<Desc/Clms Page number 1>
smeltpunt (242 C) in vergelijking tot het hydrochloride van N-methylN-bis- (3, 4-dimethoxy-fenyl-ethyl)-amine, waarvan de structuur, zoals bovenstaand is onderstreept, hierin rigoreus is bevestigd. Daarentegen wordt volgens de aanwijzingen van de bovengenoemde publikaties een andere verbinding verkregen, zoals is gevonden door dezelfde experimentele methoden die daarin beschreven worden, te herhalen.
Bijgevolg moet de verbinding met formule 1 nieuw worden geacht.
Ook konden de farmacologische eigenschappen van de verbinding met formule 1 niet op grond van zijn aan papaverine verwante structuur worden voorzien.
Het is in feite bekend dat de therapeutische werkingen van papaverine in twijfel zijn getrokken, waartoe gewezen wordt op bijvoorbeeld Goodman & Gilman's"Pharmacological Basis of Therapeutics" McMillan, New York, 830 Needleman en Johnson, waarin wordt opgemerkt dat"niet is aangetoond dat papaverine in enige toestand van therapeutische waarde is".
Soortgelijke conclusies werden ook getrokken door een commissie van deskundigen van de U. S. Food and Drug Administration, die opmerkten dat er in geen van de door de producenten genoemde indicaties elementen zijn die de werkzaamheid van papaverine bewijzen.
Op grond van deze conclusies heeft de FDA voorgesteld om papaverine van de markt te halen (FDA Drug Bull. 9,26, 1979 ; Fed. Reg. 44, 30443,1979).
De in de bovengenoemde octrooien en publikatie beschreven verbindingen werden daarom nooit in therapie toegepast en uit de aanwijzingen van de stand van de techniek konden geen therapeutische indicaties worden afgeleid.
Thans is verrassenderwijze gevonden dat de verbinding met formule I een sterke calciumantagonistische werking vertoont, die vergelijkbaar is met die van nifedipine (een bekend en recent calciumantagonistisch geneesmiddel) en niet gerelateerd is aan papaverineachtige eigenschappen.
In feite zijn de werkingen van papaverine op de calciumionen complex en gekarakteriseerd door een stimulering van calciumionenstromen bij de lagere concentraties (Carpenedo et al. J. Pharm.
Pharmacol. 1971,23, 502-505) en door een antagonisme bij concentra-
<Desc/Clms Page number 2>
EMI2.1
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op N-methyl-N-bis- (3, 4-dimethoxy-fenyl-ethyl) met de algemene formule 1 van het formuleblad, welke verbinding calciumantagonistische werking heeft.
De verbinding volgens de uitvinding, die een zeer lage toxiciteit heeft, is daarom bruikbaar in de therapie van cardiovasculaire ziekten en onregelmatigheden in de cerebrale circulatie.
Rosenmund, Külz, en Buth, in US 2006114, in Ber. 72 B 18-28, 1939 en in DE 617647 hebben de synthese vermeld van een reeks van bis-fenethylethylaminen welke papaverine-achtige en spasmolytische eigenschappen bezitten, waarbij ook N-methyl-N-bis- 4-dimethoxyfenyl)-ethyl) amine is beschreven.
In feite moet de door Rosenmund et al. genoemde verbinding (waarvoor de auteurs geen gegevens verstrekken die zijn structuur ondersteunen) een andere structuur hebben dan de verbinding volgens de onderhavige uitvinding, omdat de auteurs voor zijn hydrochloride een smeltpunt van 230 of 242 C vermelden, terwijl het hydrochloride van de hier verkregen verbinding (waarvan de structuur wel is aangetoond met behulp van NMR gegevens) zelfs na herhaalde kristallisaties en in een toestand van hoge zuiverheid smelt bij 180-1850C. Zoals hierna zal worden uiteengezet, is bovendien zelfs een uitgesproken verschil waargenomen in de farmacologische eigenschappen van de verbinding volgens de uitvinding en de door Rosenmund et al. genoemde verbinding.
Waarschijnlijk moet de andere aard van de laatstgenoemde verbinding in verband worden gebracht met het feit dat het corresponderende secondaire amine zonder N-methylgroep wordt verkregen volgens een nogal ongebruikelijke reactie, dat wil zeggen de hydrogenolyse van (3, 4-dimethoxy-fenethyl)-amine met opP/BaSO zeer hoge temperaturen, volgens het op het formuleblad weergegeven reactieschema.
Bovendien wordt in het Duitse octrooi 617647 de methylering van het secondaire amine met formaldehyde beschreven, in afwezigheid van een reducerend middel ; in het Amerikaanse octrooischrift 2006114 wordt de methylering uitgevoerd in tegenwoordigheid van mierezuur, maar het overeenkomstige hydrochloride heeft niettemin een nog hoger
<Desc/Clms Page number 3>
EMI3.1
- ties van ongeveer 10 M (Sanguinetti en West, J. Phar,. Exp. Ther., 219,715, 1981).
Dezelfde auteurs toonden ook aan dat papaverine en verapamil, een bekende calciumantagonist, wederzijds antagonistisch zijn op de langzame intreestromen die door calciumionen in geïsoleerde atria van cavia's worden ondersteund.
Papaverine is derhalve geheel verstoken van calciumantagonistische werking en dezelfde eigenschap zou men moeten verwachten voor structureel verwante verbindingen.
Bovendien is de belangrijkste biochemische werking van papaverine en enkele van zijn derivaten de inhibitie van fosfodiasterasen (Kukovetz en Poch, Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharm., 267,189-194, 1970). Daarentegen is thans verrassenderwijze gevonden dat N-methyl- N-bis- (3, 4-dimethoxy-fenyl-ethyl)-amine naast het bezit van een sterke calciumantagonistische werking, volledig verstoken is van een inhiberende werking op de fosfodiasterasen.
Het therapeutische en farmacologische profiel van de verbinding volgens de uitvinding moet om die reden onvoorzienbaar worden geacht, om redenen van zowel de bovenstaand vermelde publikaties als de farmacologie van papaverine, ondanks mogelijke structurele analogiën.
De verbindingen volgens de uitvinding zijn derhalve nieuwe therapeutische middelen die het intreden van calcium blokkeren, bruikbaar in de myocardiale ischemie en in cerebro-vasculaire ziekten die door cerebrale oligoémie worden veroorzaakt.
De verbinding volgens de uitvinding wordt bereid uit bis- (2- (3,4-dimethoxyfenyl) ethyl) amine onder omstandigheden van een reducerende aminering, dat wil zeggen door behandeling met formaldehyde in een reducerend medium.
Ter toelichting van de uitvinding wordt het volgende voorbeeld gegeven.
VOORBEELD a) 3,4-dimethoxyfenylacetylchloride
Men loste 29,5 g 3,4-dimethoxyfenyl-azijnzuur op in 200 cm3 watervrij chloroform, die vrij was van ethanol. Daarna werd 23,8 g thionylchloride toegevoegd. Men kookte het mengsel gedurende 4 uur
<Desc/Clms Page number 4>
onder terugvloeikoeling. Daarna verwijderde men onder verminderde druk het oplosmiddel en de overmaat reagens. Men destilleerde het olieachtige residu onder verminderde druk (10 mmHg) waarbij de fractie werd verzameld die bij 170-172 C overdestilleerde.
Men verkreeg aldus 26 g van het zuivere zuurchloride in een opbrengst van 81%. b) N- (2- (3, 4-dimethoxyfenyl) ethyl) -3, 4-dimethoxyfenyl-acetamide 3Men loste 21,7 g - (3, 4-dimethoxyfenyl) ethylamine op in 150 cm3 watervrije chloroform en voegde de oplossing daarna toe aan 15,2 g watervrij triëthylamine. Men koelde de oplossing op een temperatuur
EMI4.1
tussen 5 en 10 C en voegde vervolgens onder roeren het in deel a) bereide 3, 4-dimethoxyfenylacetylchloride in een hoeveelheid van 26 g, opgelost in 80 cm3 watervrije chloroform, toe. Men liet de temperatuur stijgen tot kamertemperatuur. Daarna kookte men gedurende 8 uur onder terugvloeikoeling.
