BG66813B1

BG66813B1 - Метод за in vitro размножаване на растения от вида lycium barbarum l.

Info

Publication number: BG66813B1
Application number: BG111842A
Authority: BG
Inventors: Теодора Георгиева; Маринова Георгиева Теодора; Камелия Миладинова-Георгиева; Петров Гуторанов Георги; Велмира Димитрова; Димитрова Миладинова-Георгиева Камелия; Георги Гуторанов; Людмилова Димитрова Велмира
Original assignee: "Био Трий" Оод
Priority date: 2014-10-16
Filing date: 2014-10-16
Publication date: 2019-01-15
Also published as: BG111842A

Abstract

Изобретението се отнася до метод за in vitro размножаване на растения от вида Lycium barbаrum L. с оглед използването им като източник на активни вещества за медицината, функционалното хранене и диетолечението. Методът включва култивиране върху хранителни среди на Murashige & Skoog и на Lloyd & McCown, обогатени с растителни растежни регулатори, избрани от групата, включваща бензиламинопурин (ВАР), гиберелинова киселина (GАз), индол-3-маслена киселина (IBA) и индол-3-оцетна киселина (IAA), както и адаптиране на in vitro вкоренените растения за растеж и развитие в in vivo условия върху субстрат на основата на торф с размер на частиците от 1.0 до 5.0 mm и съдържание на инертни материали при дефинирани условия на температура, влажност и осветление.

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до метод за in vitro размножаване на растения от вида Lycium barbarum L. с оглед използването им като източник на активни вещества за медицината, функционалното хранене и диетолечението.

Предшестващо състояние на техниката

Лечебните свойства на растенията от вида Lycium barbarum L. (Solanaceae) са известни от хилядолетия в Китай. Обичайният ареал на разпространението му са умерените и субтропичните райони на Китай, Монголия, Непал и Тибет, както и югоизточната част на Европа, но интереса към плодовете му расте през последните години извън неговия естествен ареал на разпространение.

Редица изследвания доказват медицинските качества на всички части на растението, дължащи се на неговите антиоксидантни свойства, включително благоприятното му въздействие при кардиоваскуларни и инфекциозни заболявания, при офталмологични проблеми (като възрастово-свързаните макуларна дегенерация и глаукома), неговите невропротективни свойства и противоракови и имуномодулаторни свойства. Lycium barbarum L. често се култивира за използването му като храна и напитка в Китай, но напоследък нараства износа и на изсушени плодове, сок и пулпа.

Известно е, че един от основните проблеми, свързани с препаратите на база фитофармацевтични растения е вариабилността в съдържанието на фармацевтично активните инградиенти. Тази вариабилност се дължи на множество различни фактори, сред които от особено значение е липсата на адекватни методи за получаване и стандартизиране на посадъчния материал и реколтата. Освен това, фитофармацевтичните растения, в това число тези от вида Lycium barbarum L., обикновено са отглеждани в естествената им природна среда и поради това са податливи на заразяване с бактерии, фунги и инсекти, които могат да променят съдържанието на фармацевтично активните компоненти. Налице е необходимост от създаване на технология за стабилно и възпроизводимо размножаване на фитофармацевтичните растения, така че съдържанието на желаните активни компоненти да е с постоянно, хомогенно и стабилно съдържание. Подобни възможности предоставя in vitro технологията за вегетативно размножаване, основана на способността на растителните клетки при поставяне в специална хранителна среда да репродуцират целия растителен организъм от клетка или група клетки. Тази способност на растителните клетки е известна като „Тотипотентност”. Процесът на образуване на de novo на цял организъм от диференцирана клетка е свързан с процеса на дедиференциация, при който диференцираните клетки започват да се делят и възобновяват своето ембрионално-активно състояние. От своя страна, делящите клетки могат да останат в недиференцирано състояние, образувайки калус или да преминат в редиференциация и да образуват нови тъкани, органи или цяло растение. Следователно, налице е необходимост от намиране на точната последователност от операции в комбинация със среди с оглед екстензивно in vitro размножаване на фитофармацевтични растения, в това число Lycium barbarum, така че да могат да бъдат получавани максимален брой жизнеспособни растения, които да бъдат използвани както в медицината, така и за функционалното и диетично хранене.

