BR102013011213A2 - processo para obtenção e criopreservação de células0tronco pós-natais derivadas de nichos de polpa dentária, objetivando um método para o tratamento autólogo, heterólogo ou alogênico, e/ou prevenção de doenças e banco de células tronco - Google Patents

Abstract

processo para a obtenção e criopreservação de células-tronco pós-natais derivadas de nichos de polpa dentária, objetivando um método para o tratamento autólogo, heterólogo ou alogênico, e/ou prevenção de doenças e banco de celulas tronco. a presente invenção refere-se a um processo de obtenção de células-tronco adultas a partir de nichos de células-tronco presentes na polpa dentária. as células-tronco obtidas por este processo apresentam inúmeras possibilidades de aplicações dentre as quais terapêuticas (transplante autólogo, heterólogo ou alogênico), farmacológicas e biotecnológicas, resultantes do desenvolvimento alcançado pelo inventor.

Description

"PROCESSO PARA A OBTENÇÃO E CRIOPRESERVAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO PÓS-NATAIS DERIVADAS DE NICHOS DE POLPA DENTÁRIA, OBJETIVANDO UM MÉTODO PARA O TRATAMENTO AUTÓLOGO, HETERÓLOGO OU ALOGÊNICO, E/OU PREVENÇÃO DE DOENÇAS E BANCO DE CÉLULAS TRONCO" Apresentação da Invenção A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de células-tronco adultas a partir de nichos de células-tronco presentes na polpa dentária. As células-tronco obtidas por este processo apresentam inúmeras possibilidades de aplicações dentre as quais terapêuticas (transplante autólogo, heterólogo ou alogênico), farmacológicas e biotecnológicas resultantes do desenvolvimento alcançado pelo inventor.

Antecedentes da Invenção O desenvolvimento de mamíferos segue um padrão molecular e celular pré-determinado, culminando na formação de um organismo multicelular com funções definidas. A formação de órgãos è tecidos ocorre de forma natural durante o desenvolvimento pré-natal do organismo sendo mantida durante toda a vida do indivíduo por meio de processos de reparação celular, os quais são iniciados após traumas ou doenças. Porém, a capacidade das células de regenerar órgãos e tecidos em adultos é limitada. O desenvolvimento, crescimento e reparação de órgãos são baseados na diferenciação celular, a qual inclui a proliferação e capacidade de se diferenciar para várias linhagens celulares especificas. As células que promovem a manutenção contínua e reparo de órgãos após o nascimento não são diferenciadas, sendo denominadas células de reserva ou células tronco pós-natais adultas, demonstrando assim o seu enorme potencial na medicina (Caplan, 1991).

Quando as células-tronco são induzidas in vitro a se diferenciarem em um tipo celular específico, sob condições já estabelecidas, elas se apresentam como uma fonte ilimitada para o tratamento de doenças, lesões e transplante tecidual.

Apresentação dos Problemas Existentes As células-tronco são encontradas em todos os órgãos do organismo, sendo responsáveis pela sua manutenção durante toda a vida. Essa manutenção ocorre graças à sua plasticidade, capacidade de auto-renovação e atividade de um grande número de moléculas bioativas, que atuam modulando a resposta inflamatória, angiogênese e mitose das células envolvidas no processo de reparação tecidual (Wan et al., 2008; Caplan, 2009).

Devido a sua capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares, quando reintroduzidas no organismo e adquirir a funcionalidade de qualquer tecido, estas células apresentam um forte potencial nos processos de regeneração tecidual (Caplan, 2000, 2003). Desta forma as células-tronco têm despertado um grande interesse na medicina regenerativa.

Embora existam no mercado diversos bancos humanos de células-tronco, conhecidos como banco de cordão umbilical (Crypraxis - www.cryopraxis.com.br, Cordivida — www.cordivida.com.br, Cordcell — www.cordcelI.com.br, Criogenesis - www.criogenesis.com.br, Hemocord - www.hemocord.com.br, BCU Brasil - www.bcubrasil.com.br), estes se restringem ao armazenamento apenas de células-tronco derivadas do cordão umbilical.

As células-tronco derivadas do cordão umbilical permitem que sejam efetuados dois tipos de transplante, o transplante autólogo e o alogênico.

No transplante autólogo, também conhecido como transplante autogênico, as células-tronco transplantadas são do próprio indivíduo, ou seja, apresentam a mesma composição genética.

No transplante alogênico, as células-transplantadas são de um doador diferente do receptor, que tenha uma composição genética similar ao do pacientes, ou seja, um parente próximo como irmão ou irmã.

Um bom exemplo são os pacientes com linfoma que após serem submetidos ao tratamento de quimioterapia, objetivando a eliminação das células neoplásicas, são submetidos ao transplante com células-tronco obtidas e armazenadas anteriormente a partir do próprio indivíduo ou de indivíduos com composição genética similar ao do paciente, de forma a recuperar a medula destruída pelo tratamento.

O armazenamento das células-tronco derivadas do cordão umbilical apresentam limitações dentre as quais temos: 1 - A possibilidade de se obter as células-tronco do cordão umbilical, objetivando a sua criopreservação se restringe ao momento do nascimento do indivíduo. Tal fato inviabiliza um possível desejo posterior de armazenar as células-tronco do indivíduo. 2 - A quantidade de células-tronco obtidas a partir do cordão umbilical é baixa, estando na proporção de aproximadamente 1 célula-tronco para cada 10 milhões de células mononucleares obtidas a partir do procedimento, 3 -Inviabiliza o transplante heterólogo, ou seja, de indivíduos de composição genética totalmente distinta. 4 - As células-tronco obtidas por meios dos processos conhecidos tem demonstrado uma limitada capacidade de diferenciação, ou seja, baixa plasticidade, pois as linhagens obtidas pelas técnicas conhecidas apresentam a capacidade de se diferenciarem apenas para um número restrito de tipos celulares (Murry et. al, 2004).

Apresentação da Solução em Linhas Gerais Tendo em vista as limitações apresentadas pelo banco de células-tronco de cordão umbilical, foi desenvolvido um processo visando à obtenção e criopreservação de células-tronco pós-natais adultas derivadas de nichos de polpa dentária, de forma mais eficiente, objetivando um método para o tratamento autólogo, heterólogo ou alogênico, e/ou prevenção de doenças e banco de células-tronco. A característica mais importante da polpa dentária, como fonte de células tronco, é o fato de seu isolamento não apresenta risco a saúde do indivíduo, uma vez que o procedimento pode ser feito no momento da troca dentária ou mesmo em um processo de tratamento dentário. Ao mesmo tempo, permite a obtenção de grandes quantidades de células tronco, que poderão ser processadas e criopreservadas, permitindo sua pronta utilização quando necessária. O processo desenvolvido visa à obtenção de células-tronco pós-natais adulta a partir de diferentes nichos de polpa dentária. A utilização destas fontes permite que as células-tronco possam ser obtidas, para a sua posterior criopreservação, durante a troca dos dentes deciduais ou durante um procedimento que permita a obtenção da polpa dentaria de um indivíduo adulto. Desta forma, fica excluída a limitação, característica das células-tronco derivadas do cordão umbilical, ou seja, a restrição de apenas poder ser obtida no momento do nascimento do indivíduo. O processo de obtenção das células-tronco, a partir da polpa dentária, é muito pouco invasivo além de apresentar o mínimo de desconforto para o indivíduo, podendo ser obtidas grandes quantidades a partir de um pequeno fragmento de polpa dentária.

As células-tronco pós-natais adultas obtidas a partir da polpa dentária apresentam a característica de não serem reconhecidas pelo sistema imune do receptor, quando obtidas a partir de cultura de células-tronco homogenias. Uma vez que elas atuam como imunomodulatores e imunossupressores, não ocorre a indução à resposta imunológica e sua rejeição por parte do organismo recipiente. Tal fato, diferentemente das células-tronco obitas do cordão umbilical, possibilita a sua utilização terapêutica a nível heterólogo, quando em seu estado homogênio, ou seja, de indivíduos com composição genética totalmente distinta.

