Composition pharmaceutique contenant du 24,25-dihydroxycholécalciférol Selon un premier aspect de la présente invention, celle-ci a pour objet une composition pharmaceutique
sous forme de dose unitaire, caractérisée en ce qu'elle est constituée par une dose efficace convenant au traitement de la douleur et de la pyrexie, de l'hypertension, de l'hypotension, de l'hyperlipémie, de maladies inflammatoires, de maladies dues à une accentuation fonctionnelle des thrombocytes ou de la myodystrophie, d'un composé formé du 24,25-dihydroxycholécalciférol et d'un. excipient (véhicule ou diluant) pharmaceutiquement acceptable.
Selon une seconde caractéristique de la présente invention, celle-ci a pour objet un procédé pour le traitement de la douleur et de la pyrexie, de l'hypertension, de l'hypotension, de l'hyperlipémie, de maladies inflammatoires, de maladies dues à une accentuation fonctionnelle des thrombocytes ou de la myodystrophie, caractérisé en
ce que l'on administre à un patient qui souffre d'une douleur et d'une pyrexie, d'hypertension, d'hypotension, d'hyperlipémie, d'une maladie inflammatoire, d'une mala-
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d'une myodystrophie, une quantité efficace d'un composé formé du 24,25-dihydroxycholécalciférol.
La présente invention se rapporte à une composition pharmaceutique contenant le 24,25-dihydroxycholécalciférol à titre d'ingrédient actif pour le traitement de la douleur et de la pyrexie, de l'hypertension, de l'hypotension, de l'hyperlipémie, de maladies inflammatoires, de maladies dues à une accentuation fonctionnelle des thombocytes ou de la myodystrophie et concerne un procédé pour le traitement des douleurs et
de la pyrexie, de l'hypertension, de l'hypotension, de l'hyperlipémie, de maladies inflammatoires, de maladies dues à une accentuation fonctionnelle des thrombocytes
ou de la myodystrophie, caractérisé en ce que l'on administre à un patient souffrant d'une douleur et de pyrexie, d'hypertension, d'hypotension, d'hyperlipémie, d'une maladie inflammatoire, d'une maladie due à une accentuation fonctionnelle des thrombocytes ou d'une myodystrophie, une quantité efficace du composé formé par
le 24,25-dihydroxycholécalciférol.
Concernant les maladies dues à une accentuatim fonctionnelle des thrombocytes, on constate que, récemment,
le nombre de cas d'accentuation fonctionnelle des thrombocytes a tendance à s'élever du fait de l'accroissement
du nombre de personnes âgées et de l'européanisation et de l'américanisation des habitudes alimentaires et de l'environnement social en tant que facteurs principaux
et, parmi les traitements prévus pour les maladies dues
à l'accentuation fonctionnelle des thrombocytes, on a appliqué un traitement antithrombotique.
Les maladies auxquelles le traitement antithrombotique s'applique sont les maladies cérébralo-vasculaires, comme l'infarctus cérébral et l'ischémie cérébrale paroxystique transitoire, des maladies cardiaques ischémiques, comme l'infarctus du myocarde, la thrombose due à l'utilisation de matériaux et d'organes artificiels, comme le coeur artificiel, le poumon artificiel, le shunt A-V artificiel, les valvules cardiaques artificielles, les cathéters et des vaisseaux artificiels, les troubles des petits vaisseaux, comme le purpura thrombotique thrombocytopénique et l'anémie hémolytique due aux troubles des petits vaisseaux et l'hyperthrombocytémie.
En outre, le traitement antithrombotique s'applique aux maladies avec l'état desquelles l'élévation fonctionnelle de thrombocytes a une certaine relation, ces maladies étant le diabète sucré, la néphrite chronique, le syndrome néphrotique, l'hypertension, la sclérose multiple, la toxicose gestationnelle, les cancers, l'hémoglobinurie nocturne paroxystique, la maladie de Kawasaki, la maladie de Raynaud et divers troubles induits par vibration.
Bien qu'à titre de traitement antithrombotique, on
ait procédé à l'administrationde certaines compositions pharmaceutiques comprenant le dipyridamole, le trapidil
ou la ticlopidine, il se pose un problème du point de
vue des effets secondaires de ces substances médicameneuses.
De même, la myodystrophie est un syndrome myopatique qui se caractérise par la dégénérescence progressive des muscles du squelette et elle est provoquée par des facteurs héréditaires. Depuis qu'un cas infantile de myodystrophie du type pseudohypertrophique a été rapporté
de manière précise en 1868 par Duchenne, on a relaté, les uns après les autres, divers cas cliniques sub-typiques
de cette maladie. Par conséquent, on a acquis la conviction que la myodystrophie est un syndrome d'une diversité particulièrement riche.
A cet égard, bien qu'une classification de la myodystrophie ait été effectuée à maintes reprises du point
de vue clinique sur base de l'âge au début de la maladie,
de la répartition des muscles attaqués, de la différence des sexes des patients, des types héréditaires de la maladie et du degré de gravité du progrès de la maladie, suivant la classification opérée en 1968 par le World Neurological Union, la myodystrophie peut être grosso-
modo classifiée comme étant une maladie héréditaire, (1) du type Duchenne (pseudohyperatrophique), (2) du type facio-scapula-brachial, (3) du type en ceinture, (4)
du type distal, (5) du type des muscles oculaires (6)
et du type pharyngo- oculaire. En outre, Walton et Gardner-Medwin ont classifié tant le type Duchenne que
le type en ceinture suivant le mode héréditaire de 1969
et ont affirmé que le nom du premier type devait être
d'un emploi limité à ceux du type à chromosome X et,
par conséquent, ils incluèrent la myotonie dans la classification de la myodystrophie, tout en classant la myotonie en les trois types suivants : (i) type congénital,
(ii) type aggravé par la froidure et (iii) type myotonique atrophique.
Les particularités caractéristiques du type Duchenne, à titre d'exemple illustratif de myodystrophie, sont les suivantes.
(A) A l'exception du très rare déclenchement du syndrome de Turner uniquement chez la femelle, le déclenchement du type Duchenne n'est observé que chez le mâle, suggérant ainsi le caractère récessif lié au sexe de la maladie (B) son déclenchement s'observe chez des enfants âgés de 2 à 5 ans, (C) en premier lieu, apparaît la réduction de la résistance des muscles de l'arche pelvienne suivie de l'attaque symétrique des muscles, (D) on observe nécessairement une pseudohypertrophie principalement sur les muscles de la cuisse inférieure, (E)
les symptômes sont habituellement progressifs et s'aggravent et le patient devient incapable de marcher dans les dix ans qui suivent le début de l'apparition de la maladie,
(F) la perturbation des muscles cardiaques est fréquemment observée chez le patient, (G) une lordose au niveau des hanches et une scoliose apparaissent, aggravant enocre davantage la maladie et (H) nombre des patients attaqués par une myodystrophie meurent de malnutrition, de maladie respiratoire infectieuse et de défaillance cardiaque
à l'âge d'approximativement 20 ans.
La myodystrophie est une des maladies dites réfractaires et jusqu'à présent, on n'a trouvé aucun traitement ni médicament qui permettent de guérir complètement la maladie et, par conséquent, la découverte d'un traitement ou d'un médicament dont on prévoit qu'il prolongera la durée de vie du patient souffrant de myodystrophie peut être important et se révéler être un grand progrès.
En résultat de recherches et d'études effectuées
par la demanderesse sur l'activité physiologique du
24,25-(OH)2-D3, on a constaté que ce produit possédait une activité antipyrétique et une activité sédative, une activité de régulation de la pression sanguine, une activité antihyperlipémique et une activité anti-inflammatoire, une activité d'inhibition de l'accentuation fonctionnelle des thrombocytes et une activité antimyodystrophique, activités non accompagnées d'effets secondaires et, par conséquent, la demanderesse est ainsi parvenue à la présente invention.
