"Procédé de préparation de produits de conjugaison d'enzyme et d'hormone, produits ainsi obtenus, et leur utilisation" "Procédé de préparation de produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone, produits ainsi obtenus, et leur utilisation"
La présente invention est relative à des produits de conjugaison d'enzyme et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène,
à leur préparation et à leur utilisation pour la détection et l'estimation d'hormones à base de protéine
ou de polypeptide ou d'anticorps ou d'antigènes et
pour la détection et le diagnostic de maladies ou d'états médicaux, y compris la détection précoce de la grossesse chez l'être humain.
Une préparation et des utilisations de produits de conjugaison d'enzyme et de protéine ont été décrites par Avrameas et Uriel en 1966 (Avrameas S . et Uriel S., C.R. Acad. Sci. Ser. D. 262,2543, 1966). Plusieurs rapports sont apparus dans la littérature en décrivant des techniques qui font usage d'anticorps et d'antigènes conjugués à une enzyme pour une analyse bio-
<EMI ID=1.1>
Immunochemistry 8:871, 1971) ont utilisé des anticorps liés à une enzyme pour une estimation d'immunoglobuline. Depuis lors, des examens immunologiques avec liaison à une enzyme ont été décrits pour la gonadotrophine chorionique humaine, l'insuline (Ishikawa E.J., Biochemistry 73:1319, 1973), le lactogène placentaire humain (Serbour H.M.J., Immunol . Methods 11:15, 1976), des oestrogènes (Van Weeman B. et Schuurs A., Immunochemistry 12:667, 1975), la thyroxine (Ullmann E., Blakemore J., Lente R., Clinical Chemistry 21:1011, 1975) et d'autres constituants hormonaux. Les enzy�mes utilisées dans les cas précités sont la phosphase alcaline, la peroxydase, le lysozyme, la bétagalactosidase ou la glucoamylase.
Un objet de la présente invention consiste
en de nouveaux produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène.
Un autre objet de l'invention consiste à prévoir un procédé de préparation de produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène.
Encore un autre objet de la présente invention consiste en l'utilisation de produits de conjugaison
de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène pour la détection et l'estimation d'hormones à base de protéine ou de polypeptide ou d'anticorps ou d'antigènes ou pour la détection et le diagnostic de maladies ou d'états médicaux, y compris une détection précoce de la grossesse chez l'être humain.
Suivant la présente invention, on prévoit de nouveaux produits de conjugaison de pénicillinase et de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène.
Suivant la présente invention on prévoit aussi un procédé de préparation de nouveaux produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène, ce procédé consistant à conjuguer une hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène avec de la pénicillinase par réaction de cette hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène et de la pénicillinase en présence d'un réactif bifonctionnel, tel que de l'aldéhyde glutarique, et par séparation et purification des produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène à partir du mélange réactionnel.
Suivant la présente invention, il est également prévu l'utilisation de nouveaux produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène pour la détection et l'estimation d'hormones à base de protéine ou de polypeptide ou d'anticorps ou d'antigènes ou pour la détection et le diagnostic de maladies, ou d'états médicaux^ compris la détection de la grossesse chez l'être humain.
L'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène est par exemple la choriogonadotrophine humaine (hCG) ou le lactogène placentaire humain (hPL).
Suivant la présente invention, il est également prévu un procédé de détection de la grossesse chez l'être humain ou d'une tumeur trophoblastique, du carcinome du chorion ou de maladies épidémiologiques, par l'utilisation d'un nouveau produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'anticorps ou d'antigène, ce procédé consistant en l'enduction d'une surface par un anticorps de hCG, en la réaction d'un échantillon d'urine d'essai contenant de la hCG avec la surface en présence de l'anticorps et du produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG et d'un tampon ou d'un mélange de tampons,tels que Tris ou du citrate-phosphate, à
des températures de l'ordre de 4 à 40[deg.]C, pendant des périodes de 1 à 4 heures, et en l'analyse de cette surface en ce qui concerne l'activité de la pénicillinase. La surface susdite peut être faite à partir de matières, telles que des polymères, comme des polymères thermoplastiques synthétiques, tels que du polychlorure de vinyle, du polystyrène ou du Nylon, de la cellulose, du "Sephadex" (gel de polysaccharide) ou de l'"Agarose"
(gel de polysaccharide ).