Na afkoeling van het mengsel door toevoe-
EMI4.2
3 ging van een extra portie chloroform van 200 werd de organische fase gewassen met water en daarna met 5% zoutzuur en een extra hoeveelheid water, vervolgens 5% natriumhydroxyde en uiteindelijk water.
De organische fase werd gedroogd boven watervrij natriumsulfaat en na filtreren werd het oplosmiddel onder verminderde druk verdampt.
De aldus verkregen vaste stof werd herkristalliseerd uit absolute ethanol. Het zuivere amide werd in een hoeveelheid van 36 g, een opbrengst van 84%, verkregen met een smeltpunt van 128 C. De stof geeft één enkele vlek bij chromatografie, waarbij als eluens ethanol werd toegepast. c) Bis- (2- (3, 4-dimethoxyfenyl) ethyl) amine
Men suspendeerde 37,7 g natriumborohydride in 1500 cm watervrije tetrahydrofuran in een inerte stikstofatmosfeer. Men voegde aan de suspensie 36 g van het in deel b) bereide amide toe, terwijl men het mengsel roerde en koelde tot 10 C, en men voegde ook 58 cm ijsazijn toe. Men kookte het mengsel onder terugvloeikoeling gedurende 4 uur.
Aan het eind van deze periode werd het oplosmiddel onder verminderde druk verdampt en werd het residu behandeld met water en daarna met verdund zoutzuur tot het volledig zuur was. Aan het mengsel werd vervolgens een oplossing toegevoegd van natriumhydroxyde totdat de pH basisch was, en het materiaal werd vier keer met telkens 300 cm3 dichloromethaan geëxtraheerd. De organische fase werd geëxtraheerd
<Desc/Clms Page number 5>
met verdund zoutzuur, de zure oplossing werd gewassen met dichloromethaan. Hij werd daarna gekoeld en basisch gemaakt met kaliumcarbonaat en uiteindelijk opnieuw geëxtraheerd met vier porties dichloromethaan, waarbij elke keer 200 cm werd gebruikt. De organische fase werd gedroogd boven watervrij natriumsulfaat, gefiltreerd en verdampt.
Het residu was het ruwe amine, dat uit ethanol werd herkristalliseerd waarbij een zuiver produkt werd verkregen in een hoeveelheid van 28,5 g, opbrengst 75% ; smeltpunt 56-580C. Bij dunnelaagchromatografie verkreeg men één enkele vlek (eluens : n-butanol, ethanol, azijnzuur, water 60 : 20 : 40 : 10).
Elementairanalyse : berekend % C = 69,54 ; H = 7,88 ; N = 4,05 ; gevonden % C = 69,77 ; H = 8,01 ; N = 4,16. d) N-methyl-N-bis- (3, 4-dimethoxy-fenyl-ethyl) amine
Men loste 10,4 g van de in deel c) bereide verbinding op in 100 cm methanol en voegde 30 cm 37%-ig formaldehyde toe. Men kookte het mengsel gedurende 40 min onder roeren, koelde daarna af met een
EMI5.1
ijsbad tot 0 C en voegde 4 g toe in kleine porties. Men zette het roeren gedurende 1 1/2 uur bij kamertemperatuur voort en verdampte vervolgens methanol onder verminderde druk. Het residu werd opgelost in water, aangezuurd met zoutzuur. Nadat men een paar minuten had geroerd, werd afgekoeld en werd de oplossing duidelijk basisch gemaakt met een natriumhydroxyde-oplossing.
De basische oplossing werd met dichloromethaan geëxtraheerd, de organische fase werd geisoleerd, werd gewassen met water, en werd gedroogd boven NaSO. Daarna werd gefiltreerd en werd het oplosmiddel onder verminderde verdampt tot een droge toestand. Het residu werd twee keer uit n-hexaan gekristalliseerd, waarbij elke keer 100 cm werd gebruikt, waarbij aldus een zuiver produkt in een hoeveelheid van 6,7 g, opbrengst 62% ; met een smeltpunt van 67-69 C werd verkregen. Het produkt gaf bij dunnelaagchromatografie een enkele chromatografische vlek onder toepassing van hetzelfde eluens als in het geval van het amine onder c).
Elementairanalyse voor C21H29N04 (mol. gew. = 359,47) berekend % C = 70,16 ; H = 8,13 ; N = 3,89 ; gevonden % C = 70,23 ; H = 8,17 ; N = 3,85.
<Desc/Clms Page number 6>
De aldus verkregen verbinding wordt onderstaand aangeduid met het symbool YS 035. De structuur van de verbinding is door spectroscopische gegevens bevestigd.
Spectrum H NMR (opgenomen in CDC1, onder toepassing van TMS als interne referentie). De waarden van de chemische verschuivingen van de protonen worden uitgedrukt in 2,35 (s, 3H, N-CH3) ; 2,7 (s, 8H, N- (CH2-CH2) 2) ; 3,8 (s, 12H, 4 (OCH3)) ; 6,7 (s, 6H aromatisch).
Het hydrochloride van de verbinding YS 035 vertoonde een smeltpunt van 180-1850C.
Elementairanalyse voor C21H30N04Cl (mol. gew. = 395,93) berekend % C = 63,70 ; H = 7,63 ; N = 3,54 ; gevonden % C = 63,42 ; H = 7,45 ; N = 3,39.
De verbinding YS 035 is onderworpen aan een reeks farmacotoxicologische tests om de werking te bepalen in vergelijking met de bekende geneesmiddelen Nifedipine en Nicardipine die een calciumantoganistische werking bezitten. De aldus verkregen resultaten worden onderstaand vermeld.
Acute toxiciteit van YS 035
De acute toxiciteit is bepaald door de orale route, door de veneuze route in mannetjes-ratten volgens de methode van Litchfield en Wilcoxon (J. Pharm. Exp. Therap., (1949), 96, blz. 99). De stof YS 035 vertoonde een toxiciteit DL50 van 177,9 mg/kg in het geval van de orale route en 19 mg/kg in het geval van de veneuze route.
PHARMACOLOGIE Calciumantagonistische werking Inhibitie van de Ca-opname in synaptosomen van de hersenen van ratten
De synaptosomen zijn bereid uit een homogenaat van de hersenen van ratten door centrifugeren in de gradiënt van Filcoll bij 23.500 omw/min in een periode van 30 min en verdund tot 1,5 mg/cm3 in het medium, gevormd door :
<Desc/Clms Page number 7>
EMI7.1
<tb>
<tb> NaCl <SEP> 120 <SEP> mM
<tb> KC1 <SEP> 30 <SEP> mM
<tb> MgS04 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> mM
<tb> KH2P04 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> mM <SEP>
<tb> NaHCO3 <SEP> 5 <SEP> mM <SEP>
<tb> TES <SEP> 20 <SEP> mM
<tb> glucose <SEP> 10 <SEP> mM
<tb>
De stof YS 035 en nifedipine en papaverine ter vergelijking zijn toegevoegd aan het medium in een uiteindelijke concentratie van
EMI7.2
45 250 Na 15 min preincubatie, werd CaCl, 3 (0, 2 ? aan het medium toegevoegd. uM.De eerste bepaling werd 2 min na de toevoeging uitgevoerd.
De gevonden concentraties werden genomen als de waarden op het tijdstip 0. De andere controles werden na 5 min, 10 min en 15 min uitgevoerd. Na elke periode werd de reactie door centrifugeren gestopt en werd de radioactiviteit in de bovenstaande vloeistof en in de pellet bepaald. Laatstgenoemde was tevoren gedenatureerd met PCA, geneutraliseerd en daarna gecentrifugeerd.