Le 24,25-(OH)2-D3 est de haute sécurité, possède une activité suppressive sur le système nerveux central, une activité régulatrice de la pression sanguine, une activité antihyperlipémique, une activité anti-inflammatoire, une activité d'inhibition de l'accentuation fonctionnelle
des thrombocytes et une activité antimyodystrophique, et, par conséquent, ce produit est extrêmement efficace à titre d'ingrédient actif d'une composition pharmaceutique convenant au traitement de la douleur et de la pyrexie,
de l'hypertension, de l'hypotension, de l'hyperlipémie, des maladies inflammatoires, des maladies dues à une accentuation fonctionnelle des thrombocytes ou la myodystrophie.
Chacun des 24,25(OH)2-D3 est une substance bien connue et représentée par l'une des formules qui suivent et se trouve décrit, par exemple, dans l'ouvrage :
''Vitamin D; Molecular Biology and Clinical Nutrition" par Anthony W. Norman, pages 1 à 92 (1980).
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Le 24,25-dihydroxycholecalciférol peut notamment être le 24R,25-(OH)2-D3, 24S,25-(OH)2-D3 ou un mélange
de ces substances, cependant, de manière plus particulière il est, de préférence, le 24R,25-(OH)2-D3. La composition pharmaceutique suivant la présente invention pour le traitement de douleurs et de la pyrexie, de l'hypertension,
de l'hypotension, de l'hyperlipémie, des maladies inflammatoires, des maladies dues à l'accentuation fonctionnelle des thrombocytes ou de la myodystrophie comprend une quantité efficace de la substance susmentionnée à titre d'ingrédient actif et un excipient (le terme excipient désignant tant un véhicule qu'un diluant) et s'utilise sous la forme d'une dose unitaire avec divers types de formules et peut s'administrer par la voie orale ou parentérale (y compris la voie rectale) cependant l'administration par la voie orale est préférable.
La composition pharmaceutique contenant du 24,25-
(OH)2-D3 à titre d'ingrédient actif s'utilise sous une forme destinée à l'administration, telle que les comprimés, les poudres, les granules, les suppositoires, les capsules, les solutions en milieu alcoolique ou en milieu huileux et les suspensions aqueuses. A titre de milieu huileux, on peut utiliser, de préférence, des triglycé-
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l'huile de graine de coton, l'huile d'arachide, l'huile de foie de poisson, l'huile de fèves de cacao ou le glycérol.
En outre, à titre d'autres constituants, on peut également mélanger du lactose, de l'amidon, du talc,
du stéarate de magnésium, de l'acide sorbique, des sels du type sorbate, des sucres et des sucres-alcools, une solution saline physiologique, ou des surfactifs, un antioxygène ou tout autre médicament au 24,25-(OH)2-D3.
La composition pharmaceutique suivant la présente invention peut contenir, sous forme de dose unitaire,
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en poids de 24,25-(OH)2-D3 et le 24,25-(0H)2-D3 s'administre à un patient adulte à la dose quotidienne de
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Les résultats de l'examen de la toxicité aiguë du
24,25-(OH)2-D3 sont présentés ci-dessous.
Une solution éthanolique de 24R,25-(OH)2-D3 ou de
24S,25-(OH)2-D3 fut dissoute dans un triglycéride
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contenant 2 % en poids d'éthanol.
On a administré l'échantillon ainsi préparé à chacun des animaux d'un groupe de 10 souris ICR mâles
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de poids corporel. L'observation des souris ainsi traitées quant à leurs symptomes d'intoxication, pendant une durée de 2 semaines suivant l'administration, ne fut suivie d'aucune découverte anormale chez les souris dont aucune ne mourut.
Les résultats des examens effectués après le sacrifice de chacune des souris, y compris l'examen sanguin, l'examen biochimique, l'autopsie et l'examen pathohistologique, furent les mêmes que ceux obtenus avec des souris auxquelles on avait seulement administré le triglycéride de l'acide gras contenant 2 % en poids d'éthanol.
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100 mg/kg de poids corporel pour chacune des souris et que les mêmes résultats furent obtenus lors de l'administration du 24S,25-(OH)2-D3 de la même manière que celle décrite plus haut, on peut dire que la présente substance est extrêmement sûre en comparaison du
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de poids corporel. La présente invention sera à présent expliquée plus en détail en se référant aux exemples qui suivent, dans lesquels on a utilisé le 24R,25-(OH)2-D3, la confirmation de la structure de l'isomère optique due
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Letters", N[deg.] 6, pages 2203 à 2206, 1975.
Les exemples qui suivent illustrent la présente invention de manière plus détaillée; cependant, il faut bien comprendre que la portée de la présente invention n'est nullement limitée par les exemples en question.
EXEMPLE 1
Activité antipyrétique et sédative de la substance suivant l'invention
Activité sédative
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On a choisi des animaux d'essai parmi des souris
ICR femelles, en opérant une pression sur la racine de
la queue de chaque animal et tout en utilisant un appareil de stimulation par pression de Takagi et Kameyama (fabriqué par la société Natsume Works) et en prenant les individus qui manifestèrent une valeur seuil de la douleur dans la gamme de 50 à 80 mm de Hg. On a divisé les animaux d'essai ainsi choisis en groupes constitués chacun de 10 animaux.
On a administré une solution de 24R,25-(OH)2-D3 dans
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orale à chaque animal soumis à l'essai, à la dose de
100 microgrammes/kg de poids corporel et on a soumis l'animal ainsi traité à la stimulation mécanique susmentionnée en répétant la stimulation au fur et à mesure de l'écoulement du temps, tout en augmentant la pression jusqu'à ce que l'animal soumis à l'essai manifestât la réaction de pseudo-échappement. La pression appliquée au moment du pseudo-échappement et la durée (secondes) jusqu'à la manifestation de la réaction de pseudoéchappement furent enregistrées et sont rapportées dans le tableau 1 et on les a utilisées comme facteur pour juger l'effet sédatif du 24R,25-(OH)2-D3.
TABLEAU 1
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On a réparti des souris ICR femelles, 5 à 6 semaines après leur naissance, en groupes constitués chacun de
10 animaux et on les a soumises à un test suivant le procédé de Kostet et coll. (1959) comme suit.
6 heures après l'administration par la voie orale
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groupe, à la dose de 100 microgrammes/kg de poids corporel, on a injecté une solution aqueuse à 0,6 % d'acide acétique par la voie intrapéritcnéale à chacune des souris ainsi traitées, à la dose de 0,1 ml/10 g de poids corporel. 10 minutes après l'injection, on a compté le nombre des souris se contorsionnant pendant 10 minutes et on a obtenu le taux (pourcent) d'inhibition de la stimulation par l'acide acétique en utilisant la formule suivante, en comparaison du nombre de contorsions observées sur chaque souris du groupe témoin, souris témoins auxquelles on n'avait administré que le triglycéride et la solution de l'acide acétique.
Le taux de suppression de la stimulation (%) =
(1-T/C) x 100 où T représente le nombre moyen de contorsionsdu groupe soumis à l'essai et C représente le nombre moyen de contorsions du groupe témoin.
Les résultats du test sont rassemblés dans le tableau 2, où le taux de suppression de la stimulation est indiqué par I.R.(%).
TABLEAU 2
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Activité antipyrétique
On a procédé à l'essai suivant le procédé de Winter et collo. (1961) comme suit.
A chacun de 6 rats constituant un groupe, on a administré par la voie sous-cutanée, une suspension aqueuse à 20 % de levure de bière et, après 19 heures de jeune, on a administré par la voie orale, une solution de 24R,25-(OH)2-D3 dans un triglycéride d'acide
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100 microgrammes/kg de poids corporel.
A chacun de 6 rats constituant un autre groupe, on
a administré la même solution aqueuse de levure de bière, cependant, après un jeune de 19 heures, on n'a administré que le même triglycéride pour faire servir ces animaux de témoins traités et on a utilisé un autre groupe de
6 rats à titre de témoin sans traitement spécifique.
On a mesuré la température rectale de chacun des animaux des trois groupes susmentionnés en fonction de l'écoulement du temps et on a enregistré la température rectale minimale de l'animal soumis à l'essai,montrée
au moment où l'activité du 24R,25-(OH)2-D3 manifesta
la valeur maximale. On a également enregistré la température rectale des témoins traités et celle des témoins au moment susmentionné.
