BG64056B1 - Състави и методи за откриване и лечение на спин - Google Patents
Състави и методи за откриване и лечение на спин Download PDFInfo
- Publication number
- BG64056B1 BG64056B1 BG102083A BG10208397A BG64056B1 BG 64056 B1 BG64056 B1 BG 64056B1 BG 102083 A BG102083 A BG 102083A BG 10208397 A BG10208397 A BG 10208397A BG 64056 B1 BG64056 B1 BG 64056B1
- Authority
- BG
- Bulgaria
- Prior art keywords
- protein
- hiv
- cells
- serum
- macroglobulins
- Prior art date
Links
- 238000011282 treatment Methods 0.000 title claims abstract description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 41
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 7
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims abstract description 62
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 claims abstract description 22
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 14
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 14
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 65
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 59
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 47
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 claims description 45
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 claims description 37
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 claims description 37
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 33
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 32
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 29
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 28
- 239000010802 sludge Substances 0.000 claims description 25
- 108010091934 Macroglobulins Proteins 0.000 claims description 24
- 102000018721 Macroglobulins Human genes 0.000 claims description 24
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 17
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 16
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 16
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 15
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 14
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 13
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 13
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 11
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 claims description 10
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 claims description 10
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 9
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 8
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 7
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 230000004807 localization Effects 0.000 claims description 7
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 7
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 7
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 6
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 6
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 4
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 claims description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims 4
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 claims 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 21
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 21
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 69
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 62
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 36
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 32
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 28
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 27
- 101710147327 Calcineurin B homologous protein 1 Proteins 0.000 description 25
- 101710205625 Capsid protein p24 Proteins 0.000 description 25
- 101710177166 Phosphoprotein Proteins 0.000 description 25
- 101710149279 Small delta antigen Proteins 0.000 description 25
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 25
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 25
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 25
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 19
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 18
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 18
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 18
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 9
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 8
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 8
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 206010001513 AIDS related complex Diseases 0.000 description 7
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 6
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 102000005686 Serum Globulins Human genes 0.000 description 4
- 108010045362 Serum Globulins Proteins 0.000 description 4
- VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K aluminium trichloride Chemical compound Cl[Al](Cl)Cl VSCWAEJMTAWNJL-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 3
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 3
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- BMQYVXCPAOLZOK-UHFFFAOYSA-N Trihydroxypropylpterisin Natural products OCC(O)C(O)C1=CN=C2NC(N)=NC(=O)C2=N1 BMQYVXCPAOLZOK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 3
- 244000309466 calf Species 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N ethyl formate Chemical compound CCOC=O WBJINCZRORDGAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 3
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 3
- BMQYVXCPAOLZOK-XINAWCOVSA-N neopterin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)C1=CN=C2NC(N)=NC(=O)C2=N1 BMQYVXCPAOLZOK-XINAWCOVSA-N 0.000 description 3
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- YODZTKMDCQEPHD-UHFFFAOYSA-N thiodiglycol Chemical compound OCCSCCO YODZTKMDCQEPHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229950006389 thiodiglycol Drugs 0.000 description 3
- HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N zidovudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](N=[N+]=[N-])C1 HBOMLICNUCNMMY-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 229960002555 zidovudine Drugs 0.000 description 3
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 102100033312 Alpha-2-macroglobulin Human genes 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 102000006395 Globulins Human genes 0.000 description 2
- 108010044091 Globulins Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282575 Gorilla Species 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 208000001388 Opportunistic Infections Diseases 0.000 description 2
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 2
- 108010015078 Pregnancy-Associated alpha 2-Macroglobulins Proteins 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 2
- 108010091268 alpha-Macroglobulins Proteins 0.000 description 2
- 102000018162 alpha-Macroglobulins Human genes 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 2
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- HWGNBUXHKFFFIH-UHFFFAOYSA-I pentasodium;[oxido(phosphonatooxy)phosphoryl] phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O HWGNBUXHKFFFIH-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BDKLKNJTMLIAFE-UHFFFAOYSA-N 2-(3-fluorophenyl)-1,3-oxazole-4-carbaldehyde Chemical compound FC1=CC=CC(C=2OC=C(C=O)N=2)=C1 BDKLKNJTMLIAFE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124321 AIDS medicine Drugs 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003846 Carbonic anhydrases Human genes 0.000 description 1
- 108090000209 Carbonic anhydrases Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010011831 Cytomegalovirus infection Diseases 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 1
- 101710121417 Envelope glycoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 1
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 1
- 208000032376 Lung infection Diseases 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 101710092599 Protein 7.7 Proteins 0.000 description 1
- 101800000460 Protein TF Proteins 0.000 description 1
- 102100033536 Ribosomal protein S6 kinase alpha-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710119197 Ribosomal protein S6 kinase alpha-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000013439 Unusual infection Diseases 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000011166 aliquoting Methods 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002155 anti-virotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 150000004691 decahydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 210000004293 human mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960005030 other vaccine in atc Drugs 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 1
- 230000012121 regulation of immune response Effects 0.000 description 1
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 229940087562 sodium acetate trihydrate Drugs 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000010648 susceptibility to HIV infection Diseases 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 238000002627 tracheal intubation Methods 0.000 description 1
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
- G01N33/56988—HIV or HTLV
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретението се отнася по-специално до състави, получени от клетки от тимусна жлеза на бозайници, приложими в имунологията и вирусологията. Клеткитеса полезни като диагностични средства, ваксини и терапевтични средства срещу инфекция с вируса на имунна недостатъчност при хора (HIV) и свързаните снего заболявания като синдром на придобита имуннанедостатъчност (СПИН) и комплекс (ARC). Изобретението се отнася още до методите за диагностика, ваксинация и лечение, и до средствата, включващи тезисъстави.
Description
Област на техниката
Изобретението се отнася до областта на имунологията и вирусологията, и по-специално се отнася до състави, които се получават от клетки от тимусна жлеза на бозайник, като клетките са полезни като диагностични средства, ваксини и терапевтични средства срещу инфекция с вируса на имунна недостатъчност при хора (HIV) и свързаните заболявания, като синдром на придобита имунна недостатъчност (СПИН) и свързан със СПИН комплекс (ARC). В описанието се включват методите за диагностика, ваксинация и лечение, както и средствата, използващи тези състави.
Предшестващо състояние на техниката
Костният мозък произвежда клетки, чието предназначение е да станат имунни клетки. Тези клетки стават лимфоцити или фагоцити. Лимфоцитите са малки бели кръвни телца, които носят главната отговорност за провеждането на дейностите на имунната система. Двата главни класа лимфоцити са В и Т клетки. В клетките узряват в костния мозък (оттам и термина “В” клетки - bone). Т клетките мигрират към тимуса (оттам и термина “Т” клетки), където те се размножават и узряват до клетки, способни на имунен отговор. Вследствие дразнене на костния мозък или тимуса, В и Т клетките изминават дълъг път през тялото.
Съществуват два вида Т клетки, регулаторни и цитотоксични Т клетки, които допринасят за имунната защита по два главни начина. Най-важните сред Т клетките са “хелперните/индуцерни” клетки. Т хелперните клетки, които могат да се идентифицират чрез Т4 клетъчен маркер, са основните за активиране на В клетките и други Т клетки, като например естествените килърни клетки и макрофагите. Цитотоксичните Т клетки и килърните клет ки, които например, директно атакуват и освобождават тялото от клетки, които са били инфектирани от вируси или трансформирани от рак.
Важните фагоцити са моноцитите и макрофагите. Моноцитите циркулират в кръвта, след което мигрират в тъканите, където те се развиват в макрофаги (“големи ядачи”). Макрофагите се откриват в телесните тъкани и са подвижни клетки, които играят много роли. Като чистачи (фагоцити), те освобождават тялото от клетъчните обвивки и други клетъчни отломки. Първи измежду клетките, които представят антигена на Т клетките, първи смилащи и извършващи процесинга, макрофагите играят решаваща роля при инициирането на имунния отговор. Като секреторни клетки, моноцитите и макрофагите са жизнено важни за регулирането на имунните отговори. Те носят също така и рецептори за лимфокини, които им позволяват да се “активират” за преследване на микробиалните и туморни клетки.
Синдромът на придобита имунна недостатъчност (СПИН) се причинява от човешкия вирус на имунна недостатъчност (HIV). HIV разрушава Т хелперните клетки и се получава от макрофагите и моноцитите. СПИН се характеризира с многобройни необичайни инфекции и иначе рядко срещани форми на рак. HIV наранява, също така, и тъканите на главния и гръбначния мозък, като по този начин предизвиква прогресираща деменция.
Когато HIV инфектира хора, той се инкорпорира в дезоксирибоиуклеиновата киселина (ДНК) на имунните клетки и за променлив период от 3 месеца до 7 години, в пациента може да не се изявяват никакви симптоми на имунна недостатъчност и понякога не се продуцират откриваеми нива на антитела срещу СПИН. Щом една начална HIV инфекция може да не доведе веднага до откриваеми клинични симптоми на заболяване или до откриваеми нива на антитела, терминът “HIV инфекция”, както се използва тук, включва инфекцията и всяко дължащо се на нея заболяване, като те се отбелязват с термина “свързани с HIV заболявания”. Пример за свързани с HIV заболявания са СПИН и ССК. След посочения инкубационен период, HIV се размножава в инфектираната клетка и евентуално пръсва клетката гостоприемник, като освобождава новообразуваните вируси. Тъй като клет ките гостоприемници се разрушават, имунната система на пациента се поврежда и гостоприемникът става възприемчив към опортюнистични заболявания, към които човек с незасегната имунна система е невъзприемчив. Вирусът на СПИН обикновено се размножава и човекът евентуално умира от тежка форма на имунна недостатъчност. От особен интерес е, че само хората страдат от СПИН. Когато бозайник, но не човек, например заек, мишка, плъх или крава се инжектира с HIV, животното може временно да развие известно разрушаване на Т клетките. Въпреки това, 14 до 21 дни след инфектирането, животното ще организира атака на антитела и няма да се поддаде на СПИН. Поради тази причина не съществува животински модел за СПИН.
Обикновено няма излекуване или даже ефективна терапия срещу СПИН. Изследванията в тази област са в безпътица.
Налице е също така и непрекъснато търсене на метод за правилно диагностициране на СПИН в един ранен етап на заболяването. Достъпните на пазара диагностични тестове са насочени към откриване в пациента на антитела срещу HIV. При такива тестове съществува промеждутък от 14 до 21 дни от момента, в който пациентът е инфектиран със СПИН до момента, в който пациентът започва да произвежда антитела срещу вируса. Следователно, ако пациентът бъде подложен на тест в този промеждутък от време, то тогава тестът ще даде погрешен отрицателен резултат. Някои от тези тестове могат да дадат и грешни положителни резултати, дължащи се на неспецифично свързване на антителата. Друг начин за откриване на вирусната инфекция е чрез хибридизация на нуклеиновите киселини.
Ако не е отбелязано друго, следващото се основава на Stein, D. S. et al., J. Infect. Diseases, 165:352 (1992). Заместителниятмаркер, който най-близко корелира с етапа на развитие на HIV инфекцията, е CD4+, или преброяване на Т хелперните клетки. Гликопротеинът от обвивката на HIV-1, gpl20 специфично се свързва с CD4 рецептора, който се експресира във високи концентрации в подгрупата Т лимфоцити и в ниски концентрации в моноцитите и макрофагите. За клетките, които експресират CD4 рецептори, се използва терминът “хелперна/индуцерна” подгрупа, което отразява тяхната роля като хелперни клет ки при В клетъчния отговор за антигените, експресирани в клетките, носещи рецептори за човешки левкоцитарен антиген (HLA) клас II, и като индуциращи клетки, които предизвикват Т клетките да подтискат имунния отговор. Селективната загуба на CD4 клетки води до многобройни дефекти в имунната система, свързани с чувствителност към опортюнистичните инфекции, които са отличителния белег на СПИН.
Присъствието на антигена от сърцевината на HIV, р24, може да се установи преди появата на HIV антителата. След появата на HIV антителата, чрез скриниране на изследването за ензимсвързан имуносорбент (ELISA), р24 антигенемията става невъзможна за установяване, въпреки че евентуално може да продължи и често може отново да се появи покъсно при развитието на болестта. Установените титрати на HIV-Ι в плазмата и в култури на моноядрените клетки от периферната кръв също бързо спадат, тъй като специфичните антитела могат да се открият, което подсказва поне временно ефективен имунен отговор на гостоприемника. Маркерите за имунно стимулиране включват Р2-микроглобулин.
При пациенти, при които е настъпил период на сероконверсия, намалелият брой CD4+ клетки се свързва с прогресирането на СПИН. Серумните нива на Р2-микроглобулин и установяването на р24 антиген в кръвта и двете независимо корелират със степента на прогресиране. При комбиниране с броя на CD4+ клетки, използването на 32-микроглобулини и р24 антиген увеличава прогностичната точност за СПИН, в сравнение единствено с преброяването на CD4+.