De in de volgende tabel A getoonde resultaten zijn uitgedrukt als de hoeveelheid calcium, die per mg eiwit was overgebracht na de maximum incubatieperiode van 15 min.
TABEL A
EMI7.3
<tb>
<tb> 2+
<tb> Verbinding <SEP> Ca-opname
<tb> (n <SEP> g <SEP> ionen/mg <SEP> eiwit/15 <SEP> min)
<tb> controle <SEP> 80 <SEP> 7
<tb> papaverine <SEP> (250 <SEP> uM) <SEP> 79 <SEP> : <SEP> 5
<tb> nifedipine <SEP> (250 <SEP> uM) <SEP> 42 <SEP> 5
<tb> YS <SEP> 035 <SEP> (250 <SEP> M) <SEP> 47 <SEP> ¯ <SEP> 4
<tb>
Op basis van de gegevens in de tabel is het mogelijk om te constateren dat de inhibitore werking op de calciumopname, die wordt uitgeoefend door de nieuwe stof YS 035 in de synaptosomen van de hersenen van ratten, vergelijkbaar is met de werking die door nifedi-
<Desc/Clms Page number 8>
pine wordt vertoond, terwijl papaverine geheel verstoken is van calciumantagonistische werking.
Inhibitie van Ca-opname in niercellen van pasgeboren hamsters-
Cellen van nieren van pasgeboren hamsters werden gewassen en daarna verscheidene keren opnieuw gesuspendeerd in een concentratie van 5. 106/cm3 in het medium met de volgende samenstelling :
EMI8.1
<tb>
<tb> NaCl <SEP> 120 <SEP> mM
<tb> KC1 <SEP> 5,5 <SEP> mM
<tb> glucose <SEP> 5,5 <SEP> mM
<tb> NaHPO <SEP> 0,7 <SEP> mM
<tb> NaHCO <SEP> 25 <SEP> mM
<tb> MgCl <SEP> 1,3 <SEP> mM
<tb> TRIS. <SEP> HCl <SEP> bij <SEP> pH <SEP> 7, <SEP> 4 <SEP> 10 <SEP> mM
<tb>
De stof YS 035 en nifedipine ter vergelijking werden toege-
EMI8.2
voegd in een uiteindelijke concentratie van 250 uM.
Na 15 min preincubatie bij 30 C, deed men de reactie beginnen 45 3 door toevoeging aan het medium van CaCl (0, 1uCi/cm3).
De concentraties op tijdstip 0 waren de concentraties die 2 min na de toevoeging werden vastgesteld. De andere controles werden na 5 min, 10 min en 20 min uitgevoerd. De bepaling van [ca2+] werd uitgevoerd als in het voorgaande experiment.
De resultaten worden getoond in tabel B als de hoeveelheid Ca
EMI8.3
c die per mg eiwit was overgebracht (1 mg eiwit = 5. cellen) na de maximale incubatieperiode van 15 min. De verkregen resultaten tonen in dit experimentele model de inhibitore werking op de opname van Ca, die door zowel de verbinding YS 035 als door nifedipine wordt vertoond. De werking van de nieuwe verbinding in kwantitatieve termen is echter superieur aan de werking van nifedipine.
TABEL B
EMI8.4
<tb>
<tb> 2+
<tb> Verbinding <SEP> Ca <SEP> - <SEP> opname <SEP>
<tb> Verbinding
<tb> (n <SEP> g <SEP> ionen/mg <SEP> eiwit/15')
<tb> - <SEP> 11, <SEP> 9
<tb> YS <SEP> 035 <SEP> 7,5 <SEP> (-36,9% <SEP> inhibitie)
<tb> nifedipine <SEP> 7,9 <SEP> (-33, <SEP> 6% <SEP> inhibitie)
<tb>
<Desc/Clms Page number 9>
Inhibitie van Ca-opname in mitochondria van de lever van ratten
Volgens klassieke methoden geprepareerde mitochondria werden verdund tot een concentratie van 1, 5 mg/cm3 in een incubatiemedium met de volgende samenstelling :
EMI9.1
<tb>
<tb> saccharose <SEP> 200 <SEP> mM
<tb> KCl <SEP> 20 <SEP> mM
<tb> TRIS. <SEP> HCl <SEP> bij <SEP> pH <SEP> 7,4 <SEP> 10 <SEP> mM
<tb> succinaat <SEP> 2 <SEP> mM <SEP>
<tb> rotenone <SEP> l <SEP> ut <SEP>
<tb>
De verbinding YS 035 en nifedipine ter vergelijking werden aan het medium toegevoegd in een uiteindelijke concentratie van
EMI9.2
45 250 uM. Na een periode van 15 min preincubatie bij 200c werd CaCl toegevoegd (50 n mol/mg eiwit).
Op een aan de voorgaande experimenten analoge wijze werden de na 2 min bepaalde concentraties genomen als concentratie op het tijdstip 0. De andere controles werden na 5 min, na 10 en na 15 min uitgevoerd. Voor de bepaling van Ca, werd het experiment op analoge wijze als de voorgaande experimenten uitgevoerd.
De resultaten worden in tabel C vermeld als de hoeveelheid Ca, die per mg eiwit was overgebracht.
TABEL C
EMI9.3
<tb>
<tb> Verbinding <SEP> Ca2+ <SEP> - <SEP> opname
<tb> Verbinding <SEP> (n <SEP> g <SEP> ionen/mg <SEP> eiwit)
<tb> - <SEP> 14, <SEP> 3
<tb> Nifedipine <SEP> 9,5
<tb> YS <SEP> 035 <SEP> 11,0
<tb>
De inhibitore werking van de verbinding YS 035 op de opname van Ca door de mitochondria van de lever van ratten volgt duidelijk uit deze resultaten, hoewel de werking onder deze experimentele omstandigheden iets slechter is dan de werking van nifedipine.
<Desc/Clms Page number 10>
Studie op de ca2+-efflux in mitochondria van de lever van ratten
De als in het voorgaande experiment geprepareerde mitochondria van de lever van ratten werden"beladen"met Ca en vervolgens in een medium gebracht dat verstoken was van deze ionen. In tegenwoordigheid van een ontkoppelingsmiddel of"Ruthenium Red", treedt een stroom van
Ca ionen uit de mitochondria in het medium op.
De stoffen YS 035 en nifedipine werden beide in een concentratie van 250 uM zowel in tegenwoordigheid van als in afwezigheid van de typen activatoren voor het binnenstromen van Ca toegevoegd.
De in tabel D vermelde resultaten zijn uitgedrukt als de hoeveelheid Ca, die uit de mitochondria per mg eiwit per minuut was overgebracht. Op basis van deze gegevens is een ontkoppelingswerking van nifedipine waargenomen, maar de stof YS 035 vertoond deze werking niet.
TABEL D
EMI10.1
<tb>
<tb> Ca--efflux <SEP> (n <SEP> g <SEP> ionen/min. <SEP> mg/eiwit
<tb> \iërbinding..-.
<tb> geïnduceerd <SEP> door <SEP> :
<tb> Ruthenium <SEP> ontkoppelingred <SEP> middel
<tb> - <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0,7 <SEP> 8,3
<tb> Nifedipine <SEP> (250 <SEP> uM) <SEP> 3,8 <SEP> 2,2 <SEP> 8,5
<tb> YS <SEP> 035 <SEP> (250 <SEP> M) <SEP> 0,0 <SEP> 0,6 <SEP> 5,4
<tb>
Antagonistische werking op de door arachidonzuur op de aorta van konijnen geproduceerde contracties Studie in vitro
De studie is uitgevoerd door vergelijking met nicardipine waarbij autoloog bloed als perfusievloeistof werd gebruikt. De toevoeging van 0,1 mg arachidonaat aan de vloeistof induceert een isometrische contractie van de aorta die door een transductor wordt geregistreerd.