Diferentemente das células-tronco derivadas do cordão umbilical, as células obtidas da polpa dentária demonstraram possuir uma ampla capacidade de proliferação e plasticidade. Tal fato permite que as células-tronco derivada da polpa dentária se diferenciem para um grande número de tipos celulares comprovando assim a sua possível utilização terapêutica em doenças que acometem diferentes tecidos e/ou órgãos.

Devido ao grande crescimento da clinica médica, a terapia celular pode ser inserida como uma nova opção para o tratamento ou melhora da qualidade de vida para diversas doenças que atingem o indivíduo. Sendo assim, faz-se necessário o desenvolvimento de métodos eficientes de isolamento de populações hõmogêniãs de células-tronco. O processo desenvolvido no invento pelo Depositante permite a realização de um procedimento de isolamento de populações homogenias de células-tronco adultas, a partir da polpa dentária, com capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares com ou sem a presença de indutores. Tal resultado possibilita a utilização das células-trono em tratamentos autólogos, alogênicos e heterólogos, com ou sem a presença de agentes indutores e/ou biomateriais. O tratamento utilizando um concentrado heterólogo de células-tronco pós-natais adultas apresenta um grande potencial, uma vez que eliminam a necessidade de submeter um paciente já debilitado, a um procedimento de retirada de tecido de onde serão isoladas as células-tronco para um posterior tratamento.

Com o transcorrer da idade, o número de células-tronco presentes nos nichos dos tecidos tende a decair o que diminui o potencial de regeneração tecidual. Tal fato pode ser comprovado por meio da comparação do processo de recuperação de uma mesma fratura ocorrida em uma criança de 12 anos de idade e um homem de 70 anos de idade. A queda no número de cèlulas-tronco no transcorrer da vida de um indivíduo e um fator fundamental no processo de recuperação da lesão.

Desta forma, se estabelece as condições para a criação de um banco de heterólogo e/ou autólogo e/ou alogênico de células-tronco originárias da polpa dentária de origem humana e animal.

Pbscrição das Figuras A figura 1 mostra um pequeno fragmento de polpa dentária o qual irã ser processado em laboratório de forma a se isolar uma cultura de células-tronco antes ou após ser exposto ao processo de criopreservação (aumento de 20x). A figura 2 mostra as células tronco sendo isoladas a partir de polpas dentárias antes (A) e após (B) serem expostas ao processo de criopreservação (aumento de 50x). A figura 3 mostra a similar morfologia de culturas de células-tronco isoladas a partir da polpa dentária, em crescimento, antes (A) e após (B) serem expostas ao processo de criopreservação (aumento de lOx). A figura 4 mostra a curva de crescimento de culturas de células-tronco isolada de amostras de polpa dentária antes (A) e após (B) serem expostas ao processo de criopreservação. Neste gráfico, colônias de células-tronco foram expandidas até atingirem a concentração 105 células. Esta foi repicada diariamente até o 16° dia quando foi possível obter a concentração de 5 x 106 células-tronco, demonstrando o alto potencial proliferativo destas células. A figura 5 mostra a diferenciação das células-tronco isolada de polpa dentária, antes (A) e após (B) serem expostas ao processo de criopreservação, em células do tecido ósseo. Marcação com Von Kossa demonstrando a calcificação da matriz extracelular. As setas indicam as regiões mineralizadas. (aumento de 40x) A figura 6 mostra a diferenciação das células-tronco isolada de polpa dentária, antes (A) e após (B) serem expostas ao processo de criopreservação, em células do tecido adiposo. A marcação com Oil Red O demonstra o acúmulo de gotas lipídicas nas culturas (aumento de 40x). A figura 7 mostra a as células tronco isoladas a partir da polpa dentária após a indução da diferenciação condrogênica induzida com TGFpi. Marcação positiva para azul de toluidina foi observada na cultura em pellet antes (A) e após (B) as células-tronco terem sido submetidas ao processo de criopreservação. Coloração com azul de toluidina (aumento de 40 x). A figura 8 mostra a diferenciação das células-tronco isolada da polpa dentária em neurônios antes (A) e após (B) serem expostas ao processo de criopreservação. Imagem obtida em microscópio invertido (aumento de 20x). A figura 9 mostra a diferenciação miogênica das células-tronco isoladas da polpa dentária antes (A) e após (B) serem expostas ao processo de criopreservação (aumento de 20x em contraste de fase). Marcação por imunofluorescência com anticorpos específicos para fibras musculares. O anticorpo primário utilizado foi o monoclonal anti-myosin skeleta. O anticorpo secundário utilizado foi o FITC em presença de DAPI. Após a realização da imunofluorescência observou-se a marcação positiva das células indicando o sucesso da diferenciação miogênica.

Estes dados comprovam a multipotencialidade destas células. Desta forma, demonstra-se que estas células, isoladas a partir de nicho de células tronco existentes na polpa dentária, podem produzir tipo celulares derivados de dois folhetos embrionários: mesoderma (gordura, osso, cartilagem e músculo) e ectoderma (neurônios).

Descrição Resumida pa Invenção A presente invenção destina-se a um processo de obtenção de células-tronco pós-natais adultas de origem humana e animal a partir de nichos presentes na polpa dentária. A presente invenção também trata do estabelecimento de um banco de células-tronco pós-natais adultas derivadas da polpa dentária de humanos e animais.

As células-tronco em questão demonstraram manter as suas características de proliferação e diferenciação mesmo após serem submetidas ao processo de criopreservação possibilitando, desta forma, o estabelecimentos de um banco de células-tronco pós-natais adultas derivadas da polpa dentária de humanos e animais.

Tal invenção também objetiva viabilizar os tratamentos e/ou prevenção de doenças por meio da utilização de células-tronco autólogas, heterólogas ou alogênicas a partir de um banco de células-tronco autõlogo e/ou heterólogo e/ou alogênico oriundo da polpa dentária de humanos e animais.

Também trata-se a presente invenção da utilização das células-tronco pós-natais adultas derivadas da polpa dentária ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, em tratamentos preventivo e/ou curativo de doenças. A presente invenção destina-se também a utilização das células-tronco pós-natais adultas heterólogas e/ou autólogas e/ou alogênicas derivadas da polpa dentária, submetidas ou não ao processo de criopreservação, seus concentrados, diferenciados ou não, modificados ou não, de forma a poderem ser utilizados na engenharia tecidual, medicina regenerativa, terapia gênica ou celular assim como em estudos in-mtro envolvendo drogas ou produtos farmacêuticos e/ou biotecnológicos. A presente invenção também objetiva a criopreservação de fragmentos de polpa dentária antes do isolamento das células-tronco.

Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção tem como meta a obtenção de células-tronco pós-natais adultas oriundas de polpa dentária de dentes de leite e/ou adultos de humanos e animais. De acordo com a presente invenção as células-tronco são particularmente extraídas e isoladas a partir de nichos de células-tronco presentes na polpa dentária e armazenadas, na forma de culturas homogenias, ou pequenos fragmentos de polpa dentária, em botijões de nitrogênio líquido. De acordo com a presente invenção, a polpa dentária poderá ser criopreservada antes de ser submetida ao processo de isolamento das células tronco.

Sendo uma população de células-tronco homogênia, as células se diferenciam de forma uniforme para os diferentes tipos celulares o que possibilita uma efetiva e ampla substituição das populações de células deficientes e/ou danificadas presentes no tecido lesado.