Въпреки това е рядко за сероконвертите да имат съществено отпадане на процента на CD4+ клетките им в следващите три години. В интервалите между посещенията са установени стабилни, както и намаляващи нива на процента на CD4+ клетките при 38% от субектите, с 12% експериментално намаляване, следвано от определяне на степента на загуба на CD4+ клетки. При 62% от изследванията намалява процента на техните CD4+ клетки след три години от началото на следенето.
При изследване на 306 серопозитивни, инфектирани с HIV хомосексуалисти с неизвестно време на сероконверсия, и двете - броят на CD4+ клетките < 500/μ1, както и устано вяването на р24 антигена, са били предсказващи за СПИН за интервал от 30 месеца.
Установено е, че нарастването на броя на CD8+ клетките е до известна степен предсказващо за последващо развитие на СПИН.
За да се свържат по-добре крайните клинични точки, като например преживяването и прогресирането на СПИН, със заместителните маркери от ефектите на антивирусната терапия, анализите от допълнителни маркери, като neopterin и Р2-микроглобулин, измежду други, се комбинират с броя на CD4+ клетките и р24 антигена.
При ограничено изследване [Jacobson, М. A., BNJ, 302:73 (1991)] на пациенти със СПИН и ARC, които понасят едно анти СПИН лекарство, zidovudine, и които преживяват 12 седмици, бе открито следното.
След контролиране на три фактора (възраст, диагноза на СПИН в начален стадий, log на концентрацията на neopterin в началния серум), log на броя на CD4* клетките през 8-12 седмици, но не и промяната извън времето, подобро предсказване последвалото преживяване. Намаляването на концентрацията на 32-микроглобулин през 8-12 седмица значително предсказва преживяване, и комбинирано с log на броя на CD4+ клетките, предоставя най-добрия модел за предсказване. Намаляването на р24 антигенемията, концентрацията на серумния neopterin, и определяне на статуса по Kamofsky (измерване на функциите при рутинни действия) не корелират значително с преживяването вследствие терапията.
Stein, D. S. et al.; посочено по-горе, стигат до извода, че промяната на броя на CD4+ клетките и други заместващи маркери може да нараства при използване като единствена крайна точка при изследването на антивъзстановителната дейност на лекарствено средство или терапия при пациенти с начална HIV инфекция.
Описание на изобретението
В един аспект на изобретението се представят състави, полезни за диагностика и лечение на HIV инфекции, като СПИН и ARC.
Друг аспект на изобретението представя методи за установяване на HIV инфекция при използване на посочените състави.
Друг аспект на изобретението представя методи за лечение на HIV инфекция при използване на посочените състави.
Друг аспект на изобретението представя методи за приготвяне на посочените състави от клетки от тимусна жлеза на бозайник, който не е човек.
Друг аспект на изобретението представя средства за in vitro установяване на HIV инфекция при използване на посочените състави.
Кратко описание на фигурите
Фигура 1 показва хроматограма на тимусен фактор (“ТФ”) препарат.
Фигура 2 - графично разположение на двуизмерния гел в неговото първо измерение.
Фигура 3 - графично разположение на двуизмерния гел в неговото второ измерение.
Фигури от 4 до 11 показват фотографии на двуизмерни гелове, които представят модела на утаяване на ТФ със серумни проби от HIV положителен или СПИН положителен субект човек и от здрав индивид.
Фигура 12 графично показва фиг. 7 и разстоянията, измерени за неговия анализ.
Фигура 13 - фотография на двуизмерен електрофоретичен гел, който показва модела на утаяване на ТФ със серумна проба от HIV отрицателен субект-човек.
Фигура 14 - фотография на двуизмерен електрофоретичен гел, който показва модела на утаяване на ТФ със серумна проба от HIV положителен субект-човек.
Фигура 15 - фотография на двуизмерен електрофоретичен гел на серумна проба, получена на 04.05.1995 от тестов субект от пример 3.
Фигура 16 - фотография на двуизмерен електрофоретичен гел на серумна проба, получена на 11.05.1995 от тестов субект от пример 3.
Фигура 17 - фотография на двуизмерен електрофоретичен гел на серумна проба, получена на 18.05.1995 от тестов субект от пример 3.
Фигура 18 - фотография на двуизмерен електрофоретичен гел на серумна проба, получена на 24.05.1995 от тестов субект от пример 3.
Фигура 19 - фотография на двуизмерен електрофоретичен гел на серумна проба, по лучена на 31.05.1995 от тестов субект от пример 3.
Техническа същност на изобретението
Изобретението представя протеин, тук означен като Тимусен фактор (“ТФ”), който е полезен за установяване на HIV, който причинява фрагментиране на друг протеин, тук означен като аТФ, който е способен да бъде свързан към ТФ.
Изхожда се от принципа, че HIV причинява фрагментирането на аТФ. Следователно, индивид, не инфектиран от HIV, ще е с интактен аТФ, докато един индивид, инфектиран с HIV, ще има фрагменти от аТФ. Приема се по-нататък, че при един ранен стадий на инфекцията, количеството фрагментиран аТФ е по-ниско, отколкото при по-късен стадий на инфекцията. По същия начин фрагментите са с по-малък размер при по-напредналите стадии на инфекцията. По този начин установяването на аТФ фрагментите показва инфекция с HIV. Количеството и размера на аТФ фрагментите са показателни за стадия на инфекцията. аТФ и фрагментите му могат да се установят по модела им на утаяване с ТФ, особено чрез месторазположението на утайката по отношение на β-, о^- и а2-макроглобулините, т.е. при гел електрофореза, както описаната в пример 2 по-долу.
В двуизмерен електрофоретичен гел се наблюдава, че ТФ взаимодейства със серум от човек, инфектиран с HIV, за да образува непрекъснато шипообразно утаяване с β-, а- и а2макроглобулин в серума. Шипообразната утайка се разрушава или липсва при един или повече от макроглобулините, когато ТФ взаимодейства със серум от инфектиран с HIV човек. Приема се, че ТФ утаява аТФ, открит в β-, сс(- и а2-макроглобулин на здрави хора, който свързва β-, α-, и а2-макроглобулините и по този начин шипообразната утайка е непрекъсната, близо до β-, ος- и а2-макроглобулините. При случаите на инфектирани с HIV хора, аТФ се фрагментира, като по този начин причинява разкъсване на шипообразната утайка или липса на шипообразно утаяване с макроглобулините.
Следователно, ТФ се утаява с аТФ, открит в човешки биологични проби. Примери за биологични проби са телесни течности като:
кръв, серум и плазма. Освен двуизмерната гел електрофореза, описана в пример 2, моделът на утаяване може да се установи чрез голям брой техники, известни на специалистите в областта, включително методи, използвани за установяване на модела на имунопреципитация между антителата и техните антигени, примери за такива техники са описани от Oudin, J., С. R. Acad. Sci., 222:115 (1946); Oudin, J., Methods in Medical Research, V:335-78, Corcoran A. C., ed., Year Book Publishers Inc. (1952); Ouchterlony, 0., Acta. Path. Microbiol. Scand., 25:186 (1948); Ouchterlony, 0., Progress in Allergy V:l78, Kallos P. & Wakeman В. H., Basel and Karger, New York (1958); Ouchterlony, 0., Progress in Allergy VI:30-154, Kallos P. & Wakeman В. H., Basel and Karger, New York (1958); Mancini, G. et al., Prot. Biol. Fluids 11** Colloqu. Bruges, pp. 370-3, Peters, H., ed. (1964); Mancini, G. et al., Immunochemistry, 2:235 (1965).
ТФ може да се използва и за лечение на HIV инфекции, като СПИН и ARC. ТФ може да съществува в метилирано или неметилирано състояние. Терминът “ТФ”, както се използва тук, ако не е модифициран, например като “метилиран ТФ”, покрива и двата, метилирания, както и неметилирания ТФ.
Изобретението представя, също така, и методи за получаване на ТФ, а по-точно от тимусни клетки. Тимусните клетки за предпочитане са от бозайник, не от човек, без значение дали са инфектирани с HIV, въпреки че инфектираните с HIV бозайници, с изключение на хора, имат по-високи титри на ТФ. Примери за бозайници, с изключение на хора са: маймуни, горили, шимпанзета, морски свинчета, крави, зайци, кучета, мишки и плъхове.
И двата вида метилиран и неметилиран ТФ могат да свързват аТФ, като по този начин могат да се използват за диагностициране на HIV инфекция, и по-точно СПИН. Въпреки това, поне в случая на серуми от тест-субекти хора, метилираният ТФ по-малко се засяга от неспецифичното свързване с други протеини, в сравнение с неметилирания ТФ. Следователно се предпочита метилиран ТФ. Неметилираният ТФ може да бъде химически метилиран при използване на известни от състоянието на техниката методи, например, както описаните в пример 1 по-долу. Метилираният ТФ може да се използва като терапевтично средство за HIV инфекция, по-точно при СПИН.
За предпочитане ТФ се пречиства от тимусните клетки на наскоро убито животно, например 4 часа или по-малко след убиването, бозайници като маймуни, горили, шимпанзета, морски свинчета, крави, зайци, кучета, мишки и плъхове. Ядрата на клетките от тимусна жлеза се изолират при използване на методи, известни от състоянието на техниката. Част от техните богати на лизин хистонови фракции се екстрахират при използване на метод за разграждане с пепсин от US № 4 415 553. Други методи на разграждане, като разграждане с трипсин, разграждане с папаин, BrCN разграждане, се явяват като неефективни при екстрахирането на ТФ. Богатият на протеин фрагмент от изолата се пречиства чрез катионообменна хроматография. Протеините в ТФ фракциите (метилиран и неметилиран) могат да се концентрират по всяка една от известен брой техники, добре известни на специалистите в областта, включително утаяване със соли, например с амониев сулфат, или чрез ултрафилтрация. Ако ТФ се концентрира чрез утаяване, за предпочитане след това се ресуспендира в подходящ физиологично балансиран солеви разтвор, съдържащ инхибитор/и на протеази.
Прилагане на ТФ като терапевтично средство срещу HIV инфекции
Установено е, че бозайниците, не хора, като кравите, които са били инфектирани с HIV, но не развиват СПИН, притежават интактен ТФ. Съгласно изобретението ТФ играе роля при предпазване от разпространението на HIV инфекциите, особено на СПИН. Следователно, прилагането на ТФ върху инфектирани с HIV 35 хора би имало терапевтично действие. За предпочитане е ТФ да е от бозайници, но не хора, които не развиват СПИН при инфектиране с HIV. Предпочита се метилиран ТФ не от бозайници. Освен това се предпочита предизвик- 40 ване на имунен отговор в инфектирания човек с лечение. Най-накрая, за предпочитане ТФ се прилага със засилващ действието агент, или ТФ химически се конюгира към имуногенен носител, който би провокирал в пациента отговор на антителата. Примери за имуногенни носители са: keyhole limpet и говежди серумен албумин.
Според един аспект на изобретението ТФ се използва за ваксиниране, за третиране или лечение на HIV инфекции, по-специално СПИН или ARC. ТФ, например, се приготвя за при ложение чрез смесването му, при желаната степен на пречистване, със засилващ действието му агент или физиологично приемливи носители, например носители, които не са токсич5 ни за реципиента в използваните дози и концентрации. Въпреки, че ТФ за предпочитане се прилага с подпомагащ действието му агент, в ситуации, когато изходният инокулат се доставя с ТФ, бусдтери с ТФ може да не изис10 кват засилващи действието агенти.
Инжектирането (мускулно или подкожно) е първият начин за терапевтично приложение на ваксините съгласно изобретението. Въпреки това, интравенозното приложение, 15 приложението чрез катетър, или друг вид хирургическо интубиране, също могат да се използват. Алтернативни пътища за приложение включват таблетки и други подобни, течни форми и инхалации с лиофилизирани или 20 аерозолни рецептори. Течните препарати могат да се използват след получаването им от прахообразни форми.
ТФ може също така да се прилага с помощта на микросфери, липозоми, други мик25 роразделни системи за доставяне или форми за поддържащо освобождаване, поставени в някои тъкани, включително в кръвта.
Дозирането на прилагания ТФ зависи от качествата на използваната лекарствена 30 форма, например неговата способност за свързване и in vivo полуживот в плазмата, концентрацията на ТФ в лекарствената форма, пътя, по който се прилага, мястото и степента на дозиране, клиничната толерантност на пациента, патологичното състояние, засягащо пациента, и други подобни, както и достатъчната опитност на лекуващия лекар. По време на серии от последователни инокулации се използва различно дозиране; лекуващият лекар може да приложи изходно инокулиране, с последващо засилване с относително малки дози ТФ.
