BE904450A - Immobilisation covalente sur nylon de substances biologiquement actives et leurs utilisations. - Google Patents
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Abstract
La méthode comprend l'adsorption sur ladite surface, à partir de la substance pure ou d'une solution concentrée de celle-ci, d'une diamine aliphatique primaire et la réaction de cette diamine avec un réactif bifonctionnel des amines suivie du couplage de ladite substance biologiquement active. Une méthode de dosage immunochimique par compétition ou par immunométrie pour des substances contenues dans les milieux biologiques, consiste à utiliser une bille de Nylon recouverte d'une diamine aliphatique primaire et sur laquelle et immobilisée, à l'aide d'un réactif bifonctionnel, une protéine de liaison ou un anticorps spécifique de la substance à doser dans le milieu biologique. L'invention concerne également la trousse pour le dosage.
Description
Immobilisation covalente sur Nylon de substances biologiquement actives et leurs utilisations.
La présente invention a pour objet l'immobilisation par covalence de substances biologiquement actives sur Nylon et leurs utilisations, particulièrement en immunochimie.
Dans les dosages immunochimiques (RIA,EIA,FIA...), la substance à doser, généralement un antigène, est mise en compétition avec un composé similaire (ou chimiquement proche) marqué de manière adéquate, vis-à-vis d'un nombre limité de sites de liaison d'un anticorps ou d'une protéine de liaison spécifique.
Le composé marqué lié à l'anticorps est séparé du composé libre et mesuré.
Les techniques de séparation,qui sont utilisées couramment,sont la précipitation de l'antigène libre avec du charbon activé ou la précipitation de l'antigène lié
à l'anticorps à l'aide d'un second anticorps.
Ces méthodes sont longues, délicates et ne donnent pas une séparation nette entre la fraction libre et la fraction liée.
L'immobilisation des anticorps sur une phase solide permet une séparation des fractions libre et liée par simple décantation.
En plus des systèmes par compétition, l'utilisation d'une phase solide peut s'appliquer aux systèmes immunométriques ("sandwich").
La substance à doser est mise en présence d'un excès d'anticorps ou de protéine de liaison spécifique. Après séparation des fractions libre et liée de la substance à doser, un second anticorps ou protéine de liaison spécifique est ajouté, qui va réagir avec la substance à doser liée au premier anticorps ou à la première protéine de liaison spécifique.
L'immobilisation d'un des deux anticorps ou protéines de liaison spécifique sur une phase solide facilite grandement la réalisation de tels dosages.
La présente invention décrit un procédé d'immobilisation par covalence de substances biologiquement actives sur Nylon et l'utilisation de ces substances plus particulièrement en vue de la réalisation de dosages immunochimiques.
Les substances ainsi immobilisées peuvent également servir en tant que support de chromatographie en vue de l'isolement ou de la purification de substances s'y liant (chromatographie d'affinité).
Les substances immobilisées peuvent également être des enzymes,qui sont utilisés dans des réacteurs en vue d'applications analytiques ou préparatives.
On connaît par l'état de la technique, voir GB-A-1 485 122, une méthode d'immobilisation de substances biologiques sur Nylon en activant le Nylon par alkylation avec le diméthyl sulfate et formation de groupements imidates. Cependant, cette méthode provoque une attaque chimique du Nylon alors qu'il est important que la structure chimique du Nylon ne soit pas altérée.
On connaît aussi par l'état de la technique, voir US-A-4 001 583, une technique d'immobilisation d'anticorps à la surface de tube de polyéthylène ou de polypropylène par polymérisation à la surface du tube de glutaral-déhyde suivie de réaction avec l'anticorps. Alternativement, l'étape à la glutaraldéhyde peut être précédée d'un traitement à chaud avec une solution diluée d'une amine aliphatique primaire de formule générale CH3-(CH2)m-NH2
(où m varie de 5 à 20 et vaut de préférence 18) ou d'une diamine aliphatique secondaire de formule générale CH3-(CH2)m-NH-(CH2)p-NH2 (où m et p varient de 3 à 20 avec
<EMI ID=1.1>
sur des réactions hydrophobes entre le support plastique et l'amine.
La méthode d'immobilisation suivant l'invention d'une substance biologiquement active à la surface du Nylon est caractérisée en ce qu'elle comprend l'adsorption sur ladite surface, à partir de la substance pure ou d'une solution concentrée de celle-ci, d'une diamine aliphatique primaire, et la réaction de cette diamine avec un réactif bifonctionnel des amines suivie du couplage de ladite substance biologiquement active.
