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MÉMOIREDESCRIPTIF
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oplost A L'APPUI D'UNE CEM.
CE BREVET D'INVENTION
ANOE FORMÉEPAR GENEX CORPORATION. p o u r procédé pour ntabiliser l'activité enzymatique de la phénylalanine ammonia-lyase pendant la production de la L-phénylalanine.
Les procédés enzymatiques pour la conversion de l' & cide trans-cinnamique en L-phénylalanine au moyen de L-phinylalanine ajmnonia-lyase comprennent generalement les stades (a) de propager en aérobiose un microorganisme producteur de phénylalanine ammonia-lyase (dite ci-après PAL) dans un milie@ nutritif aqueux
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jusqu'a production de quantités'sensibles de PAL, (b) de mettre les cellules du micro-orqanisme produc- tour de PAL cbtenues en (a), soit sous forme de bouillon de culture complet,
soit sous forme de cellules qui en cnt été isolées ou de mettre l'enzyme Isolde en contact avec des ions ammonium et des ions frans- cinnamate et de laisser la réaction progresser dans des conditions impos4es de température et de pH jusqu'à ce que la conversion en L-phénylalanine soit sensiblement. achevée et (c) de séparer et recueillir la Lphenylalanin hors du mélange de reaction.
Le procédé ci-dessus est décrit, par exemple dans le brevet anglais n 1.489.468 (19 octobre 1977).
Un inconvénient de l'application de ce procé@ à la production industrielle est l'instabilité relative du PAL et son innibition par le substrat qui est l'acide trans-cinnamique. Pour favoriser la production de la Lphénylalanine et contrecarrer les effets de l'inhibition par le substrat, le brevet anglais précité décrit un procédé dans lpquel on utilise de grandes masses de cellules contenant du Pat. et une concentration d'ions ammonium en exces.
Yamada, S. et al. (Appl. and Environ.
Microbiol., 42,773-778 (1981)) décrivent la producticn de la phénylalanine à partir de l'acide transcinnamique au moyen de cellules de Rhodotorula glutinis contenant du PAL. Ils ont envisagé que l'absence
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d'application de ce procédé étai attribuable la faible activité et du PAL microbien. Yamada et al. ont observe que la Lisoleucine a un effet stabilisant sur le PAL et auge mente la durée d'activité utile de l'enzyme. Ces auteurs ont observé, en outre, l'effet inhibiteur du substrat en notant qu'aux concentratlons pratiqucs en acide trans-cinnamique (150 mM), la vitesse de conver-
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z sion en L-phénylalanine est redite la moitie r,
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maximum.
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malgré les am61iorations le procédé au.
PAL n'aala de la deresse, pas etapplique indus- àtrielle de la L-phénylalan1ne. L'instabilité et la faible activité de l'enzyme constituent un inconvenient persistant de ce procédé.
La présente invention a pour objet un procédé perfectionné de production de la L-phenylalanine, suivant laquel : (a) on cultive un micro-organisme producteur de PAL dans des conditions d'aérobiose favorisant la croissance ; (b) on amine par induction les cellules obtenues au stade (a) à produire du PAL dans les conditions de la production du PALi (c) on expose les cellules contenant du PAL obtenues au stade (b) à des conditions sensiblement anaérobies statiques pour maintenir 1'activité de PAL ; Cd) on combine le PAL obtenu au stade (b) avec de l'acide trans-cinnamique et des ions ammonium dans des conditions sensiblement anaérobies statiques de production de la L-phénylalanine pour produire de la Lphénylalanine, et (e) on recueille la L-phenylalanin ainsi produite.
La Demanderesse a en effet découvert que l'activiste catalytique de la phénylalanine ammonialyase profite par voie microbienne peut être stabilisée par entretien d'une concentration affaiblie en oxygène dans le milieu de fermentation après la production du PAL.
En application de l'invention, le procédé de production de la L-phénylalanine par reaction de
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l ide trans-cinnamique avec l'ammoniac en présence de. phénylalanine ammonia-lyase a été perfectionné de manière que des rendements plus élevés en Lphénylalanine soient atteints et qu'un haut degré d'activiste catalytique du PAL puisse être maintenu pendant toute la réaction.
Ce perfectionnement consiste à conduire la converslon enzymatique dans des conditions sensiblement anaérobies et statiques. Ces conditions se sont révélees stabiliser sensiblement l'activité de PAL pandant la réaction et augmenter ainsi la vitesse et le rendement de conversion. Les mécanismes exacts de cet effet stabilisant ne sont nas elucides, mais l'hypothèse avancée ast que les effets chimiques de l'oxygène et les effets mécaniques de l'agitation opèrent indépendamment pour détériorer l'activité de l'enzyme. Par consequent, la reduction de ces effets à leur minimum tend à prolonger la vie utile de l'enzyme.
Les conditions anaérobies peuvent être établies par différents moyens, par exemple par barbotage d'un gaz inerte (comme l'azote), par diminution ou suppression de l'agitation et par limitation du volume d'air au-dessus de la surface du milieu contenant les cellules. Deux ou plusieurs de ces techniques peuvent être combinées avec avantage.