Suivant une forme de réalisation de l'invention, ce procédé comprend une réaction d'un échantillon d'urine témoin, qui ne contient pas de hCG ou d'antigène, avec la surface susdite, en présence de l'anticorps et du produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG
et d'un tampon ou mélange de tampons, tels que Tris ou du citrate-phosphate, la réaction de cet échantillon témoin étant effectuée simultanément avec ladite réaction de l'échantillon d'urine d'essai.
Suivant une forme de réalisation de l'invention, ladite surface est revêtue par ledit anticorps
de hCG par incubation de cette surface dans l'anticorps de hCG dans un tampon ou mélange de tampons, tels que Tris ou du citrate-phosphate, à des températures de l'ordre de 4 à 37[deg.]C, pendant des périodes de 3 à 34 heures.
Suivant une forme de réalisation de l'invention, ladite surface est, après incubation avec un échantillon d'urine et un produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG, analysée en ce qui concerne l'activité de la pénicillinase par un réactif à base d'amidoniode-pénicilline destiné à une évaluation qualitative et par l'utilisation d'un colorimètre pour l'évaluation quantitative.
Les avantages de l'utilisation de pénicillinase pour la préparation des nouveaux produits de conjugaison d'enzyme et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène sont : �a) la pénicillinase est stable à la température ambiante, (b) l'activité de la pénicillinase est élevée, (c) le substrat de pénicilline V et d'autres réactifs, à savoir l'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène utilisée pour le produit de conjugaison de pénicillinase, n'est pas cancérigène, il est stable à
la température ambiante et il est relativement peu coûteux, (d) la détection d'hormone à base de protéine ou de polypeptide ou d'anticorps ou d'antigène par l'utilisation de pénicillinase reliée à une hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène peut être réalisée à l'oeil nu, tandis que l'estimation nécessite un équipement simple tel qu'un colorimètre.
L'invention est décrite d'une manière plus détaillée à l'aide des Exemples ci-après, sans être
pour autant limitée par ces derniers.
Exemple 1
Préparation de produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'antigène.
De la hCG d'antigène (2000 i.u. (unités immunisantes)) est placée dans un récipient en verre contenant 2,5 ml d'une solution de pénicillinase préparée par dissolution de 100.000 i.u. de poudre de pénicillinase présentant une activité spécifique de 40.000 u./mg de poudre de pénicillinase dans un tampon de phosphatée,! M
(pH de 6,5 à 7,5), obtenu par mélange de phosphate disodique et de phosphate monosodique à un pH de 7,0 à 7,5.
A la solution ci-dessus, on ajoute de l'aldéhyde glutarique à une concentration finale de 0,5 %. On mélange la solution contenue dans le récipient en verre et on l'abandonne pendant 12 heures à 35[deg.]C. Le mélange réactionnel, qui contient de la pénicillinaseet de la hCG d'antigène
qui n'ont pas réagi, de l'aldéhyde glutarique et un produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'anticorps ou d'antigène, est dialysé contre un tampon de phosphate 0,01 M présentant un pH de 6,5 à 7,5 jusqu'à
ce que le mélange réactionnel atteigne le pH du tampon de phosphate ci-dessus, et il est alors centrifugé dans une centrifugeuse réfrigérée à 1800 x g pour séparer les impuretés en suspension. La solution limpide ainsi obtenue est soumise à une filtration sur une colonne de gel
de 65 x 2,0 cm d'agarose réticulé ("Sepharose 6B") et le filtrat est élué avec un tampon de phosphate 0,2 M (pH de 8,0) contenant du chlorure de sodium. Des fractions de
3,5 ml sont recueillies et contrôlées en ce qui concerne le produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'antigène par détermination de l'activité de pénicillinase par lecture de l'absorption à 280 nm dans un spectrophotomètre Beckman modèle DU. Le produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'antigène est élué dans les fractions en volume dépourvues, immédiatement ultérieures, et les impuretés, telles que la hCG d'anti-gène, la pénicillinase et l'aldéhyde glutarique qui
n'ont pas réagi, sont retenus dans la colonne de gel.
Le produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'antigène s'est révélé comme contenant 70% de pénicillinase.
Exemple 2
Procédé de détection de la grossesse chez l'être humain ou de tumeur trophoblastique, de carcinome du chorion ou de maladies épidémiologiques, par l'utilisation du produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d' antigène .