Isoamento e Armazenamento de Fragmentos de Polpa Dentária Na presente inovação o processo de criopreservação do fragmento de polpa dentária de origem humana ou animal retirado do animal ocorre quando o tecido é exposto a “meio apropriado”. Inicialmente a polpa dentária é lavada em tampão salino lx, preferencialmente tampão PBS ou D-PBS (as soluções tampões utilizadas para lavagem das células podem ser phosphate-bujfered saline (PBS - 0,01M, ph= 7,4) e/ou phosphate-buffered. saline A (PBS-A -0,01M, ph= 7,4)) ou mistura dos mesmos, com ou sem antibiótico, de forma a retirar sangue, debris e possíveis contaminantes ainda presentes na amostra (Figura 1). Após a lavagem a polpa é exposta a “meio apropriado”, inserida em criotubo e mantida criopreservada em nitrogênio. Na presente invenção, o meio de criopreservação pode conter soro fetal em uma concentração de 10% a 30% sendo utilizado preferencialmente à concentração de 20%. A concentração de meio, preferencialmente DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Médium: Nutrient Mixture F-12) ou DMEM-HIGH (Dulbecco's modiüed Eaglees's médium high glucose) ou ALFA-MEM (Minimum Essential Médium) ou DMEM-LOW (Dulbecco's modiüed Eaglees's médium low glucose) ou RPMI (Roswell Park Memorial Institute médium) ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos, pode variar de 80% a 60% e a do criopreservador dimetilsulfóxido (DMSO) de 5% a 10%, podendo este ser substituído por glicerol. Em todos os casos a concentração preferencial é de 70% e 10% respectivamente. Posteriormente, a temperatura é gradualmente reduzida, aproximadamente 1°C por minuto até a temperatura de - 80°C, sendo transferida após 24 horas para um botijão de nitrogênio líquido. Posteriormente as células-tronco foram isoladas e testadas quanto a sua pluripotencialidade por meio das técnicas de curva de crescimento e diferenciação in vitro.

Isoamento e Armazenamento das Células- Tronco A polpa dentária é retirada e lavada em tampão salino, preferencialmente tampão PBS ou D-PBS (as soluções tampões utilizadas para lavagem das células podem ser phosphate-buffered saline (PBS -0,01 M, ph= 7,4) e/ou phosphate-buffered saline A (PBS-A - 0,01M, ph= 7,4)) ou mistura dos mesmos, acrescido ou não de antibiótico de forma a retirar células vermelhas do sangue, debrís e possíveis contaminantes ainda presentes na amostra (Figura 1). Após a lavagem a polpa é mantida preferencialmente em placas de Petri 35-mm, sendo o tecido pulpar fragmentado ou não. Após a fragmentação ou não, o tecido pulpar pode ou não ser exposto a digestão enzimática, No primeiro caso, após o procedimento é adicionado “meio apropriado” sendo o tecido pulpar posteriormente mantido a 37°C em 5% de CO2, e o meio trocado se necessário. No segundo caso, o tecido pulpar, após fragmentação ou não, é exposto a uma solução de tripsina (tripsina ou tripsina/EDTA ou tryple-Express) e mantido em estufa úmida a 37°C, contendo 5% de CO2 por pelo menos 5 minutos. Após a ação enzimática, a tripsina é neutralizada com “meio apropriado” sendo posteriormente mantida a 37°C em 5% de CO2 e o meio trocado se necessário. Após ocuparem 70% da área cultivãvel, o meio de cultivo é inicialmente descartado, sendo as células lavadas duas vezes em solução salina, dissociadas na solução de tripsina (tripsina ou tripsina/EDTA ou Tryple-Express), ressuspensas em meio de criopreservação e posteriormente alicotadas. Na presente invenção, o meio de criopreservação pode conter soro fetal em uma concentração de 10% a 30% sendo utilizado preferencialmente à concentração de 20%. A concentração de meio, preferencialmente DMEM/F12 ou DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos, pode variar de 80% a 60% e a do criopreservador dimetilsulfõxido (DMSO) de 5% a 10%, podendo este ser substituído por glicerol. Em ambos os casos a concentração preferencial é de 70% e 10% respectivamente. Posteriormente, a temperatura é gradualmente reduzida, aproximadamente 1°C por minuto até a temperatura de - 80°C, sendo transferida após 24 horas para um botijão de nitrogênio líquido. Posteriormente as células-tronco foram isoladas e testadas quanto a sua pluripotencialidade por meio das técnicas de curva de crescimento e diferenciação in iritro.

As células tronco derivadas a partir de nichos de polpa dentária, foram analisadas durante o processo de isolamento das células tronco da polpa dentaria antes e após a polpa ter sido exposta ao processo de criopreservação (Figura 2).

De acordo com a presente invenção, o “meio apropriado” da presente etapa refere-se a meios de cultura de células-tronco capazes de promover o isolamento de populações homogenias e puras de células-tronco, preferencialmente DMEM/F12 ou DMÉM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos.

De acordo com a presente invenção, o “meio apropriado” da presente etapa refere-se a meios de cultura de células-tronco capazes de promover o isolamento de populações não homogenias de células-tronco, preferencialmente DMEM/F12 ou DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos. O meio em questão deve ser suplementado, de acordo com o processo, como variações de 10% a 30% de soro sendo preferencialmente utilizada à concentração de 15%. A presente invenção utiliza particularmente o soro de origem bovina não descartando porém a possível utilização de soros sintéticos ou não, humanos e de outros animais ou mistura de dois ou mais dos mesmos, que possam ser empregados na presente inovação. A utilização de outros reagentes sintéticos ou não, que propiciem uma maior eficiência ao processo de isolamento das células-tronco, inclusive associação dos mesmos, devem ser considerados na presente invenção, pois estão relacionados nas variações e aprimoramentos do processo como relatado anteriormente. O meio para cultivo de células-tronco pode ser suplementado como antibiótico, em particular penicilina, preferencialmente 100 unidades/ml e estreptomicina, preferencialmente 100 pg/ml, e/ou aminoãcidos como, por exemplo, glutamina, preferencialmente 2 mM e outros aminoãcidos não-essenciais, preferencialmente 2 mM e/ou o conjunto dos mesmos.

Na presente inovação o processo de criopreservação das células-tronco pós-natais adultas oriundas da polpa dentária ou fragmento de polpa dentária ocorre quando as células ou fragmento de polpa dentária são ressupensos em meio apropriado. Na presente invenção, o meio de criopreservação pode conter preferencialmente soro fetal bovino podendo ser utilizado soros sintéticos ou não, humano ou de outros animais ou mistura de dois ou mais dos mesmos, em uma concentração de 10% a 30% sendo utilizado preferencialmente ã concentração de 20%. A concentração de DMEM/F12 ou DMEM-HIGH ou DMEM-LOW ou ALFA-MEM ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos, pode variar de 80% a 60% e a do criopreservador dimetilsulfóxido (DMSO) de 5% a 20%, podendo este ser substituído por glicerol. Em ambos os casos a concentração preferencial é de 70% e 10% respectivamente.

Após as células-tronco serem ressuspensas em meio de criopreservação apropriado, as mesmas são armazenadas em crio tubos em concentrações que podem variar de 5 x 105 a 3 x 10e células-tronco por ml, A temperatura é gradualmente reduzida, aproximadamente 1°C por minuto até a temperatura de — 80°C, sendo transferida após no máximo um ano, preferencialmente 24 horas, para um botijão de nitrogênio liquido.

Para descongelar as células, os criotubos são colocados em banho-maria e mantidos por 1 ã 5 minutos, preferencialmente 2 minutos, podendo ser também descongelados a temperatura ambiente, sendo posteriormente adicionado meio contendo, preferencialmente, 20% de soro fetal bovino, podendo ser utilizado soros sintéticos ou não, humano ou de outros animais ou mistura de dois ou mais dos mesmos, e 80% de DMEM/F12 ou DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos, e este introduzido em garrafa de cultivo, preferencialmente T25. No dia seguinte o meio é substituído pelo “meio apropriado”.

Expansão, Proliferação e Diferenciação As células-tronco pós natais adultas isoladas a partir de nichos de polpa dentária de humanos e animais, por meio da presente invenção, são capazes de se auto-renovar, proliferar continuamente e se diferenciarem em tipo celulares derivados de diferentes folhetos embrionários como, por exemplo, mesoderma (gordura, osso e cartilagem) e ectoderma (neurônios).