Les conditions statiques sont établies par une diminution de l'agitation du melange de conversion jusqu'à une valeur minimale qui est suffisante pour assurer une homogénéité sensible. Une certaine Agitation est généralement souhaitable, en particulier pour des réactions ave des cellules entières, afin d'empê- cher la sédimentation des solides ou des composants de reaction fixes sur des solides.
Les micro-organismes producteurs de PAL utilisés dans le procédé de la présente invention ont
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besoin d'oxygène pour leur croissanct-et, par conséquent, les cellules sont initialement cultivées en conditions d'aérobiose favorisant la croissance. En général, les techniques habituelles sont appliquées à la culture des cellules. Les cellules sont inoculées dans un milieu nutritif contenant des sources assimilables de carbone et d'azote et des vitamines, minéraux et autres facteurs de croissance essentiels. Des source ? appropriées de carbone sont notamment diffe- runts hydrates de carbone raffinés ou bruts, comme le glucose, le saccharose, la melasse, amidons, !es
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cereales, etc. Une source de carbone preferee e glucose.
Des sources d'azote sont notamment les sels inorganiques d'ammonium, comme le phosphate d'ammonium, le sulfate d'ammonium, l'acetate d'ammonium, le citrate d'ammonium, le nitrate d ammonium, etc., et des substance3 organiques azotées comme la farine de soya, les infusions de viande, les aminoacides, la liqueur de maceration de mais, les hydrolysats de protéines, la peptone, les excraits de levure, etc. Une source d'azote préférée pour le procédé de l'invention est l'extrait de levure et cet élément nutritif peut, avec avantage, etre combine avec du phosphate de diammonium qui apporte simultanément de l'azote et du phosphore.
Les vitaminen, minéraux et autres facteurs de croissance peuvent être apportés par les sources de carbone et d'azote (par exemple au moyen de l'extrait de levure) ou être apportés séparément. Ces constituants peuvent varier avec la nature du micro-organisme utilisé en particulier. Normalement, des oligo-elements tels que le zinc, le manganèse, le fer, le cobalt et le calcium peuvent être apportés sous forme de sels inorganiques en quantités favorisant la croissance. Ces minéraux peuvent, par exemple, être apportés dans de l'eau, par exemple de l'eau de distribution ou de l'eau
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de mer, etc. Les milieux nutritifs du type décrit sont classiques et pelvent varier beaucoup en constitution.
Après la multiplication des cellules jusqu'a la densité de callules souhaitée dans des conditions abrobies, elles peuvent être amenees par induction à produire le PAL dans des conditions d'aérobiose pour la production du PAL. L'induction du PAL est généralement
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assurée par addition dz petites quantities d'un compose qui agit comme substrat pour le PAL. La L-phénylalanine est un bon inducteur du PAI, et un certain nombre d'analogues de la phénylalanine induisent aussi la synthèse de cette enzyme. Par exemple, la D phénylalanine, la L-'myrosine et la D, L-tyrosine con-
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viennent & cette fin. De plus, il a été dico,-ivert que différentes sources d'azote brut peuvent être utilisées pour induire le PAL.
De @elles sources d'azote brut sont notamment les proteines hydrolys es qui contiennent des quantités sensibles de N-phénylalanine ou de L-tyrosine. Les hydrolysats de caséine ou de sang peuvent être utilisés avec avantage comme sources d'azote brut pour induire la synthese du PAL.
L'inducteur de PAL est ajouté aux csllules en quantité induisant le PAL, qui a'échelonne généralement
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d'environ 0, par litre de milieu de fermen- tation. De préférence, l'inducteur de PAL est utilise en une eoncentration d'environ 4 à 8 g par litre du milieu de fermentation. Pendant cette Operation, les conditions de température et de pH, l'aération et l'agitation induisant le PAL sont entretenues. La température et le pH sont généralement maintenus entre les limites physiologiquement compatibles pendant l'induction du PAL.
Des températures quelque peu réduites, par exemple d'environ 15*C a environ 25 C, sont préférées parce qu'à ces températures plus barses, la stabilité de l'enzyme est neilleure et que la
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vitesse de consommation de l'inducteur de PAL est diminuée. Un pH préféré pour l'induction du PAL s'eche- lonne d'environ 5, 5 a environ 7,5, où des concentrations relativement élevées an PAL sont atteintes.
Si les cellules utilisées sont sensibles à la répression catabolique de la symthèse du PAL, il faut utiliser, avant l'induction, des moyens pour raréfier ou supprimeer les catabolites ou leurs precurseurs hors du milieu. Cela peut être ré par Separation des cellules hors du milieu. par lavage des cellules et par
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mise en Suspension des cellules dans du milieu exempt de catabolites. En variante, les cellules peuvent Atre laissées en croisspce que les nutritifs soient sensiblement puises duction du PAL soit commencée.
