de gerar gordura “in vitro”.

Diferenciação Condrogênica

As células-tronco pós-natais adulas isoladas a partir de nichos de polpa dentária foram capazes, por meio de o protocolo

21/25 descrito a seguir de se diferenciarem em tecido cartilaginoso (Figura 6 e 15).

Para diferenciação condrogénica, as células-tronco foram transferidas na concentração 1 x 10⁶ células-tronco para tubos falcon de 15 ml, centrifugadas a 500g por 5 minutos e cultivadas em na presença de meio DMEM, com 1% soro fetal bovino, 6.25 mM insulina, 10 ng/ml TGF-βΙ e 1% penicilina. A troca do meio indutor foi realizada diariamente durante 21 dias. Após este período ocorreu à formação de um pellet esférico o qual foi fixado e incluso em parafina para serem posteriormente cortadas e posteriormente analisadas a nível hístológico. Obtiveram-se cortes histológicos de 3gm, das amostras fixadas, que foram corados com azul de toluidina demonstrando coloração positiva. Também realizamos imunofluorescência com anticorpos específicos para diferenciação condrogénica Agrecan, Colãgeno tipo II e protoglican que foram positivas para os anticorpos, demonstrando que as célulastronco pós-natais adulas provenientes de nichos de polpa dentária são capazes de gerar cartilagem “in miro” (Figura 10).

Análise de Diferenciação por Imunofluorescência

Dez dias após o início da aplicação do meio de diferenciação realizamos a lavagem das células com solução tampão fosfato salina (PBSA) e fixamos as células com solução de paraformaldeído 4% em PBSA. Em seguida lamínulas com as células foram lavadas com solução de TBS (Rinse Buffer- 0,15 M NaCI, 20mM, Tris-HCl, e 0,05% de Tween 20, pH 7.4). Para a permeabilizacão da membrana a solução de 0,1% Triton X-100 em TBS foi usada. Após a

22/25 sequencia de lavagem em TBS e água deionizada autoclavada, as Iamínulas foram incubadas em solução de BSA 5% em PBSA durante 30 minutos para o bloqueio de marcações inespecíficas (Figura 7, 8, 9 c

10).

Análise da Expressão Gênica Via RT-PCR O RNA total das células-tronco pós-natais adultas obtidas a partir de nichos da polpa dentária foi extraído por meio do reagente Trizol (invitrogen). Foi corrido um gel de agarose 0.8% de forma a comprovar a integridade do RNA total extraído (Figura 16).

Após ser comprovada à integridade do RNA total extraído da amostra foi feita a reação de RT-PCR utilizando-se o Kit One-step RTPCR (Qiagen), oligonucleotídeos específicos para os genes Nanog (Forward GAATAACCCGAATTGGAGCAG e Reverse

AGCGATTCCTCTTCACAGTTG - 141 pb), Oct-4 (ForwardGAGTGAGAGGCAACCTGGAG e Reverse

GTGAAGTGAGGGCTCCCATA - 457 pb) e Sox2 (Forward

AGTCTCCAAGCGACGAAAAA e Reverse GCAAGAAGCCTCTCCTTGAA142 pb) e 5 ug de RNA total que resultou na análise da expressão dos genes Nanog, Oct4 e Sox2 (Figura 17). O programa utilizado para a análise RT-PCR foi: 94°C - 3 min, 40 x (94°C - 45 seg, temperatura de anelamento específica para cada oligonucleotídeo — 1 min e 72°C — 1 min) e 72°C - 5 min.

A análise por meio de RT-PCR permitiu detectar a expressão dos genes relacionados ao OCT-4, Nanog e Sox2, todos estes marcadores de células indiferencíadas (Figura 17). Estes resultados

23/25 demonstram que as células isoladas a partir a partir de nichos de células-tronco presentes na polpa dentária se encontram em seu estágio indiferenciado o qual é característico das células-tronco

As células-tronco em questão e/ou seus concentrados, diferenciados ou não, obtidas a partir da presente invenção, podem ser expostos a alterações celulares e/ou genéticas, e/ou utilizadas na terapia genética ou celular, engenharia tecidual bem como modelo in vitro para estudos da indústria farmacêutica e/ou biotecnológica.