Expansão das Células-Tronco A cultura de células-tronco da presente invenção permite o repique, por meio de dissociação celular, contínuo, sendo a cultura da presente invenção mantida constantemente semiconfluente de modo a prevenir a diferenciação celular espontânea por parte das células-tronco em questão. Entende-se por cultivo “semiconfluente” o cultivo que não esteja tão denso de forma que se caracterize como culturas confluentes de alta densidade.

As células-tronco expandidas em cultura são dissociadas por meio do seguinte processo. O meio de cultivo é inicialmente descartado sendo as células-tronco, lavadas duas vezes com solução salina, preferencialmente tampão PBS ou D-PBS (as soluções tampões utilizadas para lavagem das células podem ser phosphate-buffered saline (PBS - Ο,ΟΙΜ, ph= 7,4) e/ou phosphate-buffered soline A (PBS-A -0,01 M, ph= 7,4)) ou mistura dos mesmos, dissociadas na presença de uma solução de tripsina ou tripsina/EDTA ou Triple Express, e transferidas, após adicionar “meio apropriado”, da garrafa para um tubo falcon, centrifugadas à aproximadamente 500g por 5 minutos, onde o sobrenadante é desprezado sendo o pellet posteriormente ressuspendido preferencialmente em 2ml de “meio apropriado” sendo metade, no caso lml, transferido para uma nova garrafa de cultura de 25 cm2 sendo o outro lml para outra garrafa de 25 cm2, a cada uma das garrafas acrescenta-se 4ml do meio de cultura, “meio apropriado”, podendo também se transferir 2ml para uma garrafa de 75 cm2 acrescentando-se preferencialmente lOml do “meio apropriado” De acordo com a presente invenção, o “meio apropriado” da presente etapa refere-se a meios de cultura de células-tronco capazes de promover o isolamento de populações homogenias e puras de células-tronco como, por exemplo, o meio DMEM-HIGH ou DMEM/F12 ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos.

De acordo com a presente invenção, o “meio apropriado” da presente etapa refere-se a meios de cultura de células-tronco capazes de promover o isolamento de populações não homogenias de células-tronco, preferencialmente DMEM/F12 ou DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos. O meio em questão deve ser suplementado, de acordo com o processo, como variações de 5% a 30% de soro sendo preferencialmente utilizada à concentração de 15%. A presente invenção utiliza particularmente o soro de origem bovina (FSB, HyClone, Washington) não descartando porém a possível utilização de soros sintéticos ou não, humanos e de outros animais ou mistura de dois ou mais dos mesmos, que possam ser empregados na presente inovação. A utilização de outros reagentes sintéticos ou não, que propiciem uma maior eficiência no processo de isolamento das células-tronco, inclusive associação dos mesmos, devem ser considerados na presente invenção, pois estão relacionados nas variações e aprimoramentos do processo como relatado anteriormente. O meio para cultivo de células-tronco pode ser suplementado como antibiótico, em particular penicilina, preferencialmente 100 unidades/ml e estreptomicina, preferencialmente 100 pg/ml, e/ou aminoácidos como, por exemplo, glutamina, preferencialmente 2 mM e outros aminoácidos não-essenciais, preferencialmente 2 mM e/ou o conjunto dos mesmos.

As células tronco isoladas a partir de nichos de polpa dentária foram analisadas quanto a sua morfologia antes e após serem expostas ao processo de criopreservação (Figura 3) Curva de Proliferação de Células-Tronco As células-tronco pós-natais adultas isoladas a partir de nichos do tecido pulpar, foram analisadas quanto ao seu potencial proliferativo antes e após serem submetidas ao processo de criopreservação. Os dados demonstraram o mesmo potencial proliferativo das células-tronco isoladas a partir de nichos do tecido pulpar antes e após serem criopreservadas (Figura 4).

Uma das características principais das células-tronco é o seu crescimento exponencial após sucessivos repiqueis. O gráfico (Figura 4) demonstra que as células tronco obtidas a partir de colônias de células, antes e após o processo de criopreservação, têm o seu crescimento exponencial equivalente após repiques feitos diariamente. Desta forma, demonstramos que utilizando o nosso método de expansão, a partir uma colônia de células-tronco derivada de polpa dentária, foi possível obter altas concentração de células tronco tanto antes como após serem submetidas ao processo de criopreservação.

Este resultado é extremamente relevante, pois demonstra o alto potencial proliferativo destas células com a possibilidade de produzir quantidades suficientes para sucessivas aplicações na terapia celular.

Os últimos achados na área de terapia celular demonstram que a quantidade de células é um fator crucial para o sucesso da terapia celular.

Diferenciação Osteogênica As células-tronco pós-natais adulas isoladas a partir de nichos de polpa dentária foram capazes de se diferenciar para osteoblastos tanto antes como após serem expostas ao processo de criopreservação, uma vez que também apresentaram sinais de mineralização (Figura 5).

As células-tronco isoladas foram cultivadas em meio (DMEM/F12 ou DMEMHIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos + 10 % de Soro Fetal Bovino + 1% de L/glutamina + 1% de Streptomicina/Penicilina) durante o período de 24 horas na concentração inicial de lxlO5 células. Após as 24 horas o meio foi trocado para o de diferenciação osteogênica (DMEMHIGH ou DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos + 1% de 10‘5M de dexamethasone + 1% 5 mM de acido ascórbico + 10% de soro fetal bovino + 1% Streptomicina/Penicilina). A trocar o meio foi feita a cada 3 ou 4 dias. No dia 10 foi adicionado 1% de 200 mM de β-glicerolfosfato ao meio de cultura e nas trocas subsequentes. As células foram mantidas em cultura até o 21° dia de diferenciação. A caracterização das células foi feita por meio da coloração de Von Kossa (Figura 5). O cultivo controle foi mantido em meio durante todo experimento (DMEM-HIGH ou DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos + 10 % de Soro Fetal Bovino + 1% de L/glutamina + 1% de Streptomicina/Penicilina).

Na técnica de Von Kossa as células foram lavadas com solução tampão fosfato salina PBSA lx por 2 minutos e fixadas com 5 mL de solução de paraformaldeído a 4% em PBSA, por 1 hora. A seguir as células foram expostas à luz UV em presença de uma solução de nitrato de prata 1% por 45 minutos. As células forma lavadas lx com água destilada aplicando posteriormente solução de Tiossulfato de sódio 3% por 5 minutos sendo novamente lavadas com água destilada. Aplicou-se o corante de Von Gieson (1% de fucsina, 49% de ácido pícrico saturado e 50% de água destilada) por 5 minutos utilizando álcool 70% para remoção do corante sendo as imagens capturadas sob o microscópio Nikon Eclipse Ti-S, Japan. Os dados demonstraram que as células-tronco pós-natais adulas provenientes de nichos presentes na polpa dentária são capazes de gerar osso “in vitro”.

Diferenciação Adipogênica As células-tronco pós-natais adulas isoladas a partir de nichos de polpa dentária foram capazes, através do protocolo descrito a seguir, de se diferenciarem em adipócitos tanto antes como após serem submetidas ao processo de criopreservação (Figura 6).

Para induzir a diferenciação adipogênica cultivamos lxlO5 células-tronco em meio de cultivo (DMEM/F12 ou DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos + 10 % de Soro Fetal Bovino + 1% de L/glutamina + 1% de Streptomicina/Penicilina) durante 24 horas. Em seguida o meio basal foi trocado para o meio de diferenciação (DMEM/F12 ou DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos + 0,25M Isobutilmetilxantina +10 μΜ Insulina + 10% de Soro Fetal Bovino + 1% Streptomicina/ Penicilina). A troca do meio foi realizada a cada 3 ou 4 dias. As células foram mantidas em cultura até o 21° dia. Após este período, as células foram fixadas por 60 minutos a temperatura ambiente com paraformaldéido 4% e lavadas 3 vezes com etanol 70%. Para serem coradas, as células foram encubadas a temperatura ambiente por 5 minutos com Oil Red O sendo posteriormente lavadas 3 vezes com água destilada. Os dados demonstraram que as células-tronco pós-natais adulas provenientes de nichos presentes na polpa dentária são capazes de gerar gordura "in vitro”.