Les cellules sont cultivées avec avantage dans les conditions d'induction du PAL jusqu'à ce que l'activité du PAL atteigne au moins environ 0, 5 et de préférence au moins environ 2 unites par ml. Une unité d'activite de PAL est définie comme étant la quantité d'enzyme qui catalyse la formation de 0, 33 micromole d'acide trans-cinnamique par minute à 220C ou 1 micromole par minut3 à 30 C. Il a été observé que dans ces conditions, l'activité de PAL augmente jusqu'à un certain point, puis commence à diminuer. Le PAL obtenu par ces procédés peut etre utilisé pour produire de la L-phénylalanine a partir de l'acide trans-cinnamique et d'ammoniac.
Ces reactants peuvent être ajoutés directement aux cellules contenant du PAL dans un milieu aqueux ou bien les cellules ou l'enzyme isolée de celles-ci peuvent être immobilisées suivant des techniques connues sur un support solide qui peut être réutilisé aussi longtemps que l'activité enzymatique persi & te.
La L-phénylalanine est produite suivant ce
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procédé dans les conditions de production de la L- phénylalanine. Ces conditions varient avec la nature de la souche microbienne utilisée en particulier, le fait que l'on utilise des cellules entières ou des preparations enzymatiques exemptes de cellules, le fait que. l'on utilise des cellules entières ou des préparations enzymatiques exemptes de cellules et le fait que l'on utilise ou non des systèmes immobilisés, En general, l'acide trans-cinnamique et l'ammoniaque aqueuse (ou un sel d'ammonium soluble) sont apportés en quantités telles que l'ammoniaque se trouve sensiblement en excès sur l'acide trans-cinnamique, sur base molaire.
L'acide trans-cinnamique est utilisé en quantités d'environ 5 à environ 25 et de préférence d'environ 10 à 20 g par litre de melange de réaction. Aces concentrations en acide trans-cinnamique, la concentration en ammoniaque s'échelonne généralement d'environ 0, 1 a environ 9, 0 et de preference 5, 0 a environ 6, 0 mcl s par l . e. La reaction de l'acide trans-cinnamjoue sur l . ammoniac catalysé par le PAL produisant la L-phénylalanine est
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réversible et, en fait, l'équilibre r 4 favorise la d6corn- favorise la décom-position de la L-phénylalanine.
Par consequent, pour arriver à une vitesse de réaction favorable, la concentration en acide trans-cinnamique dans le melange de reaction est avantageusement maintenue à une valeur relativement élevée. D'autre part, des concentrations trop élevées en acide trans-cinnamique peuvent inhiber 1'ac. ti vi té de PAL. Dès lors, un procédé préféré conforme a l'invention consiste admettre de façon périodique ou continue de l'acide trans-cinnamique dans le melange de réaction tout au long de la réaction sauf au der@ier stade de celle-ci afin d'entretenir la concentration en ce réactant dans les intervalles indiqués ci-dessus.
La température pendant la pio- duction de la L-phénylalanine est généralement main-
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tenue entre les limites physiologiquement acceptables.
La temperature s'échelonne de preference d'envir. 2n 10 ci environ 30 C et de preference d'environ 14 à environ 24éC. Ces températures de reaction inférieures se sont révélées prolonger l'activité enzymatique sans effet défavorable sur 1 vitesse de reaction. Les conditions de production de la L-phénylalanine comprennent aussi un pH du domaine alcalin, qui est généralement d'environ 9 à environ 11 et de préférence environ 10, 4 a environ 10, 8.
Les sels d'ammonium prefers sont ceux qui ne contiennent pas d'ions halogénure. La présence d'halo- gènes dans la solution de substrat s'est révélée inhiber 1'activité catalytique de PAL. Par consequent, les sels d'ammonium préférés sont le carbonate d'ammonium, le sulfate d'ammonium, le nitrate d'ammonium, le cit. rate d'ammonium, l'acetate d'ammonium et @e phos- phate d'ammonium. Un sel d'ammonium spécialement préféré est le carbonate d'ammonium. Un technique avantageuse pour préparer la solution de substrat consiste à dissoudre l'acide trans-cinnamique dans une solution aqueuse d'ammoniaque, puis à ajuster le pH de la solution à la valeur souhaitée par barbotage de dioxyde de carbone ou par addition d'un acide mineral tel que l'acide sulfurique.
La conversion enzymatique de l'acide transcinnamique et de l'ammoniaque en L-phénylalanine est de
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preference exécutée dans un biréacteur. Ce mode re p opératoire consiste avantageusement à séparer les cellules de leur milieu de fermentation par filtr@tion ou centrifugation et à les mettre en juspension dans la solution de substrat contenant l'acide trans-cinnamique et les ions ammonium. Cette solution est débarrassée de l'oxygène dissous par barbotage d'un gaz inerte tel que l'azote et est maintenue dans une condition sensible-
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mentstatique.
Comme indiqu4 précédemment, la phénylalanine ammonia-lyase s'est révélée fort sensible a la dégradation en prsence d'oxygène et sous l'influence de l'agitation. Alors que l'agitation dans les réacteurs classiques (par exemple les fermenteurs à cuve pro-
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fonde) est executee avec une puissance d'environ 0, 5 watts pa litre, la puissance pour l'agitation dans les melanges de reaction conformes à l'invention s'etablit en moyenne avec avantage tout au long de la réaction au-dessous d'environ 500 et de preference audessous d'environ 100 milliwatts par litre.