Uit de in tabel E vermelde resultaten is de inhibitore werking van de twee produkten op de door het arachidonaat geproduceerde contractie vergelijkbaar omdat beide moleculen een omleiding "by-pass"tussen de synthese van tromboxan A2 en de synthese van PGI2
<Desc/Clms Page number 11>
kunnen induceren. Dit verschijnsel wordt getoond door de relactatie die volgt op de toevoeging van arachidonaat aan het perfusiebloed.
Dit effect kan worden waargenomen met 0,1 mg/kg YS 035 en 1 mg/kg nicardipine.
TABEL E
EMI11.1
<tb>
<tb> Verbinding <SEP> Contractie <SEP> van <SEP> de <SEP> Contractie <SEP> van <SEP> de <SEP> tweede <SEP> en
<tb> eerste <SEP> portie <SEP> van <SEP> derde <SEP> portie <SEP> van <SEP> de <SEP> aorta
<tb> de <SEP> aorta
<tb> (mm) <SEP> N=4 <SEP> dosis <SEP> %
<tb> mg. <SEP> kg <SEP> N <SEP> Variatie
<tb> 0,01 <SEP> 3-42 <SEP> 31, <SEP> 0
<tb> YS <SEP> 035 <SEP> 48 <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> 0,1 <SEP> 4 <SEP> (-60 <SEP> 29, <SEP> 3)
<tb> 1,0 <SEP> 1-132 <SEP> 16, <SEP> 1
<tb> - <SEP> 16 <SEP>
<tb> Nicardipine <SEP> 38 <SEP> : <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP> 0,01 <SEP> 1-6
<tb> 0,1 <SEP> 4-48 <SEP> 15, <SEP> 5
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> (-84)-162
<tb>
N = Totaal aantal onderzochte aortaporties.
() Waarden van de kleine contracties die soms voorafgaande aan de relaxatie werden waargenomen.
Inhibitie van de fosfodiasterase werking
De inhibitie van fosfodiasterase werking van YS 035 en van papaverine is geëvalueerd volgens de methode van K. G. Nair (Biochemistry, 5, 150,1966).
Het daarvoor gebruikte medium bevatte :
2,5 ml buffer tris-HCl 0,1 M pH 7,4 ;
EMI11.2
50 .
50 mg/ml) ; 5 ui adenosine-deaminase (2 mg/ml) ; 20 basisch fosfatase"Sigma" (2, 6 mg/ml) ; 15 fosfodiasterase (10 mg/ml).
<Desc/Clms Page number 12>
EMI12.1
YS 035 werd toegevoegd tot een uiteindelijke concentratie van 100 mM en papaverine tot een concentratie van 10 mM. De
11 MgSO(inhiberende dosis 50%) bleken 0,04 mM voor papaverine te zijn, terwijl YS 035 volledig onwerkzaam bleek te zijn.
Studies in vivo
Beide stoffen YS 035 en nicardipine werden oraal toegediend gedurende een periode van drie opvolgende dagen aan konijnen op een zodanige wijze dat de laatste toediening van elke stof plaatsvond
EMI12.2
1 uur voordat de dieren werden gedood. De aortaporties werden daarna f in PRP of in de Krebs-Henseleit vloeistof geincubeerd.
De resultaten die men na de toevoeging van arachidonzuur verkreeg, zijn in onderstaande tabel F vermeld.
TABEL F
EMI12.3
<tb>
<tb> Verbinding <SEP> dosis-1 <SEP> Amplitude <SEP> van <SEP> de <SEP> contractie <SEP> (mm)
<tb> Verbinding <SEP> dosis <SEP> @
<tb> mg.kg-1
<tb> P. <SEP> O <SEP> PRP <SEP> medium <SEP> Krebs
<tb> Individuele <SEP> m <SEP> ¯ <SEP> ES <SEP> Individuele <SEP> m <SEP> ¯ <SEP> ES
<tb> waarden <SEP> waarden
<tb> +26 <SEP> + <SEP> 4
<tb> +48 <SEP> +25
<tb> +23 <SEP> +12
<tb> : <SEP> : <SEP> bntroles <SEP> - <SEP> +20 <SEP> 30 <SEP> ¯ <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> +10 <SEP> 12 <SEP> :
<SEP> t <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP>
<tb> +35 <SEP> + <SEP> 8
<tb> +37 <SEP> + <SEP> 8
<tb> +36 <SEP> +18
<tb> +16 <SEP> +12
<tb> Nicardipine <SEP> 1 <SEP> +24--30
<tb> +55-10
<tb> YS <SEP> 035 <SEP> 10 <SEP> +28--6 <SEP>
<tb> +28 <SEP> + <SEP> 7
<tb>
Deze studie toont dat zowel YS 035 als nicardipine veeleer direct werken op de synthese van prostaglandine en in het bijzonder
<Desc/Clms Page number 13>
PGI2 op het niveau van het aorta-endotheel dan dat zij werken op de vasoconstrictieve werking van tromboxan A2 op de bloedplaatjes.
Effect op het multiple cerebrale infarct in ratten
De intracarotide injectie van natriumarachidonaat (0,1 mg) veroorzaakt in ratten een oedeemreactie die gepaard gaat met een accumulatie van calcium in het hersenweefsel en aan de andere kant een daling van de cholesterolspiegel. De stof YS 035 verlaagt bij intraveneuze toediening 15 min voorafgaande aan het infarct in een dosis van 1 ; 3,3 en 10 mg/kg op gematigde wijze het intreden van calcium bij het 1 mg/kg niveau maar vertoont geen invloed op de andere wijzigingen op het biochemische niveau.
Antagonistische werking op biochemische verstoringen en neurologische gebreken tijdens de post-oligemieperiode in ratten
Oligemie in ratten wordt veroorzaakt door gelijktijdige bilaterale occlusie van de carotide arteries, welke verbonden is met een lichte afname (8-9 kPa) van de bloeddruk en wordt gedurende 60 min gehandhaafd. Na verwijdering van de occlusie wordt de post-oligomie- periode gedurende verscheidene dagen gevolgd. In dit geval wordt de observatie voortgezet totaan de derde dag, op de tijd waarbij de accumulatie van Ca++ ionen in de hersenen het maximum bereikt.
De stoffen YS 035 respectievelijk nicardipine worden aan ratten toegediend 1 ; 5 ; 18 ; 24 ; 42 en 71 uren nadat de carotide-occlusie was verwijderd. De ratten werden na 72 uren gedood en de weefsels werden snel verwijderd om hun gehalte aan water, calcium en kalium te bepalen. De resultaten zijn samengeval in de volgende tabel G.