As células-tronco isoladas a partir de nichos da polpa dentária de pequenos e grandes animais por meio da presente invenção são capazes de se diferenciarem na ausência indutores, citocinas e/ou fatores de crescimento.

A presente invenção também engloba as células diferenciadas obtidas a partir das células-tronco isoladas por meio do processo inovador descrito anteriormente e o seu respectivo concentrado. As células-tronco obtidas pelo processo inovador desenvolvido se apresentam no seu estágio indiferenciado.

As células-tronco obtidas por meio da presente invenção foram testadas quando ao seu possível potencial tumorogênico por meio da injeção das ditas células-tronco em camundongos NUDE imunodeprimido. As análises demonstraram a ausência de formação de possíveis tumores.

As ditas células-tronco também forma analisas quanto a sua capacidade de se diferenciar in vivo. Para tal, as células foram injetadas em camundongos. As células incorporadas apresentaram o

24/25 padrão morfolõgico do tecido adotado demonstrando sua capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares presentes no organismo.

Os resultados descritos anteriormente sugerem que as células-tronco pós-natais adultas, obtidas por meio do presente processo inovador, são seguras para sua utilização na terapia tecidual / regenerativa.

Desta forma, as células-tronco obtidas por meio da presente invenção, podem ser utilizadas de forma autóloga, heterólogo ou alogenica em pacientes acometidos por diversos tipos de patologias de forma a curar e/ou melhorar a qualidade de vida dos pacientes.

O processo desenvolvido na presente invenção compreende a aplicação das células-tronco e/ ou concentrados, no estado diferenciado ou não, in vitro ou in vivo, em conjunto com diferentes tipos de arabouços, fatores que possam auxiliar no processo de regeneração tecidual e como veículo para carreamento e introdução de estruturas moleculares modificadas e/ou não, visando à terapia gênica e / ou celular.

A presente invenção pode ser utilizada na obtenção de células-tronco pós-natais adultas e/ou concentrados, no estado diferenciado ou não, de pacientes acometidos por patologia e/ou alterações genética. Estas podem ser alteradas molecularmente por meio da terapia gênica e/ou celular e reimplantadas nos pacientes.

Perante o potencial das células-tronco pós-natais adultas e/ou concentrados obtidos a partir de nichos de células-tronco presentes na polpa dentária, a presente invenção contempla a criação de um banco de células-tronco visando a sua utilização terapêutica de

25/25 forma autóloga, heteróloga ou alogênica. Está inovação demonstrou que as células-tronco armazenadas por meio do processo em questão, mantém suas características singulares mesmo após terem sido expostas ao processo de criopreservação possibilitando desta forma a sua utilização terapêutica, farmacológica ou biotecnolõgica.

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Claims

Reivindicações

O presente pedido refere-se ao processo de obtenção de células-tronco e/ou concentrados pós-natais adultos isolados a partir de nichos de células-tronco presentes na polpa dentária de pequenos e grandes animais e o seu processo de armazenamento (banco autólogo e/ou heterólogo) e sua aplicação terapêutica (autóloga, heteróloga ou alogênica), farmacológica e biotecnologia.

1. PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO caracterizado por: (a) lavagem da polpa dentária com solução tampão suplementado com antibióticos; (b) obtenção de células-tronco oriundas da polpa dentária; (c) transferência a um recipiente contendo meio apropriado por meio de dissociação das células; (d) cultivo e expansão das células; (e) congelamento, descongelamento e armazenamento das células.
2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por serem células pós-natais adultos a serem obtidas a partir de nichos de células-tronco presentes na polpa dentária.
3. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por serem de animais de pequeno e grande porte.
4. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 2 e 3, caracterizado por serem de animais recém nascidos, jovens, adultos ou velhos.
5. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de serem células obtidas a partir de polpas normais.

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6. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de serem células obtidas a partir de polpas que apresentem'patologias ou alterações moleculares e/ou celulares.
7. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, 5 caracterizado pelo fato da células serem isoladas por meios mecânicos e/ou enzimáticos
8. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de ser utilizado pelo menos 0.05% de tripisina ou Tryple-Express.

10 9. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do dito ser DMEM.

10. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do dito ser DMEM/F12.

11. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1,

15 caracterizado pelo fato do dito ser ALFA-MEM.

12. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do meio ser suplementado por no mínimo 10% de soro

13. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, [

20 caracterizado pelo fato do meio ser suplementado com cerca de 15% de soro

14. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do dito soro se de origem humana, animal, sintética ou mistura dos mesmos.

25 15. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do dito soro se de origem bovina.

3/9 '16, PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do dito meio conter adicionalmente antibióticos e/ou aminoãcidos.

17. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, 5 caracterizado pelo fato da etapa (d) ser continua compreendendo repiques

18. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 ou 13, caracterizado pelo fato da cultura celular da etapa (d) ser mantida semiconfluente.

10 19. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato das células serem dissociadas na etapa de repique através de meios mecânicos e/ou enzimáticos.

20. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo das células serem tripisinizadas.

15 21. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato das células serem congeladas após a realização das etapas (b) ou (d).

22. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da polpa ser congelada após a realização da

20 etapa (a).

23. PROCESSO caracterizado pelo fato das células serem congeladas após serem diferenciadas ou pré-diferenciadas.

24. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do concentrado celular ser congelado

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25. PROCESSO, caracterizado pelo fato da polpa dentária ser armazenado antes ser submetido ao processo de isolamento das células.

26. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, 21 a 25, caracterizado pelo fato de ser utilizada a concentração de soro fetal de 10% a 30% sendo utilizado preferencialmente à concentração de 20%.

27. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, 21a 25, caracterizado pelo fato de ser utilizada a concentração de DMEM/F12, ALFA-MEM ou DMEM de 80% a 60% sendo utilizado preferencialmente à concentração de 70%.

28. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, 21 a 25, caracterizado pelo fato de ser utilizada a concentração do criopreservador dimetilsulfóxido (DMSO) de 5% a 10% sendo utilizado preferencialmente à concentração de 10%.

29. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, 21 a 25, caracterizado pelo fato da temperatura ser preferencialmente reduzida gradualmente, aproximadamente 1°C por minuto até a temperatura entre - 70°C a - 90°C sendo preferencialmente - 80°C.

30. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, 21 a 25 e 29, caracterizado pelo fato de após 24 horas serem transferida para um botijão de nitrogênio líquido.

31. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1,21 a 25 e 29, caracterizado pelo fato de serem mantidas a temperatura de - 80°C.

32. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, 21 a 24, serem armazenadas em criotubos em concentrações que podem variar de 5 x 10⁵a3x 10⁶ células-tronco por ml.

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33. CÉLULA, caracterizada pelo fato de ser obtida pelo processo definido em uma das reivindicações 1 e 23 .

34. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de ser obtida a partir de polpas dentárias normais. 35. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 33,

caracterizada pelo fato de ser obtida a partir de polpas dentárias que apresentem patologias ou disfunções.

36. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de ser obtida a partir da polpa dentária.

37. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de se diferenciarem sem a formação de tumores.

38. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 33, caracterizada pelo fato de ser molecularmente modificada.

39. CONCENTRADO CELULAR, caracterizado pelo fato de compreender células-tronco conforme definidas em uma das reivindicações 33 a 38.

40. PROCESSO PARA A DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULASTRONCO, caracterizado pelo fato de ser realizado a partir das célulastronco definidas em uma das reivindicações 33 a 38.

41. PROCESSO PARA A DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULASTRONCO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por ser realizado na ausência de soro e/ou indutores para diferenciação.

42. PROCESSO PARA A DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULASTRONCO, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato das células-tronco se diferenciarem em diversas linhagens celulares como,

6/9 por exemplo, osteogêníca, adípogênica, condrogênica, neural e muscular.

43. CÉLULA DIFERENCIADA OU PRÉ-DIFERENCIADA, caracterizada pelo fato de ser obtida a partir do processo definido em uma das reivindicações 40 a 42.

I 44. CÉLULA DIFERENCIADA OU PRÉ-DIFERENCIADA, de acordo com a reivindicação 43, caracterizada pelo fato de não formar tumores.

45. CONCENTRADO CELULAR DIFERENCIADO, caracterizado pelo fato de compreender células diferenciadas conforme definidas em uma das reivindicações 43 ou 44.