Des puissances plus élevées. par exemple jusqu'à environ 5 watts par litre, peuvent convenir, mais dans de tels cas, l'agitation est intermittente, par exemple 30 secondes d'agitation à irtervalles de 2 heures.
La nature de l'agitation influence aussi la stabilité de l'enzyme. Une agitation ä faible cisaillement est préférée. Ce type d'agitation peut être assure avantageusement par barbotage périodique d'un gaz inerte tel que l'azote dans le mélange de réaction, De plus, les agitateurs mécaniques conçus pour un melange à faible cisaillement peuvent etre utilises. En général, l'agitation est juste suffisante pour entretenir le mélange à l'état sensiblement homogene pendant la ré@@tion.
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La bioréaction est poursuvie jusqu'a accumulation de quantités dans sensibles de L-phénylalaninele melange de reaction. En général, l'isolement du produit est commencé lorsque la concentration en Lphénylalanine atteint environ 30 et de préférence d'environ 45 a 50 g par litre. La 1,-phanylalanine peut être isolée du mélange de réaction de toute manière appropriée. Par exemple, les solides peuvent être séparés par filtration ou @ntrifugation pour donner
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une solution clarifie dor t la L-phénylalanine peut être précipité par ajustement du H au point isoelectrique de la L-phénylalanine, a savoir environ 5, 5.
Les exemples ci-après illustrent davantage l'invention sans la limiter et font ressortir les effets avantageux de l'entretien de conditions de reaction anaérobies et de la diminution de l'agitation sur la stabilité et la @ie utile de la phénylalanine a..monia-lyase.
EXEMPLE 1. -
Pour determiner l'effet du pH sur la production de la L-phenylalanine, on utilise, pour des reactions à l'échelle du laboratoire de l'acide transcinnamique avec l'ammoniac, des cellules de Rhodotorula rubra titrant 51 unités d'activité de PAL par g de cellules en poids sec (cps). On exécute les expériences
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a 4 9 par litre de cps'a en 15 g par litre de cinnamate et lOO g par litre de sulfate d'ammonium et a un pH de 9, 4 à 10, 6 ajusté au moyen d'hydroxyde d'ammonium. Les résultats de J'expé- rience rassemblés au tableau I prouvent que la vitesse
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de conversion eat maximale à pH 10, constate aussi qu'à des pH de 10, et davantage, les activités de PAL commencent à diminuer.
EXEMPLE 2.-
6. OnOn determine les effets d l'agitation et de l'apport d'air (apport d'oxygène) sur l'activité du PAL au cours de reactions compares produisam : de la L-
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phenyl'seine a 2 et à 4 g par litre de cps a 2S. et à pH 10, 3 ou 9, 4. Les résultats des expériences sont rassembles au tableau II. L'efficacite du catalyseur est plus grande dans un réacteur non agité d'où l'oxygene est éliminé par remplissage complet du réacteur ou bien par purge au moyen d'azote cu barbotage d'azote en vue de l'entretien d'une atmosphère inerte dans le
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réacteur.
EXEMPLE 3.-
On exécute la production de la L-ph nylalanine à partir d'acide trans-cinnamique et d'ammoniac dans un bioréacteur en utilisant des cellules entières de Rhodotorula rubra ayant une haute activité d P . On ajoute à 390 litres d'eau, 11,2 kg d'acide transcinnamique, puis 470 litres d'ammoniaque aqueuse a 29%.
Après la dissolution de l'acide cinnamique, on ajuste le pH de la solution a 10, 6 par addition de 31 kg de dioxyde de carbone. On désaère la solution par barbotage d'azote pendant 5 minutes. on ajoute 5, 06 kg (en poids sec) de cellules de Rhodotorula rubra à la solution du substrat et on laisse la réaction se poursuivre pendant'130 heures. On ajoute periodiqu ment des suppléments de'substrat dans le bioréacteur sous la forme d'une solution concentrée de cinnamate d'ammonium. Après chaque addition, on melange brie ement le contenu du bioréacteur par barbotage d'azote. On maintient la température dans le bioréacteur à 290C pendant les premières 17 heures de reaction, puis jn la fait baisser graduellement jusqu'à 13 /c à 130 heures.
Après 130 heures d'incubation, la solution de nubstrat contient 42, 7 9 par litre de L-phénylalanine et 6, 4 g par litre d'acide trans-cinnamique.
On sépare les cellules de la solution de substrat au moyen d'une centrifugeuse à bol et disque. On filtre le liquide surnageant centrifugé et on en chasse l'ammoniac et le carbonate d'ammonium par evaporation. Les cristaux de L-phénylalanine précipitent lors du refroidissement. On recueille les cristaux de L-phénylalanine dans une centrifugeuse à panier, on les rince à l'eau froide et on les sèche.
On collecte ainsi 22 kg de L-phénylalanine.