Le taux de suppression de l'élévation de la température rectale, c'est-à-dire le taux de suppression de la
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suivante :
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dans laquelle T représente la température rectale moyenne
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température rectale moyenne du groupe d'animaux témoins traités et C2 représente la température rectale moyenne des animaux témoins non spécifiquement traités.
Le taux ainsi obtenu de suppression de la pyrexie provoquée par la levure de bière et supprimé par le
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EXEMPLE 2
Activité réductrice de la pression sanguine
Par la voie orale, on a administré une solution de
24R,25-(OH)2-D3 dans un triglycéride d'un acide gras en
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animaux souffraient d'hypertension spontanée, l'administration s'effectuant à la dose de 100 microgrammes/kg de poids corporel. Après 6 heures et 12 heures suivant l'administration, on a mesuré la pression sanguine de chacun des rats ainsi traités en utilisant un tonomètre
(fabriqué par Ueda Works, modèle USM-105R) et on a évalué la différence entre la pression sanguine avant l'administration et celle après 9 et 12 heures suivant l'adminis-
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titre d'hypotenseur, tout en utilisant des rats auxquels on avait seulement administré le triglycéride à titre de témoin.
Les résultats de l'essai sont rapportés ci-dessous dans le tableau 3.
TABLEAU 3
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De même, dans le test effectué de manière similaire en utilisant du 24S,25-(OH)2-D3, on a obtenu un résultat approximativement identique.
Notamment, chacun des 24,25-(OH)2-D3 manifesta clairement une activité réductrice de la pression sanguine, démontrant ainsi leur efficacité à titre d'hypotenseur.
EXEMPLE 3
Activité de réduction de la teneur en lipides du sang
Après avoir alimenté un groupe de lapins blancs du Japon, mâles, d'une nourriture solide (CR-1) contenant 1 % de cholestérol pendant environ 3 mois, l'alimentation s'effectuant ad libitum et confirmation de l'élévation
de la teneur en lipides du sang de ces animaux, on a procédé à l'essai suivant, cependant que l'on utilisait les animaux ainsi traités à titre d'animaux modèles d'hyperlipémie.
Par la voie orale, on a administré une solution de
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grammes/kg de poids corporel et on a prélevé un échantillon de sang en fonction de l'écoulement du temps en vue de l'analyser quant à la teneur en liquides du sérum, à savoir le taux de cholestérol total du sérum par mise en oeuvre d'un procédé enzymatique et des �-lipoprotéines s'y trouvant, par le procédé turbidimétrique. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 4 qui suit.
TABLEAU 4
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Notes : * durée après l'administration
** les groupes alimentés par CR-1, mais non
soumis à l'administration
*** le signe de(-) montre l'accroissement du
taux.
A partir des propriétés toxicologiques et des résultats pharmacologiques décrits plus haut, on comprend que le 24R,25-(OH)2-D3 peut être utilisé de manière pratique comme ingrédient actif de la composition pharmaceutique antilipémique et de la composition pharmaceutique pour le traitement de l'artériosclérose.
EXEMPLE 4
Activité anti-inflammatoire de la substance suivant l'invention
Activité de suppression de l'oedème provoqué par la carraghénine
Après 6 heures d'administration forcée d'une solution de 24R,25-(OH)2-D3 dans un triglycéride d'acide gras en
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groupe constitué de 10 rats à la dose de 100 microgrammes/ kg, en suivant le procédé de van Arman et coll. (1963), on a injecté une suspension aqueuse à 1 % de carraghénine dans une solution saline aqueuse physiologique dans la plante de la patte arrière droite de chacun des rats. On
a déterminé le volume de la plante ainsi traitée en fonction de l'écoulement du temps après l'injection de façon à obtenir le taux de suppression de l'oedème dû
à l'injection de la carraghénine,tout en se servant de
la formule suivante:
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où T représente le volume moyen de la plante de la patte et C représente le volume moyen de la plante de la patte du rat témoin auquel on avait administré le triglycéride au lieu de la solution de 24R,25-(OH)2-D3 dans le triglycéride.
En résultat de cette expérience, on a constaté que le taux de suppression de l'oedème dû à la carraghénine <EMI ID=31.1>
Activité de suppression de la formation de granulome
Après injection d'air par la voie sous-cutanée, dans le dos de chacun de 6 rats, constituant un groupe, pour former une poche, on a injecté 0,5 ml d'une solution de 1 % d'huile de croton dans de l'huile de sésame dans la poche. Ensuite, on a administré par la voie orale une solution de 24R,25-(OH)2-D3 dans un trigly-
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ainsi traités, de manière continue, pendant 5 jours, à
la dose quotidienne de 10 microgrammes/kg de poids corporel. Le 6ème jour, on a mesuré la quantité du liquide ayant exsudé dans la poche et on a appliqué les données en même temps que les données obtenues sur les animaux témoins auxquels on avait injecté le triglycéride au
lieu de la solution dans le triglycéride, à la même formule, on a obtenu le taux de suppression de la formation du granulome. Le taux de suppression par le 24R,25-(OH)2D3 était de 17,8 %, montrant l'efficacité de cette substance médicamenteuse à titre d'agent anti-inflammatoire.
EXEMPLE 5
Activité inhibitrice de la vitesse d'agglutination des thrombocytes
L'effet du 24R,25-(OH)2-D3 sur l'agglutination des thrombocytes induite par l'adénosine diphosphate (que l'on appellera dans la suite du présent mémoire ADP) fut examiné in vitro, tout en utilisant un plasma riche en plaquettes (appelé dans la suite du présent mémoire PRP) obtenu à partir de rats Wistar mâles normaux, 20 semaines après la naissance, de la manière suivante.
On a procédé à la collecte de sang avec addition de citrate en la proportion de 1/9 du sang total recueilli des rats, et on a soumis l'échantillon de sang ainsi recueilli à une centrifugation pendant 6 minutes à
1500 tpm, de façon à obtenir un liquide surnageant que l'on a utilisé à titre de PRP.
A 250 ml de PRP, on a ajouté 1,5 microlitre d'une solution éthanolique de 24R,25-(OH)2-D3, à la concentration de 2 mg/ml et, après incubation du mélange pendant 2 minutes à 37[deg.]C, on a ajouté 30 micromoles d'ADP au mélange incubé et on a soumis le mélange ainsi obtenu à une détermination de la vitesse d'agglutination, en se servant d'un module de Lumiagglutination de Payton, modèle 1000, comme appareil pour l'observation de cette fonction, la concentration final: en 24R,25-(OH)2-D3 atteignant 12 microgrammes/ml du mélange de PRP et de la
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de l'éthanol dans le mélange étant de 0,6 %. A titre de témoin, on a utilisé un mélange de 250 ml de PRP et de 1,5 microlitre d'éthanol contenant 0,6 % d'éthanol. Le
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l'agglutination des thrombocytes dans le PRP induite par l'ADP fut obtenu à partir de la formule suivante :
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où C représente le taux maximum d'agglutination chez les témoins et T représente le taux maximum d'agglutination dans l'échantillon auquel on avait ajouté le 24R,25-(OH)2D3.
Dans l'essai en question, C était de 44,5 % et T
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(OH)2-D3 était d'environ 0 %.
EXEMPLE 6
Activité inhibitrice sur l'agglutination de thrombocytes humains
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tination de thrombocytes humains induite à l'ADP, d'une manière similaire à celle décrite à l'exemple 5, en utilisant cependant du PRP obtenu à partir de sang frais provenant de la veine d'une personne en bonne santé, la concentration finale de 24R,25-(OH)2-D3 dans l'échantillon traité étant de 1 microgramme/ml et la quantité d'ADP étant de 5 micromoles.
En résultat de cet examen, on a constaté que le
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tion des thrombocytes humains induite par l'ADP était
de 37,6 %.
EXEMPLE 7
Activité inhibitrice de l'agglutination des thrombocytes d'un rat souffrant de diabète sucré induit par la STZ
L'effet inhibiteur du 24R,25-(OH)2-D3 sur l'agglutination des thrombocytes dans du PRP prélevé de rat souffrant de diabète sucré artificiel induit à la streptozocine et sur celle dans du PRP prélevé de rats normaux fut examiné comme suit.
