BG65951B1

BG65951B1 - Метод за in vitro определяне на автоантитела в серум на човек

Info

Publication number: BG65951B1
Application number: BG109907A
Authority: BG
Inventors: Мариан ДРАГАНОВ; Мариана МУРДЖЕВА
Original assignee: Мариан ДРАГАНОВ; Мариана МУРДЖЕВА
Priority date: 2007-07-09
Filing date: 2007-07-09
Publication date: 2010-06-30
Also published as: BG109907A

Abstract

Изобретението се отнася до метод за in vitro определяне на автоантитела в серум на човек, по-специално на антинуклеарни и антимитохондриални антитела, с участието на щам постоянна клетъчна линия, депозирана в НБПМКК под № 8574.

Description

(54) МЕТОД ЗА IN VITRO ОПРЕДЕЛЯНЕ HA АВТОАНТИТЕЛА В СЕРУМ НА ЧОВЕК

Област на техниката

Изобретението се отнася до метод за in vitro определяне на автоантитела в серум на човек, по-специално на антимитохондриални и антинуклеарни антитела, приложим за изследване на автоимунното състояние на човек в норма и патология.

Предшестващо състояние на техниката

Известно е, че изследването на автоимунното състояние на човека при норма и патология се осъществява чрез прилагане на специфични имунологични методи и тяхната интерпретация. Основна цел при тези изследвания е осигуряването на ранна и надеждна информация за промените в основните показатели на имунната система.

Известно е също, че автоимунните заболявания се характеризират с появата на антитела, насочени срещу молекули и структури на собствения организъм, означавани като автоантителата. Автоантителата, насочени срещу компоненти на ядрото се означават като антинуклеарни, а такива насочени срещу митохондриите, се наричат антимитохондриални антитела. Доказването на антинуклеарните и антимитохондриални автоантитела в серума на човек може да се използва за диагностика и оценка на автоимунния феномен при колагенози, лекарствени интоксикации, заболявания на черния дроб и жлъчни пътища, малигнени процеси и др.

Известно е, че като основен имунологичен тест за in vitro доказване на антинуклеарни и антимитохондриални антитела се използва методът на индиректна имунофлуоресценция, при който в качеството на субстрат се използват замразени животински срези от различни видове чернодробни или бъбречни тъкани /1,2/, а в качеството на антитяло, насочено срещу антигенните детерминанти на присъстващото в серума антитяло, се използва флуоресцентно- маркирано антитяло. Този метод, обаче, изисква непрекъснато изготвяне на препарати от прясно изолирани органи. Друг недостатък се явява тъкан ната архитектура на среза, определяща по-малките размери на клетките в субстрата, което затруднява визуализацията.

Известно е също, че в качеството на субстрат при индиректната имунофлуоресценция за определяне на антинуклеарни и антимитохондриални антитела могат да се използват и клетки от малигнени бъбречни тумори, по-специално хипернефромни клетки /3/. Този метод изисква намножаване на клетките в подходяща хранителна среда в първична тъканна култура, стабилизирана като клетъчна линия и на 50-тия пасаж съхранена в течен азот при -196°. Недостатък на този метод е, че с оглед определяне на антинуклеарните антитела, клетъчният субстрат трябва да се фиксира, а за определяне на антимитохондриални антитела клетъчният субстрат следва да се използва като изсушен на въздух.

Известно е още /4/, че като субстрат в имунофлуоресцентен тест за in vitro диагностика на автоимунни заболявания, по-специално системен лупус еритематозус, могат да се използват фетални телешки тимоцити след специална обработка. Недостатък на този метод е, че изисква прясно изолиране на тимоцити, както и това, че поради спецификата натимоцигната морфология е приложим единствено за определяне на антинуклеарните антитела в серум на човек.

Известно е също използването на имунопероксидазен метод за доказване на антинуклеарни антитела в серум на човек, при който антисерумът е маркиран с пероксидаза /5/. Основен недостатък на този метод е неговата ниска чувствителност.

Техническа същност на изобретението

Изобретението се отнася до метод за in vitro определяне на автоантитела в серум на човек, по-специално на антинуклеарни и антимитохондриални антитела посредством индиректна имунофлуоресценция, съгласно който в качеството на антиген се използва специално създаден за целта щам постоянна клетъчна линия, регистрирана в НБПМКК под № 8574 на 20.03.2007. Клетъчната линия е миша по произход, съдържа фибробластоподобни клетки и е специално адаптирана за култивиране в свободна от протеин и серум среда.