От патент ЕР 1164831 е известен метод за in vitro размножаване на фитофармацевтични растения, който включва култивиране на стерилни експланти от растенията върху индукционна хранителна среда, съдържаща поне един растителен растежен регулатор с цитокинова активност за формиране на регенеративна тъкан, прехвърляне на тази регенерирана тъкан в базална среда и култивирането й за формиране на разсад. В качеството на базална среда се използва известната хранителна среда на Murashige and Skoog (1962).

Изобретението обаче не включва следващите етапи, свързани с подготовката на намножените растения и тяхната аклиматизация към in vivo условия. Това са процесите на индуциране на коренова система, нарастване на растението единствено чрез апикалната си меристема и адаптирането му към in vivo условия, така че да бъдат получавани много на брой жизнеспособни растения с идентични характеристики.

Описания на издадени патенти за изобретения № 02.1/15.02.2019

Задача на изобретението е да предложи метод за in vitro размножаване на растения от вида Lycium barbarum L., който да позволи ефективно завършване на процеса на in vitro мултипликация от изходния експлант до получаване на цели растения, годни за самостоятелно развитие.

Техническа същност на изобретението

По своята същност методът за in vitro размножаване на растения от вида Lycium barbarum L. включва следната последователност от операции: подготовка на стартовия материал преди in vitro култивирането с цел поддържане на чисти от болести и неприятели растения, поливане и минерално хранене; стерилно изолиране на растителен материал (семена, зародиши, меристема, стъблен връх, експлант) и въвеждането му в хранителна среда; култивиране с цел получаване на голям брой растения без загуба на генетична стабилност; подготовка на получените растения за развитие в in vivo условия, състояща се от стопиране образуването на адвентивни стъбла и иницииране на коренообразуване, прехвърляне на растенията в почва и адаптиране към in vivo условия на развитие.

Като стартов материал за in vitro размножаване се използват нодални сегменти, семена от зрели плодове, зародиши, меристема, стъблен връх или експлант от десет различни източника.

По-специално, подготовката на стартовия материал преди in vitro култивирането предвижда обеззаразяване, като за целта изходният материал от стъблени сегменти се стерилизира чрез промиване в стерилна дестилирана вода с Tween 20 за 5 min, прехвърля се в 10% разтвор на Clorox с непрекъснато разбъркване и накрая се промива трикратно в стерилна дестилирана вода с последващо стерилно изолиране на растителен материал. В случаите, когато като изходен материал се използват семена, времето за обеззаразяване в Clorox се увеличава трикратно.

Така стерилизираният изходен материал се въвежда в хранителна среда за иницииране на прорастването, обогатена с растителни растежни регулатори и се култивира в продължение на 30 дни при условията на 16-часов фотопериод и температура 25°С +/- 2°С. По-специално, средата представлява хранителна среда на Murashige and Skoog, 1962 (MS) в комбинация с растителни растежни регулатори, избрани от групата, включваща бензиламинопурин (ВАР), гиберелинова киселина (GA₃), индол-3-маслена киселина (IBА) и индол-3-оцетна киселина (IAA).

Съгласно един предпочитан вариант на изпълнение, хранителната среда за иницииране на прорастването на растения Lycium barbarum, съгласно изобретението, включва хранителна среда на Murashige and Skoog (MS), към която са добавени от 0.1 до 2 mg/1 ВАР и от 0.1 до 1 mg/1 GA₃.

Съгласно втори вариант на изпълнение, хранителната среда за иницииране на прорастването на растения Lycium barbarum, съгласно изобретението, включва MS, към която са добавени от 0.1 до 1 mg/1 ВАР, от 0.01 до 0,2 mg/1 IAA и от 0.1 до 0.5 mg/1 GA₃.

Съгласно трети предпочитан вариант на изпълнение, хранителната среда за иницииране на прорастването на растения Lycium barbarum, съгласно изобретението, включва допълнително от 0.1 до 2 mg/1 ВАР и от 0.1 до 1 mg/1 GA₃.

Съгласно още един предпочитан вариант на изпълнение, хранителната среда за иницииране на прорастването на растения Lycium barbarum, съгласно изобретението, включва допълнително от 0.1 до 0.3 mg/1 IBA и от 0.01 до 0.2 mg/1 IAA.