Après avoir fait jeûner des rats Wistar mâles dans la 6ème semaine après leur naissance pendant 48 heures, on a administré de la streptozocine à chaque rat, à la dose de 65 mg/kg de poids corporel et, une semaine après l'administration, on a prélevé un échantillon de sang de la veine codale de chaque rat, en vue de tester la concentration de sucre sanguin s'y trouvant et on a également mesuré la concentration du glucose dans l'urine des rats.
Les rats manifestant un taux de sucre sanguin de
500 à 600 mg/kg et une excrétion urinaire de glucose de ++++(2 %) sur du papier d'essai Hemaconbistiz III
(Miles.Sankyo Co., Ltd.) furent pris comme animaux d'essai souffrant du diabète sucré et on a recueilli
le sang de ces rats, ainsi que celui des rats normaux
(auxquels on n'avait pas administré de streptozocine), tout en utilisant du citrate lors de la collecte du sang.
Le PRP préparé à partir du sang recueilli ainsi obtenu de la même manière que celle décrite à l'exemple 7 fut davantage dilué par addition de PPP (plasma pauvre
en plaquettes, obtenu en soumettant le reste de la préparation du PRP à une séparation par centrifugation d'une durée de 10 minutes à 3.000 tpm), pour obtenir le PRP dilué contenant 300.000 thrombocytes/mm<3>. La quantité d'ADP (coagulant) était de 30 micromoles.
Le résultat de l'examen est présenté au tableau 5.
A titre de référence, dans le présent essai, la concentration finale en 24R,25-(OH)2-D3 dans le mélange du
PRP dilué et de la solution éthanolique de 24R,25-(OH)2D3 est également présentée dans le tableau 5. En témoin, on a utilisé le mélange du PRP dilué et d'éthanol.
TABLEAU 5
Effet du 24R,25-(OH) -D sur les thrombocytes dans le PRP prélevé de rats soutirant de diabète sucré artificiel
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Note : * Témoin, PRP contenant 0,6 % d'éthanol.
En outre, on a examiné l'effet du 24R,25-(OH)2-D3 sur l'inhibition de l'agglutination des thrombocytes induites par 30 micromoles d'ADP dans le PRP dilué
(contenant 300.000 thrombocytes/mm<3> de ce PRP dilué)
préparé à partir du sang prélevé de rats normaux, pour montrer que le taux maximal d'agglutination des throm-
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concentration du 24R,25-(OH)2-D3.
Ainsi qu'il ressort du tableau 5, l'effet inhibiteur du 24R,25-(OH)2-D3 sur l'agglutination des thrombocytes induites par l'ADP dans le PRP préparé à partir du sang prélevé de rat souffrant de diabète sucré induit à la streptozocine, a manifesté une élévation avec l'augmentation de la concentration en 24R,25-(OH)2-D3 après avoir présenté un pic (non représenté dans le tableau 5), puis qu'il a graduellement diminué, mais en demeurant cependant important, par exemple, le taux d'inhibition de l'agglutination des thrombocytes était de 25,1 % à la
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EXEMPLE 8
Activité inhibitrice sur l'agglutination de thrombocytes chez le rat souffrant d'hypertension héréditaire
On a examiné comme suit l'effet du 24R,25-(OH)2-D3 sur l'inhibition de l'agglutination des thrombocytes dans du PRP recueilli à partir du sang prélevé de rat souffrant d'hypertension héréditaire (l'animal modèle d'hypertension spontanée, appelé dans la suite du présent mémoire rats RHS).
Du sang fut recueilli de chaque aorte abdominale des rats RHS de 7 à 8 semaines après leur naissance, en se servant de citrate et du PRP fut préparé à partir du sang ainsi recueilli afin d'examiner l'agglutination des thrombocytes dans le PRP de la manière décrite à l'exemple 8, la concentration finale du 24R,25-(OH)2-D3 étant de 1 ng/ml de PRP prélevé de l'animal soumis à l'essai et de l'éthanol étant ajouté au PRP prélevé d'animaux normaux au lieu de la solution éthanolique
de 24R,25-(OH)2-D3.
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l'agglutination des thrombocytes induite à l'ADP était de 8,3 % par comparaison aux témoins.
EXEMPLE 9
Activité inhibitrice sur l'agglutination de thrombocytes de lapins souffrant d'hyperlipémie et d'arthériosclérose expérimentale
On a alimenté des lapins blancs mâles du Japon d'une nourriture solide contenant 1 % en poids de cholestérol, ad libitum, pendant 3 mois et après confirmation de l'élévation de la concentration en lipides de leur sérum, on a examiné les effets du 24R,25-(OH)2-D3 sur l'agglutination des thrombocytes dans du PRP des lapins ainsi alimentés, induite à l'ADP, tout en suivant le procédé de préparation du PRP et de détermination du degré d'agglutination présentés à l'exemple 9. La
<EMI ID=43.1>
était de 1 ng/ml et la quantité d'ADP était de 30 micromoles. On a mélangé de l'éthanol au lieu de la solution
<EMI ID=44.1>
sang prélevé d'animaux témoins (normaux).
En résultat, on a constaté que le 24R,25-(OH)2-D3 manifestait un taux d'inhibition de 15,8 % sur l'agglutination de thrombocytes dans du PRP préparé à partir des lapins traités induits à l'ADP.
EXEMPLE 10
Fonction inhibitrice sur l'agglutination de thrombocytes des animaux modèles souffrant de défaillance rénale
On a soumis des rats Wistar mâles, 6 semaines après leur naissance, à une néphrectomie totale et après confirmation de la notable élévation du BUN (azote d'urée dans le sérum) sérique de ces animaux, le troisième jour après l'intervention, on a examiné l'effet du 24R,25-(OH)2-D3 sur l'agglutination des thrombocytes dans du PRP préparé
à partir du sang des rats ainsi traités induits à l'ADP, tout en utilisant les rats ainsi traités comme animaux modèles de défaillance rénale et en suivant les procédés de préparation du PRP et de détermination du degré d'agglutination des thrombocytes présentés à l'exemple 10.
La concentration finale en 24R,25-(OH)2-D3 dans le PRP traité était de 1 ng/ml et la quantité d'ADP était de
30 micromoles. On a mélangé le PRP d'animaux témoins
à de l'éthanol au lieu de la solution éthanolique de
24R,25-(OH)2-D3.
En résultat, on a constaté que le 24R,25-(OH)2-D3 manifestait un effet d'inhibition de l'agglutination des thrombocytes dans le PRP des animaux ainsi traités de
17,3 %.
EXEMPLE 11
Fonction antithrombotique de la substance suivant l'invention
On a réparti 20 rats Wistar mâles 10 semaines après leur naissance en deux groupes égaux et on a administré de force une solution de 24R,25-(0H)2-D3 dans du tri-
<EMI ID=45.1>
du premier groupe et on a administré uniquement du triglycéride aux animaux de l'autre groupe pour les faire servir de témoins.
On a injecté de l'ADP par la voie intraveineuse à tous les rats 6 heures après l'administration précitée.
En résultat, tous les rats du groupe témoin moururent, cependant la mortalité de ceux du premier groupe
<EMI ID=46.1>
de 63 %. Ces résultats prouvent la fonction antithrombotique du 24R,25-(OH)2-D3.
EXEMPLE 12
Traitement des animaux modèles souffrant de dystrophie
Après l'obtention de souris mâles C57BL/6J dy/dy
(que l'on appellera dans la suite du présent mémoire présents animaux) âgées de 4 semaines à partir de la Japan Clea Co. et confirmation que ces animaux souffraient du myodystrophie, on a donné ad libitum une solution de 24R,25-(OH)2-D3, préparée en dissolvant ce composé dans une solution aqueuse à 0,001 % d'alcool isopropylique (contenant du 24R,25-(OH)2-D3 correspondant à la dose quotidienne
de 0,1 �g/kg de poids du corps ou 1 �g/kg de poids du corps) aux groupes I et II des présents animaux, à titre d'eau de boisson depuis la cinquième semaine suivant la naissance. En outre, au groupe témoin des présents animaux, on a donné ad libitum une solution aqueuse à 0,001 % d'alcool isopropylique à titre d'eau de boisson. Ensuite, au groupe non traité des présents animaux, on a administré de l'eau de robinet ad libitum à titre d'eau de boisson.