Diferenciação Condrogênica As células-tronco pós-natais adulas isoladas a partir de nichos de polpa dentária foram capazes, por meio do protocolo descrito a seguir, de se diferenciarem em tecido cartilaginoso tanto antes como após serem expostas ao processo de criopreservação (Figura 7).

Para diferenciação condrogênica, as células-tronco foram transferidas na concentração 1 x 106 células-tronco para tubos falcon de 15 ml, centrifugadas a 500g por 5 minutos e cultivadas em na presença de meio DMEM/F12 ou DMEM-HIGH ou ALFA-MEM ou DMEM-LOW ou RPMI ou mistura de dois ou mais dos mesmos, com 1% soro fetal bovino, 6.25 mM insulina, 10 ng/ml TGF-βΙ e 1% penicilina. A troca do meio indutor foi realizada diariamente durante 21 dias. Após este período ocorreu à formação de um pellet esférico o qual foi fixado e incluso em parafina para serem posteriormente cortadas e posteriormente analisadas a nível histolõgico. Obtiveram-se cortes histológicos de 3μτη, das amostras fixadas, que foram corados com azul de toluidina demonstrando coloração positiva. Os dados demonstram que as células-tronco pós-natais adulas provenientes de nichos de polpa dentária são capazes de gerar cartilagem “in vitro”.

Diferenciação Neurogênica As células-tronco pós-natais adulas isoladas a partir de nichos de polpa dentária também demonstraram alto potencial de diferenciação para derivados do ectoderma, sendo capaz de se diferenciar para neurônios. Protocolo da diferenciação e os resultados obtidos são apresentados abaixo (Figura 8).

As células-tronco isoladas da polpa dentária foram cultivadas em meio (DMEM + 10 % de Soro Fetal Bovino + 1% de L/glutamina + 1% de Streptomicina/Penicilina) durante o período de 24 horas na concentração inicial de lxlO5 células. Após as 24 horas o meio foi trocado para o de diferenciação neurogênica (DMEM+ 10% de Soro Fetal Bovino + 5 mM β-mercaptoetanol + 1% L-Glutamina + 1% Streptomicina/Penicilina). A troca do meio foi feita a cada 3 ou 4 dias. As células foram mantidas em cultura até o 25° dia de diferenciação. Após este período, as células foram fixadas por 60 minutos a Os resultados descritos aniertormente sugerem que as céiulas-tronco pós-natais adultas* obtidas por meio do presente processo inovador, são seguras para sua utilização na terapia tecídual/regenerativa* Desta forma* as c é lukis-trc>nco obtidas por meio da presente invenção, podem ser utilizadas de forma auióloga* heterõiogo ou alogêrnca em pacientes acometidos por diversos tipos de patologias de forma a curar e/ou melhorar a qualidade de vida dos pacientes* O processo desenvolvido na presente invenção compreende a aplicação das células* tronco e / ou concentrados* no estado diferenciado ou não* in vitro ou m uiim7 çm conjunto com diferentes tipos de arabouços* fatores que possam auxiliar no processo de regeneração tecidual e como veículo para carreamento e introdução de estruturas moléculas modificadas e/ou não* visando ã terapia g$nic& e/ou celular* A presente invenção pode ser utilizada na obtenção de células-tronco pós-n&t&kis arb ritos e/ou çencén toados, no estado diferenciado ou nâo* de pacientes acometidos por patologia e/ou alterações genética. Estas podem ser alteradas molécu iarmen te por meio dâ terapia gênicae/ou celular e reimplantadas nos pacientes* Perante o potencial das células tronco pós-natais adultas e/ou concentrados obtidos a partir de nichos de células-tronco presentes na polpa dentária* a presente invenção contempla a criação de um banco de células-tronco visando a sua utilização terapêutica de forma aptôHoga, hcteróloga ou aiogemea* Esiã inovação demonstrou que as céluías-tronco armazenadas por meio do processo em questão* Ass céíulas-tronco em questão e/ou setis concentrados, diferenciados ou não, obtidas a partir da presente invenção, podem ser expostas a alterações celulares e/ou genéticas e^ou moleculares e/ou utilizadas na terapia genética ou celular, engenharia tecidual, medicina regen.ertaiva bem como modelo in tAtro para estudas da indústria farmacêutica e/ou biotecnológica.

As celulaís-tronco isoladas a partir de nichos da polpa dentária de humanos e animais por meio da presente invenção são capares de se diferenciarem na ausência indutores, citoeinas e/ou fatores de crescimento. A presente invenção também engloba as células diferenciadas obtidas a partir das células-tronco isoladas por meio do processo inovador descrito anteriorroente e o sen respectivo concentrado. As células-tronco obtidas pelo processo inovador desenvolvido, apresentam-se no seu estágio mdifereneiadm As células-tronco obtidas por meio da presente invenção foram testadas quando ao seu possível, potencial tumorogênioo por meio da injeção das ditas eélulas-tronco em cairmndongos NODE imuno-deprimido. As análises demonstraram a ausência de formação de possíveis tumores.

As ditas céluias-tronco também forma analisas quanto a sua capacidade de se diferenciar in uiím Para rid, as células foram injetadas em camundongos, As células incorporadas apresentaram o padrão moríoJá^co do tecido adotado demonstrando su&. capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares presentes no organismo. temperatura ambiente com pãrafonrnaldéido 4¾ e lavadas 3 veaçs com etanol 70%. Para que fossem coradas, as células foram cncubadas a temperatura ambiente per cinco minutos com Oü Red o sendo po^ieriormtn te iãvadãs 3 vezes com água destil&da. Os dados demonstraram que as células-troneo pós-natais adulas provenientes de nichos de polpa dentária são capares de gerai' neurônios % uitro^ Diferenciação MíoKènica A* céfuius tronco pós-natais adulas isoladas a partir de nichos de. polpa dentária foram capasses, por meio de o protocolo descrito a seguir., de se diferenciarem em tecido muscular (Figura. 9), O meio de cultura para indução miogemca foi composto por DMem-HGv 10%· de feoro fetal bovino e 5% de soro de cavalo, suplementado com 0,1 pM dê desametasonía, 50 μΜ de hídroeortisona, 1% de antibiótico (100 unidades/ml de penicilina e 100 pg/ml de estreptomicína. As células foram cultivada» neste meío por 50 dias e depois realizou-se a irnunofluorescéncia ootn anticorpos específicos pa.ra ftbras musculares. Os anticorpos primários utilizados na imunojfluoresceneía das células induzidas ã diferenciação miogênica foi o Tnonociofiai tinti-ntyosin sísrc/etcr O anticorpo secundário utilizado foi o FITC. Após a. realização das irrmn ofí uoreíscènri as observou-se s marcação positiva das células indicando o sucesso da diferenciação míogèniea. Os dados demonstram que as céluías-Eronco pós-natais adulas provenientes de. nichos de polpa dentária são capazes de gerar músculo “m wtfro”. mantém suas características singulares mesmo após terem sido expostas ao processo de criopreservação possibilitando desta forma, a sua utilização terapêutica, farmacológica ou biotecnolõgica.

Reivindicações O presente pedido refere-se ao processo de obtenção de cêlulas-tronco e/ou concentrados pós-natais adultas isoladas a partir de nichos de cêlulas-tronco presentes na polpa dentária de humanos e/ou animais e o seu processo de armazenamento (banco autólogo e/ou heterólogo) e sua aplicação terapêutica (autóloga, heteróloga ou alogênica), farmacolôgica e biotecnologia.