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TABLEAUI
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<tb>
<tb> Exp. <SEP> cps <SEP> Temp. <SEP> pH <SEP> Phénylalanine
<tb> (g/l) <SEP> C <SEP> (après <SEP> 1 <SEP> h <SEP> de
<tb> réaction)
<tb> mole/min/g <SEP> cps
<tb> 1 <SEP>
<tb> 2 <SEP>
<tb> 3 <SEP>
<tb> 4 <SEP>
<tb> 5 <SEP>
<tb>
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TABLEAU II
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<tb>
<tb> 4 <SEP> 25 <SEP> Exp.
<SEP> cps <SEP> Agita- <SEP> Atmos- <SEP> L-Phe <SEP> Produite <SEP> (g/l)
<tb> (g/l) <SEP> tion <SEP> phère
<tb> (+ <SEP> ou <SEP> -) <SEP> Air/N2 <SEP> 2 <SEP> h <SEP> 8 <SEP> h <SEP> 24h <SEP> 42 <SEP> h
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> + <SEP> Air <SEP> 0,41 <SEP> 1,0 <SEP> 1,9 <SEP> 1,8
<tb> 2 <SEP> 2 <SEP> + <SEP> * <SEP> 0,40 <SEP> 1,3 <SEP> 2,9 <SEP> 3,1
<tb> 3 <SEP> 2 <SEP> + <SEP> N2 <SEP> 0,41 <SEP> 1,3 <SEP> 2,2 <SEP> 2,2
<tb> 4 <SEP> 2 <SEP> - <SEP> Air <SEP> 0,47 <SEP> 1,2 <SEP> 3,2 <SEP> 5,1
<tb> 5 <SEP> 2 <SEP> - <SEP> * <SEP> 0,47 <SEP> 1,3 <SEP> 3,4 <SEP> 5,8
<tb> 6 <SEP> 2 <SEP> - <SEP> N2 <SEP> 0,50 <SEP> 1,3 <SEP> 3,4 <SEP> 5,6
<tb> 7 <SEP> 4 <SEP> - <SEP> Air <SEP> 0,64 <SEP> 2,0 <SEP> 5,1 <SEP> 7,2
<tb> 8** <SEP> 4 <SEP> - <SEP> Air <SEP> 0,29 <SEP> 1,0 <SEP> 3,3 <SEP> 5,0
<tb> 9** <SEP> 2 <SEP> - <SEP> air <SEP> 0,15 <SEP> 0,53 <SEP> 1,7 <SEP> 2,
2
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-"'acteur **-pH
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DESCRIPTION MEMORY
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oplost IN SUPPORT OF EMC.
THIS PATENT OF INVENTION
ANOE FORMÉEPAR GENEX CORPORATION. for a method for stabilizing the enzymatic activity of phenylalanine ammonia-lyase during the production of L-phenylalanine.
The enzymatic processes for the conversion of trans-cinnamic acid to L-phenylalanine by means of L-phinylalanine ajmnonia-lyase generally comprise the stages (a) of propagating aerobically a microorganism producing phenylalanine ammonia-lyase (hereinafter after PAL) in an aqueous nutritious medium
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until the production of sensitive quantities of PAL, (b) putting the cells of the micro-organism producing PAL cbtenues in (a), either in the form of a complete culture broth,
either in the form of cells which have been isolated therefrom or of bringing the Isolde enzyme into contact with ammonium ions and frans-cinnamate ions and allowing the reaction to progress under imposed conditions of temperature and pH until the conversion to L-phenylalanine is substantially. completed and (c) separate and collect the Lphenylalanin out of the reaction mixture.
The above process is described, for example in English Patent No. 1,489,468 (October 19, 1977).
A disadvantage of the application of this process to industrial production is the relative instability of PAL and its innibition by the substrate which is trans-cinnamic acid. To promote the production of Lphenylalanine and counteract the effects of inhibition by the substrate, the abovementioned English patent describes a process in which large masses of cells containing Pat are used. and a concentration of excess ammonium ions.
Yamada, S. et al. (Appl. And Environ.
Microbiol., 42,773-778 (1981)) describe the production of phenylalanine from transcinnamic acid using Rhodotorula glutinis cells containing PAL. They envisioned that the absence
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application of this process was due to the low activity and microbial PAL. Yamada et al. observed that Lisoleucine has a stabilizing effect on PAL and increases the useful life of the enzyme. These authors observed, in addition, the inhibitory effect of the substrate, noting that at the concentrations concentrated in trans-cinnamic acid (150 mM), the rate of conversion
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z sion in L-phenylalanine is repeated half r,
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maximum.
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despite the improvements the process.
PAL does not have a pregnancy, and does not apply industrial L-phenylalanine. Instability and low activity of the enzyme is a persistent drawback of this process.
The present invention relates to an improved process for the production of L-phenylalanine, according to which: (a) a PAL-producing microorganism is cultivated under aerobic conditions promoting growth; (b) the cells obtained in stage (a) are induced by induction to produce PAL under the conditions for the production of PALi (c) the cells containing PAL obtained in stage (b) are exposed to substantially anaerobic static conditions for maintain PAL activity; Cd) the PAL obtained in stage (b) is combined with trans-cinnamic acid and ammonium ions under substantially anaerobic static conditions for the production of L-phenylalanine to produce Lphenylalanine, and (e) the L-phenylalanin thus produced.