En résultat des essais de l'exemple 12, on donne dans le tableau 6 ci-dessous le taux de survie des
souris de chaque groupe, 150 jours après l'administration de l'eau de boisson spécifiée (150 jours correspondent
à la durée de vie moyenne des présents animaux de 4 à
5 mois décrite dans l'ouvrage ''Handbook for Model Animals of Diseases " Ed. by ISHIYAKU Publishing Co., page 421).
TABLEAU 6
<EMI ID=47.1>
Les résultats présentés dans le tableau 6 démontrent l'efficacité de la substance suivant l'invention pour allonger la vie des animaux malades.
EXEMPLE 13
Préparation d'une composition pharmaceutique contenant la substance suivant l'invention à titre d'ingrédient actif
<EMI ID=48.1>
C10, dans lequel on avait barboter de l'argon gazeux pendant 72 heures sous irradiation par une lampe à mercure
à pression élevée de 400 W, de manière à ainsi éliminer les peroxydes qui y étaient contenus à l'origine, on a dissous 5 mg de 24R,25-(OH)2-D3. On a introduit la solution ainsi obtenue et la composante pour paroi, préparée en combinant les composantes suivantes sous chauffage, dans une machine de production de gélules molles, de façon à obtenir la composition pharmaceutique encapsulée dans des gélules molles contenant 1,2,5 ou 10 microgrammes de 24R,25-(OH)2-D3 dans une gélule.
Composantes pour la paroi des gélules molles
10 parties en poids de gélatine,
2 parties en poids de glycérol,
0,05 partie en poids de parahydroxybenzoate d'éthyle
a titre d'antiseptique,
0,2 partie en poids de blanc de titane et
0,2 partie en poids d'eau dans la gélule achevée.
REVENDICATIONS
1. Composition pharmaceutique sous la forme d'une dose unitaire, caractérisée en ce qu'elle comprend une dose efficace pour le traitement de la douleur et de la pyrexie, de l'hypertension, de l'hypotension, de l'hyperlipémie, de maladies inflammatoires, de maladies dues à l'accentuation fonctionnelle des thrombocytes ou de la myodystrophie, d'un composé du 24,25-dihydroxycholécalciférol et un excipient (véhicule ou diluant) pharmaceutiquement acceptable.
2. Composition pharmaceutique suivant la revendication 2, caractérisée en ce que le composé est le 24R,25dihydroxycholécalciférol.
3. Procédé pour le traitement de la douleur et de la pyrexie, l'hypertension, l'hypotension, l'hyperlipémie, de maladies inflammatoires, de maladies dues à l'accentuation fonctionnelle des thrombocytes ou de la myodystrophie, caractérisé en ce que l'on administre à un patient souffrant de douleurs et de pyrexie, d'hypertension, d'hypotension, d'hyperlipémie, de maladies inflammatoires, de maladies dues à l'accentuation fonctionnelle de thrombocytes ou de myodystrophie, une quantité efficace d'un composé du 24,25-dihydroxycholécalciférol.
Pharmaceutical composition containing 24,25-dihydroxycholecalciferol According to a first aspect of the present invention, the subject of the present invention is a pharmaceutical composition
in the form of a unit dose, characterized in that it consists of an effective dose suitable for the treatment of pain and pyrexia, hypertension, hypotension, hyperlipemia, inflammatory diseases, diseases due to functional enhancement of thrombocytes or myodystrophy, of a compound formed by 24,25-dihydroxycholecalciferol and a. excipient (vehicle or diluent) pharmaceutically acceptable.
According to a second characteristic of the present invention, it relates to a method for the treatment of pain and pyrexia, hypertension, hypotension, hyperlipemia, inflammatory diseases, diseases due functional enhancement of thrombocytes or myodystrophy, characterized by
what is given to a patient who has pain and pyrexia, hypertension, hypotension, hyperlipemia, inflammatory disease, illness
<EMI ID = 1.1>
myodystrophy, an effective amount of a compound consisting of 24,25-dihydroxycholecalciferol.
The present invention relates to a pharmaceutical composition containing 24,25-dihydroxycholecalciferol as an active ingredient for the treatment of pain and pyrexia, hypertension, hypotension, hyperlipemia, diseases inflammatory, diseases due to functional enhancement of the thrombocytes or myodystrophy and relates to a method for the treatment of pain and
pyrexia, hypertension, hypotension, hyperlipemia, inflammatory diseases, diseases due to functional enhancement of thrombocytes
or myodystrophy, characterized in that it is administered to a patient suffering from pain and pyrexia, hypertension, hypotension, hyperlipemia, an inflammatory disease, a disease due to a functional enhancement of thrombocytes or myodystrophy, an effective amount of the compound formed by
24,25-dihydroxycholecalciferol.
Concerning the diseases due to a functional accentuatim of the thrombocytes, one notes that, recently,
the number of cases of functional enhancement of thrombocytes tends to increase due to the increase
the number of elderly people and the Europeanization and Americanization of eating habits and the social environment as main factors
and, among the treatments planned for diseases due
to the functional enhancement of the thrombocytes, an antithrombotic treatment was applied.
The diseases to which antithrombotic treatment applies are cerebrovascular diseases, such as cerebral infarction and transient paroxysmal cerebral ischemia, ischemic heart diseases, such as myocardial infarction, thrombosis due to the use of materials and artificial organs, such as the artificial heart, artificial lung, artificial AV shunt, artificial heart valves, artificial catheters and vessels, small vessel disorders, such as thrombotic thrombocytopenic purpura and hemolytic anemia due to small vessel disorders and hyperthrombocytemia.
In addition, antithrombotic treatment applies to diseases with which the functional elevation of thrombocytes has a certain relationship, these diseases being diabetes mellitus, chronic nephritis, nephrotic syndrome, hypertension, multiple sclerosis, gestational toxicosis, cancers, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria, Kawasaki disease, Raynaud's disease and various vibration-induced disorders.
Although as an antithrombotic treatment,
has administered certain pharmaceutical compositions comprising dipyridamole, trapidil
or ticlopidine, there is a problem with
view of the side effects of these drugs.
Likewise, myodystrophy is a myopatic syndrome which is characterized by progressive degeneration of the skeletal muscles and is caused by hereditary factors. Since an infantile case of pseudohypertrophic myodystrophy has been reported
precisely in 1868 by Duchenne, we reported, one after the other, various sub-typical clinical cases
of this disease. As a result, we have gained the conviction that myodystrophy is a syndrome of particularly rich diversity.
In this regard, although a classification of myodystrophy has been carried out repeatedly from the point
from a clinical point of view based on the age at the onset of the disease,
of the distribution of the muscles attacked, the difference in the sexes of the patients, the hereditary types of the disease and the degree of severity of the progress of the disease, according to the classification operated in 1968 by the World Neurological Union, myodystrophy can be roughly
modo classified as being a hereditary disease, (1) of the Duchenne type (pseudohyperatrophic), (2) of the facio-scapula-brachial type, (3) of the belt type, (4)
distal type, (5) eye muscle type (6)
and pharyngoocular type. In addition, Walton and Gardner-Medwin classified both the Duchenne type and the
the belt type following the hereditary mode of 1969
and claimed that the name of the first type should be
of use limited to those of the X chromosome type and,
therefore, they included myotonia in the classification of myodystrophy, while classifying myotonia into the following three types: (i) congenital type,
(ii) type aggravated by coldness and (iii) atrophic myotonic type.
The characteristic features of the Duchenne type, as an illustrative example of myodystrophy, are as follows.