Следното представлява пример за ТФ лекарствени форми, дозиране и схема за при45 ложение. На пациента се прилага мускулно или подкожно инжектиране с 8 mg ТФ (за предпочитане 2 ml от лекарствена форма, съдържаща 4 mg/ml ТФ, във физиологично приемлив разтвор) или 57 pg ТФ протеин на ки50 лограм телесно тегло на пациента. Всеки курс за лечение се състои от 16 инжектирания, като две инжектирания в последователни дни на седмицата, в продължение на 8 седмици. Състоянието на болестта на пациента се регистрира чрез средства, описани по-долу в текста. Курсът на лечение се повтаря, ако пациентът още страда от болестта, три месеца след последното инжектиране. Курсът на лечение може да се повтаря, докато не се получат задоволителни резултати, например до постигане на преустановяване или забавяне на развитието на болестта, до едно облекчаване на болестта или излекуване. ТФ се формулира с алуминиев хидрооксид като спомагателен агент. Крайният 1 ml от крайната ТФ лекарствена форма съдържа: 4 mg ТФ, 0,016 М А1РО4 (за 0,5 mg А13+), 0,14 М NaCl, 0,004 М CH3COONa, 0,004 М КС1, pH 6,2.
Алтернативно, инфектираните с HIV пациенти или неинфектирани субекти, могат да бъдат инокулирани пет месеца по-късно, за предпочитане от шест месеца до две години, и даже по-предпочитано осем месеца до една година по-късно, за да се засили “имунната памет” на пациента. Виж Anderson et al., J. Infectious Diseases, 160 (6): 960-969 (1989). Обикновено, рядкото имунизиране c ТФ, отделено във времето на относително дълги интервали, е за предпочитане пред честите имунизации, за извличане на максимален имунен отговор и за постигане на предпазен ефект.
ТФ може да се прилага по най-различни начини и на различни групи реципиенти. ТФ може да се използва и за ваксиниране на индивиди, които са или не са изложени на риск от HIV, и допълнително, ваксините желателно се прилагат на серопозитивни индивиди и на индивиди, които са били изложени на HIV.
ТФ може да се прилага в комбинация с други антигени в единичен инокулационен “коктейл”. ТФ може да се прилага и на инокулационни серии, приложени извънредно. Такива серии могат да включват инокулации със същите или различни препарати на HIV антигени или други ваксини.
Съответствието на избраните параметри на лечението, например схема, избор на подпомагащ агент и други подобни, се определя, като се взимат аликвотни части серум от пациента, и се изследват за титри на антитела и/ или Т клетки, по време на програмата на курса на лечение. Тигърът на Т клетките може да се следи по конвенционални методи. Например Т лимфоцитите могат да се открият чрез образуването на Е-розетки, както е описано от Bach, J. F., Contemporaty Topics in Immunology, Vol. 2: Thymus Dependency, p. 189, Press, New York, 1973; Hoffman, T. & Kunkel, H. G„ and Kaplan, Μ. E., et al., като и двата документа са поместени в In Vitro Methods in Cell Mediated and Tumor Immunity, B. R. Bloom & J. R. David eds., Academic Press, New York (1976). Степента на образуване на Т-клетъчни розетки може да се изследва след третата, но преди десетата седмица от лечението с ТФ. Образуване на розетки над 65% означава добър клетъчномедииран имунен отговор на пациента. Друг индикатор за онагледяване е аТФ, продуциран от пациента, това може да се онагледи чрез метода на двуизмерна електрофореза, описан по-долу.
Като допълнение може да се следи клиничното състояние на пациента за желан ефект, например антиинфекционен ефект. Ако се постигне недостатъчен антиинфекционен ефект, тогава пациентът може да се засили с допълнително третиране с ТФ и параметрите на третирането могат да се променят, например за поефикасен имунен отговор, чрез увеличаване количеството на ТФ и/или на подпомагащия агент, чрез свързване на ТФ в комплекс с носител или конюгирането му към имуногенен протеин, или чрез изменение на начина на приложение.
ТФ може по желание да се прилага заедно с други фармакологични агенти, използвани за лечение на HIV инфекции, като СПИН и ARC. Примери за такива фармакологични агенти са: AZT, антибиотици, имуномодулатори като интерферон, противовъзпалителни агенти и антитуморни агенти.
Диагностични средства за установяване на HIV инфекции
Друг аспект на изобретението представя диагностични устройства, полезни при in vitro откриване на HIV инфекция. Устройството е проектирано така, че да позволява откриване на взаимодействията между ТФ и аТФ в биологични проби. В случаите, когато биологичната проба е кръв, серум или плазма, устройството позволява откриването на модела на утаяване на ТФ в съответствие с β-, α(- и а2-макроглобулините в пробата. Предпочита се устройството да съдържа място за ТФ и място за пробата за тестуване. Тъй като се предпочита двуизмерна гел електрофореза, как то е описана в следващия пример 2 по-долу, устройството за предпочитане се състои от гел с прорези, в които да се поместват съответно ТФ и пробата за тестуване, например проба от серум. Устройството за предпочитане се опакова с комплект от контейнери за реагентите, необходими за извършването на теста, като например буферен разтвор и ТФ. За предпочитане устройството е със самостоятелно електрозахранване, например акумулатор, за да позволи провеждането на двуизмерната електрофореза. Проектира се така, че да може да се свърже към външен източник на напрежение.
Следните примери се предоставят, за да илюстрират изобретението, без да ограничават обхвата му.
Примери за конкретно изпълнение
Пример 1. Изолиране и пречистване на тимусен фактор
Следващите експерименти показват изолирането, пречистването и охарактеризирането на ТФ от телешка тимусна жлеза 4 h след убиването на животното.
Екстрахиране на богата на лизин хистонова фракция от тимусни клетки чрез ензимно разграждане с пепсин.
Всички използвани в този раздел буфери и разтвори се стерилизират чрез филтриране. При необходимост буферите, обозначени с pas, се коригират с 0,2 N Noah или 0,1 N НС1. Всички химикали, включително и дестилираната вода за приготвянето на буферите и разтворите, са със степен USP.
Тимусната тъкан и свързаните с нея съединителни тъкани се отделят от телето 4 h след убиването му. Тъканите се промиват с разтвор, съдържащ 0,14 М NaCl и 0,005 М EDTA-Na при 4°С в продължение на 5 min. Промивният разтвор се отдекантира и тъканите се промиват повторно при същите условия. Тъканта се тегли след отдекантиране на промивния разтвор. Тъканите се хомогенизират в 0,14 М NaCl, 0,005 М КС1. 0,005 MgCl2, 0,003 М СаС12, 0,15 М Tris-HCl, pH 7,6, 0,25 М захароза, в хомогенизатор за тъкани (Brinkman Polytron Homogenizer, Brinkman Instruments, Inc., Westbury, New York), при 4°C, при rpm (оборота в минута) и времетраене, препоръчани от производителя на хомогенизатора, за отделяне на клетъчните ядра. Съотношението между тъкан и буфер е 1:4 (тегло/тегло).
След това тъканният хомогенат се филтрира с вакуум през фино филтрираща метална мрежа. Филтратът се центрофугира на 1000 х g при 4°С, в продължение на 90 min. Супер5 натантата се отстранява. Получената пелета (плътна утайка) се ресуспендира в 0,008 NaCl, 0,003 М СаС12, 0,08 М NaH2PO4, 0,002 М TrisHCl, 0,25 М захароза, pH 5,2. Съотношението между пелетата и буфера е 1:4 (тегло/тег10 ло). Ресуспендираната утайка се хомогенизира в бехерова чаша с магнитна бъркалка при 200 rpm на 4®С в продължение на 5 min. След това хомогенатът се центрофугира при 3500 g при 4°С в продължение на 60 min. Суперна15 тантата се отстранява. Получената пелета се ресуспендира в 0,14 М NaCl, 0,001 М СаС12, 0,002 MgCl2, 0,001 М EDTA-Na3, 0,002 М TrisHCl, 0,25 М захароза, pH 4,2, при съотношение между пелетата и буфера от 1:4 (тегло/ 20 тегло). Ресуспендираната утайка се хомогенизира в бехерова чаша с магнитна бъркалка при 200 rpm на 4°С в продължение на 5 min. След това хомогенатът се центрофугира при 8000 g, при 4°С, в продължение на 60 min. 25 Супернатантата се отстранява. Получената пелета се ресуспендира в съотношение 1:4 (тегло/тегло) с предварително приготвен буфер, съдържащ: 1 част (обем/обем) разтвор 1, 2 части разтвор 2 и 17 части буфер 4. Разтвор 1 30 се състои от: 10% натриев додецилсулфат във вода/етанол (при съотношение 55/45 об/об). Разтвор 2 се състои от: 10% Tween 80 (в дестилирана вода). Буфер 4 се състои от: 0,11 М NaH2PO4 и 0,19 М Na2HPO4, pH 7,4.
Ресуспендираната утайка се хомогенизира в бехерова чаша с магнитна бъркалка при 200 rpm, на 4°С, в продължение на 5 min. След това хомогенатът се центрофугира при 12000 g, при 4°С в продължение на 60 min.
Супернатантата се отстранява. Получената пелета се тегли и ресуспендира в 0,05 М Na3C6H5O7, 0,05 М CH3COONa, 0,1 N НС1, pH 2,8, при съотношение между пелета и буфер 1:4 (тегло/тегло). Ресуспендираната утайка се хомогенизира на хомогенизатор за тъкани на 1000 rpm при 4°С в продължение на 1 min.
Пепсин (каталожен номер Р 7000, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri), разтворен в дестилирана вода в отношение 1:10 000, с активност 800-2500 единици/mg протеин се добавя към хомогената при съотношение 100:1,8 на пепсин (прах) към тегло на пеле тата след хомогенизиране. Сместа се поставя в бехерова чаша и се разбърква в азотна атмосфера с магнитна бъркалка с 45 грш при 4°С в продължение на 12 h. Получената смес се центрофугира след това на 12 000 g при 4°С в продължение на 60 min. Пелетата се отстранява. Супернатантата се премества и се утаява с разтвор, състоящ се от наситен (NH4)2SO4. Една част от супернатантата се смесва с една част от разтвора и се разбърква с магнитна бъркалка на 600 грш в продължение на 6 h, при 4°С. Получената смес се центрофугира след това на 12 000 g при 4°С в продължение на 60 min. Супернатантата се отстранява. Пелетата се разтваря в разтвор, съдържащ минимално количество 0,1 М NaCl, 0,1 М CHjCOONa, 0,02 М тиодигликол. Полученият разтвор се диализира срещу 0,01 М NaCl, 0,01 М CH3COONa, pH 6,4, докато не се отстрани амониевият сулфат от диализата.
Протеинът при диализата се измерва по метода на Lowry. Разтворът се разрежда до получаване на 2 mg/ml протеин. Тогава pH на разтвора се коригира до 7,2, с 0,1 N NaOH. Отделно се приготвя разтвор на 0,2 М бромоцетна киселина чрез разреждане на бромоцетна киселина в 10 ml или по-малко вода и pH се коригира на 7,0 с 0,1 N NaOH. Полученият разтвор на бромоцетна киселина се добавя към протеиновия разтвор и сместа се разбърква с магнитна бъркалка в продължение на 48 h в азотна атмосфера. По време на реакцията pH на сместа се поддържа на 7,2. Накрая на реакцията се повтаря етапа на утаяване с амониев ацетат до етапа на измерване на концентрация на протеина по метода на Lowry. Крайният разтвор се разрежда или концентрира според нуждите до получаване на 4 mg/ml протеин ТФ от 200 g клети от телешки тимус.
Карбоксиметил колонна хроматография ml от разтвора на ТФ, съдържащ 4 mg протеин, се пропуска на 0,9 х 14 cm карбоксиметилна колона, уравновесена с 0,05 М натриев ацетат. Колоната се промива и елуира чрез прилагане на линеен градиент на натриев хлорид в 0,05 М натриев ацетат, pH 6,8. За да се постигне градиента, се използва сифон за свързване на два съда с еднакъв размер и форма. Единият съд съдържа 50 ml 0,05 натриев ацетат, pH 6,8, а другият съдържа 50 ml 0,05 натриев ацетат с 0,5 М натриев хлорид, pH 6,8. Единствено съдът, съдържащ 0,5 М натри ев хлорид, се свързва към колоната. Градиентът е от 0 до 0,5 М натриев хлорид. Двата съда трябва силно да се разбъркват, което да осигури добро смесване. Събират се фракции по 1 ml всяка. Елуатьт се изследва чрез поточен спектрометър, четящ на 280 nm абсорбция. Фракция 45 от елуата се определя като съдържаща протеин (виж фиг. 1). ТФ фракцията се центрофугира при 10 000 rpm и двете ивици утайка се изследват. Фракция 45 се събира и концентрира чрез утаяване с амониев ацетат.