46. USO DE CÉLULAS-TRONCO, definidas em uma das reivindicações 33 a 38 ou 43 a 44, ou sob forma do concentrado definido em uma das reivindicações 39 ou 45, caracterizado pelo fato de ser para a terapia regenerativa animal.

47. USO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de ser conjuntamente com arcabouços (“scaffolds”).

48. USO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de ser para a regeneração de tecidos ou membros.

49. USO DE CÉLULAS-TRONCO, definidas em uma das reivindicações 33 a 38 ou 43 a 44, ou sob forma de concentrado definido em uma das reivindicações 39 ou 45, caracterizado pelo fato de ser para apEcação biotecnolõgica.

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50. USO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de ser como veículo para o carreamento e introdução de moléculas modificadas ou não.

51. USO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de ser para vacina gênica ou terapia gênica e/ou celular.

52. USO DE CÉLULAS-TRONCO, definidas em uma das reivindicações 33 a 38 ou 43 a 44, ou sob forma de concentrado definido em uma das reivindicações 39 ou 45, caracterizado por ser para o tratamento curativo e/ou preventivo de doenças.

53. USO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato das ditas doenças serem uma ou mais dentre: doenças genéticas, doenças neurodegenerativas, doenças oftalmológícas, regeneração de cartilagem e/ou articulações, osteoartrites, displasia coxofemoral, traumas, regeneração de ossos, doenças cardiovasculares, doenças angiogêrácas, doenças neuromusculares, regeneração ou reposição da epiderme, lesão na coluna aguda ou crônica, lesão renal aguda ou crônica, cinomose, lesões relacionadas à medula (aplasia, hipoplasia, etc), entre outras.

54. USO DE CÉLULAS-TRONCO, definidas em uma das reivindicações 33 a 38 ou 43 a 44, ou sob forma de concentrado definido em uma das reivindicações 39 ou 45, caracterizado por ser para a avaliação de fármacos ou identificação de compostos.

55. USO DE CÉLULAS-TRONCO, definidas em uma das reivindicações 33 a 38 ou 43 a 44, ou sob forma de concentrado

8/9 definido em uma das reivindicações 39 ou 45, caracterizado por ser para pesquisa farmacêutica.

56. USO DE CÉLULAS-TRONCO, definidas em uma das reivindicações 33 a 38 ou 43 a 44, ou sob forma de concentrado definido em uma das reivindicações 39 ou 45, caracterizado por ser para o estudo de patologias, bem como o seu tratamento.

57. MÉTODO PARA O TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE DOENÇAS, de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo fato de ser para tratamento ou prevenção de uma ou mais dentre doenças genéticas, doenças neurodegenerativas, doenças oftalmológicas, regeneração de cartilagem e/ou articulações, osteoartrites, displasia coxofemoral, traumas, regeneração de ossos, doenças cardiovasculares, doenças angiogênicas, doenças neuromusculares, regeneração ou reposição da epiderme, lesão na coluna aguda ou crônica, lesão renal aguda ou crônica, cinomose, lesões relacionadas à medula (aplasia, hipoplasia, etc), entre outras.

58. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, caracterizado pelo fato de compreender as células definidas em uma das reivindicações 33 a 38 ou 43 a 44, ou sob forma de concentrado definido em uma das reivindicações 39 ou 45.

59. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo falto das células-tronco serem obtidas a partir da polpa dentária.

60. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 58 a 59, caracterizado pelo falto das células-tronco serem autólogas ou heterólogas.
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61. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 58 a 60, caracterizado pelo falto das células-tronco serem utilizadas em terapias autólogas, heterólogas ou alogênicas.

62. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a 5 reivindicação 58 a 61, caracterizado pelo falto das células-tronco serem obtidas a partir da polpa dentária para sua utilização a nível farmacológico ou biotecnológico.

63. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 58 a 61, caracterizado pelo falto das células- a serem
10 obtidas e modificadas molecularmente para a sua utilização na terapia gênica. e/ou celular.

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3/17 • Diasde Cultivo Número de Células

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» » s J. • - • « · τ V tf V A B £ c

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13/17
14/17
15/17
16/17

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Oct4-457 PB ->

Sox2 -142 PB

Nanog- 141 PB

PN PO

OS

M

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