Suivant une réalisation de l'invention la substance biologiquement active est une protéine ou une enzyme et la diamine aliphatique primaire est l'éthylène diamine.
L'invention concerne encore une méthode de dosage immunochimique ou par immunométrie pour des substances contenues dans les milieux biologiques, caractérisée en ce qu'elle consiste à utiliser une bille de Nylon recouverte d'une diamine aliphatique primaire et sur laquelle est immobilisée, à l'aide d'un réactif bifonctionnel, une protéine de liaison ou un anticorps spécifique de la substance à doser dans le milieu biologique.
Suivant une réalisation de l'invention la substance à doser est la thyroxine ou le cortisol.
L'invention concerne également la trousse pour
le dosage dans les milieux biologiques. Cette trousse=est caractérisée en ce qu'elle comprend :
a) une bille de Nylon, sur laquelle est adsorbée une diamine primaire aliphatique mise à réagir avec un réactif bifonctionnel ; b) une protéine de liaison spécifique de la substance à doser et couplée de manière covalente à la surface du Nylon décrite ci-dessus ; c) la substance à doser ou un analogue de la substance à doser marqué par une enzyme ; d) un tampon et un substrat permettant de révéler colorimétriquement l'activité enzymatique liée à la bille ; e) un réactif permettant d'arrêter la réaction enzymatique en maintenant la coloration stable ; f) les solutions d'étalonnage contenant la substance à doser.
L'invention est décrite ci-après avec plus de détails.
La surface de la bille de Nylon est traitée à l'aide d'une solution concentrée d'une diamine aliphatique de formule générale NH2-(CH2)n-NH2, où n est un entier positif. L'excès de diamine est éliminé par lavage et les groupements aminés adsorbés à la surface du Nylon sont
mis à réagir avec un réactif bifonctionnel, qui peut être le l,5-difluoro-2,4-dinitrobenzène, la glutaraldéhyde, le diméthyl adipidiimidate ou tout autre réactif bifonctionnel réagissant avec les groupements aminés. Ce réactif réagit par un de ses groupements avec les fonctions aminées de la diamine adsorbée sur le Nylon tandis que l'autre groupement fonctionnel réagit avec un groupement aminé de l'anticorps ou de la protéine de liaison spécifique à immobiliser.
Pour la réalisation du dosage immunochimique par
<EMI ID=2.1>
hapténiqun, une hormone protéique, un médicament, une pro-téine, un antigène, un anticorps ou un antigène figuré, et la substance non marquée provenant d'un milieu biologique (sérum, plasma, urine...) sont mis à incuber dans un tube avec une bille de Nylon recouverte d'anticorps ou de protéine de liaison spécifique suivant le procédé décrit dans cette invention. Après une incubation appropriée, l'antigène libre est rapidement éliminé par décantation et la bille est lavée avec un tampon approprié. L'antigène marqué lié à la bille est mesuré de manière adéquate suivant sa nature. Avec un marqueur radioactif, la bille est transférée dans un compteur de radioactivité. Dans le cas d'un marqueur enzymatique, on procède à la mesure de l'activité enzymatique liée à la bille.
Lors de dosage par une technique sandwich, la substance à doser contenue dans un milieu biologique est mise à incuber avec la bille recouverte, selon le procédé décrit ici, avec un anticorps ou une protéine de liaison spécifique. Après une incubation appropriée le milieu biologique est éliminé et la bille est lavée. Le deuxième anticorps ou protéine de liaison spécifique marqué est ajouté et mis à incuber avec la bille. Cet anticorps ou cette protéine de liaison spécifique se fixe à la substance à doser elle-même liée à la bille. Après incubation, élimination de l'excès de second anticorps ou protéine de liaison spécifique et lavage de la bille, on procède comme décrit ci-dessus à la mesure spécifique du marqueur utilisé.
L'adsorption d'une diamine à la surface du Nylon augmente fortement la capacité d'immobilisation par rapport au Nylon intact.
Cette technique n'altère pas la structure du Nylon (rigidité) comme le font les techniques utilisant une hydrolyse acide (acide chlorhydrique), une hydrolyse <EMI ID=3.1>
tion par alkylation (diméthylsulfate ou triéthyloxonium tétrafluoroborate).
TRAITEMENT DES BILLES DE NYLON.