Получените концентрирани фракции се анализират по-нататък както следва.
i) Определяне на молекулно тегло
Молекулното тегло на събраната ТФ фракция се определя чрез оцветяване със сребро на 11% нередуциращ SDS-Page (натриев додецилсулфат - полиакриламидна гелелектрофореза), при използване на метода на Laemmli (Laemmli, U.K., Nature, 227:680 (1970)) и според препоръките в Sigma Technical Bulletin MWS-877L (Sigma Chemical Company, Louis, Missouri). Използва се бързо оцветяване със сребро (RSK-1, Sigma Chemical Company) за багрене на протеините. Използва се стандарт за ниско молекулно тегло (М 5630, Sigma Chemical Company), който съдържа смес от 5 протеина (концентрация на общия протеин 1 ng/ml): говежди серумен албумин (66,000 молекулно тегло, МТ); фумароза от свинско сърце (48,500 МТ); карбонова анхидраза от говежди еритроцити (29,000 МТ); β-лактоглобулин от крава (18,400 МТ); и а-лактоалбумин от крава (14,200 МТ).
На гела се наблюдават две ивици. Пошироката ивица е неметилиран ТФ, който представлява 98% от ТФ фракцията. По-тясната ивица е метилиран ТФ, който съставя останалите 2% от ТФ фракцията.
На основата на кривата на калибрирането на протеина се определя, че неметилираният ТФ е с молекулно тегло от около 35 kD, а метилираният ТФ е с молекулно тегло от около 28 kD.
ТФ съставът, включващ метилирания и неметилирания ТФ, е с pH от около 7,64 и 8,6, чрез pH титруване. Изоелектричната точка на ТФ състава е от около 5,6±0,1, както е определено чрез имуноелектрично фокусиране.
Метилиране на протеина, открит в ТФ фракцията
ТФ се метилира, за да образува метили ран ТФ препарат за използване в следващите примери. Метилирането се осъществява както следва.
ТФ се смесва с СН2ВгСООН в достатъчно количество за получаване на краен разтвор от 0,2 М СН2ВгСООН. Например 2,78 g СН2ВгСООН се разтварят в 10 ml дестилирана вода и се прибавя в 100 ml ТФ, съдържащ 700 mg ТФ (7 mg/ml). pH на сместа се довежда и поддържа на 7,24 с 0,1 М NaOH. Сместа се оставя да се инкубира от 6 до 8 h. ТФ протеинът в получената водна фракция се концентрира чрез утаяване с амониев сулфат при използване на техники, известни от състоянието на техниката. Към 10 ml метилирана ТФ фракция се добавя равен обем наситен амониев сулфат. Сместа се пази в хладилник в продължение на 12 h, след което се центрофугира в продължение на 60 min при 20 000 rpm. Плътната утайка (пелета) се отделя и се разтваря в краен буфер, съдържащ 0,1 М NaCl, 0,1 М натриев цитрат, 0,02 М тиодигликол. След това сместа се диализира в продължение на 24 h срещу същия буфер за отделяне на амониевия сулфат.
Пример 2. Диагностициране на HIV инфекции
Полученият в пример 1 метилиран ТФ се използва за определяне, дали дадена проба от човешки серум е от пациент, инфектиран с HIV. Експериментите протичат както следва.
Пробите от човешки серум в този пример са доставени от AIDS Health Foundation, Los Angeles, California. Фондацията е тествала пробите при използване на намиращ се в търговската мрежа ензим свързан имуносорбентен анализ (ELISA) и Western блот, чрез което се откриват у пациента антителата срещу HIV. Първо се провежда ELISA. Ако чрез ELISA се открие HIV инфекция (HIV позитивен), Western блот се провежда като тест за потвърждение.
При използване на настоящото изобретение, горните проби се тестват чрез двуизмерна електрофореза. Използваното устройство е имерсионна мини гелелектрофорезна единица (каталожен номер Е 0638, Sigma Chemical Company). Единицата съдържа буферна камера с капацитет 800 ml буфер. Единицата е снабдена и с перисталтична помпа за рециклиране на буфера. Захранването е с напрежение на изхода от 20 до 240 V, от 0 до 100 mA, с постоянен ток и изходно напрежение.
Гелът се приготвя с 1 % агароза (каталожен номер А 4679, Sigma Chemical Company). Буферът за гела се състои от: 0,0257 М Tris-HCl, 0,009 М натриев борат 5 декахидрат, 0,0067 глицин, 0,0034 М натриев ацетат трихидрат, 0,015 М 2-меркаптоетанол и 0,015 М тиодигликол, pH 7,64. 14,25 ml от 1 %-ния втечнен агарозен гел се прилагат към електрофоретичната пластина. Втвърденият гел 10 е с дебелина 0,2 cm и с размер 7,5 cm х 7,5 cm. Гелът се залива със същия буфер. В гела се пробива ямка с радиус 0,9 mm с игла от спринцовка (с отвор 0,9 mm диаметър), което представлява 0,5 μΐ от серумната проба. По време на пропус15 кането на пробата по първото измерение за разделяне на серумните протеини, използваното напрежение е 9 V/cm, токът е 27 mA/cm2 и електричеството се прилага в продължение на 90 min при 14°С. Фигура 2 схематично представя раз20 положението при първото измерение на гела, с 1 се бележи ямката за серумната проба. При пускането на електрофорезата по второто измерение, плаката с гела се завърта на 90° и от гела се отделя цилиндър 0,9 х 45 mm от стра25 ната на новия катод, между позицията на новия катод и ямката за серума и перпендикулярно на линията катод-анод. Фигура 3 схематично представя разположението при второто измерение на гела, с 2 се бележи ямката за серумната проба. Ямката се пълни със 100 μΙ от метилирания ТФ от пример 1. Същото напрежение и ток се прилагат за 50 min на гела при 14°С. По време на двуизмерната електрофореза, буферът рециркулира със скорост 25 ml/min. След последното преминаване се изключва захранването и гелът се изважда след няколко секунди. След това гелът едновременно се фиксира и оцветява в продължение на 45 min в разтвор, съдържащ: 3 части метанол, 1 част етанол, 12% оцетна киселина и 1 % бромфенол блу (каталожен номер В-8026, Sigma Chemical Company). Багрилото от гела се премахва чрез накисването му в дестилирана вода в продължение на 3 до 4 h и гелът се суши.
За определяне на молекулното тегло се провежда отделно контролна двуизмерна електрофореза при същите условия, но при използване на маркери за оцветяване със сребро на ниско молекулно тегло, вместо за серум и ТФ, както е описано в пример 1.
Позицията на серумните протеини на гела от двуизмерната електрофореза е показана на фигура 4. На фигура 4 обагреният имуноглобулин 3 се появява до ямката със серума 1, съдържаща пробата от серума на пациента, както и Р^макроглобулина 4, по-далече от ямката за серума са а2-макроглобулина 5, о^макроглобулина 6 и албумин 7.
Утаяването на ТФ с аТФ в серумите се определя чрез появяване на фина непрозрачна лента (шиповидно утаяване). Моделът на това шиповидно утаяване показва дали субектът е с HIV инфекция.
Непрекъснато шиповидно утаяване, 8, продължаващо успоредно на β и ος-макроглобулините, до аг-макроглобулините, както е показано на фигура 4, показва, че изследваният субект не е инфектиран с HIV;
непрекъснато (т.е. прекъснато) шиповидно утаяване успоредно на β и а( и аг-макроглобулините, и/или шипове, които не са успоредни малко или съвсем на макроглобулините, показва HIV инфекция.
По-нататък, ако прогресира HIV инфекцията (като например СПИН) на субекта, утайките са по-малко и по този начин шиповидната утайка се изтощава.
Горните наблюдение подсказват, че аТФ, открит в серуми от здрави индивиди, се фрагментира по време на HIV инфекцията, като резултатът е прекъсване на шиповидната утайка между ТФ и фрагментирания аТФ. Фрагментите са от по-ниско молекулно тегло, отколкото целия аТФ, поради което те мигрират в електрическото поле. По този начин шиповидната утайка е далеч от ТФ ямката. Без да искаме да се обвързваме с тази хипотеза, изглежда хипотетично възможно аТФ да се фрегментира на повече части, когато СПИН, свързаните с HIV заболявания или HIV инфекцията е в по-напреднал стадий, като при това положение шиповидната утайка ще е с попрекъснат вид и на по-голямо разстояние от вдлъбнатината, съдържаща ТФ. По този начин моделът на утаяване е показателен, също така, за етапа на развитие на болестта.
Теловете, показани на фигурите, се интерпретират, както следва.
Фиг.5 показва прекъсната шипообразна утайка 9, която означава, че субектът е HIV позитивен. Серумът от този субект се взима и се изследва за HIV позитивност чрез ELISA и теста съгласно настоящото изобретение. Когато е взет серумът, субектът не е показвал никакви клинични симптоми на СПИН.
Фиг. от 6 до 9 показват позиция 10, където е локализиран β-макроглобулин и към която би била прилежаща шипообразната утайка на здрав пациент, и шипообразното утаяване би било непрекъснато утаяване, разпростиращо се успоредно на месторазположението на β-, α-, и а2-макроглобулините (както във фигура 4). В противоположност, на фигури от 6 до 9, шипообразното утаяване 11 на пациента е прекъснато (т.е. не е непрекъснато по продължение на разположението на β-, α-, и а2-8макроглобулините) и под позиция 10. Позициите на шипообразните утайки на тествания субект показват, че те са с по-ниско молекулно тегло от шипообразните утайки на здрав субект. Разкъсаните фрагменти и шипообразните утайки и тяхното по-ниско молекулно тегло сочат, че тестваните субекти са HIV-позитивни. От три до шест месеца преди настоящите тестове, тези субекти са тествани за HIV-позитивни. От три до шест месеца преди настоящите тестове тези субекти, тествани за HIVпозитивност чрез ELISA. Настоящият тест използва серуми, взети по същото време, като тези за ELISA теста. По време на настоящите тестове субектите показваха клинични симптоми на СПИН. Тежестта на заболяването е от порядъка на това на субекта на фиг.6 (найтежкият случай на СПИН), фиг.7, фиг.8 и фиг.9 (най-лекият случай на СПИН). Клинично наблюдаваната тежест на заболяването съответства на модела на утаяване на показаните фигури. Първо, теловете с шипообразни утайки, по-надалеч по разстояние от разположението на шипообразната утайка, очаквана от един здрав субект, говорят за по-малки фрагменти аТФ и, следователно, по-тежък случай на СПИН, отколкото теловете с шипообразни утайки, които са по-близо до очакваното местонахождение на шипообразната утайка на здрав пациент. Това разстояние може да се определи на основата на относителното разстояние на първата шипообразна утайка, т.е. най-близката по вертикално разстояние шипообразна утайка до ямката със серума 1, от очакваната шипообразна утайка, която би била при здрав субект. Колкото е по-голямо относителното разстояние по двете, по хоризонталната и вертикалната посока от местонахождението на шипообразната утайка на здрав субект, толкова е по-тежко заболяването. Вто11 ро, ако горните фактори не могат да бъдат различени между теловете на субектите със СПИН, заболяването е по-малко тежко за субекта, който има тел, показващ шипообразни утайки, които са по-интензивни и по-малко на брой. По-малкият брой шипообразни утайки, и по-тежкото утаяване сочат аТФ, който е помалко фрагментиран и в по-висока степен, и следователно, по-лек случай на СПИН.
Пример за приложението на първия анализ се прилага за анализиране на фигури от 6 до 10. C цел да се вкара в норма анализирането на тези фигури, се избира фиксирана точка за всички фигури, в случая вдлъбнатина за серум 1, като базова линия. Първата шипообразна утайка е най-близката във вертикално разстояние 15 от базовата линия 14 (виж фиг. 12). Тъй като шипообразната утайка от здрав субект се разпростира от прилежащия към локализациите на β- и а! макроглобулини (както е на фиг. 4), то тогава е възможно да се измери относително разстояние от β-, а- или а2_макрогробулините. В този случай се избира β-макроглобулина 10. Двете, вертикалното разстояние 17, както и хоризонталното разстояние 16 на шипообазната утайка от локализацията на β-макроглобулина 10 (виж фиг. 12), се измерват и се сравняват за тези серии от фигури. Субекти, чиито серуми продуцират гелове с поголямо вертикалното разстояние 17 и/или хоризонталното разстояние 16 на шипообразната утайка от локализацията на β-макроглобулин 10, страдат от тежък случай на заболяването, в сравнение с тези с по-малко разстояние. Сравнението показва следното. На фиг.6 е най-тежкият случай на СПИН, на фиг.7, фиг.8 и фиг.9 е най-лекият случай на СПИН. Това е пример за приложението на първият анализ. За специалиста в областта е лесно, че базовата линия може да е друга позиция, която се стандартизира за всички фотографии на гелове, и относителните разстояния могат да се измерят от друга точка, локализирана в серумната намазка, дотолкова, доколкото тези точки се използват за измерване на относителното разстояние. Могат да се използват и други варианти, които не се отклоняват от общия замисъл на първия анализ.