Une plaque de microtitre en polyvinyle, présentant deux cuvettes, est revêtue d'un anticorps à base d'immunoglobuline pour la hCG, par incubation de la plaque avec l'anticorps (200 ml) dans 4 ml d'un tampon
de barbitone 0,07 M présentant un pH de 9,6, à 5[deg.]C, pendant 16 heures. Une goutte d'échantillon d'urine d'essai contenant de la hCG, une goutte de tampon de phosphate 0,1 M (pH de 7,0) et deux gouttes de produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'antigène de l'Exemple 1, dilué à 10/1, dans 0,4 ml de tampon de phosphate
0,1 M (pH de 7,0) sont ajoutées à une des cuvettes susdites par un compte-gouttes. Une goutte d'échantillon d'urine mâle ne contenant pas de hCG (qui agit comme échantillon témoin), une goutte de tampon de phosphate 0,1 M (pH de 7,0) et deux gouttes de produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'antigène, à la dilution précitée, sont ajoutées à l'autre desdites cuvettes par un compte-gouttes. Les cuvettes sont mises à incuber
à 37[deg.]C pendant 90 minutes. Ensuite, le contenu des cuvettes est évacué et les cuvettes sont lavées à deux reprises avec du tampon de phosphate 0,1 M (pH de 7 à 8). Quatre gouttes d'un complexe d'amidon et d'iode (0,25 ml d'une solution d'iode préparée par dissolution de 2 g d'iode et de 53,3 g d'iodure de potassium dans 100 ml d'eau distillée et additionnée à un mélange de 190 ml de tampon de phosphate 0,1 M (pH de 7,0) et à 30 ml d'amidon soluble à 2%), contenant 4 mg de pénicilline pour 10 ml du complexe susdit, sont ajoutées à chacune des cuvettes.
Le complexe contenu dans les cuvettes qui présentaient l'échantillon d'urine mâle devient décoloré après 15 à
30 minutes, tandis que le complexe contenu dans la cuvette qui présentait l'échantillon d'urine d'essai contenant de la hCG continue à rester bleu. La décoloration du complexe indique la présence de pénicillinase et par conséquent l'absence de hCG tandis que la persistance
de la couleur bleue indique l'absence de pénicillinase
et par conséquent la présence de hCG pour la raison suivante :
le produit de conjugaison de pénicillinase et
de hCG d'anticorps ou d'antigène et la hCG présente dans l'échantillon d'urine d'essai sont en compétition pour l'anticorps de hCG enduit dans la cuvette qui contenait l'échantillon d'urine d'essai. La pénicilline en présence de la pénicillinase du produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'antigène est hydrolysée en acide pénicilloique qui absorbe l'iode du complexe susdit, en décolorant le complexe bleu.
Une tumeur trophoblastique et un carcinome du chorion sont également détectés selon le processus décrit ci-dessus.
Des troubles épidémiologiques peuvent également être détectés selon ce processus, en utilisant un produit de conjugaison de pénicillinase et d'anticorps au lieu d'un produit de conjugaison de pénicillinase et d'antigène. Un produit de conjugaison de pénicillinase et d'anticorps peut être préparé en suivant le procédé de l'Exemple 1.
Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée au mode de réalisation décrit ci-dessus et que bien des modifications peuvent
y être apportées sans sortir du cadre du présent brevet.
"Method for preparing conjugation products of enzyme and hormone, products thus obtained, and their use" "Process for preparing conjugation products of penicillinase and hormone, products thus obtained, and their use"
The present invention relates to conjugates of enzyme and hormone based on protein or polypeptide of antibody or antigen,
preparing and using them for the detection and estimation of protein-based hormones
or polypeptide or antibodies or antigens and
for the detection and diagnosis of diseases or medical conditions, including the early detection of pregnancy in humans.
Preparation and uses of enzyme and protein conjugates have been described by Avrameas and Uriel in 1966 (Avrameas S. And Uriel S., C.R. Acad. Sci. Ser. D. 262.2543, 1966). Several reports have appeared in the literature describing techniques which make use of antibodies and antigens conjugated to an enzyme for bioassay analysis.