(A) With the exception of the very rare triggering of Turner's syndrome only in the female, the triggering of the Duchenne type is observed only in the male, thus suggesting the recessive character linked to the sex of the disease (B) its triggering is observed in children aged 2 to 5 years, (C) in the first place, appears the reduction of the resistance of the muscles of the pelvic arch followed by the symmetrical attack of the muscles, (D) we necessarily observe a pseudohypertrophy mainly on the lower thigh muscles, (E)
the symptoms are usually progressive and worsen and the patient becomes unable to walk within ten years of the onset of the disease,
(F) disruption of the heart muscles is frequently observed in the patient, (G) lordosis in the hips and scoliosis appear, further aggravating the disease and (H) many of the patients attacked by a myodystrophy die from malnutrition, infectious respiratory disease and heart failure
at the age of approximately 20 years.
Myodystrophy is one of the so-called refractory diseases and so far, no treatment or drug has been found that will completely cure the disease and, therefore, the discovery of a treatment or a drug which is expected 'it will extend the life of the patient with myodystrophy can be important and prove to be a great progress.
As a result of research and studies carried out
by the plaintiff on the physiological activity of
24.25- (OH) 2-D3, it has been found that this product has an antipyretic activity and a sedative activity, a blood pressure regulation activity, an antihyperlipemic activity and an anti-inflammatory activity, an inhibiting activity functional enhancement of thrombocytes and antimyodystrophic activity, activities not accompanied by side effects and, therefore, the applicant has thus arrived at the present invention.
24,25- (OH) 2-D3 is of high security, has a suppressive activity on the central nervous system, an activity regulating blood pressure, an antihyperlipemic activity, an anti-inflammatory activity, an activity of inhibition of functional emphasis
thrombocytes and antimyodystrophic activity, and therefore this product is extremely effective as an active ingredient in a pharmaceutical composition suitable for the treatment of pain and pyrexia,
hypertension, hypotension, hyperlipemia, inflammatory diseases, diseases due to functional enhancement of thrombocytes or myodystrophy.
Each of 24.25 (OH) 2-D3 is a well-known substance represented by one of the following formulas and is described, for example, in the work:
'' Vitamin D; Molecular Biology and Clinical Nutrition "by Anthony W. Norman, pages 1 to 92 (1980).
<EMI ID = 2.1>
24,25-dihydroxycholecalciferol can in particular be 24R, 25- (OH) 2-D3, 24S, 25- (OH) 2-D3 or a mixture
of these substances, however, more particularly it is preferably 24R, 25- (OH) 2-D3. The pharmaceutical composition according to the present invention for the treatment of pain and pyrexia, hypertension,
hypotension, hyperlipemia, inflammatory diseases, diseases due to functional enhancement of thrombocytes or myodystrophy includes an effective amount of the above-mentioned substance as an active ingredient and an excipient (the term excipient denotes both a vehicle and a diluent) and is used in the form of a unit dose with various types of formulas and can be administered orally or parenterally (including the rectal route), however administration by the oral is preferable.
The pharmaceutical composition containing 24.25-
(OH) 2-D3 as active ingredient is used in a form intended for administration, such as tablets, powders, granules, suppositories, capsules, solutions in alcoholic medium or in oily medium and aqueous suspensions. As the oily medium, use may preferably be made of triglycerides.
<EMI ID = 3.1>
cottonseed oil, peanut oil, fish liver oil, cocoa bean oil or glycerol.
In addition, as other constituents, it is also possible to mix lactose, starch, talc,
magnesium stearate, sorbic acid, sorbate-type salts, sugars and sugar alcohols, physiological saline, or surfactants, an antioxidant or any other drug at 24.25- (OH) 2- D3.
The pharmaceutical composition according to the present invention may contain, in the form of a unit dose,
<EMI ID = 4.1>
by weight of 24.25- (OH) 2-D3 and 24.25- (0H) 2-D3 is administered to an adult patient at the daily dose of
<EMI ID = 5.1>
The results of the acute toxicity review of
24.25- (OH) 2-D3 are shown below.
An ethanolic solution of 24R, 25- (OH) 2-D3 or
24S, 25- (OH) 2-D3 was dissolved in a triglyceride
<EMI ID = 6.1>
containing 2% by weight of ethanol.
The sample thus prepared was administered to each of the animals in a group of 10 male ICR mice
<EMI ID = 7.1>
body weight. The observation of the mice thus treated as for their symptoms of intoxication, for a period of 2 weeks following the administration, was not followed by any abnormal finding in the mice, none of which died.
The results of the examinations performed after the sacrifice of each of the mice, including the blood examination, the biochemical examination, the autopsy and the pathohistological examination, were the same as those obtained with mice to which only the triglyceride was administered. fatty acid containing 2% by weight of ethanol.
<EMI ID = 8.1>
<EMI ID = 9.1>
100 mg / kg of body weight for each of the mice and that the same results were obtained during the administration of 24S, 25- (OH) 2-D3 in the same manner as that described above, it can be said that the present substance is extremely safe compared to
<EMI ID = 10.1> <EMI ID = 11.1>
body weight. The present invention will now be explained in more detail with reference to the following examples, in which 24R, 25- (OH) 2-D3 were used, confirmation of the structure of the optical isomer due
<EMI ID = 12.1>
Letters ", N [deg.] 6, pages 2203 to 2206, 1975.
The following examples illustrate the present invention in more detail; however, it should be understood that the scope of the present invention is in no way limited by the examples in question.
EXAMPLE 1
Antipyretic and sedative activity of the substance according to the invention
Sedative activity
<EMI ID = 13.1>
Test animals were chosen from mice
ICR females, by pressing on the root of
the tail of each animal and while using a pressure stimulation device from Takagi and Kameyama (manufactured by the company Natsume Works) and taking the individuals who manifested a pain threshold value in the range of 50 to 80 mm of Hg The test animals thus chosen were divided into groups each consisting of 10 animals.
A solution of 24R, 25- (OH) 2-D3 was administered in
<EMI ID = 14.1>
oral to each animal tested, at a dose of
100 micrograms / kg of body weight and the animal thus treated was subjected to the aforementioned mechanical stimulation by repeating the stimulation as time goes by, while increasing the pressure until the animal subjected to the test manifested the pseudo-escape reaction. The pressure applied at the time of the pseudo-escape and the duration (seconds) until the manifestation of the pseudo-escape reaction were recorded and are reported in Table 1 and they were used as a factor to judge the sedative effect of 24R, 25- (OH) 2-D3.
TABLE 1
<EMI ID = 15.1>
Female ICR mice were distributed 5 to 6 weeks after birth into groups each consisting of
10 animals and tested according to the method of Kostet et al. (1959) as follows.
6 hours after oral administration
<EMI ID = 16.1>
group, at a dose of 100 micrograms / kg of body weight, an aqueous solution containing 0.6% of acetic acid was injected intraperitoneally into each of the mice thus treated, at a dose of 0.1 ml / 10 g of body weight. 10 minutes after the injection, the number of mice contorting for 10 minutes was counted and the rate (percent) of inhibition of stimulation by acetic acid was obtained using the following formula, in comparison with the number of contortions observed on each mouse in the control group, control mice to which only the triglyceride and the acetic acid solution had been administered.
The stimulation suppression rate (%) =
(1-T / C) x 100 where T represents the average number of contortions in the test group and C represents the average number of contortions in the control group.
The results of the test are collated in Table 2, where the rate of suppression of stimulation is indicated by I.R. (%).
TABLE 2
<EMI ID = 17.1>
Antipyretic activity
The test was carried out according to the method of Winter et al. (1961) as follows.
To each of 6 rats constituting a group, a 20% aqueous suspension of brewer's yeast was administered by the subcutaneous route and, after 19 hours of youth, a 24R solution was administered by the oral route. 25- (OH) 2-D3 in an acid triglyceride
<EMI ID = 18.1>
100 micrograms / kg body weight.
To each of 6 rats constituting another group, one
administered the same aqueous solution of brewer's yeast, however, after a 19 hour youngster, only the same triglyceride was administered to serve these treated control animals and another group of
6 rats as a control without specific treatment.
The rectal temperature of each of the animals in the three groups mentioned above was measured as a function of time and the minimum rectal temperature of the animal under test, shown, was recorded.
when the activity of 24R, 25- (OH) 2-D3 manifested
the maximum value. The rectal temperature of the treated witnesses and that of the witnesses at the time mentioned above were also recorded.