Claims (126)

1. PROCESSO PARA A OBTENÇÃO DE CÊLULAS-TRONCO caracterizado por: (a) lavagem do fragmento de polpa dentária com solução tampão suplementado ou não com antibióticos; (b) obtenção de cêlulas-tronco oriundas da polpa dentária; (c) transferência a um recipiente contendo meio apropriado, sendo que a dita transferência é realizada sem ou com a dissociação das células; (d) cultivo e expansão das células em meio apropriado; (e) congelamento, descongelamento e armazenamento das células em meio apropriado.

2. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato das células pós-natais adultas serem obtidas a partir de nichos de cêlulas-tronco presentes na polpa dentária.

3. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado pelo fato das células pós-natais adultas serem isoladas a partir de nichos de cêlulas-tronco presentes na polpa de dente de leite.

4. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 e 2, caracterizado pelo fato das células pós-natais adultas serem isoladas a partir de nichos de cêlulas-tronco presentes na polpa de dente de adulto.

5. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 2 à 4, caracterizado por serem células humanas.

6. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 2 à 4, caracterizado por serem células animais.

7. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 à 6, caracterizado pelo fato de serem células obtidas a partir de polpas normais.

8. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 ã 6, caracterizado pelo fato de serem células obtidas a partir de polpas que apresentem patologias ou alterações moleculares e/ou celulares.

9. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato das células serem isoladas por meios mecânicos e/ou enzimáticos

10. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 e 9, caracterizado pelo fato de ser utilizado tripsina ou tripsina/EDTA ou Tryple-Express.

11. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato no dito ser utilizado meio DMEM-HIGH, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes ao mesmo, nos processos de armazenamento e/ou expansão e/ou descongelamento e/ou congelamento e/ou na solução de descongelamento e/ou na solução de congelamento e/ ou na solução de lavagem e/ou na solução de aplicação.

12. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato no dito ser utilizado meio DMEM-LOW, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes ao mesmo, nos processos de armazenamento e / ou expansão e / ou descongelamento e/ou congelamento e/ou na solução de descongelamento e/ou na solução de congelamento e/ ou na solução de lavagem e/ou na solução de aplicação.

13. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato no dito ser utilizado meio DMEM/F12, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes ao mesmo, nos processos de armazenamento e/ou expansão e/ou descongelamento e/ou congelamento e/ou na solução de descongelamento e/ou na solução de congelamento e/ ou na solução de lavagem e/ou na solução de aplicação.

14. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato no dito ser utilizado meio ALFA-MEM, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes ao mesmo, nos processos de armazenamento e/ou expansão e/ou descongelamento e/ou congelamento e/ou na solução de descongelamento e/ou na solução de congelamento e/ ou na solução de lavagem e/ou na solução de aplicação.

15. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato no dito ser utilizado meio RPMI, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes ao mesmo, nos processos de armazenamento e/ou expansão e/ou descongelamento e/ou congelamento e/ou na solução de descongelamento e/ou na solução de congelamento e/ou na solução de lavagem e/ou na solução de aplicação.

16. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 11 à 15, caracterizado pelo fato no dito ser utilizado à mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos, nos processos de armazenamento e/ou expansão e/ou descongelamento e/ou congelamento e/ou na solução de descongelamento e/ou na solução de congelamento e/ ou na solução de lavagem e/ ou na solução de aplicação.

17. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 1, 11 à 16, caracterizado pelo fato do meio ser suplementado por no mínimo 5% de soro.

18. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 1, 11 ã 16, caracterizado pelo fato do meio ser suplementado com cerca de 15% de soro.

19. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 17 e 18, caracterizado pelo fato do dito soro se de origem sintética ou não, humana ou animal ou mistura de dois ou mais dos mesmos.

20. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 17 e 18, caracterizado pelo fato do dito soro sc de origem bovina.

21. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do meio não ser suplementado com soro.

22. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do dito meio conter adicionalmente antibióticos e/ou aminoãcidos.

23. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato do dito meio não conter adicionalmente antibióticos e/ou aminoãcidos.

24. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da expansão da cultura de células-tronco da etapa (d) ser continua compreendendo repiques

25. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 1 e 24, caracterizado pelo fato da cultura de células - tr o n c o em expansão da etapa (d) ser mantida semico afluente -

26. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, 9, 10 e 24, caracterizado pelo fato da cultura de células-tronco ser dissociada na etapa de repique através de meios mecânicos e/ou enzimãticos.

27. PROCESSO, de acordo com as reivindicações 1, 9, 10 e 26, caracterizado pelas culturas das células serem tripisinizadas.

28. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato das células serem congeladas apôs a realização das etapas (b) ou (d).

29. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da polpa de dente de leite ou adulta se congelada após a realização da etapa (a).

30. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato das células serem congeladas em seu estágio ind íferenciado.

31. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato das células serem congeladas após serem diferenciadas ou pré-diferenciadas»

32. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato do concentrado celular indíferenciado ser congelado.

33. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato do concentrado celular diferenciado ou pré-diferenciado ser congelado.

34. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 e 29 caracterizado pelo fato da polpa dentária ser congelada antes ser submetida ao processo de isolamento das células.

35. PROCESSO, de acordo com a reivindicações 1, etapa (e), caracterizado pelo fato de ser utilizada a concentração de soro de 5% a 30% sendo utilizado preferencialmente à concentração de 20%.

36. PROCESSO, de acordo com a reivindicações 1, etapa (e), caracterizado pelo fato do dito soro se de origem sintética ou não, humana ou animal ou mistura de dois ou mais dos mesmos.

37. PROCESSO, de acordo com a reivindicações 1, etapa (e), caracterizado pelo fato do meio não ser suplementado com soro.

38. PROCESSO, de acordo com a reivindicações 1, etapa (e), caracterizado pelo fato do dito meio conter adicionalmente antibióticos e/oü aminoácidos.

39. PROCESSO, de acordo com a reivindicações 1, etapa (e),, caracterizado pelo fato do dito meio não conter adicionalmente antibióticos e /ou aminoácidos.

40. PROCESSO, de acordo com a reivindicações 1, etapa (e), caracterizado pelo fato de ser utilizada a concentração de DMEM/F12 ou ALFA-MEM ou DMEM-HIGH ou DMEM-LOW ou RPMÍ ou mistura de dois mais dos respectivos, de 80% a 60% sendo utilizado preferencialmente ã concentração de 70%.

41. PROCESSO, de acordo com a reivindicações 1, etapa (e), caracterizado pelo fato de ser utilizada a concentração do criopreservador dimetilsulfõxido (DMSO) ou glicerol de 5% a 20% sendo utilizado preferencialmente â concentração de 10%.

42. POCESSO, de acordo com a reivindicações 1, etapa (e),, caracterizado pelo fato da temperatura ser preferencialmente reduzida gradualmente, aproximadamente 1°C por minuto até a temperatura entre - 70°C a - 90°C sendo preferencialmente - 80°C.

43. PROCESSO, de acordo com a reivindicações 1, etapa (e), e 42, caracterizado pelo fato de preferencialmente após 24 horas transferida para um botijão de nitrogênio liquido.

44. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, etapa (e), 42 e 43, caracterizado pelo fato de serem mantidas a temperatura de -80°C.

45. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelas células-tronco ou seu respectivo concentrado celular, diferenciado ou não, serem armazenadas em criotubos em concentrações celulares que podem variar de 5 x 105 a 3 x 106 células por ml sendo utilizado preferencialmente ã concentração de 2 x 106 células por ml.

46. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelos criotubos contendo concentrações celulares que podem variar de 5 x 105 a 3 x 106 células por ml de células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, a serem transportados em gelos seco ou nitrogênio líquido.

47. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelos criotubos contendo concentrações que podem variar de 5 x 105 a 3 x 106 células por ml de células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, sendo utilizado preferencialmente à concentração de 2 x 106 células por ml, a serem expostos a temperaturas entre 10 °C a 45°C, preferencialmente 37°C, durante um período que pode variar de 1 minuto à 5 minutos, preferencialmente 2 minutos, para que sejam descongeladas.