The Applicant has in fact discovered that the catalytic activator of phenylalanine ammonialyase benefits microbially can be stabilized by maintenance of a weakened concentration of oxygen in the fermentation medium after the production of PAL.
In application of the invention, the process for the production of L-phenylalanine by reaction of
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the trans-cinnamic idea with ammonia in the presence of. phenylalanine ammonia lyase has been improved so that higher yields of phenylalanine are achieved and a high level of PAL catalytic activator can be maintained throughout the reaction.
This improvement consists in carrying out the enzymatic converslon under substantially anaerobic and static conditions. These conditions have been found to substantially stabilize PAL activity during the reaction and thereby increase the rate and efficiency of conversion. The exact mechanisms of this stabilizing effect are not elucidating, but the hypothesis put forward is that the chemical effects of oxygen and the mechanical effects of agitation operate independently to deteriorate the activity of the enzyme. Therefore, minimizing these effects tends to prolong the useful life of the enzyme.
Anaerobic conditions can be established by various means, for example by bubbling an inert gas (such as nitrogen), by reducing or eliminating agitation and by limiting the volume of air above the surface of the medium. containing cells. Two or more of these techniques can be combined with advantage.
The static conditions are established by reducing the agitation of the conversion mixture to a minimum value which is sufficient to ensure substantial homogeneity. Some agitation is generally desirable, particularly for reactions with whole cells, in order to prevent sedimentation of solids or fixed reaction components on solids.
The PAL-producing microorganisms used in the process of the present invention have
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need oxygen for their growth - and, consequently, the cells are initially cultivated in aerobic conditions promoting growth. In general, the usual techniques are applied to cell culture. The cells are inoculated into a nutritious medium containing assimilable sources of carbon and nitrogen and vitamins, minerals and other essential growth factors. Sources? Appropriate carbohydrates are notably different refined or crude carbohydrates, such as glucose, sucrose, molasses, starches,! es
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cereals, etc. A preferred carbon source for glucose.
Sources of nitrogen include inorganic ammonium salts, such as ammonium phosphate, ammonium sulfate, ammonium acetate, ammonium citrate, ammonium nitrate, etc., and organic nitrogenous substances3 such as soy flour, infusions of meat, amino acids, corn maceration liquor, protein hydrolysates, peptone, yeast extracts, etc. A preferred source of nitrogen for the process of the invention is yeast extract and this nutrient can, with advantage, be combined with diammonium phosphate which simultaneously supplies nitrogen and phosphorus.
Vitamins, minerals and other growth factors can be supplied by carbon and nitrogen sources (for example by means of yeast extract) or can be supplied separately. These constituents may vary with the nature of the microorganism used in particular. Normally, trace elements such as zinc, manganese, iron, cobalt and calcium can be provided in the form of inorganic salts in amounts that promote growth. These minerals can, for example, be supplied in water, for example tap water or water.
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sea, etc. Nutrient media of the type described are conventional and can vary greatly in constitution.
After the cells have multiplied to the desired density of callulas under abobed conditions, they can be induced by induction to produce PAL under aerobic conditions for the production of PAL. PAL induction is generally
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ensured by adding small quantities of a compound which acts as a substrate for the PAL. L-phenylalanine is a good inducer of PAI, and a number of phenylalanine analogs also induce the synthesis of this enzyme. For example, D phenylalanine, L-'myrosine and D, L-tyrosine con-
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come to this end. In addition, it has been recognized that different sources of raw nitrogen can be used to induce PAL.
Such sources of crude nitrogen include hydrolyzed proteins which contain substantial amounts of N-phenylalanine or L-tyrosine. Casein or blood hydrolysates can be used with advantage as sources of crude nitrogen to induce the synthesis of PAL.
The PAL inducer is added to the capsules in a PAL-inducing amount, which generally ranges
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about 0, per liter of fermentation medium. Preferably, the PAL inducer is used in a concentration of about 4 to 8 g per liter of the fermentation medium. During this Operation, the temperature and pH conditions, the aeration and the agitation inducing the PAL are maintained. Temperature and pH are generally maintained within physiologically compatible limits during induction of PAL.
Slightly reduced temperatures, for example from about 15 ° C to about 25 C, are preferred because at these lower temperatures the stability of the enzyme is better and the
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consumption speed of the PAL inductor is decreased. A preferred pH for the induction of PAL ranges from about 5.5 to about 7.5, where relatively high concentrations of PAL are reached.
If the cells used are sensitive to the catabolic repression of the PAL symthesis, it is necessary to use, before induction, means to rarefy or suppress catabolites or their precursors outside the medium. This can be done by separating the cells from the middle. by cell washing and by
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Suspending cells in medium free of catabolites. Alternatively, the cells can be left to grow until the nutrients are substantially drawn once PAL has started.
The cells are cultured advantageously under the PAL induction conditions until the activity of PAL reaches at least about 0.5 and preferably at least about 2 units per ml. One unit of activity of PAL is defined as the amount of enzyme which catalyzes the formation of 0.33 micromole of trans-cinnamic acid per minute at 220C or 1 micromole per minute3 at 30 C. It has been observed that in these conditions, PAL activity increases to a certain extent, then begins to decrease. The PAL obtained by these processes can be used to produce L-phenylalanine from trans-cinnamic acid and ammonia.