Фиг. 10 е от значение поради това, че по времето, когато е взет серум за тази проба, субектът е бил с отрицателен ELISA HIV-тест. Въпреки това тестът съгласно настоящото изоб10 ретение сочи, че субектът е HIV-позитивен, както е показано от прекъснатата шипообразна утайка 11. Два месеца след като е взет серума за теста, субектът показва HIV-позитивен резултат на ELISA. По този начин фигурата потвърждава, че тестът съгласно изобретението е способен на по-ранно откриване на HIV инфекция, отколкото конвенционалния ELISA.
Фиг. 11 е от значение поради това, че серумната проба е взета, след като на субект с клинично диагностициран СПИН е прелята кръв от здрав донор. Шипообразната утайка, получена от серума на донора, е посочена със стрелка 12 с локализация при най-високото молекулно тегло, което се стреми да покаже, че първоначалният малък обем на фрагментиране на целия aTF от здравия донор, и по този начин локализацията на шипообразната утайка е по-близо до молекулното тегло, очаквано за здрав субект и по-показателно за един по-ранен стадий на инфекция, както се показва от относително сходните локализации на тези шипообразна утайка спрямо шипообразната утайка на фиг. 10. Шипообразната утайка, получена от серума на субекта със СПИН, се обозначава със стрелка 13, с локализация при ниските молекулни тегла, което означава фрагментиран и, следователно, помалък аТФ от пациента и HIV-инфекция.
Показаната тук двуизмерна електрофореза може да бъде мас-продуцирана като in vitro тестване на проби от биологични течности за установяване на присъствието на HIV инфекция в тестваните субекти. Теловете могат да се изсушат за по-лесно пакетиране и транспортиране. Пакетираният гел може да съдържа предварително оформени ямки за пробите и процеп на ТФ. ТФ може да се съхранява в контейнер и да се продава отделно или заедно с гела като комплект. Допълнително комплектът може да съдържа контейнери за електрофоретичния буфер, багрилата и/или стандарти за молекулно тегло. Комплектът може да съдържа освен това контейнери със серумна (и) проба (и) от здрав (и) субект (и) като контрола.
Освен посочените изследвания, в настоящото изобретение са включени варианти на описаното изследване и всяко изследване, което спомага за определянето на модела на утаяване на проби от телесни течности от субект, с аТФ, за предпочитане във връзка с β-, а- и а2 мароглобулина. В настоящото изобретение се включват, също така, и комплекти, съдържащи реагенти и материали за тези изследвания.
Пример 3. Този пример описва изследване, в което пациент със СПИН, използва се също като “тестов субект” в този пример 3, се лекува терапевтично с ТФ състав съгласно изобретението. По време на изследването върху пациента не се прилага никакво друго лечение или лекарства.
Пациентът е 27-годишен бял мъж хомосексуалист, тежащ 138 паунда в началото на изследването. Осемнайсет месеца по-рано, серумът на пациента е тестван и определен като положителен за HIV антитела. Пациентът е диагностициран, също така, като HIV положителен въз основа на клиничните му симптоми, брой на р24 антиген, CD4+ и CD8+ при преброяването на клетките като абсолютни стойности (клетки/μΐ) и процент на лимфоцитните подгрупи, както е показано на таблица 1 по-долу, за тестовете, проведени върху кръвната проба от пациента, взета на 12 април 1995 г., две седмици преди да се подложи на лечението с ТФ. Пациентът не е страдал от 5 СПИН преди това и по време на лечението с ТФ.
Лечението започва на 27 април 1995 г. Пациентът получава 14 mg ТФ на седмица, разделени на две мускулни инжекции, една ин10 жекция във вторник и другата в сряда. Всяка инжекция съдържа 7 mg ТФ (2 ml препарат, съдържащ 3,5 mg/ml ТФ). ТФ се пречиства, както е описано в пример I по-горе, и стерилният ТФ препарат съдържа: 3,5 mg/ml метили15 ран ТФ, 8,1 mg/ml натриев хлорид, 1,9 mg/ml натриев ацетат, 2,6 mg/ml натриев трифосфат, 2,1 mg/ml алуминиев хлорид, pH 6,2.
Таблица 1 представлява резултатите от експериментите. Посочените са датите, на които са взети кръвните проби от пациента. Тестовете се осъществяват чрез Unilab Corporation (Tarzana, California), при използване на общоприети клинични изпитания.
Таблица 1
| Име на теста | Дата на работа | |||||
| 12-Апр-95 | 27-Апр-95 | 04-Май-95 | 11-Май-95 | 18-Май-95 | 24-Май-95 | |
| RBC | 4.94 | 4.62 | 4.77 | 4.85 | 4.79 | 4.66 |
| ХЕМОГЛОБИН | 15.3 | 16.6 | 14.6 | 15.5 | 14.8 | 14.7 |
| бр. тромбоцити | 233 | 221 | 236 | 206 | 186 | 208 |
| WBC | 4.3 | 4.5 | 6.2 | 6 | 5.7 | 5.5 |
| POLYS | 53 | 61 | 58 | 52 | 64 | 57 |
| ЛИНфОЦИТИ | 32 | 27 | 33 | 24 | 26 | 27 |
| МОНОЦИТИ | 12 | 10 | 7 | 12 | 8 | 10 |
| ЕОЗИНОфИЛИ | 2 | 1 | 1 | 11 | 2 | 4 |
| БАЗОфИЛИ | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 2 |
| CD4% | 33 | 32 | 25 | 31 | 31 | 33 |
| CD4 ABS | 468 | 397 | 531 | 446 | 459 | 498 |
| CD8% | 52 | 56 | 52 | 56 | ||
| CD8ABS | 1108 | 806 | 979 | 848 | ||
| отношение H/S | 04.7 | 0.6 | 0.6 | 0.6 | ||
| общ белтък | 7.7 | 7.4 | 7.6 | 8 | 7.3 | 7.2 |
| ALB. | 4.8 ;62% | 3.8; 51.3% | 3.9; 51.3% | 4.3; 53.7% | 3.9; 53,3% | 3.6 |
| ALPHA-1 | 0.1; 1.35% | 0.2; 2.63% | 0.2; 1.9% | 0.1; 1.7% | 0.1 | |
| ALPHA-2 | 0.7; 9.45% | 0.7; 9.21% | 0.8; 10.1% | 0.5; 7.3% | 0.7 | |
| ВЕТА | 2.9; 38% | 0.9; 12.5% | 0.9; 11.84% | 0.8; 10.0% | 0.8; 11.4% | 0.9 |
| GAMMA | 1.9; 25.66% | 1.9; 25.00% | 1.9; 24.3% | 1.9; 26.3% | 1.9 | |
| Р/24 | положителен | положителен | неизвестен | отицателен | отрицателен | отрицателен |
Тестовете са както следва:
“RBC” и “WBC” разкриват броя на червените и белите кръвни клетки, съответно (х 103/mm3).
“Хемоглобин” и “Брой на тромбоцити те” означават преброяването на хемоглобина (в g/dl) и преброяването на тромбоцитите (х 103/mm3), съответно.
“Поли” означава брой на неутрофилните клетки, изразени като процент от броя на белите кръвни клетки.
Броят на “лимфоцити”, “Моноцити”, “Еозинофили”, и “Базофили” се изразява за всеки като проценти от броя на белите кръвни клетки. Пълното преброяване на кръвните клетки се определя при използване на хематологичен анализатор.
“CD4%” и “CD8” означават процента на лимфоцитните подгрупи на CD4+ и CD8+ клетките, съответно. “CD4 ABS” и “CD8 ABS” означават абсолютните стойности на броя клетки (в клетки/μΐ) на CD4+ и CD8+ клетките, съответно. Броят на CD4+ и CD8+ клетките се определя чрез поточна цитометрия.
“Отношение Η/S” означава отношението на Хелперните към Супресорните клетки и се получава чрез разделяне на броя на “CD4 ABS” на броя на “CD8 ABS”.
“Общ белтък” означава общия серумен протеин в кръвта в g/dl в пробата от пациента, като се определя по колориметричен метод при използване на Olympus AU 5000 съоръжение (Olympus Co., Ltd., Tokyo, Japan).
“ALB”, означава албумин; “Алфа-1” означава алфа-1 глобулин; “Алфа-2” означава алфа-2 глобулин; “Бета” означава бета-глобулин; “Гама” означава гама-глобулин. Тези серумни протеини се определят чрез електрофореза на серумния протеин. За всяка колона специфичен серумен протеин, числото отляво е в g/dl, а числото отдясно дава процентното разпределение на специфичния серумен глобулин, измежду всички серумни глобулини.
“Р/24” означава р24 вирусен антиген на сърцевината, който се определя чрез комплект на EIA тест за р24 антиген (Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois).
След това кръвните проби, взети в посоченото в таблица 1 време, също се определят като положителни за HIV-1 антитела, при определяне чрез комплект за тест на HIV чрез ELISA на Organon Technica (Raleigh, North Carolina). Пациентът наддава на тегло 7 паунда от първата инжекция с ТФ до 24-ти май
1995.
Посочените тестове показват тенденция към покачване на броя на CD+ клетките и намаляване на броя на CD8+ клетките, след започването на лечението с ТФ. Тестовете за р24 антигена допълнително показват отрицателни резултати след началото на лечението с ТФ, като тестуваният субект е показвал положи телни резултати преди и в началото на лечението с ТФ.Изследването за HIV-антитела остава положително, тъй като остатъчните антитела остават в тестваният субект. Резултатите от този тест предразполагат към предположението, че лечението с ТФ е ефективно при борбата с HIV-инфекцията и напредването на заболяването, причинено от HIV.
В допълнение към посочените тестове, проведени от Unilab Corporation, заявителят провежда тестове за диагностика на HIV, двуизмерна електрофореза, описана в пример 2 по-горе, върху серумните проби, взети във време, посочено на таблица 1.
Фиг. 13 и 14 представляват фотографии на двуизмерни електрофоретични гелове на серумни проби от две контроли: човешки субект, чиято серумна проба дава отрицателен тест за HIV антитела при изследване на ELISA от Organon Technica, и човешки субект, чиято серумна проба дава положителен тест при същото изследване на ELISA. Може да се види, че при фиг. 13 шипообразната утайка 9 е непрекъсната, разпростираща се по продължение на локализациите на β-, а-,, и а-2 макроглобулините, които сочат здрав HIV-отрицателен субект. В противоположност, шипообразната утайка 9 на фиг. 14 е прекъсната, което означава HIV-инфекция при субекта.
Фигури от 15 до 19 представят получените фотографии на тестовете с двуизмерни електрофоретични гелове на тествания субект със серумна проба, взета на 11-ти, 18-ти, 24ти и 31-ви 1995 година, съответно.
Както е показано на фиг. 15, след една седмица на прилагане на посоченото лечение с ТФ, на 4-ти май 1995 г., серумната проба на тествания субект е отрицателна за HIV инфекция, както се вижда от непрекъснатата шипообразна утайка 9, разпростираща се по продължение на локализациите на β-, α-, и α-2 макроглобулините.
Както се вижда от фигура 16, през втората седмица на лечение, на 11-ти май 1995 г., серумната проба на тествания субект образува непрекъсната шипообразна утайка 9, разпростираща се по продължение на локализациите на β-, а-1 и а-2 макроглобулините, която шипообразна утайка е по-непрекъсната от тази, наблюдавана за контролния HIV-позитивен пациент на фиг. 14.
Както е показано на фигури 17 и 18, през третата и четвъртата седмица на лечение, на 18-ти и 24-ти май 1995 г., серумната проба на тествания субект образува по-малко непрекъсната шипообразна утайка 9. Въпреки това, през петата седмица, на 31-ви май 1995 г., отново се наблюдава непрекъсната шипообразна утайка 9, разпростираща се по продължение на локализациите на β-, α-l и α-2 макроглобулините, както е показано на фиг. 19, което означава HIV-отрицателен статус. Двуизмерните електрофоретични тестове подсказват предположението, че лечението с ТФ съгласно настоящото изобретение е ефективно срещу HIV-инфекция и/или развитието на болестта.
Пример 4. Този пример представя допълнителни данни, касаещи шест пациента, които са били терапевтично третирани с ТФ състава съгласно настоящото изобретение. Тези пациенти не са получавали никакво друго лечение или лекарства по време и след шестседмичния период на лечение. Таблиците по-долу също показват данни за пациентите след девет месеца (за пациенти от No 1 до 5), и след два месеца (за пациент No6), след края на периода на лечение.