48. PROCESSO, de acordo com a reivindicações 1, etapa (e), e 47, caracterizado pela utilização de um “meio apropriado” para promover a inativação do DMSO ou glicerol. O “meio apropriado” é composto por DMEM-HIGH (Dulbecco's modified Eaglees's médium high glucose) ou DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Médium: Nutrient Mixture F-12) ou ALFA-MEM (Minimum Essential Médium) ou DMEM-LOW (Dulbecco s modified Eaglees's médium low glucose) ou RPMI (Roswell Park Memorial Institute médium) ou a mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescido de possíveis variações e aprimoramentos referentes aos mesmos.

49. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pela pelo “meio apropriado” ser ou não suplementado como variações de 5% a 30% de soro sendo preferencialmente utilizada à concentração de 15%. A presente invenção utiliza particularmente o soro de origem bovina não descartando porém a possível utilização de soros sintéticos ou não, humanos e de outros animais ou mistura de dois ou mais dos mesmos, que possam ser empregados na presente inovação. diferenciado ou não, por aproximadamente SOOg por aproximadamente 5 minutos antes de serem homogeneizadas.

50. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo “meio apropriado” ser ou não suplementado com antibiótico, em particular penicilina e/ou estreptomicma, e/ou aminoãcídos como, por exemplo, glutomina e outros ammoãcidos não-essenciais ou o conjunto dos mesmos.

51. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado por lavagens sucessivas das células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, com “meio apropriado” ou PBS ou DPBS ou outra solução salina ou solução fisiológica ou concentrado, sintético ou não, de origem animal ou humana ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescida de possíveis variações e aprimoramentos.

52. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, de homogeneização de células-tronco ou seu respectivo concentrado, diferenciado ou não, caracterizado por ressuspender as células-tronco ou concentrado celular em “meio apropriado” ou PBS ou DPBS ou outra solução salina ou solução fisiológica ou concentrado, sintético ou não, de origem animal ou humana ou mistura de dois ou mais dos mesmos, acrescida de possíveis variações e aprimoramentos.

53. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela utilização de reagentes sintéticos ou não, que propiciem uma maior eficiência no processo, inclusive associação dos mesmos, e variações e aprimoramentos relacionados aos mesmos.

54. PROCESSO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, de centrifugação das células-tronco ou seu respectivo concentrado,

55. CÉLULA, caracterizada pelo fato de ser obtida pelo processo definido em uma das reivindicações 1 a 54.

56. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de ser obtida a partir de polpa dentária de dente de leite.

57. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de ser obtida a partir de polpa dentária de dente adulto.

58. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 55 à S7, caracterizada pelo fato de ser obtida a partir de polpa dentária normais.

59. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de ser obtida a partir de polpas dentárias que apresentem patologias ou disfunções.

60. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de se diferenciarem sem a formação de tumores.

61. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de ser molecularmente modificada.

62. CÉLULA, de acordo com a reivindicação 55, caracterizada pelo fato de, em seu estado indiferenciado, apresentar marcadores de superfície celular típicos de células embrionárias.

63. CONCENTRADO CELULAR, caracterizado pelo fato de compreender células-tronco conforme definidas em uma das reivindicações 55 a 62,

64. PROCESSO PARA A DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS -TRONCO, caracterizado pelo fato de ser realizado a partir das células-tronco definidas em uma das reivindicações 55 a 62 ou do concentrado celular definido na reivindicação 63.

65. PROCESSO PARA A DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado por ser realizado na presença de soro e/ou indutores de diferenciação.

66. PROCESSO PARA A DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado por ser realizado na ausência de soro e/ou indutores de diferenciação.

67. PROCESSO PARA A DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato das células-tronco se diferenciarem em diversas linhagens celulares como, por exemplo, osteogênica, adipogênica, condrogênica, neuronal, dental, hematopoiético, endotelial, epitelial e muscular.

68. CÉLULA DIFERENCIADA, caracterizada pelo fato de ser obtida a partir do processo definido em uma das reivindicações 64 a 67.

69. CÉLULA DIFERENCIADA, de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de não formar tumores.

70. CONCENTRADO CELULAR DIFERENCIADO, caracterizado pelo fato de compreender células diferenciadas conforme definidas em uma das reivindicações 67 ou 69.

71. CÉLULAS-TRONCO PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADAS, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizada pelo fato de ser obtida a partir de nichos presentes em polpa dentária de humanos.

72. CÉLULAS-TRONCO PRÉ OU PÔS-CRIOPRESERVADAS, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizada pelo fato de ser obtida a partir de nichos presentes em polpa dentária de animais.

73. CONCENTRADO CELULAR PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser obtido a partir de nichos de células-tronco presentes na polpa dentária de humanos.

74. CONCENTRADO CELULAR PRÉ OU PÔS- CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser obtido a partir de nichos de células-tronco presentes na polpa dentária de animais.

75. CONCENTRADO CELULAR PRÉ OU PÓS- CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de compreender células-tronco.

76. CONCENTRADO CELULAR PRÉ OU PÔS- CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de compreender células-tronco humanas.

77. CONCENTRADO CELULAR PRÉ OU PÓS- CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de compreender células-tronco animais.

78. CONCENTRADO CELULAR PRÉ-DIFERENCIADO, PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de compreender células pré-diferenciadas.

79. CONCENTRADO CELULAR DIFERENCIADO, PRÉ OU PÔS-CRIOPRESERVADAS, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de compreender células diferenciadas.

80. USO DE CÊLULAS-TRONCO, definidas em uma das reivindicações 55 a 62 ou 68 a 69 ou 71 a 72, ou sob forma do concentrado definido em uma das reivindicações 63 ou 70 ou 73 a 79, caracterizado pelo fato de ser para a terapia regenerativa humana e/ou animal.

81. USO DE CÊLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de ser conjuntamente com arcabouços (“scaffolds”).

82. USO DE CÊLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de ser para a regeneração de tecidos ou membros.

83 USO DE CÊLULAS-TRONCO, definidas em uma das reivindicações 55 a 62 ou 68 a 69 ou 71 a 72, ou sob forma do concentrado definido em uma das reivindicações 63 ou 70 ou 73 a 79, caracterizado pelo fato de ser para aplicação biotecnológica.

84. USO DE CÊLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de ser como veículo para o carreamento e introdução de moléculas ativas, proteínas, peptídeos, oligopeptídeos ou outras moléculas derivadas do DNA ou RNA modificadas ou não.

85. USO DE CÊLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de ser para vacina gênica ou terapia gênica e/ou celular.

86. USO DE CÊLULAS-TRONCO, definidas em uma das reivindicações 55 a 62 ou 68 a 69 ou 71 a 72, ou sob forma do concentrado definido em uma das reivindicações 63 ou 70 ou 73 a 79, caracterizado por ser para o tratamento curativo e/ou preventivo de doenças.

87. USO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato das ditas doenças serem uma ou mais dentre: doenças genéticas, doenças neurodegenerativas, doenças oftalmológicas, regeneração dc cartilagem e/ou articulações, traumas, regeneração de ossos, doenças cardiovasculares, doenças hepáticas, doenças autoimunes, doenças angiogênicas, doenças neuromuseulares, regeneração ou reposição da epiderme, lesão na coluna aguda ou crônica, doença renal, lesões relacionadas â medula, entre outras.

88. USO DE CÉLULAS-TRONCO, definidas em uma das reivindicações 73 a 87, caracterizado pelo fato de ser de forma autóloga ou heterôloga ou alogênica.

89. USO DE CÉLULAS-TRONCO, definidas em uma das reivindicações 55 a 62 ou 68 a 69 ou 71 a 72, ou sob forma do concentrado definido em uma das reivindicações 63 ou 70 ou 73 a 79, caracterizado por ser para a avaliação de embriotoxicidade de compostos e seleção de fármacos ou identificação de compostos.