Методът включва последователност от

65951 Bl операции, както следва:

Клетките от постоянната клетъчна линия НБПМКК № 8574/20.03.2007, след предварително култивиране в свободна на серум и протеини хранителна среда, се съхраняват в течен азот при -196°С. За целите на метода, размразяването се извършва посредством бързо затопляне на криоепруветката чрез поставянето й в съд с вода на 37°С.

За доказване на антинуклеарните антитела (АНА) и антимитохондриалните антитела (АМА) в серум на човек, след размразяване и разреждане в обем 8 ml с Dulbecco’s Minimum Essential Medium/Ham’s F-12 (DMEM/HAM F-12), клетъчната линия се залага в съд за клетъчно култивиране и след 5-6 дни клетъчният монослой се дезагрегира с трипсин. За изготвяне на предметните стъкла с клетъчен субстрат, във всяка ямка от предметно стъкло с 5 или 10 ямки се поставят от 40 до 50 microl суспензия на клетки от щама. Предметните стъкла се инкубират във влажна камера в продължение на 48 h при 37°С и 5% ниво на СО₂ във въздушната фаза. Следва промиване с топъл (37°С) фосфатно-буфериран солев разтвор (PBS) и фиксиране с леденостуден химически чист ацетон за 10 min.

Характерно за метода, съгласно изобретението е, че както за определяне на АНА, така и за определяне на АМА, клетките се подлагат на фиксиране, което позволява запазване на молекулите в ядрото или митохондриите, свързващи автоантителата.

Предметните стъкла, съдържащи клетъчен субстрат от постоянната клетъчна линия НБПМКК № 8574/ 20.03.2007, се темперират на стайна температура във влажна камера от 20 до 40 min, след което в ямките се накапват по 20 microl от изследвания серум на човек и се инкубират от 20 до 40 min на стайна температура с оглед свързване на антитялото с антигена. Тестваните серуми са предварително разредени с изотоничен солев разтвор, по-специално PBS - за скриниращ тест -1:40, а за разгънат - 1:40,1:80,1:160, 1:320,1:640,1:1280 или още повече понижаващи разреждания в зависимост от интензитета на флуоресценцията в скриниращия тест. Целта е да се получи информация за титъра на тези автоантитела в серума на пациента, което подпомага прецизирането на съответното предполагаемо заболяване. Следва трикратно промиване с PBS и прибавяне на флуоресцентно-маркирано антитяло, насочено срещу присъстващото в серума антитяло - АНА или АМА. Инкубира се за 30 min в тъмна влажна камера, отново се промива с PBS и се покрива с включваща среда от PBS и глицерол.

Микроскопската оценка на така подготвения препарат се осъществява по начин, известен на специалистите в имунофлуоресцентната микроскопия /5/. Използва се флуоресцентен микроскоп Nicon Optiphot 2 (Nicon Corp., Japan), a микроскопските изображения са заснети с фотографска камера Nicon FX-35DX (Nicon Corp., Japan). При наличие на АНА микроскопската картина се демонстрира с характерно светене в ядрото на клетките (фиг. 1), а при наличието на АМА - с характерно светене в цитоплазмата (фиг. 2), служещи като диагностичен маркер за наличие на автоимунно заболяване.

Предимствата на метода, съгласно изобретението се състоят в това, че предлага много по-добре дефинирана културална система, която е по-надеждна, осигурява по-лесно интерпретиране на резултатите, както и ниска себестойност на клетъчния субстрат спрямо известните досега НЕр-2 клетки, фетални телешки тимоцити и хипернефромни клетки в култура. Съответно, клетъчната линия НБПМКК № 8574/20.03.2007 е особено подходяща за in vitro диагностика на автоимунни заболявания чрез определяне на АНА и АМА.

Пояснение на приложените фигури

Фигура 1 представлява микроскопско изображение за антинуклеарни антитела от серум на болен със системен лупус еритематозус, получено чрез метода, съгласно изобретението;

фигура 2 - микроскопско изображение за антимитохондриални антитела от серум на болен с първична билиарна цироза, получено чрез метода, съгласно изобретението.

Примери за изпълнение на изобретението

Изобретението се илюстрира със следните примерни изпълнения, без да ограничават неговия обхват.