В продължение на шест последователни седмици пациентът получава 14 mg ТФ на седмица, в две мускулни (IM) инжекции, една инжекция във вторник и една инжекция в сряда, на седмица. Всяка инжекция съдържа 7 mg ТФ (в 2 ml препарат, съдържащ 3,5 mg/ml ТФ). ТФ се пречиства, както е описано в пример 1 по-горе, и стерилизираният ТФ препарат съдържа: 3,5 mg/ml метилиран ТФ, 8,1 mg/ml натриев хлорид, 1,9 mg/ml натриев ацетат, 2,6 mg/ml натриев трифосфат, 2,1 mg/ml алуминиев хлорид, pH 6,2.
Таблиците от 2 до 7 представят резултатите от изследването на всеки пациент. Тестовете се осъществяват в лаборатории при използване на общоприети в практиката клинични изследвания.В таблиците “HIV-ab, ELISA” означава HIV-1 антитяло, както е определено чрез ELISA. С “CD4 ads”, и CD8 abs”. се означават абсолютните стойности (в клетки на μΐ) на броя CD4 и CD8 клетки, съответно. “р24 Ag” означава р24 вирусен антиген на вътрешността, който се определя чрез разграждането на имунния комплекс (ICD) на р24 антигена EIA; тогава EIA за HIV-1 антиген установява р24 протеин на вътрешността след разграждането на имунните комплекси. “HIV-1 РНК PCR” означава количествено определяне на броя на копията на HIV-1 рибонуклеиновата киселина (РНК) на милилитър от тестваната плазма, чрез амплифициране с полимеразната верижна реакция (PCR). Нарастването или намаляването на броя установени копия на вирусна РНК се свързват съответно с нарастването или намаляването на плазмената виремия. “HIV-1 плазмена култура” дава титрите на HIV-1, откриват в плазмата и в моноядрена клетъчна култура на периферната кръв. “Количество HIV-1 плазма” означава заразителността на HIV-1 вируса, изразена като инфекциозни единици на ml (IU/ml). “Поли клетки” означава брой на белите кръвни клетки в абсолютна стойност (клетки/ μΐ). α-l макроглобулин (означен като “алфа-1 Макро”), а-2 макроглобулин (означен като “алфа-2 Макро”), и гама-имуноглобулин (“IgG”) се определят чрез електрофореза на серумния протеин. Означеното с числото (с %) е процентното разпределение на специфичния серумен глобулин измежду всички серумни глобулини. В таблица 7 “IgA” и “gM” означават имуноглобулини А и М, съответно. В таблица 7, IgG, IgA и IgM са изразени в mg/dl серум. “HLA-DR” означава продукт на Главния човешки комплекс на Хистосъвместимост, локализиран в хромозома 6.
Други дефиниции, използвани в таблиците от 2 до 7 са:
inc. нормално ниво за здрав човек; pos. положителен;
+ положителен, увеличаването на положителното ниво се означава с “+”; neg. отрицателен;
не е тестуван; nt не е тестуван;
х множественост на нормалното ниво за здрав човек, например, “2х” означава два пъти нормално ниво
Следващото описание дава в детайли състоянието на всеки пациент.
Пациент No 1
Следващата таблица 2 обобщава резултатите от клиничните тестове, проведени върху пациент No 1.
В началото на лечението пациент No 1. (21-годишна жена) е със СПИН с церебрално увреждане и умствени нарушения, броят на CD4 е 36, и очакването за продължителност на живот е от шест до дванадесет месеца. Нейният брой на CD4 се увеличава от 36 (в началото на лечението) до 108 (девет месеца след края на периода на лечение). Като се започне от четвъртата седмица на лечение, р24 антигенът на вътрешността е отрицателен, т.е. помалко от 5 pg/ml. Това отрицателно отчитане на р24 антигенана на вътрешността означава липса на вирусна активност, както и по време на четирите седмици на лечение. Плазмената HIV-1 култура дава отрицателен тест както и по време на четирите месеца на лечението. Отрицателното отчитане на плазмената HIV-1 култура означава, че Т-клетките на тази пациентка, изолирани от плазма, не са инфекциозни, когато се смесят с Т-клетки от неинфектирана контролна кръв при in vitro изследване, т.е. отрицателна плазмена култура. Обратното, продуцира се положителна плазмена култура, 5 когато Т-клетките от контролна инфектирана с HIV-1 кръв се смесват с неинфектирана контролна кръв при in vitro изследването. Повишаването на IgG, α-l и α-2 макроглобулиновата активност се наблюдават по време и след 10 лечението с ТФ. Девет месеца след лечението с ТФ, пациентът вече не страда от СПИН (например без опортюнистични инфекции), въпреки, че е все още HIV позитивен за антитела срещу HIV при (ELISA).
ТАБЛИЦА2
Пациент Nol КЛИНИЧНИ И ЛАБОРАТОРНИ ТЕЗУЛТАТИ ОТ ТЕСТОВЕ НА ЧОВЕК
Извършен тест Преди лечение резултати по време на лечението Резултати след лечението без по 2 мускулни инжекции на седмица друго лечение - месеци
| 2 | 4 | 6 | 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 9 | ||
| HIV-Ab,ELISA | + | ++ | ++ + | +++ | - | - | +++ + | + + + + | +++ + | ||
| CD4 abs | 36 | 23 | 34 | 49 | - | - | 53 | 61 | 108 | ||
| CD8 abs. | 672 | 237 | 775 | 537 | - | - | 1209 | 1162 | 983 | ||
| p24Ag | пол. | пол. | отр. | отр. | - | - | отр. | отр. | отр. | ||
| HIV-IJHKJ’CR | 88200 | - | - | 17300 | - | - | 11900 | - | 6500 | ||
| копия на ml. | |||||||||||
| HIV-1, плазме- | пол. | - | - | отр. | - | - | отр. | - | отр. | ||
| на култура | |||||||||||
| HIV-1, култу- | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||
| pa Количество | |||||||||||
| POLY клетки | 2.23 | 2.8 | 4.16 | 5.7 | - | - | 6.6 | 6.4 | 6.9 | ||
| х103х | |||||||||||
| Алфа-1 Макро | 1.35% | 1.24% | 2.66% | 2.70% | - | - | 2.70% | 2.70% | 1.9% | ||
| Алфа-2 Макро | 8.12% | 7.91% | 5.22% | 11.1% | - | - | 9.30% | 8.80% | 8.80% | ||
| IgG | 14.20% | 23.60% | 25.00% | 26.2% | - | - | 26.00% | 25.20% | 22.0% | ||
| делта/аама ве- | 2х | 2х | 1.5х | - | - | inc. | inc. | inc. | |||
| рига | |||||||||||
| HLA-DR | 2х | 2х | 2х | - | - | inc. | inc. | inc. |
Пациент No 2.
Следващата таблица 3 обобщава резултатите от клиничните тестове, проведени върху пациент No 2.
В началото на лечението пациент No 2 (30-годишен мъж) е HIV положителен (т.е. дава положителен тест за антитела срещу HIV при ELISA), въпреки това той не страда от всички симптоми на СПИН. Броят на неговите CD4 клетки нараства от 193 (преди лечението с ТФ) до 305 (девет месеца след края на лечението) . Неговият р24 антиген на вътрешността остава отрицателен преди, по време на и след лечението с ТФ, което показва ниска вирусна активност. Неговата плазмена култура се преобразува на отрицателна на 4- месец след лечението, което означава липса на зараз45 ност на неговата плазма при in vitro изследването. Повишава се хуморалния имунитет, което се забелязва от повишаването на нивото на IgG, α-l и α-2 макроглуболините. 9 месеца след завършването на курса на лече50 ние, пациентът все още не показва никакъв признак на СПИН.
резултати но време на лечението Резултати след лечението без по 2 мускулни инжекции на седмица друго лечение - месеци
ТАБЛИЦА 3
Пациент No2 КЛИНИЧНИ И ЛАБОРАТОРНИ ТЕЗУЛТАТИ ОТ ТЕСТОВЕ НА ЧОВЕК
Извършен тест Преди лечение
| 2 | 4 | 6 | 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | Ί | 9 | ||
| HIV-Ab, ELISA | + | + + | + + + | + + + | - | - | +++ | + + + + | ++ + + | ||
| CD4abs | 193 | 50 | 144 | 173 | 193 | 288 | 305 | ||||
| CD8 abs. | 1348 | 298 | 755 | 840 | - | - | 1533 | 1312 | 1291 | ||
| p24 Ag | отр. | отр. | отр. | отр. | - | - | отр. | отр. | отр. | ||
| HIV-1,PHK.PCR копия на ml. | 43000 | - | 21100 | 9000 | - | - | - | 7000 | |||
| HIV-1, плазмена култура | отр. | - | отр. | - | • | отр. | - | - | отр. | ||
| HIV-1, култура Количество | • | - | - | - | - | ||||||
| POLY клетки х103х | 4.9 | 3.8 | 6.1 | 6.2 | - | - | 6.8 | 6.9 | - | - | 6.1 |
| Алфа-1 Макро | 1.37% | 1.4% | 2.4% | 2.5% | - | - | 2.5% | 2.3% | 2.1% | ||
| Алфа-2 Макро | 2.7% | 4.2% | 8.4% | 8.7% | - | - | 8.8% | 8.3% | 8.5% | ||
| IgG | 13.0% | 13.5% | 15.0% | 17.0% | - | - | 20.0% | 18.0% | 18.8% | ||
| делта/гама ве- | 1.5х | 1.4х | 1.2х | - | - | inc. | inc. | inc. | |||
| рига HLA-DR | 1.2х | 1.2х | 1.2х | inc. | inc. | inc. |
Пациент No 3.
Следващата таблица 4 обобщава резултатите от клиничните тестове, проведени върху пациент No3.
В началото на лечението пациент No 3 (24-годишна жена) е HIV положителен, т.е. дава положителен тест за антитела срещу HIV при ELISA, въпреки това тя не страда от всички симптоми на спин. Броят на нейните CD4 клетки нараства от 404 (преди лечението с ТФ) до 636 (девет месеца след края на лечението). Нейният р24 антиген на вътрешността остава отрицателен по време на изследването. Нейната плазмена култура се преобразува на отрицателна на 4-ия месец след лечението. Повишаването на хуморалния имунитет на пациента се изразява с повишаването на нивото на IgG, α-l и α-2 макроглуболините. 9 месеца след завършването на курса на лечение, пациентът все още не показва никакъв признак на СПИН.
ТАБЛИЦА 4
Пациент Νο3 КЛИНИЧНИ И ЛАБОРАТОРНИ ТЕЗУЛТАТИ ОТ ТЕСТОВЕ НА ЧОВЕК
Извършен тест Преди лечение резултати по време на лечението Резултати след лечението без по 2 мускулни инжекции на седмица друго лечение - месеци
| 2 | 4 | 6 | 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 9 | ||
| HIV-Ab,ELISA | + + | + + | + + + | + + + | - | - | + + + | + + + + | +++ | ||
| CD4abs | 404 | 217 | 538 | 375 | - | - | 446 | 580 | 636 | ||
| CD8 abs. | 1544 | 1054 | 1587 | 898 | - | - | 1496 | 1381 | 1191 | ||
| p24 Ag | отр. | отр. | отр. | отр. | - | - | отр. | отр. | отр. | ||
| HIV-1,PHK.PCR | 51210 | - | - | 14240 | - | - | - | - | 8840 | ||
| копия на ml. | |||||||||||
| HIV-1, плазме- | отр. | - | - | отр. | - | - | отр. | - | отр. | ||
| на култура | |||||||||||
| HTV-1, култу- | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||
| pa Количество | |||||||||||
| POLY клетки | 3.7 | 2.9 | 5.1 | 6.9 | - | - | 6.8 | 6.6 | 6.7 | ||
| xlO3 x | |||||||||||
| Алфа-1 Макро | 1.2% | 1.4% | 2.6% | 2.7% | - | - | 2.7% | 2.4% | 2.4% | ||
| Алфа-2 Макро | 4.1% | 4.1% | 5.3% | 8.3% | - | - | 8.1% | 8.2% | 8.2% | ||
| IgG | 12.24% | 14.4% | 17.7% | 21.0% | - | - | 19.8% | 18.01% | 18.0% | ||
| делта/гама ве- | 1.2х | 1.4х | тел | - | - | inc. | inc. | inc. | |||
| рига | |||||||||||
| HLA-DR | 1.8х | 1.4х | 1.2х | - | - | inc. | inc. | inc. |
Пациент No 4
Следващата таблица 5 обобщава резултатите от клиничните тестове, проведени върху пациент No 4.