The suppression rate of the rectal temperature rise, i.e. the suppression rate of the
<EMI ID = 19.1>
next :
<EMI ID = 20.1>
in which T represents the mean rectal temperature
<EMI ID = 21.1>
mean rectal temperature of the group of treated control animals and C2 represents the mean rectal temperature of the control animals not specifically treated.
The rate thus obtained of suppression of pyrexia caused by brewer's yeast and suppressed by
<EMI ID = 22.1>
EXAMPLE 2
Reducing blood pressure activity
Orally, a solution of
24R, 25- (OH) 2-D3 in a triglyceride of a fatty acid in
<EMI ID = 23.1>
animals suffered from spontaneous hypertension, the administration being carried out at a dose of 100 micrograms / kg of body weight. After 6 hours and 12 hours after administration, the blood pressure of each of the rats thus treated was measured using a tonometer
(manufactured by Ueda Works, model USM-105R) and the difference between the blood pressure before administration and that after 9 and 12 hours after administration was evaluated.
<EMI ID = 24.1>
as a hypotensive, while using rats which had been administered only triglyceride as a control.
The results of the test are reported below in Table 3.
TABLE 3
<EMI ID = 25.1>
Likewise, in the test carried out in a similar manner using 24S, 25- (OH) 2-D3, an approximately identical result was obtained.
In particular, each of the 24.25- (OH) 2-D3 clearly manifested a reduction in blood pressure activity, thus demonstrating their effectiveness as a hypotensive.
EXAMPLE 3
Activity to reduce blood lipid content
After having fed a group of white Japanese rabbits, male, of a solid food (CR-1) containing 1% cholesterol for approximately 3 months, the feeding being carried out ad libitum and confirmation of the elevation
the lipid content of the blood of these animals, the following test was carried out, however the animals thus treated were used as model animals for hyperlipemia.
Orally, a solution of
<EMI ID = 26.1>
<EMI ID = 27.1>
grams / kg of body weight and a blood sample was taken over time to analyze it for serum fluid content, i.e. total serum cholesterol level per use an enzymatic process and � -lipoproteins therein, by the turbidimetric process. The results obtained are presented in Table 4 which follows.
TABLE 4
<EMI ID = 28.1>
Notes: * duration after administration
** groups powered by CR-1, but not
subject to administration
*** the sign of (-) shows the increase in
rate.
From the toxicological properties and the pharmacological results described above, it is understood that 24R, 25- (OH) 2-D3 can be conveniently used as an active ingredient in the antilipemic pharmaceutical composition and the pharmaceutical composition for the treatment of arteriosclerosis.
EXAMPLE 4
Anti-inflammatory activity of the substance according to the invention
Carrageenan-induced edema suppression activity
After 6 hours of forced administration of a solution of 24R, 25- (OH) 2-D3 in a fatty acid triglyceride
<EMI ID = 29.1>
group consisting of 10 rats at a dose of 100 micrograms / kg, following the method of van Arman et al. (1963), an aqueous suspension of 1% carrageenan in physiological aqueous saline was injected into the plant of the right hind paw of each of the rats. We
determined the volume of the plant thus treated as a function of the passage of time after the injection so as to obtain the rate of suppression of the edema due
injection of carrageenan, while using
the following formula:
<EMI ID = 30.1>
where T represents the average volume of the plant of the paw and C represents the average volume of the plant of the paw of the control rat to which the triglyceride was administered instead of the solution of 24R, 25- (OH) 2-D3 in triglyceride.
As a result of this experiment, it was found that the rate of suppression of edema due to carrageenan <EMI ID = 31.1>
Granuloma formation suppressing activity
After injection of air by the subcutaneous route, into the back of each of 6 rats, constituting a group, to form a pocket, 0.5 ml of a solution of 1% croton oil was injected into sesame oil in the pocket. Then a solution of 24R, 25- (OH) 2-D3 was administered orally in a trigly-
<EMI ID = 32.1>
thus treated, continuously, for 5 days, at
the daily dose of 10 micrograms / kg of body weight. On the 6th day, the quantity of the liquid which exuded in the bag was measured and the data were applied at the same time as the data obtained on the control animals to which the triglyceride was injected with
instead of the solution in the triglyceride, with the same formula, the rate of suppression of the formation of the granuloma was obtained. The suppression rate by 24R, 25- (OH) 2D3 was 17.8%, showing the efficacy of this drug substance as an anti-inflammatory agent.
EXAMPLE 5
Activity inhibiting the rate of agglutination of thrombocytes
The effect of 24R, 25- (OH) 2-D3 on the agglutination of thrombocytes induced by adenosine diphosphate (which will be called hereinafter ADP) was examined in vitro, while using a plasma. rich in platelets (hereinafter referred to as PRP) obtained from normal male Wistar rats, 20 weeks after birth, as follows.
The blood was collected with the addition of citrate in the proportion of 1/9 of the whole blood collected from rats, and the blood sample thus collected was subjected to centrifugation for 6 minutes.
1500 rpm, so as to obtain a supernatant liquid which was used as PRP.
To 250 ml of PRP was added 1.5 microliter of an ethanolic solution of 24R, 25- (OH) 2-D3, at a concentration of 2 mg / ml and, after incubation of the mixture for 2 minutes at 37 [ deg.] C, 30 micromoles of ADP were added to the incubated mixture and the mixture thus obtained was subjected to a determination of the agglutination speed, using a Lumiagglutination module from Payton, model 1000, as apparatus for the observation of this function, the final concentration: in 24R, 25- (OH) 2-D3 reaching 12 micrograms / ml of the mixture of PRP and
<EMI ID = 33.1>
ethanol in the mixture being 0.6%. As a control, a mixture of 250 ml of PRP and 1.5 microliter of ethanol containing 0.6% ethanol was used. The
<EMI ID = 34.1>
ADP-induced thrombocyte agglutination in PRP was obtained from the following formula:
<EMI ID = 35.1>
where C represents the maximum agglutination rate in the controls and T represents the maximum agglutination rate in the sample to which 24R, 25- (OH) 2D3 was added.
In the test in question, C was 44.5% and T
<EMI ID = 36.1>
(OH) 2-D3 was approximately 0%.
EXAMPLE 6
Inhibitory activity on the agglutination of human thrombocytes
<EMI ID = 37.1>
ADP induced human thrombocyte count, similar to that described in Example 5, however using PRP obtained from fresh blood from the vein of a healthy person, the final concentration of 24R, 25- (OH) 2-D3 in the treated sample being 1 microgram / ml and the amount of ADP being 5 micromoles.
As a result of this review, it was found that the
<EMI ID = 38.1>
tion of human thrombocytes induced by ADP was
37.6%.
EXAMPLE 7
Inhibitory activity of thrombocyte agglutination in a rat suffering from STZ-induced diabetes mellitus
The inhibitory effect of 24R, 25- (OH) 2-D3 on the agglutination of thrombocytes in PRP taken from rats suffering from streptozocin-induced artificial diabetes mellitus and that in PRP taken from normal rats was examined as follows .
After fasting male Wistar rats in the 6th week after birth for 48 hours, streptozocin was administered to each rat, at a dose of 65 mg / kg of body weight, and one week after administration, took a blood sample from the codal vein of each rat to test the concentration of blood sugar in it and the concentration of glucose in the urine of the rats was also measured.
Rats with low blood sugar
500 to 600 mg / kg and a urinary glucose excretion of ++++ (2%) on Hemaconbistiz III test paper
(Miles.Sankyo Co., Ltd.) were taken as test animals with diabetes mellitus and collected
the blood of these rats, as well as that of normal rats
(who had not been administered streptozocin), while using citrate when collecting blood.
The PRP prepared from the collected blood thus obtained in the same manner as that described in Example 7 was further diluted by adding PPP (lean plasma
in platelets, obtained by subjecting the rest of the PRP preparation to a centrifugal separation lasting 10 minutes at 3,000 rpm), to obtain the diluted PRP containing 300,000 thrombocytes / mm <3>. The amount of ADP (coagulant) was 30 micromoles.