These reactants can be added directly to cells containing PAL in an aqueous medium or the cells or the enzyme isolated from these can be immobilized according to known techniques on a solid support which can be reused as long as the enzymatic activity persi & te.
L-phenylalanine is produced according to this
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process under the conditions of production of L-phenylalanine. These conditions vary with the nature of the microbial strain used in particular, the fact that whole cells or cell-free enzyme preparations are used, the fact that. whole cells or cell-free enzyme preparations are used and whether or not immobilized systems are used, In general, trans-cinnamic acid and aqueous ammonia (or a soluble ammonium salt ) are supplied in quantities such that the ammonia is found to be appreciably in excess on trans-cinnamic acid, on a molar basis.
Trans-cinnamic acid is used in amounts of from about 5 to about 25 and preferably from about 10 to 20 g per liter of reaction mixture. At these trans-cinnamic acid concentrations, the ammonia concentration generally ranges from about 0.1 to about 9.0 and preferably 5.0 to about 6.0 mcl s per l. e. The reaction of trans-cinnamic acid plays on l. PAL-catalyzed ammonia producing L-phenylalanine is
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reversible and, in fact, the balance r 4 promotes d6corn- promotes the decomposition of L-phenylalanine.
Therefore, to achieve a favorable reaction rate, the concentration of trans-cinnamic acid in the reaction mixture is advantageously kept at a relatively high value. On the other hand, too high concentrations of trans-cinnamic acid can inhibit ac. ti vi ty of PAL. Therefore, a preferred process according to the invention consists in admitting periodically or continuously trans-cinnamic acid into the reaction mixture throughout the reaction except at the last stage of the latter in order to maintain the concentration of this reactant in the ranges indicated above.
The temperature during the production of L-phenylalanine is generally
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held within physiologically acceptable limits.
The temperature preferably ranges from around. 2n 10 ci about 30 C and preferably about 14 to about 24éC. These lower reaction temperatures have been shown to prolong the enzymatic activity without an adverse effect on the reaction rate. The conditions for producing L-phenylalanine also include an alkaline domain pH, which is generally from about 9 to about 11 and preferably about 10.4 to about 10.8.
Preferred ammonium salts are those which do not contain halide ions. The presence of halogens in the substrate solution has been found to inhibit the catalytic activity of PAL. Therefore, the preferred ammonium salts are ammonium carbonate, ammonium sulfate, ammonium nitrate, cit. ammonium spleen, ammonium acetate and ammonium phosphate. An especially preferred ammonium salt is ammonium carbonate. An advantageous technique for preparing the substrate solution is to dissolve the trans-cinnamic acid in an aqueous ammonia solution, then to adjust the pH of the solution to the desired value by bubbling carbon dioxide or by adding a mineral acid such as sulfuric acid.
The enzymatic conversion of transcinnamic acid and ammonia to L-phenylalanine is
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preferably performed in a twin-engine. This operating mode advantageously consists in separating the cells from their fermentation medium by filtration or centrifugation and putting them in suspension in the substrate solution containing trans-cinnamic acid and ammonium ions. This solution is freed from dissolved oxygen by bubbling an inert gas such as nitrogen and is maintained in a sensitive condition.
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mentstatic.
As indicated above, phenylalanine ammonia-lyase has proved to be very sensitive to degradation in the presence of oxygen and under the influence of agitation. While agitation in conventional reactors (e.g. tank fermenters
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) is run with a power of about 0.5 watts per liter, the power for stirring in the reaction mixtures according to the invention is established on average with advantage throughout the reaction below d 'around 500 and preferably below about 100 milliwatts per liter.
Higher powers. for example up to about 5 watts per liter may be suitable, but in such cases the stirring is intermittent, for example 30 seconds of stirring in 2 hour intervals.
The nature of the agitation also influences the stability of the enzyme. Low shear agitation is preferred. This type of agitation can advantageously be ensured by periodic bubbling of an inert gas such as nitrogen in the reaction mixture. In addition, mechanical agitators designed for a mixture with low shear can be used. In general, the agitation is just sufficient to maintain the mixture in a substantially homogeneous state during the reaction.
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The bioreaction is continued until significant amounts have accumulated in the L-phenylalanine reaction mixture. In general, the isolation of the product is started when the concentration of Lphenylalanine reaches about 30 and preferably about 45 to 50 g per liter. 1, -phanylalanine can be isolated from the reaction mixture in any suitable way. For example, the solids can be separated by filtration or @ntrifugation to give
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a solution clarifies now that L-phenylalanine can be precipitated by adjusting the H at the isoelectric point of L-phenylalanine, namely approximately 5.5.
The following examples further illustrate the invention without limiting it and highlight the advantageous effects of maintaining anaerobic reaction conditions and the reduction of agitation on the stability and useful life of phenylalanine a .. monia-lyase.