<Desc/Clms Page number 14>
EMI14.1
TABEL G
EMI14.2
<tb>
<tb> Groep <SEP> N <SEP> mg.kg-1 <SEP> Cerebrale <SEP> concentratie
<tb> P. <SEP> kg
<tb> 7x <SEP> H2O <SEP> K+ <SEP> Ca
<tb> % <SEP> mol.kg-1 <SEP> droge <SEP> stof
<tb> Controles <SEP> 36 <SEP> - <SEP> 78, <SEP> 7 <SEP> :
<SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 499,3 <SEP> 3, <SEP> 45 <SEP> 4,4 <SEP> 0, <SEP> 20
<tb> Post-oligemie <SEP> 80,1 <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP> 366, <SEP> 2 <SEP> 12, <SEP> 58 <SEP> 28,2 <SEP> 3, <SEP> 22
<tb> controles <SEP> 11 <SEP> - <SEP> * <SEP> 0,005 <SEP> * <SEP> 0,0001 <SEP> * <SEP> 0,0001
<tb> Nicardipine <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> 79,2 <SEP> ¯ <SEP> 0,42 <SEP> 368,5 <SEP> ¯ <SEP> 19,69 <SEP> 19,3 <SEP> ¯ <SEP> 4,92
<tb> *NS <SEP> **NS <SEP> *0,01 <SEP> **NS <SEP> *NS <SEP> **NS
<tb> YS <SEP> 035 <SEP> 8 <SEP> 3 <SEP> 79,0 <SEP> : <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP> 420,0 <SEP> :
<SEP> t <SEP> 11, <SEP> 85 <SEP> 10,7 <SEP> 2, <SEP> 46
<tb> * <SEP> NS <SEP> * <SEP> 0, <SEP> 0000 <SEP> * <SEP> 0, <SEP> 0500
<tb> ** <SEP> 0, <SEP> 0309 <SEP> ** <SEP> 0, <SEP> 004 <SEP> ** <SEP> 0, <SEP> 0004
<tb>
N = aantal ratten voor elke groep P = 0,05 volgens de test van Student of Cochran * tegen de controles ** tegen de post-oligemie controles
De bovenstaande resultaten tonen YS 035 in staat is om de ernst van het celebrale oedeem te verminderen en in het bijzonder de intracellulaire accumulatie van Ca ionen aanzienlijk te verlagen.
Nicardipine schijnt eveneens op dezelfde wijze te werken, hoewel zijn werking veel minder significant is, in het bijzonder met betrekking tot de accumulatie van Ca ionen.
Anti-aritmiewerking en anti-ischemiewerking in ratten
De linker kransarterie induceert, wanneer hij is dichtgebonden, in onder anesthesie gebrachte ratten een vroegtijdige aritmie (30 min), in het bijzonder ectopische kloppingen, ventriculaire tachycardie (VT), ventriculaire fibrillatie (VF) volgens de methoden Selye 1960, Clark 1980 en Parratt 1982.
<Desc/Clms Page number 15>
Door intraveneuze injectie van YS 035,15 min voor het dichtbinden van de kransarterie in een dosis tussen 0,156 mg/kg en 20 mg/kg, werden de in onderstaande tabel B vermelde resultaten verkregen :
TABEL H
EMI15.1
<tb>
<tb> Groep <SEP> dosis <SEP> N <SEP> Significante <SEP> waarden <SEP> voor <SEP> elke <SEP> groep
<tb> mg/kg
<tb> I. <SEP> V. <SEP> aan-V <SEP> T <SEP> V <SEP> F <SEP> aantal <SEP> la-% <SEP> latente
<tb> tal <SEP> sec. <SEP> sec.
<SEP> fasen <SEP> tente <SEP> sterf-tijd
<tb> ecto-VF <SEP> (%) <SEP> tijd <SEP> te <SEP> sterfpische <SEP> te
<tb> klop- <SEP> (min)
<tb> pingen
<tb> Controles-12 <SEP> 1324 <SEP> 113 <SEP> 71 <SEP> 75 <SEP> 14 <SEP> 59 <SEP> 20
<tb> 0, <SEP> 156 <SEP> 5 <SEP> 907 <SEP> 34 <SEP> 4 <SEP> 40 <SEP> 22 <SEP> 20 <SEP> 26
<tb> 0,625 <SEP> 5 <SEP> 646 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 30 <SEP> 0 <SEP> > <SEP> 30
<tb> 1,25 <SEP> 5 <SEP> 684 <SEP> 29 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 30 <SEP> 0 <SEP> > <SEP> 30
<tb> YS <SEP> 035
<tb> 2,5 <SEP> 5 <SEP> 725 <SEP> 34 <SEP> 9 <SEP> 20 <SEP> 26 <SEP> 0 <SEP> > <SEP> 30
<tb> 5 <SEP> 2 <SEP> 1287 <SEP> 62 <SEP> 5 <SEP> 50 <SEP> 21 <SEP> 0 <SEP> > <SEP> 30
<tb> 10 <SEP> 3 <SEP> 474 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 30 <SEP> 0 <SEP> > <SEP> 30
<tb> 20 <SEP> 2 <SEP> 777 <SEP> 22 <SEP> 10 <SEP> 50 <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP> > <SEP> 30
<tb>
Zoals uit de tabel blijkt,
verhindert de toediening langs de endoveneuze route van de stoffen YS 035 het beginnen van meest ernstige aritmieén zoals VF en VT en sterkte in een dosis tussen 0,625 en 10 mg/kg. Er bestaat geen verband tussen de dosis en de waargenomen werking omdat boven een bepaalde dosis van 10 mg/kg een teruggang van de resultaten plaatsvindt.
Werking op het myocardiale infarct in de subacute fase in honden
EMI15.2
Het dichtbinden van de intravertriculaire kransarterie door de methode van Harris veroorzaakt de volgende werkingen : a) een daling in de coronaire bloedstroming b) een stijging van de coronaire vasculaire weerstand c) een afname van de werkindex van de linker ventricel d) een stijging van de verhouding DPTI/TTI
<Desc/Clms Page number 16>
e) een afname van de aortastromingsindex f) een afname van het glucose-, zuurstof-en lactaatverbruik op het deel van het myocardium g) een daling van de opname van vrije vetzuren door het myocardium.
De intraveneuze behandeling met YS 035 in een dosis van 0,1 mg/kg, uitgevoerd na dichtbinden van de kransarterie en drie keer binnen 48 uur in dezelfde dosis, gaf de volgende resultaten : a) De coronaire bloedstroming bleef vergelijkbaar met die van de
Controlegroepen, of neigde op zijn hoogst tot een matige toename tijdens het experiment. b) De coronaire vasculaire weerstand wordt niet alleen verlaagd, maar wordt kleiner dan die van de controlegroep. c) De werkindex van de linker ventricel is significant hoger dan die in de honden met het infarct. d) De verhouding DPTI/TTI wordt niet gewijzigd. e) De aortastromingsindex wordt niet gewijzigd. f) Het verbruik van glucose in het myocardium wordt niet gewijzigd, terwijl het verbruik van zuurstof aanzienlijk toeneemt en het ver- bruik van lactaat tot terugkeer naar normaliteit neigt.
g) De opname van de vrije vetzuren neemt toe en bereikt ook een waarde van twee maal de basalstroming, gemeten in gezonde controledieren.
De onderhavige uitvinding omvat ook alle van toepassing zijnde industriële aspecten die verbonden zijn aan het gebruik van verbindingen met formule 1 in de cardiovasculaire therapie.
Een essentieel aspect van de uitvinding is derhalve gelegen in farmaceutische preparaten die als actieve componenten een verbinding volgens formule 1 bevatten, die ook samen met conventionele, gewoonlijk in preparaten toegepaste excipiéntia kan worden gebruikt.
De verbindingen volgens de uitvinding kunnen langs de orale of parenterale route worden toegediend. In het geval van YS 035 bedraagt de gemiddelde dagelijkse dosis langs de orale route tussen 20 en 150 mg in twee of drie toedieningen.
De behandeling kan gedurende een lange tijdsperiode worden voortgezet. In het geval van een acute toestand, kan de stof YS 035 ook door een langzaam infuus in de aderen worden toegediend in een dosis tussen 10 en 20 mg/kg.
<Desc/Clms Page number 17>
Als voorbeelden van de farmaceutische preparaten volgens de onderhavige uitvinding kunnen worden genoemd : - beklede gelatinecapsules die 10 mg YS 035 bevatten ; - compresse die 20 mg YS 035 bevatten naast gewoonlijk in farmaceu- tische preparaten toegepaste excipiêntia ; - steriele flesjes, geschikt voor parenterale toediening die 1 mg/cm3
YS 035 hydrochloride in steriel apyrogeen gedestilleerd water bevat- ten.