<EMI ID = 1.1>
Immunochemistry 8: 871, 1971) used enzyme-linked antibodies for an immunoglobulin estimate. Since then, enzyme linked immunoassays have been described for human chorionic gonadotropin, insulin (Ishikawa EJ, Biochemistry 73: 1319, 1973), human placental lactogen (Serbour HMJ, Immunol. Methods 11:15, 1976), estrogens (Van Weeman B. and Schuurs A., Immunochemistry 12: 667, 1975), thyroxine (Ullmann E., Blakemore J., Lente R., Clinical Chemistry 21: 1011, 1975) and others hormonal constituents. The enzymes used in the above-mentioned cases are alkaline phosphase, peroxidase, lysozyme, betagalactosidase or glucoamylase.
An object of the present invention is
into new conjugates of penicillinase and hormone based on protein or antibody or antigen polypeptide.
Another object of the invention is to provide a process for the preparation of penicillinase and hormone conjugate products based on protein or polypeptide of antibody or antigen.
Yet another object of the present invention consists in the use of conjugation products
of penicillinase and hormone based on protein or polypeptide of antibody or antigen for the detection and estimation of hormones based on protein or polypeptide or antibody or antigens or for the detection and diagnosis of diseases or medical conditions, including early detection of pregnancy in humans.
According to the present invention, new conjugation products of penicillinase and protein or polypeptide of antibody or antigen are provided.
According to the present invention, there is also provided a process for preparing new conjugates of penicillinase and hormone based on protein or antibody or antigen polypeptide, this process consisting in conjugating a hormone based on protein or antibody or antigen polypeptide with penicillinase by reacting this hormone based on protein or antibody or antigen polypeptide and penicillinase in the presence of a bifunctional reagent, such as glutaraldehyde , and by separation and purification of the penicillinase and hormone conjugate products based on protein or antibody or antigen polypeptide from the reaction mixture.
According to the present invention, provision is also made for the use of new conjugates of penicillinase and hormone based on protein or of antibody or antigen polypeptide for the detection and estimation of hormones based on protein or polypeptide or antibodies or antigens or for the detection and diagnosis of diseases, or medical conditions, including the detection of pregnancy in humans.
The hormone based on protein or on antibody or antigen polypeptide is for example human choriogonadotropin (hCG) or human placental lactogen (hPL).
According to the present invention, there is also provided a method for detecting pregnancy in humans or a trophoblastic tumor, chorion carcinoma or epidemiological diseases, by the use of a new penicillinase conjugate product. and antibody or antigen hCG, the method comprising coating a surface with an hCG antibody, reacting a test urine sample containing hCG with the surface present antibody and conjugate of penicillinase and hCG and a buffer or mixture of buffers, such as Tris or citrate-phosphate, to
temperatures of the order of 4 to 40 [deg.] C, for periods of 1 to 4 hours, and in the analysis of this surface with regard to the activity of penicillinase. The above-mentioned surface can be made from materials, such as polymers, such as synthetic thermoplastic polymers, such as polyvinyl chloride, polystyrene or nylon, cellulose, "Sephadex" (polysaccharide gel) or the "Agarose"
(polysaccharide gel).
According to one embodiment of the invention, this method comprises a reaction of a control urine sample, which does not contain hCG or of antigen, with the aforementioned surface, in the presence of the antibody and the product of conjugation of penicillinase and hCG
and a buffer or mixture of buffers, such as Tris or citrate-phosphate, the reaction of this control sample being carried out simultaneously with said reaction of the test urine sample.
According to one embodiment of the invention, said surface is coated with said antibody
of hCG by incubating this surface in hCG antibody in a buffer or mixture of buffers, such as Tris or citrate-phosphate, at temperatures of the order of 4 to 37 [deg.] C, for periods from 3 to 34 hours.
According to one embodiment of the invention, said surface is, after incubation with a urine sample and a conjugate of penicillinase and hCG, analyzed with regard to the activity of penicillinase by a reagent based on amidoniode-penicillin intended for qualitative evaluation and by the use of a colorimeter for quantitative evaluation.
The advantages of using penicillinase for the preparation of new enzyme and hormone conjugate products based on protein or antibody or antigen polypeptide are: a) penicillinase is stable at the ambient temperature, (b) the activity of penicillinase is high, (c) the substrate of penicillin V and other reagents, namely the hormone based on protein or on polypeptide of antibody or antigen used for the penicillinase conjugate, is not carcinogenic, it is stable at
room temperature and it is relatively inexpensive, (d) detection of protein or polypeptide hormone or antibody or antigen by the use of penicillinase linked to a protein or polypeptide hormone antibody or antigen can be performed with the naked eye, while estimation requires simple equipment such as a colorimeter.
The invention is described in more detail using the Examples below, without being
however limited by them.
