BE900641A - Procede de preparation de produits de conjugaison d'enzyme et d'hormone, produits ainsi obtenus, et leur utilisation. - Google Patents
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Abstract
Procécé de préparation de produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène, comprenant la conjugaison d'hormone à base de proteine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène avec de la pénicillinase par réaction de cette hormone et de la pénicillinase en présence d'un réactif bifonctionnel, tel que l'aldéhyde glutarique et la séparation et la purification des produits de conjugaison à partir du mélange réactionnel. Les produits ainsi obtenus sont utilisés pour la détection et l'évacuation d'hormones à base de protéine ou de polypeptide ou d'anticorps ou d'antigènes et pour le détection et le diagnostique de maladies ou d'états médicaux y compris la grossesse chez l'etre humain.
Description
"Procédé de préparation de produits de conjugaison d'enzyme et d'hormone, produits ainsi obtenus, et leur utilisation" "Procédé de préparation de produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone, produits ainsi obtenus, et leur utilisation"
La présente invention est relative à des produits de conjugaison d'enzyme et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène,
à leur préparation et à leur utilisation pour la détection et l'estimation d'hormones à base de protéine
ou de polypeptide ou d'anticorps ou d'antigènes et
pour la détection et le diagnostic de maladies ou d'états médicaux, y compris la détection précoce de la grossesse chez l'être humain.
Une préparation et des utilisations de produits de conjugaison d'enzyme et de protéine ont été décrites par Avrameas et Uriel en 1966 (Avrameas S . et Uriel S., C.R. Acad. Sci. Ser. D. 262,2543, 1966). Plusieurs rapports sont apparus dans la littérature en décrivant des techniques qui font usage d'anticorps et d'antigènes conjugués à une enzyme pour une analyse bio-
<EMI ID=1.1>
Immunochemistry 8:871, 1971) ont utilisé des anticorps liés à une enzyme pour une estimation d'immunoglobuline. Depuis lors, des examens immunologiques avec liaison à une enzyme ont été décrits pour la gonadotrophine chorionique humaine, l'insuline (Ishikawa E.J., Biochemistry 73:1319, 1973), le lactogène placentaire humain (Serbour H.M.J., Immunol . Methods 11:15, 1976), des oestrogènes (Van Weeman B. et Schuurs A., Immunochemistry 12:667, 1975), la thyroxine (Ullmann E., Blakemore J., Lente R., Clinical Chemistry 21:1011, 1975) et d'autres constituants hormonaux. Les enzy�mes utilisées dans les cas précités sont la phosphase alcaline, la peroxydase, le lysozyme, la bétagalactosidase ou la glucoamylase.
Un objet de la présente invention consiste
en de nouveaux produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène.
Un autre objet de l'invention consiste à prévoir un procédé de préparation de produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène.
Encore un autre objet de la présente invention consiste en l'utilisation de produits de conjugaison
de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène pour la détection et l'estimation d'hormones à base de protéine ou de polypeptide ou d'anticorps ou d'antigènes ou pour la détection et le diagnostic de maladies ou d'états médicaux, y compris une détection précoce de la grossesse chez l'être humain.
Suivant la présente invention, on prévoit de nouveaux produits de conjugaison de pénicillinase et de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène.
Suivant la présente invention on prévoit aussi un procédé de préparation de nouveaux produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène, ce procédé consistant à conjuguer une hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène avec de la pénicillinase par réaction de cette hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène et de la pénicillinase en présence d'un réactif bifonctionnel, tel que de l'aldéhyde glutarique, et par séparation et purification des produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène à partir du mélange réactionnel.
Suivant la présente invention, il est également prévu l'utilisation de nouveaux produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène pour la détection et l'estimation d'hormones à base de protéine ou de polypeptide ou d'anticorps ou d'antigènes ou pour la détection et le diagnostic de maladies, ou d'états médicaux^ compris la détection de la grossesse chez l'être humain.
L'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène est par exemple la choriogonadotrophine humaine (hCG) ou le lactogène placentaire humain (hPL).