Пример 1. In vitro определяне на антинуклеарни антитела в серум на болни със системен

65951 Bl лупус еритематозус

За in vitro определяне на антинуклеарни антитела в серум на болни със системен лупус еритематозус, в качеството на антигенен субстрат се използва щам постоянна клетъчна линия НБПМКК № 8574/20.03.2007. Клетъчната линия е миша по произход, съдържа фибробластоподобни клетки и е специално адаптирана за култивиране в свободна от протеин и серум среда. Клетъчната линия е предварително култивирана в модифицирана хранителна среда, позната в литературата с името Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/Hams’s Nutrient Mixture F-12 with 15 mM HEPES and L-glutamine /6/, и съхранявана в течен азот при -196°С. За целите на метода, размразяването се извършва посредством бързо затопляне на криоепруветката чрез поставянето й в съд с вода с температура 37°С. Следва разреждане в обем 8 ml с Dulbecco’s Minimum Essential Medium/Ham’s F-12 (DMEM/ HAM F-12), след което клетъчната линия се залага в съд за клетъчно култивиране и след 5-6 дни клетъчният монослой се дезагрегира с трипсин в крайна концентрация 0.005%.

Всяко кладенче от предметните стъкла, съдържащи 8 ямки, се покрива с 50 microl клетъчна суспенсия, съдържаща 2х10⁵ клетки/ml и предметните стъкла се инкубират в продължение на 48 h в камера с висока влажност (над 98%) при 37°С и ниво на СО₂ във въздушната фаза 5%. След инкубацията предметните стъкла се промиват с топъл (37°С) фосфатно-буфериран разтвор на сол (PBS) KCL 0,2 g/1; NaCl 8,0 gd; Na₂HPO₄x H₂O 2,16 g/1; pH 7,4-7,6) и се фиксират с леденостуден химически чист ацетон за 10 min.

Предметните стъкла, съдържащи клетъчен субстрат от постоянната клетъчна линия НБПМКК № 8574/20.03.2007, се темперират на стайна температура във влажна камера за 30 min, изплакват се с PBS, промиват се в кювета с PBS чрез внимателно разклащане за 10 min, след което в ямките се накапват по 20 microl от изследвания серум на болен и се инкубират 30 min на стайна температура с оглед свързване на антитялото с антигена.

Серумът е предварително разреден с PBS до 1:40, тъй като предварителните изследвания показват висока чувствителност на метода за пациенти със системен лупус еритематозус при титър 1:40. Следва трикратно промиване с PBS и прибавяне на 20 microl флуоресцентно-маркирано антитяло, по-специално FITC-конюгат, инкубиране за 30 min в тъмна влажна камера, отново се промива с PBS чрез внимателно разклащане за 10 min и се покрива с включваща среда, съдържаща PBS и глицерол. Предметните стъкла се оценяват на флуоресцентен микроскоп Nicon Optiphot 2 (Nicon Corp., Japan) при увеличение x 400. Микроскопските изображения са заснети с Nicon FX-35DX фотографска камера (Nicon Corp., Japan) върху цветен филм Fuji Supera ISO 400.

Наличието на антинуклеарни антитела в из»следвания серум, което е показател за заболяване на индивида, се демонстрира с характерно светене в ядрото на клетките, показано на приложената фигура 1.

Методът осигурява високо качество на наблюдавания образ в ядрото на клетките.

Пример 2. In vitro определяне на антимитохондриални антитела в серум на болни с първична билиарна цироза

За in vitro определяне на антимитохондриални антитела в серуми на болни с първична билиарна цироза чрез индиректна имунофлуоресценция се следва последователността от операции, изложена в пример 1. При наличие на антимитохондриални антитела в серума на пациента, се наблюдава характерно флуоресцентно светене в цитоплазмата на клетките, показано на приложената фигура 2.

Методът осигурява високо качество на наблюдавания образ в цитоплазмата, съдържаща митохондриите на клетките.

Claims

Патентни претенции

1. Метод за in vitro определяне на автоантитела в серум на човек, по-специално на антинуклеарни и антимитохондриални антитела, посредством поставяне на изследвания серум с търсеното антитяло върху антигенен субстрат, инкубиране и промиване на клетките с последващо прибавяне на флуоресцентно маркирано антитяло, характеризиращ се с това, че в качеството на антигенен субстрат се използва щам постоянна клетъчна линия, депозирана в НБПМКК под № 8574.