90. USO DE CÉLULAS-TRONCO, definidas em uma das reivindicações 55 a 62 ou 68 a 69 ou 71 a 72, ou sob forma do concentrado definido em uma das reivindicações 63 ou 70 ou 73 a 79, caracterizado por ser para suporte de proliferação das células tronco embrionárias indiferenciadas ou para a produção e obtenção de células estromais.

91- USO DE CÊLULAS-TRONCO, definidas em uma das reivindicações 55 a 62 ou 68 a 69 ou 71 a 72, ou sob forma do concentrado definido em uma das reivindicações 63 ou 70 ou 73 a 79, caracterizado por ser para pesquisa farmacêutica.

92. USO DE CÉLULAS-TRONCO, definidas em uma das reivindicações 55 a 62 ou 68 a 69 ou 71 a 72, ou sob forma do concentrado definido em uma das reivindicações 63 ou 70 ou 73 a 79, caracterizado por ser para o estudo de patologias, bem como o seu tratamento.

93. USO DE CÊLULAS-TRONCO AUTÓLOGAS, ALOGÊNÍCAS OU HETERÔLOGAS, PRÉ OU PÔS-CRIO PRESERVADAS, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para a terapia era humanos.

94. USO DE CÊLULAS-TRONCO AUTÓLOGAS, ALOGÊNÍCAS OU HETERÔLOGAS, PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADAS, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para a terapia em animais.

95. USO DE CÊLULAS-TRONCO AUTÓLOGAS, ALOGÊNÍCAS OU HETERÔLOGAS, PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADAS, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento e/ou melhoria da qualidade de vida de humanos.

96. USO DE CÊLULAS-TRONCO AUTÓLOGAS, ALOGÊNÍCAS OU HETERÔLOGAS, PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADAS, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento e/ou melhoria da qualidade de vida de animais.

97. USO DE CONCENTRADO CELULAR AUTÔLOGO, ALOGÊNICO OU HETEROLOGO, PRÉ OU PÔS-CRIOPRESERVADO COMPREENDENDO CÊLULASTRONCO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para a terapia em humanos.

98. USO DE CONCENTRADO CELULAR AUTÔLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÔLOGO, PRÉ OU PÔS-CRIOPRESERVADO COMPREENDENDO CÉLULAS TRONCO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para a terapia em animais.

99. USO DE CONCENTRADO CELULAR AUTÔLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÔ LOGO, PRÉ OU PÔS-CRIOPRESERVADO COMPREENDENDO CÊLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento e/ou melhoria da qualidade de vida de humanos.

100. USO DE CONCENTRADO CELULAR AUTÔLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÔLOGO, PRÉ OU PÔS-CRIOPRESERVADO COMPREENDENDO CÊLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento e/ou melhoria da qualidade de vida de animais.

101. USO DE CONCENTRADO CELULAR PRÉ- DIFERENCIADO AUTOLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÔLOGO, PRÉ OU PÔS-CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para a terapia em humanos.

102. USO DE CONCENTRADO CELULAR PRÊ- DIFERENCIADO AUTÔLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÔLOGO, PRÉ OU PÔS-CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para a terapia em animais.

103. USO DE CONCENTRADO CELULAR PRÉ-DIFERENCIADO AUTÓLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÔLOGO, PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento e / ou melhoria da qualidade de vida de humanos.

104. USO DE CONCENTRADO CELULAR PRÉ-DIFERENCIADO AUTÓLOGO, ALOGÊNICO OU HETER0LOGO, PRÉ OU PÔS-CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento e / ou melhoria da qualidade de vida de animais.

105. USO DE CONCENTRADO CELULAR DIFERENCIADO AUTÓLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÔLOGO, PRÉ OU PÓS-CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para a terapia em humanos.

106. USO DE CONCENTRADO CELULAR DIFERENCIADO AUTÓLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÔLOGO, PRÉ OU PÓS- CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para a terapia em animais.

107. USO DE CONCENTRADO CELULAR DIFERENCIADO AUTÓLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÔLOGO, PRÉ OU PÓS- CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento e/ ou melhoria da qualidade de vida, de humanos.

108. USO DE CONCENTRADO CELULAR DIFERENCIADO AUTÓLOGO, ALOGÊNICO OU HETERÔLOGO, PRÉ OU PÓS- CRIOPRESERVADO, de acordo com a reivindicação 1 a 6, caracterizado pelo fato de ser para o tratamento e/ou melhoria da qualidade de vida, de animais.

109. MÉTODO PARA O TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE DOENÇAS, caracterizado pelo fato de ser aplicado ao paciente quantidade terapeuticamente eficaz de células tronco definidas em uma das reivindicações 55 a 62 ou 68 a 69 ou 71 a 72, ou sob forma do concentrado definido em uma das reivindicações 63 ou 70 ou 73 a 79.

110. MÉTODO PARA O TRATAMENTO E/OU PREVENÇÃO DE DOENÇAS, de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de ser para tratamento ou prevenção de uma ou mais dentre doenças genéticas, doenças neurodegenerativas, doenças oftalmológicas, regeneração de cartilagem e/ou articulações, traumas, regeneração de ossos, doenças hepáticas, doenças autoimunes, doenças cardiovasculares, doenças angiogênicas, doenças neuromusculares, regeneração ou reposição da epiderme, lesão na coluna aguda ou crônica, doença renal, lesões relacionadas à medula, entre outras.

111. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, caracterizado pelo fato de compreender células definidas em uma das reivindicações 55 a 62 ou 68 a 69 ou 71 a 72, ou sob forma do concentrado definido em uma das reivindicações 63 ou 70 ou 73 a 79.

112. BANCO DE CÉLULAS TRONCO, caracterizado pelo fato de compreender polpa dentária definidas em uma das reivindicações 55 a 62 ou 68 a 69 ou 71 a 72, ou sob forma do concentrado definido em uma das reivindicações 63 ou 70 ou 73 a 79.

113. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 111, caracterizado pelo falto das células-tronco serem obtidas a partir da polpa dentária.

114. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 111 a 113, caracterizado pelo falto das células-tronco serem autólogas ou heterólogas ou alogènicas.

115. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 111 a 114, caracterizado pelo falto das células-tronco serem utilizadas em terapias autólogas, heterólogas ou alogènicas.

116. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 111 a 115, caracterizado pelo falto das células-tronco serem obtidas a partir da polpa dentária para sua utilização a nível farmacológico e/ou biotecnológico.

117. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 111 a 115, caracterizado pelo falto das células-tronco serem modificas molecularmente para a sua utilização na terapia gêmea e/ou celular.

118. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 111 a 114, caracterizado pelo falto de ser um concentrado celular a ser utilizado em terapias autólogas, heterólogas ou alogènicas.

119. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 111 a 115, caracterizado pelo falto do concentrado celular ser utilizado a nível farmacológico ou biotecnológico.

120. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 111 a 115, caracterizado pelo falto do concentrado celular ser modificado molecularmente para sua utilização na terapia gênica. e/ou celular.

121. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 111a 114, caracterizado pelo falto de ser um concentrado celular pré-diferenciado a ser utilizado em terapias autólogas, heterõlogas ou alogênicas.

122. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 111 a 115, caracterizado pelo falto do concentrado celular pré-diferenciado ser utilizado a nível farmacolõgico ou biotecnológico.

123. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 111 a 115, caracterizado pelo falto do concentrado celular pré-diferenciado ser modificado molecularmente para sua utilização na terapia gênica. e/ou celular.

124. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 111 a 114, caracterizado pelo falto de ser de um concentrado celular diferenciado a ser utilizado em terapias autólogas, heterólogas ou alogênicas.

125. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 111 a 115, caracterizado pelo falto do concentrado celular diferenciado ser utilizado a nível farmacolõgico ou biotecnológico.

126. BANCO DE CÉLULAS-TRONCO, de acordo com a reivindicação 111 a 115, caracterizado pelo falto do concentrado celular diferenciado ser modificado molecularmente para sua utilização na terapia gênica. e/ou celular.