EXAMPLE 1. -
To determine the effect of pH on the production of L-phenylalanine, for laboratory-scale reactions of transcinnamic acid with ammonia, Rhodotorula rubra cells with 51 units of activity are used. PAL per g of cells by dry weight (cps). We run the experiments
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at 4 9 per liter of cps'a in 15 g per liter of cinnamate and 100 g per liter of ammonium sulphate and at a pH of 9.4 to 10.6 adjusted by means of ammonium hydroxide. The results of the experiment collated in Table I prove that the speed
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conversion is maximum at pH 10, also notes that at pH 10 and above, PAL activities begin to decrease.
EXAMPLE 2.-
6. We determine the effects of agitation and the supply of air (oxygen supply) on the activity of PAL during comparative reactions produisam: L-
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phenyl'seine has 2 and 4 g per liter of cps at 2S. and at pH 10, 3 or 9, 4. The results of the experiments are collated in Table II. The efficiency of the catalyst is greater in an unstirred reactor from which oxygen is eliminated by complete filling of the reactor or else by purging with nitrogen or bubbling nitrogen for the maintenance of an atmosphere. inert in the
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reactor.
EXAMPLE 3.-
The production of L-ph nylalanine from trans-cinnamic acid and ammonia is carried out in a bioreactor using whole Rhodotorula rubra cells having a high P activity. 11.2 kg of transcinnamic acid are added to 390 liters of water, then 470 liters of 29% aqueous ammonia.
After the cinnamic acid has dissolved, the pH of the solution is adjusted to 10.6 by the addition of 31 kg of carbon dioxide. The solution is deaerated by bubbling nitrogen through for 5 minutes. 5.06 kg (dry weight) of Rhodotorula rubra cells are added to the substrate solution and the reaction is allowed to continue for 130 hours. Substrate supplements are added periodically to the bioreactor as a concentrated solution of ammonium cinnamate. After each addition, the contents of the bioreactor are mixed briefly by bubbling nitrogen through. The temperature in the bioreactor is maintained at 290 ° C. for the first 17 hours of reaction, then it is gradually lowered to 13 ° C. at 130 hours.
After 130 hours of incubation, the nubstrate solution contains 42.79 per liter of L-phenylalanine and 6.4 g per liter of trans-cinnamic acid.
The cells are separated from the substrate solution by means of a disc and bowl centrifuge. The centrifuged supernatant is filtered and the ammonia and ammonium carbonate are removed by evaporation. L-phenylalanine crystals precipitate upon cooling. The L-phenylalanine crystals are collected in a basket centrifuge, rinsed with cold water and dried.
22 kg of L-phenylalanine are thus collected.
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TABLEAUI
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<tb>
<tb> Exp. <SEP> cps <SEP> Temp. <SEP> pH <SEP> Phenylalanine
<tb> (g / l) <SEP> C <SEP> (after <SEP> 1 <SEP> h <SEP> from
<tb> reaction)
<tb> mole / min / g <SEP> cps
<tb> 1 <SEP>
<tb> 2 <SEP>
<tb> 3 <SEP>
<tb> 4 <SEP>
<tb> 5 <SEP>
<tb>
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TABLE II
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<tb>
<tb> 4 <SEP> 25 <SEP> Exp.
<SEP> cps <SEP> Agita- <SEP> Atmos- <SEP> L-Phe <SEP> Produced <SEP> (g / l)
<tb> (g / l) <SEP> tion <SEP> sphere
<tb> (+ <SEP> or <SEP> -) <SEP> Air / N2 <SEP> 2 <SEP> h <SEP> 8 <SEP> h <SEP> 24h <SEP> 42 <SEP> h
<tb> 1 <SEP> 2 <SEP> + <SEP> Air <SEP> 0.41 <SEP> 1.0 <SEP> 1.9 <SEP> 1.8
<tb> 2 <SEP> 2 <SEP> + <SEP> * <SEP> 0.40 <SEP> 1.3 <SEP> 2.9 <SEP> 3.1
<tb> 3 <SEP> 2 <SEP> + <SEP> N2 <SEP> 0.41 <SEP> 1.3 <SEP> 2.2 <SEP> 2.2
<tb> 4 <SEP> 2 <SEP> - <SEP> Air <SEP> 0.47 <SEP> 1.2 <SEP> 3.2 <SEP> 5.1
<tb> 5 <SEP> 2 <SEP> - <SEP> * <SEP> 0.47 <SEP> 1.3 <SEP> 3.4 <SEP> 5.8
<tb> 6 <SEP> 2 <SEP> - <SEP> N2 <SEP> 0.50 <SEP> 1.3 <SEP> 3.4 <SEP> 5.6
<tb> 7 <SEP> 4 <SEP> - <SEP> Air <SEP> 0.64 <SEP> 2.0 <SEP> 5.1 <SEP> 7.2
<tb> 8 ** <SEP> 4 <SEP> - <SEP> Air <SEP> 0.29 <SEP> 1.0 <SEP> 3.3 <SEP> 5.0
<tb> 9 ** <SEP> 2 <SEP> - <SEP> air <SEP> 0.15 <SEP> 0.53 <SEP> 1.7 <SEP> 2,
2
<tb>
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- "'actor ** - pH