Suivant la présente invention, il est également prévu un procédé de détection de la grossesse chez l'être humain ou d'une tumeur trophoblastique, du carcinome du chorion ou de maladies épidémiologiques, par l'utilisation d'un nouveau produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'anticorps ou d'antigène, ce procédé consistant en l'enduction d'une surface par un anticorps de hCG, en la réaction d'un échantillon d'urine d'essai contenant de la hCG avec la surface en présence de l'anticorps et du produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG et d'un tampon ou d'un mélange de tampons,tels que Tris ou du citrate-phosphate, à
des températures de l'ordre de 4 à 40[deg.]C, pendant des périodes de 1 à 4 heures, et en l'analyse de cette surface en ce qui concerne l'activité de la pénicillinase. La surface susdite peut être faite à partir de matières, telles que des polymères, comme des polymères thermoplastiques synthétiques, tels que du polychlorure de vinyle, du polystyrène ou du Nylon, de la cellulose, du "Sephadex" (gel de polysaccharide) ou de l'"Agarose"
(gel de polysaccharide ).
Suivant une forme de réalisation de l'invention, ce procédé comprend une réaction d'un échantillon d'urine témoin, qui ne contient pas de hCG ou d'antigène, avec la surface susdite, en présence de l'anticorps et du produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG
et d'un tampon ou mélange de tampons, tels que Tris ou du citrate-phosphate, la réaction de cet échantillon témoin étant effectuée simultanément avec ladite réaction de l'échantillon d'urine d'essai.
Suivant une forme de réalisation de l'invention, ladite surface est revêtue par ledit anticorps
de hCG par incubation de cette surface dans l'anticorps de hCG dans un tampon ou mélange de tampons, tels que Tris ou du citrate-phosphate, à des températures de l'ordre de 4 à 37[deg.]C, pendant des périodes de 3 à 34 heures.
Suivant une forme de réalisation de l'invention, ladite surface est, après incubation avec un échantillon d'urine et un produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG, analysée en ce qui concerne l'activité de la pénicillinase par un réactif à base d'amidoniode-pénicilline destiné à une évaluation qualitative et par l'utilisation d'un colorimètre pour l'évaluation quantitative.
Les avantages de l'utilisation de pénicillinase pour la préparation des nouveaux produits de conjugaison d'enzyme et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène sont : �a) la pénicillinase est stable à la température ambiante, (b) l'activité de la pénicillinase est élevée, (c) le substrat de pénicilline V et d'autres réactifs, à savoir l'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène utilisée pour le produit de conjugaison de pénicillinase, n'est pas cancérigène, il est stable à
la température ambiante et il est relativement peu coûteux, (d) la détection d'hormone à base de protéine ou de polypeptide ou d'anticorps ou d'antigène par l'utilisation de pénicillinase reliée à une hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène peut être réalisée à l'oeil nu, tandis que l'estimation nécessite un équipement simple tel qu'un colorimètre.
L'invention est décrite d'une manière plus détaillée à l'aide des Exemples ci-après, sans être
pour autant limitée par ces derniers.
Exemple 1
Préparation de produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'antigène.
De la hCG d'antigène (2000 i.u. (unités immunisantes)) est placée dans un récipient en verre contenant 2,5 ml d'une solution de pénicillinase préparée par dissolution de 100.000 i.u. de poudre de pénicillinase présentant une activité spécifique de 40.000 u./mg de poudre de pénicillinase dans un tampon de phosphatée,! M
(pH de 6,5 à 7,5), obtenu par mélange de phosphate disodique et de phosphate monosodique à un pH de 7,0 à 7,5.
A la solution ci-dessus, on ajoute de l'aldéhyde glutarique à une concentration finale de 0,5 %. On mélange la solution contenue dans le récipient en verre et on l'abandonne pendant 12 heures à 35[deg.]C. Le mélange réactionnel, qui contient de la pénicillinaseet de la hCG d'antigène
qui n'ont pas réagi, de l'aldéhyde glutarique et un produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'anticorps ou d'antigène, est dialysé contre un tampon de phosphate 0,01 M présentant un pH de 6,5 à 7,5 jusqu'à
ce que le mélange réactionnel atteigne le pH du tampon de phosphate ci-dessus, et il est alors centrifugé dans une centrifugeuse réfrigérée à 1800 x g pour séparer les impuretés en suspension. La solution limpide ainsi obtenue est soumise à une filtration sur une colonne de gel
de 65 x 2,0 cm d'agarose réticulé ("Sepharose 6B") et le filtrat est élué avec un tampon de phosphate 0,2 M (pH de 8,0) contenant du chlorure de sodium. Des fractions de
3,5 ml sont recueillies et contrôlées en ce qui concerne le produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'antigène par détermination de l'activité de pénicillinase par lecture de l'absorption à 280 nm dans un spectrophotomètre Beckman modèle DU. Le produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'antigène est élué dans les fractions en volume dépourvues, immédiatement ultérieures, et les impuretés, telles que la hCG d'anti-gène, la pénicillinase et l'aldéhyde glutarique qui
n'ont pas réagi, sont retenus dans la colonne de gel.