Преди лечението пациентът (27-годишен мъж) е HIV положителен (т.е. дава положителен тест за антитела срещу HIV при ELISA), и всички симптоми на СПИН (степен 3, с опуртюнистични инфекции на гърлото и горната част на белите дробове). Броят на неговите CD4 клетки нараства от 389 (преди лечението с ТФ) до 599 (девет месеца след края на лечението).
Неговият р24 антиген на вътрешността се превръща в отрицателен след 4 седмици на лечение и остава отрицателен. Способността за заразяване на неговата HIV плазма става не5 заразна след 6 седмици от приложеното лечение и остава незаразна. Повишаването на хуморалния имунитет на пациента се изразява с повишаването на нивото на IgG, α-l и α-2 макроглобулините. 9 месеца след завършването 10 на курса на лечение пациентът не показва никакъв признак на СПИН.
| ТАБЛИЦА5 |
Пациент Νθ4 КЛИНИЧНИ И ЛАБОРАТОРНИ ТЕЗУЛТАТИ ОТ ТЕСТОВЕ НА ЧОВЕК
| Извършен тест Преди лечение | резултати по време на лечението Резултати след лечението без по 2 мускулни инжекции на седмица друго лечение - месеци |
| 2 | 4 | 6 | 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 9 | ||
| HTV-Ab, ELISA | + | + + | + + + | + + + | - | - | + + + + | + + + + | ++ + + | ||
| CD4 abs | 389 | 322 | 507 | 394 | - | - | 393 | 573 | 599 | ||
| CD8 abs. | 850 | 752 | 839 | 540 | - | - | 563 | 607 | 802 | ||
| p24Ag | пол. | пол. | отр. | отр. | - | - | отр. | отр. | отр. | ||
| HIV-1,PHK.PCR | 116000 | - | - | 30000 | - | - | 6600 | ||||
| копия на ml. | |||||||||||
| HIV-1, плазме- | пол. | пол. | - | отр. | - | - | отр. | - | отр. | ||
| на култура | |||||||||||
| HIV-1, култу- | - | - | - | - | - | - | - | - | - | ||
| pa Количество | |||||||||||
| POLY клетки | 4.3 | 3.8 | 6.3 | 6.7 | 6.6 | 6.3 | 6.4 | ||||
| xlO’x | |||||||||||
| Алфа-1 Макро | 1.7% | 1.8% | 4.0% | 4.4% | - | - | 3.3% | 2.4% | 1.6% | ||
| Алфа-2 Макро | 9.1% | 9.0% | 7.8% | 10.2% | - | - | 10.2% | 9.8% | 10.1% | ||
| IgG | 14.8% | 12.6% | 23.0% | 23.0% | - | - | 19.8% | 21.0% | 19.3% | ||
| делта/гама ве- | 2х | 2х | 1.5х | - | - | inc. | inc. | inc. | |||
| рига | |||||||||||
| HLA-DR | 2х | 2х | 2х | - | - | inc. | inc. | inc. |
Пациент № 5.
Този пациент е същият от пример 3, погоре.
Следващата таблица 6 обобщава резултатите от клиничните тестове, проведени върху пациент No 5.
Преди лечението пациентът е HIV положителен (т.е. дава положителен тест за антитела срещу HIV при ELISA), страда от пневмония, повръщане и диария, без кръв в екскрементите. Въпреки това липсва цялостна картина на СПИН. Броят на неговите CD4 клетки остава постоянен след лечението. Неговият р24 антиген на вътрешността става отрицателен по време на 4-тата седмица на лечение и остава такъв в продължение на седем месеца след лечението. HIV-1 РНК PCR показва, че броят на вирусни копия се задържа на около 6000-7000 копия на ml. Неговата плазмена култура не е заразна след лечението. Неговата имунна система продуцира повишено количество IgG, α-1 и α-2 макроглобулини. Наддава 10-12 паунда тегло. 10 месеца след края на лечението, той не показва никакви симптоми на СПИН.
Пациент No5 КЛИНИЧНИ И ЛАБОРАТОРНИ ТЕЗУЛТАТИ ОТ ТЕСТОВЕ НА ЧОВЕК
Извършен тест Преди лечение резултати по време на лечението Резултати след лечението без по 2 мускулни инжекции на седмица друго лечение - месеци
ТАБЛИЦА 6
| 2 | 4 | 6 | 1 | 2 | 4 | 5 | 6 | 7 | 9 | ||
| HIV-Ab, ELISA | + | + | ++ | + + + | + + + | + + + | + + + + | +++ | + + | + + + + | |
| +- | + | + | + + | ||||||||
| CD4 abs | 528 | 531 | 582 | 420 | 470 | 596 | 434 | 415 | 438 | 438 | 669 |
| CD8 abs. | nt | 1108 | 979 | 803 | 818 | 1220 | 1004 | 1150 | 926 | 909 | 890 |
| p24 Ag | пол. | пол. | отр. | отр. | отр. | отр. | отр. | отр. | отр | отр. | отр. |
| HIV-1,PHILPCR копия на ml. | 70000 | - | - | 7870 | 30928 | * | • | - | 6317 | - | |
| HIV-1, плазме- | пол. | пол. | пол. | отр. | отр. | отр. | отр. | отр. | отр | отр. | отр. |
| на култура HIV-1, култура Количество | nt | nt | - | - | nt | nt | nt | nt | nt | nt | nt |
| POLY клетки xio’x | 4.3 | 6.2 | 5.7 | 5.9 | 6.0 | 5.9 | 7.3 | 6.5 | 5.6 | 5.8 | 6.0 |
| Алфа-1 Макро | 1.3% | 2.6% | 1.9% | 2.0% | 2.8% | 2.6% | 2.1% | 2.4% | 2.4% | 2.4% | 2.4% |
| Алфа-2 Макро | 9.4% | 9.2% | 7.3% | 8.0% | 10.3% | - | 10.1% | 11.8% | 11.8% | 11.2% | |
| IgG | 18.6% | 25.0% | 26.3% | 25.1% | 24.7% | - | 24.6% | 23.9% | 22.8% | 23.3% | |
| делта/гама ве- | 1.2х | 1.6х | 2.0х | 1.5х | - | inc. | inc. | ||||
| рига HLA-DR | 1.2х | 1.8х | 2. Ох | 2.0х | - | - | 1.2x | inc. |
Пациент No 6
Следващата таблица 7 обобщава резултатите от клиничните тестове, проведени върху пациент No 6.
В началото на лечението пациентът проявява пълна картина на СПИН (степен между 3 и 4, страда например от възпаление на ретината, цитомегаловирусна инфекция, гьбична инфекция на гърлото, белите дробове трахеята и бронхите, и е прикован на легло). Броят на неговите CD4 клетки слабо се покачва след 2 месеца лечение. р24 антигена на вътрешността става отрицателен след 4 седмици лечение и остава отрицателен. Неговата плазмена култура е положителна преди лечението и се променя на отрицателна и незаразяваща след лечението. Обикновено клетъчната култура от периферна кръв е положителна при пациент с брой на CD4 под 100 и вирусно съдържание 5 х 105. Въпреки това, в случая на пациент No 6, не се открива HIV в клетките на периферната кръв, на 1-ия и 2-ия месец от лечението. Количеството вируси в пациента спада от 5 х 105 до 3 х 104 копия вирусна РНК. Това е близко до спад с 1,5 log на вирусната РНК. Пациент No 6, също така, наддава на тегло 15 паунда от началото на лечението. Три месеца след началото на лечението пациентът не страда от СПИН.
ТАБЛИЦА7
Пациент No6 КЛИНИЧНИ И ЛАБОРАТОРНИ ТЕЗУЛТАТИ ОТ ТЕСТОВЕ НА ЧОВЕК
| Извършен шест Преди лечение | резултати no време на лечението Резултати след лечението без по 2 мускулни инжекции на седмица друго лечение - месеци | ||||||||||
| 2 | 4 | 6 | 1 | 2 | 3 4 | 5 | 6 | 7 | 9 | ||
| HIV-AbJELISA | + | + | + | + | + | + | |||||
| CD4 abs | 70 | 79 | 90 | ||||||||
| CD8 abs. | 624 | 700 | 685 | ||||||||
| р24 Ag | пол. | пол. | отр. | omp. | omp. | omp. <5pg/l | |||||
| HTV-1,PHK,PCR копия на ml. | 5x10s | nt. | nt. | nt. | 30924 | 31795 | |||||
| HTV-1, плазмена култура | ПОЛ. | nt | nt | nt. | omp. | omp. | |||||
| HIV-1, култура Количество | nt | nt | nt | nt | omp. | omp. | |||||
| IfiG | nt | nt | nt | nt | 1413 | 1323 | |||||
| IgA | nt | nt | nt | nt | 768 | 802 | |||||
| JsM | nt | nt | nt | nt | 218 | 244 |
nt=ne е тестван
Изводи
Примерът показва, че HIV вирусната активност се спира, както се вижда, с промяната на Р24 антиген на по-малко от 5 pg/ml, границата на тест метода. Показано е, също така, драматично увеличаване на броя на CD4 в пациента с HIV. Това увеличение е още по-драматично във времето, отколкото наблюдаваното за антивирусните продукти, намиращи се в търговската мрежа в САЩ, като например AZT и други. Този пример показва, също така, и драматично намаляване на количеството вируси в пациента, определено чрез количествена РНК-полимеразна верижна реакция. Плазмената култура на пациента става отрицателна. При in vitro система, кръвната плазма на пациента става незаразна. Т-клетките на пациента стават неспособни in vitro да заразяват Тклетки от неинфектиран (нормален) пациент. Горното може да сочи липса на вирус в плазмата. Може да сочи, също така, че пациентът е имунизиран, като по този начин е неспособен да инфектира други неинфектирани пациенти.
Мононуклеоцитите от периферната кръв (РВМС) дават отрицателен тест за HIV. Лечението променя пациентите с пълна картина на СПИН на пациенти с недоловим HIV както в тяхната плазма, така и в клетките от тяхната периферна кръв. Изглежда, че и двете, както хуморалният, така и клетъчният имунитет на пациента, са използвани за разрушаване и неутрализиране на вируса.
Изобретението се описва с отпратки към специфични варианти за изпълнение. Настоящата заявка има претенциите да обхваща тези промени и замествания, които могат да се осъществяват от специалисти в областта в състоянието на техниката, без да се излиза от идеята и обхвата на приложените претенции.
Claims (29)
1. Състав на ТФ протеин, характеризиращ се с това, че съдържа богата на лизин хистонова фракция от ядра на тимусни клетки на бозайник, като при контакт на състава със серум от неинфектиран с HIV човек, той е способен да утаява β-, а,- и а2- макроглобулини на здрав бозайник.
2. Състав, съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че ТФ протеинът е неметилиран и съдържа протеин от около 35 kD, както е определен чрез 11% нередуцираща натриев додецилсулфат, - полиакриламидна гел електрофореза.
3. Състав съгласно претенция 1, харак-
5 теризиращ се с това, че ТФ протеинът е метилиран и съдържа протеин от около 28 kD, както е определен чрез 11 % нередуцираща натриев додецилсулфат - полиакриламидна гел електрофореза.
10 4. Състав съгласно претенция 1, характеризиращ се с това, че изоелектричната точка на ТФ протеина е около 5,6.
5. Състав съгласно претенция 4, характеризиращ се с това, че pH на състава е между
15 7,64 и 8,6.
6. Метод за получаване на състав на ТФ протеин, включващ следните етапи:
а) пречиства се богатата на лизин хистонова фракция от ядра на тимусни клетки на
20 бозайник; и
б) довежда се богатата на лизин хистонова фракция в контакт с катионообменен хроматографски материал за време, достатъчно ТФ протеинът да се свърже към материала;
25 в) ТФ протеинът от катионообменния хроматографски материал се елюира чрез довеждане на катионообменния хроматографски материал в контакт с ефективен воден солеви разтвор;
7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че включва освен това и етап, при който се събира елюата, който е способен да утаява β-, ος- и α2- макроглобулини на здрав бозайник.
8. Метод съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че катионообменният хроматографски материал е карбоксиметил колонна хроматография и карбоксиметилната колона се промива и ТФ протеинът се елюира чрез прилагане на линеен градиент на натриев хлорид в 0,05 М натриев ацетат с pH 6,8.
9. Метод съгласно претенция 7, характеризиращ се с това, че богатата на лизин хистонова фракция се получава чрез разрушаване на клетъчното ядро чрез ензимно обработване с пепсин и се изолира от получената смес от отломки на богата на лизин хистонова фракция.
10. Метод за откриване на инфекция в човек, характеризиращ се с това, че включва следните етапи:
а) взима се биологична проба от субекта, и
б) определя се модела на фрагментиране на протеин, аТФ, който е способен да свързва ТФ протеин, присъстващ в богатата на лизин хистонова фракция, който може да се получи от ядра на тимусни клетки, като посочената инфекция причинява фрагментирането на аТФ.