За вкореняване, намножените растения се въвеждат в хранителна среда на Lloyd & McCown, 1980, наречена Woody Plant Media, (WPM), обогатена c растителни растежни регулатори, избрани от групата, включваща индол-3-маслена киселина (IBA), индол-3-оцетна киселина (IAA) и гиберелинова киселина (GA₃), както и източник на въглерод и желиращ агент и се култивират в продължение на 20 дни при условията на 16/8-часов фотопериод (осветеност 3000 lux) и температура 25°С +/- 2°С. След 10-14 дни над 95% от растенията формират коренови връхчета с размер 3-4 cm и минимум 4-5 броя на растение. Успоредно с това растенията се развиват нормално и удвояват първоначалната си височина, като премахването на цитокинина в хранителната среда елиминира образуването на странични стебла. Листата формират по-големи петури спрямо средата за размножаване, което подобрява последващата им адаптация към външни условия.

Съгласно един предпочитан вариант на изпълнение, хранителната среда за иницииране на коре

Описания на издадени патенти за изобретения № 02.1/15.02.2019 нообразуването на растения Lycium barbarum, съгласно изобретението, включва хранителна среда на Lloyd & McCown, 1980 (WPM), обогатена с от 0.2 до 0.3 mg/1 индол-3-маслена киселина (IBA), от 0.1 до 0.2 mg/1 индол-3-оцетна киселина (IAA) и от 0.1 до 0.3 mg/1 гиберелинова киселина (GA₃), както и от 20.0 до 25.0 g източник на въглерод и от 7.0 до 8.0 g желиращ агент. Добавянето на ауксина IBA в посоченото количество води до развитие на кореновата система на растението в рамките на 20 дни, а ауксина IAA стимулира нарастването му във височина и развитието на листните петури с цел улесняване аклиматизацията му in vivo.

Съставът на хранителните среди, съгласно изобретението, е съобразен максимално със специфичните физиологични особености на растението Lycium barbarum така, че да се осигурят оптимални условия за успешното му in vitro размножаване. Подбраните растежни регулатори, използвани в хранителната среда изключват вероятността от индуциране на сомаклонално вариране в in vitro тъканни култури; създава се възможност за получаване на идентичен клонов материал от жизнени, устойчиви на заболявания и годни за самостоятелно развитие растения, като от един изходен експлант за един месец могат да бъдат получени между 3 и 5 растения, а в рамките на една година количеството може да достигне до над милион; при това процеса не засяга генотипа на растението и получените растения са идентични на селектирания изходен материал.

Последващ много важен етап от метода за in vitro култивиране на растенията от вид Lycium barbarum, съгласно изобретението, е етапа на адаптация на in vitro вкоренените растения за растеж и развитие в in vivo условия. Той предвижда прехвърляне на вкоренените растения в субстрат на основата на торф с размер на частиците от 1 до 5 mm и съдържание на инертни материали 40% перлит и 20% пясък при киселинност pH 6,5, където се оставят за адаптация в продължение на 14 дни. През този период се поддържа температура от 20°С +/- 5°С и фотопериод 16/8 (светлинна/тъмнинна фаза) при 2000 lux. През първите три дни от периода на адаптация се поддържа 100% влажност, които постепенно се намаляват до 70% в края на седмия ден. След този първи етап на адаптация, протичащ в покрити плати и контролирани параметри на влажност, температура и осветеност, растенията преминават през втори етап, в който формират стабилна коренова система и достигат до височина около 7 до 9 cm. В края на втория период те са вече адаптирани и готови за прехвърляне и доотглеждане в по-големи контейнери.

Предимствата на метода, съгласно изобретението се състоят в това, че предлага ефективен начин за In vitro размножаване, съобразен със специфичните изисквания на растенията от вида Lycium barbarum. Той дава огромно стопанско предимство с много високия си коефициент на намножаване. В естествени условия от едно растение годишно могат да се получат до 100 нови, докато по метода, съгласно изобретението се достига получаване на до 1 000 000, отглеждани на малка площ жизнеспособни индивиди с хомогенни качествени характеристики, които са стабилни и осигуряват сигурност при използването на фитофармацевтичните им свойства.

Примери за изпълнение на изобретението

Изобретението се илюстрира със следните примерни изпълнения, без да ограничават неговия обхват.