Le produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'antigène s'est révélé comme contenant 70% de pénicillinase.
Exemple 2
Procédé de détection de la grossesse chez l'être humain ou de tumeur trophoblastique, de carcinome du chorion ou de maladies épidémiologiques, par l'utilisation du produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d' antigène .
Une plaque de microtitre en polyvinyle, présentant deux cuvettes, est revêtue d'un anticorps à base d'immunoglobuline pour la hCG, par incubation de la plaque avec l'anticorps (200 ml) dans 4 ml d'un tampon
de barbitone 0,07 M présentant un pH de 9,6, à 5[deg.]C, pendant 16 heures. Une goutte d'échantillon d'urine d'essai contenant de la hCG, une goutte de tampon de phosphate 0,1 M (pH de 7,0) et deux gouttes de produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'antigène de l'Exemple 1, dilué à 10/1, dans 0,4 ml de tampon de phosphate
0,1 M (pH de 7,0) sont ajoutées à une des cuvettes susdites par un compte-gouttes. Une goutte d'échantillon d'urine mâle ne contenant pas de hCG (qui agit comme échantillon témoin), une goutte de tampon de phosphate 0,1 M (pH de 7,0) et deux gouttes de produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'antigène, à la dilution précitée, sont ajoutées à l'autre desdites cuvettes par un compte-gouttes. Les cuvettes sont mises à incuber
à 37[deg.]C pendant 90 minutes. Ensuite, le contenu des cuvettes est évacué et les cuvettes sont lavées à deux reprises avec du tampon de phosphate 0,1 M (pH de 7 à 8). Quatre gouttes d'un complexe d'amidon et d'iode (0,25 ml d'une solution d'iode préparée par dissolution de 2 g d'iode et de 53,3 g d'iodure de potassium dans 100 ml d'eau distillée et additionnée à un mélange de 190 ml de tampon de phosphate 0,1 M (pH de 7,0) et à 30 ml d'amidon soluble à 2%), contenant 4 mg de pénicilline pour 10 ml du complexe susdit, sont ajoutées à chacune des cuvettes.
Le complexe contenu dans les cuvettes qui présentaient l'échantillon d'urine mâle devient décoloré après 15 à
30 minutes, tandis que le complexe contenu dans la cuvette qui présentait l'échantillon d'urine d'essai contenant de la hCG continue à rester bleu. La décoloration du complexe indique la présence de pénicillinase et par conséquent l'absence de hCG tandis que la persistance
de la couleur bleue indique l'absence de pénicillinase
et par conséquent la présence de hCG pour la raison suivante :
le produit de conjugaison de pénicillinase et
de hCG d'anticorps ou d'antigène et la hCG présente dans l'échantillon d'urine d'essai sont en compétition pour l'anticorps de hCG enduit dans la cuvette qui contenait l'échantillon d'urine d'essai. La pénicilline en présence de la pénicillinase du produit de conjugaison de pénicillinase et de hCG d'antigène est hydrolysée en acide pénicilloique qui absorbe l'iode du complexe susdit, en décolorant le complexe bleu.
Une tumeur trophoblastique et un carcinome du chorion sont également détectés selon le processus décrit ci-dessus.
Des troubles épidémiologiques peuvent également être détectés selon ce processus, en utilisant un produit de conjugaison de pénicillinase et d'anticorps au lieu d'un produit de conjugaison de pénicillinase et d'antigène. Un produit de conjugaison de pénicillinase et d'anticorps peut être préparé en suivant le procédé de l'Exemple 1.
Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée au mode de réalisation décrit ci-dessus et que bien des modifications peuvent
y être apportées sans sortir du cadre du présent brevet.
Claims (11)
1. Produit de conjugaison de pénicillinase
et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène.