<Desc / Clms Page number 1>
melting point (242 C) compared to the hydrochloride of N-methylN-bis- (3,4-dimethoxy-phenyl-ethyl) -amine, the structure of which, as underlined above, is rigorously confirmed herein. In contrast, according to the directions of the above publications, another compound is obtained, as found by repeating the same experimental methods described therein.
Consequently, the compound of formula 1 must be considered new.
Also, the pharmacological properties of the compound of formula 1 could not be foreseen due to its papaverine-related structure.
In fact, it is known that the therapeutic effects of papaverine have been called into question, citing, for example, Goodman & Gilman's "Pharmacological Basis of Therapeutics" McMillan, New York, 830 Needleman and Johnson, noting that "papaverine has not been shown is of any therapeutic value in any state ".
Similar conclusions were also drawn by a panel of experts from the US Food and Drug Administration, who noted that none of the indications cited by the manufacturers have elements proving the efficacy of papaverine.
Based on these conclusions, the FDA has proposed withdrawing papaverine from the market (FDA Drug Bull. 9,26, 1979; Fed. Reg. 44, 30443,1979).
The compounds described in the above patents and publication were therefore never used in therapy and no therapeutic indications could be derived from the indications of the prior art.
Surprisingly, it has now been found that the compound of formula I exhibits a strong calcium antagonist activity similar to that of nifedipine (a known and recent calcium antagonist drug) and is not related to papaverine-like properties.
In fact, the actions of papaverine on the calcium ions are complex and characterized by stimulation of calcium ion currents at the lower concentrations (Carpenedo et al. J. Pharm.
Pharmacol. 1971,23, 502-505) and due to an antagonism at concentrated
<Desc / Clms Page number 2>
EMI2.1
The present invention relates to N-methyl-N-bis- (3,4-dimethoxy-phenyl-ethyl) of the general formula 1 of the formula sheet, which compound has calcium antagonistic activity.
The compound of the invention, which has a very low toxicity, is therefore useful in the therapy of cardiovascular diseases and irregularities in the cerebral circulation.
Rosenmund, Külz, and Buth, in US 2006114, in Ber. 72 B 18-28, 1939 and DE 617647 disclose the synthesis of a series of bis-phenethylethylamines which have papaverine-like and spasmolytic properties, also including N-methyl-N-bis-4-dimethoxyphenyl) -ethyl) amine described.
In fact, the compound mentioned by Rosenmund et al. (For which the authors do not provide data supporting its structure) must have a different structure from the compound of the present invention, because the authors report a melting point of 230 or 242 C for its hydrochloride, while the hydrochloride of the compound obtained here (whose structure has been demonstrated by NMR data) melts at 180-1850C even after repeated crystallizations and in a high purity state. In addition, as will be explained below, even a marked difference has been observed in the pharmacological properties of the compound of the invention and the compound mentioned by Rosenmund et al.
Probably the other nature of the latter compound has to be related to the fact that the corresponding secondary amine without N-methyl group is obtained according to a rather unusual reaction, i.e. the hydrogenolysis of (3,4-dimethoxy-phenethyl) -amine with opP / BaSO very high temperatures, according to the reaction scheme shown on the formula sheet.
In addition, German Patent 617647 describes the methylation of the secondary amine with formaldehyde in the absence of a reducing agent; in U.S. Patent No. 2006,114, methylation is performed in the presence of formic acid, but the corresponding hydrochloride nevertheless has an even higher
<Desc / Clms Page number 3>
EMI3.1
about 10 M (Sanguinetti and West, J. Phar. Exp. Ther., 219, 715, 1981).
The same authors also showed that papaverine and verapamil, a known calcium channel blocker, are mutually antagonistic to the slow entry currents supported by calcium ions in isolated guinea pig atria.
Papaverine is therefore completely devoid of calcium antagonistic activity and the same property should be expected for structurally related compounds.
In addition, the major biochemical action of papaverine and some of its derivatives is the inhibition of phosphodiasterases (Kukovetz and Poch, Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharm., 267,189-194, 1970). In contrast, it has now surprisingly been found that N-methyl-N-bis- (3,4-dimethoxy-phenyl-ethyl) -amine, in addition to having a strong calcium antagonistic activity, is completely devoid of an inhibitory activity on the phosphodiasterases.
The therapeutic and pharmacological profile of the compound of the invention should therefore be considered unforeseeable, for reasons of both the above publications and the pharmacology of papaverine, despite possible structural analogies.
The compounds of the invention are therefore new therapeutic agents that block calcium entry, useful in myocardial ischemia and in cerebrovascular diseases caused by cerebral oligoemia.
The compound of the invention is prepared from bis- (2- (3,4-dimethoxyphenyl) ethyl) amine under reducing amination conditions, i.e., by treatment with formaldehyde in a reducing medium.
The following example is given to illustrate the invention.
EXAMPLE a) 3,4-dimethoxyphenylacetyl chloride
29.5 g of 3,4-dimethoxyphenyl acetic acid were dissolved in 200 ml of anhydrous chloroform, which was free from ethanol. 23.8 g of thionyl chloride was then added. The mixture was boiled for 4 hours
<Desc / Clms Page number 4>
under reflux. The solvent and excess reagent were then removed under reduced pressure. The oily residue was distilled under reduced pressure (10 mmHg) to collect the fraction which distilled at 170-172 ° C.
26 g of the pure acid chloride are thus obtained in 81% yield. b) N- (2- (3,4-dimethoxyphenyl) ethyl) -3,4-dimethoxyphenyl-acetamide 3Men dissolved 21.7 g - (3,4-dimethoxyphenyl) ethylamine in 150 ml anhydrous chloroform and then added the solution to 15.2 g anhydrous triethylamine. The solution was cooled to a temperature
EMI4.1
between 5 DEG and 10 DEG C. and then, with stirring, added the 3,4-dimethoxyphenylacetyl chloride prepared in part a) in an amount of 26 g dissolved in 80 ml anhydrous chloroform. The temperature was allowed to rise to room temperature. It was then refluxed for 8 hours.
After cooling the mixture by adding
EMI4.2
3 g of an additional 200 chloroform portion, the organic phase was washed with water and then with 5% hydrochloric acid and an additional amount of water, then 5% sodium hydroxide and finally water.
The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, and after filtration, the solvent was evaporated under reduced pressure.
The solid thus obtained was recrystallized from absolute ethanol. The pure amide was obtained in an amount of 36 g, a yield of 84%, with a melting point of 128 C. The substance gives a single spot on chromatography, using ethanol as the eluent. c) Bis- (2- (3,4-dimethoxyphenyl) ethyl) amine
37.7 g of sodium borohydride were suspended in 1500 cm of anhydrous tetrahydrofuran in an inert nitrogen atmosphere. 36 g of the amide prepared in part b) were added to the suspension, while the mixture was stirred and cooled to 10 ° C, and 58 cm of glacial acetic acid was also added. The mixture was refluxed for 4 hours.
At the end of this period, the solvent was evaporated under reduced pressure and the residue was treated with water and then with dilute hydrochloric acid until completely acidic. A solution of sodium hydroxide was then added to the mixture until the pH was basic, and the material was extracted four times with 300 ml dichloromethane each time. The organic phase was extracted
<Desc / Clms Page number 5>
with dilute hydrochloric acid, the acidic solution was washed with dichloromethane. It was then cooled and made basic with potassium carbonate and finally re-extracted with four portions of dichloromethane using 200 cm each time. The organic phase was dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and evaporated.
The residue was the crude amine which was recrystallized from ethanol to give a pure product in an amount of 28.5 g, yield 75%; mp 56-580C. Thin layer chromatography gave a single spot (eluent: n-butanol, ethanol, acetic acid, water 60:20:40:10).