La technique de préparation est donnée pour des billes de Nylon. Elle peut être adaptée à d'autres formes physiques de même support (tube, tuyau, microbilles,poudre...).
On ajoute la diamine pure (n inférieur à 5) ou
une solution 1M de la diamine.
L'adsorption se déroule à température ambiante.
Le temps de contact peut être ajusté suivant le degré de fonctionalisation désiré. Après 24 heures de réaction une fonctionalisation maximum est obtenue.
La diamine est éliminée et les billes sont lavées.
Les billes sont mises à réagir avec le l,5-difluoro-2,4-dinitro-benzène dans une solution de tétraborate sodique 25mM pendant au moins 15 minutes sous agitation.
Après lavage à l'eau les billes sont lavées avec
une solution de tétraborate sodique 25mM.
Les billes sont ainsi fonctionalisées et la protéine peut être immobilisée à leur surface.
IMMOBILISATION D'ANTICORPS SUR LES BILLES FONCTIONALISEES.
Les anticorps ou les protéines sont immobilisés
à la surface des billes par leurs groupements aminés primaires.
La quantité de protéine immobilisée est directement fonction de la concentration de la protéine en solution. Cette quantité doit être ajustée en fonction de l'utilisation prévue.
Dans le cas d'un dosage de thyroxine totale dans le serum humain, les billes fonctionalisées ont été mises
à réagir avec une solution de tétraborate sodique 25mM contenant 8 mg/L d'IgG anti-thyroxine et 32 mg/L d'IgG banales de porc.
Dans le cas d'un dosage de cortisol total dans le sérum humain, les billes fonctionalisées sont mises à réagir avec une solution de tétraborate sodique 25mM contenant 16 mg/L d'IgG anti-cortisol et 24 mg/1 d'IgG banales de porc.
Après quatre heures à température ambiante la réaction est terminée.
Après réaction les billes sont lavées avec un tampon phosphate et conservées humides dans le même tampon.
EXEMPLE 1 : DOSAGE DE LA THYROXINE.
<EMI ID=4.1>
de tampon barbital à pH=8,6 contenant 400 mg/1 de 8-anilinonaphtol-sulfonate, 350 mg/L d'acide salicylique et de la thyroxine marquée à la phosphatase alcaline (approximativement 220 U/L).
Homogénéiser et ajouter une bille de Nylon recouverte d'anticorps anti-thyroxine suivant le procédé décrit ci-dessus.
Incuber une heure à température ambiante.
Aspirer la solution et laver les billes deux fois avec une solution de chlorure sodique 9 g/L.
<EMI ID=5.1>
phate lOmM dans un tampon diéthanolamine 1M pH=9,8) et incuber 20 minutes à 37[deg.] C.
Ajouter 1 mL de réactif d'arrêt de la réaction enzymatique (soude 100 mM et EDTA 20 mM).
Mesurer les absorbances à 405 nm et construire
la courbe standard en portant les absorbances des standards en fonction de la concentration en thyroxine.
Calculer le taux de thyroxine dans les échantillons nar internolation sur la courbe standard.
<EMI ID=6.1>
EXEMPLE 2 : DOSAGE DU CORTISOL
<EMI ID=7.1>
de tampon phosphate à PH=7,2 contenant 400 mg/L de 8-anilinonaphtol-sulfonate,2,8 g/L d'acide salicylique et du cortisol marqué à la phosphatase alcaline (approximativement 120 U/L). Homogénéiser et ajouter une bille de Nylon recouverte d'anticorps anti-cortisol suivant le procédé décrit ci-dessus.
Incuber 30 minutes à température ambiante.
Aspirer la solution et laver les billes deux fois avec une solution de chlorure sodique 9 g/L.
<EMI ID=8.1>
10 mM dans un tampon diéthanolamine 1 M pH=9,8) et incuber
20 minutes à 37[deg.] C.
Ajouter 2 mL de réactif d'arrêt de la réaction enzymatique (soude 100 mM et EDTA 20 mM) .
Mesurer les absorbances à 405 nm et construire
la courbe standard en portant les absorbances des standards en fonction de la concentration en cortisol.
Calculer le taux de cortisol dans les échantillons par interpolation sur la courbe standard.