2. Procédé de préparation de produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de molypeptide d'anticorps ou d'antigène, ce procédé comprenant la conjugaison d'une hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène avec de la pénicillinase par réaction de cette hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène et
de la pénicillinase en présence d'un réactif bifonctionnel, tel que l'aldéhyde glutarique, et la séparation et la purification des produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène à partir du mélange réactionnel.
3. Application de produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène, pour la détection et l'évaluation d'hormones à base de protéine ou de polypeptide ou d'anticorps ou d'antigènes et pour la détection et
le diagnostic de maladies ou d'états médicaux, y compris
la grossesse chez l'être humain.
4. Procédé de détection de la grossesse chez l'être humain ou d'une tumeur trophoblastique, du carcinome du chorion ou de troubles épidémiologiques, par l'utilisation d'un produit de conjugaison de pénicillinase et de choriogonadotrophine humaine d'anticorps ou d'antigène, ce procédé comprenant l'enduction d'une surface par un anticorps de choriogonadotrophine humaine, la réaction d'un échantilllon d'urine d'essai contenant de la choriogonadotrophine humaine avec ladite surface en présence du produit de conjugaison susdit de pénicillinase et de choriogonadotrophine humaine et dudit anticorps et d'un tampon ou mélange de tampons, à des températures de l'ordre de 4 à 40[deg.]C, pendant des périodes de <EMI ID=2.1>
ne l'activité de la pénicillinase.
5. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la surface susdite est faite en une matière polymère.
6. Procédé suivant la revendication 4, caractérisé en ce que la surface susdite est faite en un polymère synthétique, en cellulose ou en gel de polysaccharide.
7. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 6, caractérisé en ce qu'il comprend la réaction d'un échantillon d'urine témoin ne contenant pas de choriogonadotrophine humaine ou d'antigène avec ladite surface, en présence dudit anticorps et du produit de conjugaison susdit de pénicillinase et de choriogonadotrophine humaine et d'un tampon ou mélange de tampons,
la réaction de l'échantillon d'urine témoin étant effectuée simultanément à la réaction susdite de l'échantillon d'urine d'essai.
8. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 7, caractérisé en ce que la surface susdite est enduite par l'anticorps de choriogonadotrophine humaine par incubation de cette surface dans l'anticorps
de choriogonadotrophine humaine dans un tampon ou mélange de tampons, à des températures de l'ordre de 4 à 37[deg.]C, pendant des périodes de 3 à 34 heures.
9. Procédé suivant l'une quelconque des revendications 4 à 8, caractérisé en ce que la surface susdite est analysée en ce qui concerne l'activité de
la pénicillinase par un réactif à base d'amidon-iodepénicilline pour l'évaluation qualitative et/ou par l'utilisation d'un colorimètre pour l'évaluation quantitative.
10. Procédé de pr éparation de produits de conjugaison de pénicillinase et d'hormone à base de protéine ou de polypeptide d'anticorps ou d'antigène, tel que décrit ci-dessus, et en particulier suivant l'Exemple 1.
11. Procédé de détection de la grossesse
chez l'être humain ou d'une tumeur trophoblastique, du carcinome du chorion ou de troubles épidémiologiques,
par l'utilisation d'un produit de conjugaison de pénicillinase et de choriogonadotrophine humaine d'anticorps ou d'antigène, tel que décrit ci-dessus, en particulier suivant l'Exemple 2.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BE0/213695A BE900641A (fr) | 1984-09-20 | 1984-09-20 | Procede de preparation de produits de conjugaison d'enzyme et d'hormone, produits ainsi obtenus, et leur utilisation. |
Applications Claiming Priority (2)
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| BE0/213695A BE900641A (fr) | 1984-09-20 | 1984-09-20 | Procede de preparation de produits de conjugaison d'enzyme et d'hormone, produits ainsi obtenus, et leur utilisation. |
| BE900641 | 1984-09-20 |
Publications (1)
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| BE900641A true BE900641A (fr) | 1985-01-16 |
Family
ID=25654234
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| BE0/213695A BE900641A (fr) | 1984-09-20 | 1984-09-20 | Procede de preparation de produits de conjugaison d'enzyme et d'hormone, produits ainsi obtenus, et leur utilisation. |
Country Status (1)
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| BE (1) | BE900641A (fr) |
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1984
- 1984-09-20 BE BE0/213695A patent/BE900641A/fr not_active IP Right Cessation
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| RE | Patent lapsed |
Owner name: HINDUSTAN ANTIBIOTICS LTD Effective date: 19870930 |