Elemental analysis: calculated% C = 69.54; H = 7.88; N = 4.05; found% C = 69.77; H = 8.01; N = 4.16. d) N-methyl-N-bis- (3,4-dimethoxy-phenyl-ethyl) amine
10.4 g of the compound prepared in part c) were dissolved in 100 cm of methanol and 30 cm of 37% formaldehyde was added. The mixture was boiled under stirring for 40 min, then cooled with a
EMI5.1
ice bath to 0 ° C and added 4 g in small portions. Stirring was continued for 1 1/2 hours at room temperature and then methanol evaporated under reduced pressure. The residue was dissolved in water, acidified with hydrochloric acid. After stirring for a few minutes, it was cooled and the solution was made basic with a sodium hydroxide solution.
The basic solution was extracted with dichloromethane, the organic phase was isolated, washed with water, and dried over NaSO. Then it was filtered and the solvent was evaporated to dryness under reduced pressure. The residue was crystallized twice from n-hexane using 100 cm each time, thus yielding a pure product in an amount of 6.7 g, yield 62%; with a melting point of 67 DEG-69 DEG C. was obtained. The product gave a single chromatographic spot on thin layer chromatography using the same eluent as in the case of the amine under c).
Elemental analysis for C21H29NO4 (mol. Wt. = 359.47) calculated% C = 70.16; H = 8.13; N = 3.89; found% C = 70.23; H = 8.17; N = 3.85.
<Desc / Clms Page number 6>
The compound thus obtained is indicated below with the symbol YS 035. The structure of the compound has been confirmed by spectroscopic data.
Spectrum H NMR (recorded in CDC1, using TMS as internal reference). The chemical shift values of the protons are expressed in 2.35 (s, 3H, N-CH3); 2.7 (s, 8H, N- (CH 2 -CH 2) 2); 3.8 (s, 12H, 4 (OCH3)); 6.7 (s, 6H aromatic).
The hydrochloride of the compound YS 035 had a melting point of 180-1850C.
Elemental analysis for C21 H30 NO4 Cl (mol. Wt. = 395.93) calculated% C = 63.70; H = 7.63; N = 3.54; found% C = 63.42; H = 7.45; N = 3.39.
The compound YS 035 has been subjected to a series of pharmacotoxicological tests to determine its action compared to the known drugs Nifedipine and Nicardipine which have a calcium antoganistic effect. The results thus obtained are reported below.
Acute toxicity of YS 035
The acute toxicity is determined by the oral route, by the venous route in male rats according to the method of Litchfield and Wilcoxon (J. Pharm. Exp. Therap., (1949), 96, 99). The substance YS 035 showed a toxicity DL50 of 177.9 mg / kg in the case of the oral route and 19 mg / kg in the case of the venous route.
PHARMACOLOGY Calcium antagonistic activity Inhibition of Ca uptake in synaptosomes of the rat brain
The synaptosomes were prepared from a rat brain homogenate by centrifugation in the Filcoll gradient at 23,500 rpm over a 30 min period and diluted to 1.5 mg / cm3 in the medium formed by:
<Desc / Clms Page number 7>
EMI7.1
<tb>
<tb> NaCl <SEP> 120 <SEP> mM
<tb> KC1 <SEP> 30 <SEP> mM
<tb> MgS04 <SEP> 1, <SEP> 2 <SEP> mM
<tb> KH2P04 <SEP> 0, <SEP> 4 <SEP> mM <SEP>
<tb> NaHCO3 <SEP> 5 <SEP> mM <SEP>
<tb> TES <SEP> 20 <SEP> mM
<tb> glucose <SEP> 10 <SEP> mM
<tb>
YS 035 and nifedipine and papaverine for comparison were added to the medium at a final concentration of
EMI 7.2
45 250 After 15 min preincubation, CaCl 3 (0.2?) Was added to the medium, µM. The first determination was made 2 min after the addition.
The concentrations found were taken as the values at time 0. The other controls were performed after 5 min, 10 min and 15 min. After each period, the reaction was stopped by centrifugation and the radioactivity in the supernatant and in the pellet was determined. The latter was previously denatured with PCA, neutralized and then centrifuged.
The results shown in the following Table A are expressed as the amount of calcium transferred per mg of protein after the maximum incubation period of 15 min.
TABLE A
EMI7.3
<tb>
<tb> 2+
<tb> Connection <SEP> Ca recording
<tb> (n <SEP> g <SEP> ions / mg <SEP> protein / 15 <SEP> min)
<tb> control <SEP> 80 <SEP> 7
<tb> papaverine <SEP> (250 <SEP> uM) <SEP> 79 <SEP>: <SEP> 5
<tb> nifedipine <SEP> (250 <SEP> uM) <SEP> 42 <SEP> 5
<tb> YS <SEP> 035 <SEP> (250 <SEP> M) <SEP> 47 <SEP> ¯ <SEP> 4
<tb>
Based on the data in the table, it is possible to establish that the inhibitory effect on calcium absorption exerted by the new substance YS 035 in the synaptosomes of the rat brain is comparable to that seen by nifedi-
<Desc / Clms Page number 8>
pine is shown, while papaverine is completely devoid of calcium antagonistic action.
Inhibition of Ca uptake in renal hamster kidney cells-
Kidney hamster kidney cells were washed and then resuspended several times at a concentration of 5.16 / cm3 in the medium of the following composition:
EMI8.1
<tb>
<tb> NaCl <SEP> 120 <SEP> mM
<tb> KC1 <SEP> 5.5 <SEP> mM
<tb> glucose <SEP> 5.5 <SEP> mM
<tb> NaHPO <SEP> 0.7 <SEP> mM
<tb> NaHCO <SEP> 25 <SEP> mM
<tb> MgCl <SEP> 1.3 <SEP> mM
<tb> TRIS. <SEP> HCl <SEP> at <SEP> pH <SEP> 7, <SEP> 4 <SEP> 10 <SEP> mM
<tb>
YS 035 and nifedipine were added for comparison
EMI8.2
added at a final concentration of 250 µM.
After 15 min preincubation at 30 ° C, the reaction was started by adding CaCl medium (0.1 µCi / cm 3) to the medium.
The concentrations at time 0 were those observed 2 min after the addition. The other controls were performed after 5 min, 10 min and 20 min. The determination of [ca2 +] was performed as in the previous experiment.
The results are shown in Table B as the amount of Ca
EMI8.3
c transferred per mg protein (1 mg protein = 5. cells) after the maximum incubation period of 15 min. The results obtained show in this experimental model the inhibitory effect on the uptake of Ca, which is produced by both the compound YS 035 and by nifedipine is displayed. However, the action of the new compound in quantitative terms is superior to the action of nifedipine.
TABLE B
EMI8.4
<tb>
<tb> 2+
<tb> Connection <SEP> Ca <SEP> - <SEP> recording <SEP>
<tb> Connection
<tb> (n <SEP> g <SEP> ions / mg <SEP> protein / 15 ')
<tb> - <SEP> 11, <SEP> 9
<tb> YS <SEP> 035 <SEP> 7.5 <SEP> (-36.9% <SEP> inhibition)
<tb> nifedipine <SEP> 7.9 <SEP> (-33, <SEP> 6% <SEP> inhibition)
<tb>
<Desc / Clms Page number 9>
Inhibition of Ca uptake in rat liver mitochondria
Mitochondria prepared by classical methods were diluted to a concentration of 1.5 mg / cm3 in an incubation medium of the following composition:
EMI9.1
<tb>
<tb> sucrose <SEP> 200 <SEP> mM
<tb> KCl <SEP> 20 <SEP> mM
<tb> TRIS. <SEP> HCl <SEP> at <SEP> pH <SEP> 7.4 <SEP> 10 <SEP> mM
<tb> succinate <SEP> 2 <SEP> mM <SEP>
<tb> rotenone <SEP> l <SEP> ut <SEP>
<tb>
Compound YS 035 and nifedipine for comparison were added to the medium at a final concentration of
EMI9.2
45 250 µM. After a period of 15 min preincubation at 200C, CaCl was added (50 n mol / mg protein).