<EMI ID=9.1>
<EMI ID=10.1>
On a cité plus haut comme état connu de la technique GB-A-1 485 122 et US-A-4 001 583. Or, la technique décrite dans le premier document provoque une attaque chimique du Nylon, alors que suivant la présente invention il n'y a pas d'altération de la structure chimique du Nylon. D'autre part, suivant la présente invention et comparativement au second document, on utilise une diamine aliphatique primaire et la réaction se fait à froid
et en solution concentrée. Le polymère utilisé comme support est le Nylon et le traitement est basé sur des forces d'attraction de type Van der Waals. Alors que dans
US-A-4 001 583 l'étape d'adsorption de la diamine est suivie d'une polymérisation de glutaraldéhyde, suivant l'invention elle est suivie d'une réaction monomoléculaire entre les fonctions aminées adsorbées à la surface du
Nylon et un réactif bifonctionnel. Suivant ce document
le support avec les protéines immobilisées est conservé
à sec alors que suivant la présente invention les billes sont conservées, après immobilisation de la protéine, en milieu humide.
Claims (1)
- R E V E N D I C A T I O N S1. Méthode d'immobilisation d'une substance biologiquement active à la surface du Nylon, caractérisée en ce qu'elle comprend l'adsorption sur ladite surface, à partir de la substance pure ou d'une solution concentrée de celle-ci, d'une diamine aliphatique primaire et la réaction de cette diamine avec un réactif bifonctionnel des amines suivie du couplage de ladite substance biologiquement active.2. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la substance biologiquement active estune protéine.3. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la substance biologiquement active est une protéine spécifique de liaison d'origine naturelle ou un anticorps.4. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la substance biologiquement active est une enzyme.5. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la diamine aliphatique primaire est l'éthylène diamine.6. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la diamine aliphatique primaire est le1-3 diaminopropane.7. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la diamine aliphatique primaire est le 1-4 diaminobutane.8. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que la diamine aliphatique primaire est le 1-5 diaminopentane.9. Méthode suivant la revendication 1 - caractérisée en ce que la diamine aliphatique primaire est le 1-6 diaminohexane. <EMI ID=11.1>en ce que le réactif bifonctionnel est le 1-5-difluoro2-4-dinitrobenzène.11. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le réactif bifonctionnel est la glutaraldéhyde.12. Méthode suivant la revendication 1, caractérisée en ce que le réactif bifonctionnel est un diimidate.<EMI ID=12.1>tion ou par immunométrie pour des substances contenues dans les milieux biologiques, caractérisée en ce qu'elle consiste à utiliser une bille de Nylon recouverte d'une diamine aliphatique primaire et sur laquelle est immobilisée, à l'aide d'un réactif bifonctionnel, une protéine de liaison ou un anticorps spécifique de la substance à doser dans le milieu biologique.14. Méthode suivant la revendication 13, caractérisée en ce que la substance à doser est la thyroxine.15. Méthode suivant la revendication 13, caractérisée en ce que la substance à doser est le cortisol.16. Trousse pour le dosage dans les milieux biologiques, caractérisée en ce qu'elle comprend :a) une bille de Nylon, sur laquelle est adsorbée une diamine primaire aliphatique mise à réagir avec un réactif bifonctionnel ; b) une protéine de liaison spécifique de la substance à doser et couplée de manière covalente à la surface du Nylon décrite ci-dessus ; c) la substance à doser ou un analogue de la substance à doser marqué par une enzyme ; d) un tampon et un substrat permettant de révéler colorimétriquement l'activité enzymatique liée à la bille ; e) un réactif permettant d'arrêter la réaction enzymatique en maintenant la coloration stable ; f) les solutions d'étalonnage contenant la substance à doser.17. Trousse de dosage suivant la revendication 16, caractérisée en ce que la substance à doser est la thyroxine.<EMI ID=13.1>caractérisée en ce que la substance à doser est le cortisol.
Priority Applications (1)
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| BE6/48209A BE904450A (fr) | 1986-03-20 | 1986-03-20 | Immobilisation covalente sur nylon de substances biologiquement actives et leurs utilisations. |
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| BE904450 | 1986-03-20 |
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| BE904450A true BE904450A (fr) | 1986-07-16 |
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| BE (1) | BE904450A (fr) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0353460A3 (fr) * | 1988-06-28 | 1991-09-04 | Millipore Corporation | Membranes pour séquencer des protéines à la phase solide |
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1986
- 1986-03-20 BE BE6/48209A patent/BE904450A/fr not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0353460A3 (fr) * | 1988-06-28 | 1991-09-04 | Millipore Corporation | Membranes pour séquencer des protéines à la phase solide |
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