Пример 1. In vitro култивиране на растения от вида Lycium barbarum чрез стъблени сегменти

Стъблени сегменти от растение Lycium barbarum се стерилизират чрез промиване в стерилна дестилирана вода с Tween 20 за 5 min, прехвърлят се в 10% разтвор на Clorox с непрекъснато разбъркване и накрая се промиват трикратно в стерилна дестилирана вода с последващо стерилно изолиране на растителен материал.

Последният се въвежда в хранителна среда за иницииране на прорастването, обогатена с 1 mg/1 ВАР, 0.2 mg/1 IAA и 0.5 mg/1 GA₃ и се култивира в продължение на 30 дни при условията на 16-часов фотопериод и температура 25 °C +/- 2°С. Тази комбинация от растителни растежни регулатори в хранителната среда дава максимално количество на развити странични пъпки за получаване на максимален коефициент на размножаване.

Следва етап на вкореняване на така получените експланти чрез въвеждането им в хранителна среда Woody Plant Media, Lloyd & McCown, 1980 (WPM), обогатена c 0.1 mg/1 IAA, 0.3 mg/1 GA₃ и 0.3 mg/1 IBA; 20.0 g захароза и 8.0 g arap при киселинност на средата pH 5.8. Култивирането протича при

Описания на издадени патенти за изобретения № 02.1/15.02.2019 температура 25 °C +/- 2°С и фото период 16/8 (3000 lux) в продължение на 10 до 14 дни.

Така вкоренените растения (моностъблени без развити странични адвентивни стебла) се подлагат на адаптация за растеж и развитие в in vivo условия. Този етап предвижда прехвърляне на вкоренените растения в субстрат на основата на торф с размер на частиците от 1 до 5 mm и съдържание на 40% перлит и 20% пясък при киселинност pH 6.5, където се оставят за адаптация в продължение на 14 дни. През този период се поддържа температура от 20°С +/- 5 °C и фото период 16/8 h (светлинна/тъмнинна фаза), при 2000 lux. През първите три дни от периода на адаптация се поддържа 100% влажност, които постепенно се намаляват до 70% в края на седмия ден. След този първи етап на адаптация, протичащ в покрити плати и контролирани параметри на влажност, температура и осветеност, растенията преминават през втори етап, в който формират стабилна коренова система и достигат до височина около 7 до 9 cm. В края на втория период те са вече аклиматизирани и готови за прехвърляне и доотглеждане в по-големи контейнери.

Claims

Патентни претенции

1. Метод за in vitro размножаване на растения от вида Lycium barbarum L. с използване на хранителни среди на Murashige & Skoog (MS) и на Lloyd & McCown (WPM), характеризиращ се с това, че включва:

a) култивиране на стерилни експланти от растението върху хранителна среда за иницииране на прорастването, представляваща среда на Murashige & Skoog (MS), обогатена с 0.1 до 2.0 mg/1 бензиламинопурин (ВАР), от 0.01 до 0.2 mg/1 индол-3-оцетна киселина (IAA), от 0.1 до 1.0 mg/1 гиберелинова киселина (GA₃) и от 0.1 до 0.3 mg/1 индол-3-маслена киселина (IBA);

b) прехвърляне на намножените растения в хранителна среда за вкореняване, включваща среда на Lloyd & McCown (WPM), обогатена с от 0.2 до 0.3 mg/1 индол-3-маслена киселина (IBA), от 0.1 до 0.2 mg/1 индол-3-оцетна киселина (IAA) и от 0.1 до 0.3 mg/1 гиберелинова киселина (GA₃), както и източник на въглерод и желиращ агент;

c) адаптиране на in vitro вкоренените растения за растеж и развитие в in vivo условия върху субстрат на основата на торф с размер на частиците от 1.0 до 5.0 mm и съдържание на инертни материали при pH 6,5, температура от 20°С +/- 5°С, влажност от 70 до 100% и фотопериод 16/8 h при 2000 lux за време от 10 до 14 дни.
2. Метод за in vitro размножаване на растения от вида Lycium barbarum L. съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че като източник на въглерод в хранителната среда за вкореняване се използва захароза в количество от 20.0 до 25.0 g, а като желиращ агент се използва агар в количество от 7.0 до 8.0 g.