Example 1
Preparation of conjugate of penicillinase and antigen hCG.
Antigen hCG (2000 i.u. (immunizing units)) is placed in a glass container containing 2.5 ml of a penicillinase solution prepared by dissolving 100,000 i.u. penicillinase powder with a specific activity of 40,000 u./mg of penicillinase powder in a phosphate buffer! M
(pH 6.5 to 7.5), obtained by mixing disodium phosphate and monosodium phosphate at a pH of 7.0 to 7.5.
To the above solution, glutaraldehyde is added at a final concentration of 0.5%. The solution contained in the glass container is mixed and left for 12 hours at 35 [deg.] C. The reaction mixture, which contains penicillinase and antigen hCG
unreacted glutaraldehyde and a conjugate of penicillinase and hCG of antibody or antigen is dialyzed against 0.01 M phosphate buffer with pH 6.5 to 7 , 5 up
the reaction mixture reaches the pH of the above phosphate buffer, and it is then centrifuged in a centrifuge refrigerated at 1800 x g to separate the suspended impurities. The clear solution thus obtained is subjected to filtration on a gel column.
of 65 x 2.0 cm of crosslinked agarose ("Sepharose 6B") and the filtrate is eluted with a 0.2 M phosphate buffer (pH 8.0) containing sodium chloride. Fractions of
3.5 ml are collected and checked for the conjugate of penicillinase and antigen hCG by determination of penicillinase activity by reading the absorption at 280 nm in a Beckman DU model spectrophotometer. The conjugate of penicillinase and antigen hCG is eluted in void, immediately subsequent volume fractions and impurities, such as the anti-gene hCG, penicillinase and glutaraldehyde which
have not reacted, are retained in the gel column.
The conjugate of penicillinase and antigen hCG has been shown to contain 70% penicillinase.
Example 2
Method of detecting pregnancy in humans or trophoblastic tumor, chorion carcinoma or epidemiological diseases, by the use of the conjugate of penicillinase and hCG antigen.
A polyvinyl microtiter plate, presenting two cuvettes, is coated with an antibody based on immunoglobulin for hCG, by incubation of the plate with the antibody (200 ml) in 4 ml of a buffer.
of 0.07 M barbitone having a pH of 9.6, at 5 [deg.] C, for 16 hours. One drop of test urine sample containing hCG, one drop of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) and two drops of penicillinase conjugate and hCG antigen 'Example 1, diluted 10/1, in 0.4 ml of phosphate buffer
0.1 M (pH 7.0) is added to one of the above-mentioned bowls by a dropper. One drop of male urine sample containing no hCG (which acts as a control sample), one drop of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) and two drops of penicillinase conjugate and hCG of antigen, at the aforementioned dilution, are added to the other of said cuvettes by a dropper. The cuvettes are incubated
at 37 [deg.] C for 90 minutes. Then the contents of the cuvettes are drained and the cuvettes are washed twice with 0.1 M phosphate buffer (pH 7-8). Four drops of a starch and iodine complex (0.25 ml of an iodine solution prepared by dissolving 2 g of iodine and 53.3 g of potassium iodide in 100 ml of distilled water and added to a mixture of 190 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) and 30 ml of 2% soluble starch), containing 4 mg of penicillin per 10 ml of the above-mentioned complex, are added to each of the bowls.
The complex in the cuvettes which presented the male urine sample becomes discolored after 15 to
30 minutes, while the complex in the cuvette which presented the test urine sample containing hCG continues to remain blue. Discoloration of the complex indicates the presence of penicillinase and therefore the absence of hCG while persistence
blue indicates absence of penicillinase
and therefore the presence of hCG for the following reason:
the conjugate of penicillinase and
of antibody or antigen hCG and the hCG present in the test urine sample compete for the hCG antibody coated in the cuvette which contained the test urine sample. Penicillin in the presence of penicillinase from the conjugate of penicillinase and antigen hCG is hydrolyzed to penicilloic acid which absorbs iodine from the above complex, discoloring the blue complex.
A trophoblastic tumor and a chorion carcinoma are also detected according to the process described above.
Epidemiological disorders can also be detected by this process, using a penicillinase and antibody conjugate instead of a penicillinase and antigen conjugate. A conjugate of penicillinase and antibodies can be prepared by following the method of Example 1.
It should be understood that the present invention is in no way limited to the embodiment described above and that many modifications can
be made without departing from the scope of this patent.