The result of the examination is presented in Table 5.
By way of reference, in this test, the final concentration of 24R, 25- (OH) 2-D3 in the mixture of
Diluted PRP and ethanolic solution of 24R, 25- (OH) 2D3 is also presented in Table 5. As a control, the mixture of diluted PRP and ethanol was used.
TABLE 5
Effect of 24R, 25- (OH) -D on thrombocytes in PRP taken from rats with artificial diabetes mellitus
<EMI ID = 39.1>
Note: * Control, PRP containing 0.6% ethanol.
In addition, the effect of 24R, 25- (OH) 2-D3 on the inhibition of thrombocyte agglutination induced by 30 micromoles of ADP in diluted PRP was examined.
(containing 300,000 thrombocytes / mm <3> of this diluted PRP)
prepared from blood taken from normal rats, to show that the maximum rate of agglutination of throm-
<EMI ID = 40.1>
concentration of 24R, 25- (OH) 2-D3.
As can be seen from Table 5, the inhibitory effect of 24R, 25- (OH) 2-D3 on the agglutination of thrombocytes induced by ADP in PRP prepared from the blood drawn from rats suffering from diabetes mellitus induced to streptozocin, manifested an elevation with increasing concentration of 24R, 25- (OH) 2-D3 after having presented a peak (not shown in table 5), then it gradually decreased, but while remaining important, for example, the rate of inhibition of thrombocyte agglutination was 25.1% at the
<EMI ID = 41.1>
EXAMPLE 8
Inhibitory activity on the agglutination of thrombocytes in rats suffering from hereditary hypertension
The effect of 24R, 25- (OH) 2-D3 on the inhibition of thrombocyte agglutination in PRP collected from blood drawn from rats with hereditary hypertension (the model animal) was examined as follows spontaneous hypertension, referred to hereinafter as RHS rats).
Blood was collected from each abdominal aorta of RHS rats 7 to 8 weeks after birth, using citrate, and PRP was prepared from the collected blood to examine the aggregation of thrombocytes in the PRP of the as described in Example 8, the final concentration of 24R, 25- (OH) 2-D3 being 1 ng / ml of PRP withdrawn from the animal subjected to the test and ethanol being added to the PRP withdrawn normal animals instead of the ethanolic solution
of 24R, 25- (OH) 2-D3.
<EMI ID = 42.1>
ADP-induced thrombocyte agglutination was 8.3% compared to controls.
EXAMPLE 9
Inhibitory activity on the agglutination of thrombocyte from rabbits suffering from hyperlipemia and experimental arteriosclerosis
Male white Japanese rabbits were fed solid food containing 1% by weight cholesterol, ad libitum, for 3 months and after confirmation of the elevation in the lipid concentration of their serum, the effects of 24R, 25- (OH) 2-D3 on the agglutination of thrombocytes in PRP of rabbits thus fed, induced with ADP, while following the process of preparation of PRP and determination of the degree of agglutination presented in l example 9. The
<EMI ID = 43.1>
was 1 ng / ml and the amount of ADP was 30 micromoles. Ethanol was mixed instead of the solution
<EMI ID = 44.1>
blood taken from control (normal) animals.
As a result, it was found that 24R, 25- (OH) 2-D3 exhibited an inhibition rate of 15.8% on the agglutination of thrombocytes in PRP prepared from treated rabbits induced with ADP.
EXAMPLE 10
Inhibitory function on the agglutination of thrombocytes from model animals suffering from renal failure
Male Wistar rats were subjected, 6 weeks after birth, to a total nephrectomy and after confirmation of the marked increase in serum BUN (urea nitrogen in serum) of these animals, on the third day after the intervention, examined the effect of 24R, 25- (OH) 2-D3 on the agglutination of thrombocytes in prepared PRP
from the blood of rats thus treated induced with ADP, while using the rats thus treated as animal models of renal failure and by following the methods of preparation of PRP and of determination of the degree of agglutination of the thrombocytes presented to the example 10.
The final concentration of 24R, 25- (OH) 2-D3 in the treated PRP was 1 ng / ml and the amount of ADP was
30 micromoles. The PRP of control animals was mixed
with ethanol instead of the ethanolic solution of
24R, 25- (OH) 2-D3.
As a result, it was found that 24R, 25- (OH) 2-D3 exhibited an effect of inhibiting the agglutination of thrombocytes in the PRP of animals thus treated with
17.3%.
EXAMPLE 11
Antithrombotic function of the substance according to the invention
Twenty male Wistar rats were divided 10 weeks after birth into two equal groups and a solution of 24R, 25- (0H) 2-D3 was forcibly administered in tri-
<EMI ID = 45.1>
from the first group and animals from the other group were administered only triglyceride for control.
ADP was injected intravenously into all rats 6 hours after the above administration.
As a result, all rats in the control group died, however the mortality in those in the first group
<EMI ID = 46.1>
63%. These results prove the antithrombotic function of 24R, 25- (OH) 2-D3.
EXAMPLE 12
Treatment of model animals with dystrophy
After obtaining male mice C57BL / 6J dy / dy
(which will be called hereinafter in this brief present animals) 4 weeks old from the Japan Clea Co. and confirmation that these animals suffered from myodystrophy, we gave ad libitum a solution of 24R, 25- (OH ) 2-D3, prepared by dissolving this compound in an aqueous solution of 0.001% isopropyl alcohol (containing 24R, 25- (OH) 2-D3 corresponding to the daily dose
0.1 g g / kg body weight or 1 g g / kg body weight) to groups I and II of the present animals, as drinking water since the fifth week following the birth. In addition, the control group of the present animals was given ad libitum a 0.001% aqueous solution of isopropyl alcohol as drinking water. Next, to the untreated group of animals, tap water ad libitum was administered as drinking water.
As a result of the tests of Example 12, the survival rate of the
mice in each group, 150 days after administration of the specified drinking water (150 days corresponds
the average lifespan of the present animals from 4 to
5 months described in the book "Handbook for Model Animals of Diseases" Ed. By ISHIYAKU Publishing Co., page 421).
TABLE 6
<EMI ID = 47.1>
The results presented in Table 6 demonstrate the effectiveness of the substance according to the invention for lengthening the life of sick animals.
EXAMPLE 13
Preparation of a pharmaceutical composition containing the substance according to the invention as an active ingredient
<EMI ID = 48.1>
C10, in which argon gas was bubbled for 72 hours under irradiation with a mercury lamp
at a high pressure of 400 W, so as to remove the peroxides which were originally contained therein, 5 mg of 24R, 25- (OH) 2-D3 were dissolved. The solution thus obtained and the wall component, prepared by combining the following components under heating, were introduced into a machine for producing soft capsules, so as to obtain the pharmaceutical composition encapsulated in soft capsules containing 1,2,5 or 10 micrograms of 24R, 25- (OH) 2-D3 in a capsule.
Components for the wall of soft capsules
10 parts by weight of gelatin,
2 parts by weight of glycerol,
0.05 part by weight of ethyl parahydroxybenzoate
as an antiseptic,
0.2 part by weight of titanium white and
0.2 parts by weight of water in the finished capsule.
CLAIMS
1. Pharmaceutical composition in the form of a unit dose, characterized in that it comprises an effective dose for the treatment of pain and pyrexia, hypertension, hypotension, hyperlipemia, inflammatory diseases, diseases due to functional enhancement of thrombocytes or myodystrophy, of a 24,25-dihydroxycholecalciferol compound and a pharmaceutically acceptable excipient (vehicle or diluent).
2. Pharmaceutical composition according to claim 2, characterized in that the compound is 24R, 25dihydroxycholécalciferol.
3. Method for the treatment of pain and pyrexia, hypertension, hypotension, hyperlipemia, inflammatory diseases, diseases due to functional enhancement of thrombocytes or myodystrophy, characterized in that l is administered to a patient suffering from pain and pyrexia, hypertension, hypotension, hyperlipemia, inflammatory diseases, diseases due to functional enhancement of thrombocytes or myodystrophy, an effective amount of a compound 24,25-dihydroxycholecalciferol.