11. Метод съгласно претенция 10, характеризиращ се с това, че ТФ е способен да утаява β-, а,- и а2- макроглобулини на здрав бозайник.
12. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че ТФ е около 35 kD, когато не е метилиран, и около 28 kD, когато е метилиран, както е определен чрез 11 % нередуцираща натриев додецилсулфат - полиакриламидна гел електрофореза.
13. Метод съгласно претенция 12, характеризиращ се с това, че моделът на фрагментиране на аТФ се определя чрез модела му на утаяване с ТФ.
14. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че методът включва двуизмерна гел електрофореза и моделът на утаяване на аТФ и ТФ се определя след това чрез локализацията му по отношение на β-, ος- и α2- макроглобулините върху гелната електрофореза.
15. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че биологичната проба се избира от група, състояща се от: серум кръв и плазма.
16. Метод за определяне на HIV инфекция в човек, характеризиращ се с това, че включва следните етапи:
а) взима се биологична проба от субекта, като пробата се избира от група, състояща се от серум, плазма и кръв;
б) смесват се биологичната проба с TF протеин, пречистен от богатата на лизин хистонова фракция от тимусни ядра на небозайници,
в) моделът на утаяване на ТФ и β-, οςи α2- макроглобулините от биологичната проба се свързва с HIV инфекция.
17. Метод съгласно претенция 16, характеризиращ се с това, че биологичната проба и ТФ се подлагат на гел електрофореза, и свързване на модела на утаяване на ТФ и на биологичната проба се свързва с локализацията на β-, а,- и а2- макроглобулините от гела, с HIV инфекция.
18. Метод съгласно претенция 17, ха рактеризиращ се с това, че ТФ се метилира и е с молекулно тегло около 28 kD, както е определен чрез 11 % нередуцираща натриев додецилсулфат - полиакриламидна гел електрофореза и с изоелектрична точка от около 5,6.
19. Метод съгласно претенция 18, характеризиращ се с това, че електрофорезата е двуизмерна гел електрофореза.
20. Метод съгласно претенция 19, характеризиращ се с това, че липсата на непрекъсната шипообразна утайка близо до позициите на β-, а,- и а2- макроглобулините върху гела означава HIV инфекция в човек.
21. Метод съгласно претенция 20, характеризиращ се с това, че ако липсва непрекъсната шипообразна утайка, а се наблюдава разкъсана шипообразна утайка, в такъв случай субектът е в по-напреднал стадий на HIV инфекция или свързано с HIV заболяване, ако шипообразните утайки са изтощени или с пониско молекулно тегло.
22. Устройство за in vitro определяне на HIV инфекция в човек, характеризиращо се с това, че включва твърда поставка, която съдържа област за разстилане на проба от биологична течност от субекта човек, и област на застилане на ТФ протеин, като ТФ протеинът може да се екстрахира от богатата на лизин част от ядрата на тимусни клетки на бозайници, но не хора, и е способен да утаява β-, о^и а2- макроглобулин и от серумна проба на неинфектиран с HIV човек, твърдата поставка дава възможност на биологичната проба да влезе в контакт и да се утаи с ТФ, както и откриването на такова утаяване.
23. Устройство съгласно претенция 22, характеризиращо се с това, че посочената твърда поставка е двуизмерен електрофоретичен гел и контактуването и утаяването се осъществяват с помощта на двуизмерна гел електрофореза, и биологичната проба се избира от група, състояща се от кръв, серум и плазма.
24. Комплект за in vitro откриване на HIV инфекция в човек, който съдържа:
а) контейнер, съдържащ ТФ протеин, който може да се екстрахира от богатата на лизин част от ядрата на тимусни клетки на бозайници, но не хора, и е способен да утаява β-, с^- и а2- макроглобулини от серумна проба на неинфектиран с HIV човек; и
б) устройство с електрофоретичен гел, подходящ за провеждане на двуизмерна гел електрофореза.
25. Метод за пречистване на ТФ протеин, характеризиращ се с това, че включва следните етапи:
а) екстрахират се клетъчните ядра от тимус на бозайник;
б) получава се богата на лизин част от клетъчните ядра; и
в) пречистват се ТФ от богатата на лизин част, на основата на способността на ТФ да утаява β-, с^- и а2- макроглобулини.
26. Един първи протеин, притежаващ качествата на втори протеин, като този втори протеин може да се екстрахира от богатата на лизин хистонова фракция на ядра от тимусни клетки на бозайници, като качествата, притежавани от първия и втория протеин са техните:
а) способност за утаяване на единична непрекъсната шипообразна утайка върху двуизмерния електрофоретичен тел, прилежаща до β-, α(- и α2- макроглобулините от серум на здрав човек; и
б) неспособност за утаяване на единична непрекъсната шипообразна утайка върху двуизмерния електрофоретичен гел, прилежаща до β-, и а2- макроглобулините от серум на пациент човек със СПИН.
27. Първият протеин съгласно претенция 26, характеризиращ се с това, че вторият
5 протеин може да се екстрахира от ядра на тимусни клетки на бозайници чрез разграждане с пепсин.
28. Използване на състав, включващ първия и/или втория протеин съгласно пре-
10 тенция 26 за лечение на човек, страдащ от HIV инфекция.
29. Използване съгласно претенция 28, при което HIV инфекцията се избира между СПИН и ARC; и вторият протеин може да се
15 екстрахира от ядра на тимусни клетки на бозайници чрез разграждане с пепсин и ядрото от тимусна клетка на бозайник, който не е човек.
30. Използване на състав, съдържащ 20 първия и/или втория протеин съгласно претенция 26, за ваксиниране на хора срещу HIV инфекция.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US43188395A | 1995-05-01 | 1995-05-01 | |
| US48554895A | 1995-06-07 | 1995-06-07 | |
| US64193696A | 1996-05-01 | 1996-05-01 | |
| PCT/US1996/006079 WO1996034886A1 (en) | 1995-05-01 | 1996-05-01 | Compositions and methods for detecting and treating acquired immunodeficiency syndrome |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BG102083A BG102083A (bg) | 1998-10-30 |
| BG64056B1 true BG64056B1 (bg) | 2003-11-28 |
Family
ID=27411755
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BG102083A BG64056B1 (bg) | 1995-05-01 | 1997-11-28 | Състави и методи за откриване и лечение на спин |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP0826003B1 (bg) |
| CN (1) | CN1221568C (bg) |
| AT (1) | ATE205221T1 (bg) |
| BG (1) | BG64056B1 (bg) |
| CA (1) | CA2220347C (bg) |
| DE (1) | DE69615015T2 (bg) |
| DK (1) | DK0826003T3 (bg) |
| EA (1) | EA001100B1 (bg) |
| ES (1) | ES2163028T3 (bg) |
| HK (1) | HK1009457A1 (bg) |
| IL (1) | IL118103A (bg) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102008057479A1 (de) | 2008-11-14 | 2010-05-20 | Bernhard, Stefan, Dr. | Vorrichtung und Verfahren zur Stärkung des Immunsystems durch Langzeitstimulation der Thymusdrüse |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112782398A (zh) * | 2020-12-28 | 2021-05-11 | 重庆生命知源科技有限公司 | 一种微量蛋白免疫印迹检测方法 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4415553A (en) * | 1973-08-06 | 1983-11-15 | Dso "Pharmachim" | Compositions, processes for their preparation and method for treatment of neoplasms |
| US4818763A (en) * | 1984-01-12 | 1989-04-04 | Volker Rusch | Biologically active substance with hormonal properties, production process thereof and utilization of histones for medical purposes |
| AU2800389A (en) * | 1987-12-02 | 1989-07-05 | Regents Of The University Of California, The | Aids-related anti-t-cell antibody test |
| GB9209874D0 (en) * | 1992-05-07 | 1992-06-24 | Ml Lab Plc | Pharmaceutical compositions |
-
1996
- 1996-05-01 AT AT96920118T patent/ATE205221T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-05-01 ES ES96920118T patent/ES2163028T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-01 CA CA002220347A patent/CA2220347C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-05-01 IL IL11810396A patent/IL118103A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-05-01 DK DK96920118T patent/DK0826003T3/da active
- 1996-05-01 EA EA199700353A patent/EA001100B1/ru not_active IP Right Cessation
- 1996-05-01 EP EP96920118A patent/EP0826003B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-05-01 CN CNB961952032A patent/CN1221568C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-05-01 DE DE69615015T patent/DE69615015T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-05-01 EP EP00125954A patent/EP1104770A3/en not_active Withdrawn
-
1997
- 1997-11-28 BG BG102083A patent/BG64056B1/bg unknown
-
1998
- 1998-09-03 HK HK98110415A patent/HK1009457A1/xx not_active IP Right Cessation
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE102008057479A1 (de) | 2008-11-14 | 2010-05-20 | Bernhard, Stefan, Dr. | Vorrichtung und Verfahren zur Stärkung des Immunsystems durch Langzeitstimulation der Thymusdrüse |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL118103A (en) | 2000-02-29 |
| DE69615015T2 (de) | 2002-06-27 |
| IL118103A0 (en) | 1997-03-18 |
| CN1189839A (zh) | 1998-08-05 |
| EP1104770A3 (en) | 2001-06-27 |
| DK0826003T3 (da) | 2001-11-26 |
| CA2220347A1 (en) | 1996-11-07 |
| EA199700353A1 (ru) | 1998-04-30 |
| CN1221568C (zh) | 2005-10-05 |
| BG102083A (bg) | 1998-10-30 |
| EP1104770A2 (en) | 2001-06-06 |
| EA001100B1 (ru) | 2000-10-30 |
| EP0826003B1 (en) | 2001-09-05 |
| EP0826003A1 (en) | 1998-03-04 |
| HK1009457A1 (en) | 1999-06-04 |
| ATE205221T1 (de) | 2001-09-15 |
| ES2163028T3 (es) | 2002-01-16 |
| DE69615015D1 (de) | 2001-10-11 |
| CA2220347C (en) | 2003-03-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kirkpatrick | Transfer factors: identification of conserved sequences in transfer factor molecules | |
| Nair et al. | Immunoregulatory effects of morphine on human lymphocytes | |
| Emödi et al. | Human interferon therapy for herpes zoster in adults | |
| JP2002511063A (ja) | 細胞質性ジペプチダーゼに結合する化合物の送達による免疫応答の増強 | |
| Sirima et al. | Safety and immunogenicity of the Plasmodium falciparum merozoite surface protein-3 long synthethic peptide (MSP3-LSP) malaria vaccine in healthy, semi-immune adult males in Burkina Faso, West Africa | |
| AU2003235005A8 (en) | Antibodies to non-functional P2X7 receptor diagnosis and treatment of cancers and other conditions | |
| KR20010072517A (ko) | 아글리코 생성물 및 그의 사용 방법 | |
| WO2003020762A1 (en) | Antibodies to non-functional p2x7receptor, diagnosis and treatment of cancers and other conditions | |
| WO2008054635A2 (en) | Proteins for use in diagnosing and treating infection and disease | |
| Redmond et al. | Delayed skin reactions to benzylpenicillin in man | |
| US7625565B2 (en) | Antiviral compositions comprising lysine-rich histone fractions prepared by pepsin treatment of thymic cell nuclei | |
| EP0313156A1 (en) | SnRNP-A antigen and fragments thereof | |
| Jakobsen et al. | Identification of an erythrocyte binding peptide from the erythrocyte binding antigen, EBA-175, which blocks parasite multiplication and induces peptide-blocking antibodies | |
| Norris et al. | Humoral immune response to the Trypanosoma cruzi complement regulatory protein as an indicator of parasitologic clearance in human Chagas' disease | |
| EP0230052B1 (en) | Immunoamplifiers and related Compositions | |
| BG64056B1 (bg) | Състави и методи за откриване и лечение на спин | |
| JP3816524B2 (ja) | 後天性免疫不全症候群を検出しそして処置するための組成物および方法 | |
| Shapiro et al. | Epstein-Barr virus co-reconstituted with Sendai virus envelopes infects Epstein-Barr virus-receptor negative cells | |
| EP4382122A1 (en) | Peptide complex ipf-h2a for modulation immune function of the human body | |
| DK173667B1 (da) | Små peptider, der hæmmer binding til T-4 receptorer og virker som immunogener, farmaceutisk produkt som omfatter mindst 1 af peptiderne samt prøveudstyr til påvisning af antistoffer | |
| WO1990002567A1 (en) | Virus-derived antigenic composition and its preparation and use | |
| Romsdahl et al. | Immunological studies on malignant melanomas of man. | |
| Lopez-Trascasa et al. | Interaction between C3 Nephritic Factor and Erythrocyte Membranes | |
| JP3840408B2 (ja) | アトピー性皮膚炎の検出方法 | |
| CN117083290A (zh) | 戊型肝炎病毒样颗粒及其用途 |