In an analogous manner to the previous experiments, the concentrations determined after 2 min were taken as concentration at time 0. The other controls were performed after 5 min, after 10 and after 15 min. For the determination of Ca, the experiment was performed analogously to the previous experiments.
The results are reported in Table C as the amount of Ca transferred per mg of protein.
TABLE C
EMI9.3
<tb>
<tb> Connection <SEP> Ca2 + <SEP> - <SEP> recording
<tb> Compound <SEP> (n <SEP> g <SEP> ions / mg <SEP> protein)
<tb> - <SEP> 14, <SEP> 3
<tb> Nifedipine <SEP> 9.5
<tb> YS <SEP> 035 <SEP> 11.0
<tb>
The inhibitory activity of the compound YS 035 on the uptake of Ca by the rat liver mitochondria clearly follows from these results, although the activity under these experimental conditions is slightly inferior to that of nifedipine.
<Desc / Clms Page number 10>
Study on the ca2 + efflux in mitochondria of the liver of rats
The rat liver mitochondria prepared as in the previous experiment were "loaded" with Ca and then placed in a medium devoid of these ions. In the presence of a decoupling agent or "Ruthenium Red", a current of
Ca ions from the mitochondria into the medium.
Substances YS 035 and nifedipine were both added at a concentration of 250 µM both in the presence and absence of the types of Ca influx activators.
The results listed in Table D are expressed as the amount of Ca transferred from the mitochondria per mg of protein per minute. Based on these data, a decoupling action of nifedipine has been observed, but substance YS 035 does not show this activity.
TABLE D
EMI10.1
<tb>
<tb> Ca - efflux <SEP> (n <SEP> g <SEP> ions / min. <SEP> mg / protein
<tb> \ ierbinding ..-.
<tb> induced <SEP> by <SEP>:
<tb> Ruthenium <SEP> decoupling red <SEP> agent
<tb> - <SEP> 0, <SEP> 0 <SEP> 0.7 <SEP> 8.3
<tb> Nifedipine <SEP> (250 <SEP> uM) <SEP> 3.8 <SEP> 2.2 <SEP> 8.5
<tb> YS <SEP> 035 <SEP> (250 <SEP> M) <SEP> 0.0 <SEP> 0.6 <SEP> 5.4
<tb>
Antagonistic effect on contractions produced by arachidonic acid on the aorta of rabbits In vitro study
The study was conducted by comparison to nicardipine using autologous blood as the perfusion fluid. The addition of 0.1 mg arachidonate to the liquid induces an isometric contraction of the aorta, which is registered by a transducer.
From the results listed in Table E, the inhibitory activity of the two products on the contraction produced by the arachidonate is similar in that both molecules by-pass a by-pass between the synthesis of thromboxan A2 and the synthesis of PGI2
<Desc / Clms Page number 11>
can induce. This phenomenon is shown by the reaction following the addition of arachidonate to the perfusion blood.
This effect can be observed with 0.1 mg / kg YS 035 and 1 mg / kg nicardipine.
TABLE E
EMI11.1
<tb>
<tb> Connection <SEP> Contraction <SEP> of <SEP> the <SEP> Contraction <SEP> of <SEP> the <SEP> second <SEP> and
<tb> first <SEP> portion <SEP> of <SEP> third <SEP> portion <SEP> of <SEP> the <SEP> aorta
<tb> the <SEP> aorta
<tb> (mm) <SEP> N = 4 <SEP> dose <SEP>%
<tb> mg. <SEP> kg <SEP> N <SEP> Variation
<tb> 0.01 <SEP> 3-42 <SEP> 31, <SEP> 0
<tb> YS <SEP> 035 <SEP> 48 <SEP> 6, <SEP> 7 <SEP> 0,1 <SEP> 4 <SEP> (-60 <SEP> 29, <SEP> 3)
<tb> 1.0 <SEP> 1-132 <SEP> 16, <SEP> 1
<tb> - <SEP> 16 <SEP>
<tb> Nicardipine <SEP> 38 <SEP>: <SEP> 4, <SEP> 9 <SEP> 0.01 <SEP> 1-6
<tb> 0.1 <SEP> 4-48 <SEP> 15, <SEP> 5
<tb> 1, <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> (-84) -162
<tb>
N = Total number of aortic portions examined.
() Values of the small contractions sometimes observed prior to relaxation.
Inhibition of the phosphodiasterase activity
The inhibition of phosphodiasterase activity of YS 035 and of papaverine has been evaluated according to the method of K. G. Nair (Biochemistry, 5, 150,1966).
The medium used for this included:
2.5 ml buffer tris-HCl 0.1 M pH 7.4;
EMI11.2
50.
50 mg / ml); 5 µl adenosine deaminase (2 mg / ml); Basic phosphatase "Sigma" (2.6 mg / ml); Phosphodiasterase (10 mg / ml).
<Desc / Clms Page number 12>
EMI12.1
YS 035 was added to a final concentration of 100 mM and papaverine to a concentration of 10 mM. The
11 MgSO (inhibitory dose 50%) were found to be 0.04 mM for papaverine, while YS 035 was found to be completely ineffective.
In vivo studies
Both substances YS 035 and nicardipine were administered orally to rabbits for a period of three consecutive days in such a way that the last administration of each substance took place
EMI12.2
1 hour before the animals were killed. The aortic portions were then incubated f in PRP or in the Krebs-Henseleit fluid.
The results obtained after the addition of arachidonic acid are shown in Table F below.
TABLE F
EMI12.3
<tb>
<tb> Compound <SEP> dose-1 <SEP> Amplitude <SEP> of <SEP> the <SEP> contraction <SEP> (mm)
<tb> Compound <SEP> dose <SEP> @
<tb> mg.kg-1
<tb> P. <SEP> O <SEP> PRP <SEP> medium <SEP> Krebs
<tb> Individual <SEP> m <SEP> ¯ <SEP> ES <SEP> Individual <SEP> m <SEP> ¯ <SEP> ES
<tb> values <SEP> values
<tb> +26 <SEP> + <SEP> 4
<tb> +48 <SEP> +25
<tb> +23 <SEP> +12
<tb>: <SEP>: <SEP> bntroles <SEP> - <SEP> +20 <SEP> 30 <SEP> ¯ <SEP> 8, <SEP> 0 <SEP> +10 <SEP> 12 <SEP> :
<SEP> t <SEP> 2, <SEP> 3 <SEP>
<tb> +35 <SEP> + <SEP> 8
<tb> +37 <SEP> + <SEP> 8
<tb> +36 <SEP> +18
<tb> +16 <SEP> +12
<tb> Nicardipine <SEP> 1 <SEP> + 24--30
<tb> + 55-10
<tb> YS <SEP> 035 <SEP> 10 <SEP> + 28--6 <SEP>
<tb> +28 <SEP> + <SEP> 7
<tb>
This study shows that both YS 035 and nicardipine act directly on the synthesis of prostaglandin and in particular
<Desc / Clms Page number 13>
PGI2 at the aortic endothelium level than that they act on the vasoconstrictor action of thromboxan A2 on platelets.
Effect on multiple cerebral infarction in rats
The intracarotide injection of sodium arachidonate (0.1 mg) causes an edema reaction in rats that is accompanied by an accumulation of calcium in the brain tissue and, on the other hand, a decrease in cholesterol levels. The substance YS 035 decreases at a dose of 1 when administered intravenously 15 min before the infarct; 3.3 and 10 mg / kg moderate onset of calcium at the 1 mg / kg level but does not affect the other changes at the biochemical level.
Antagonistic effect on biochemical disturbances and neurological deficits during the post-oligemia period in rats
Oligemia in rats is caused by simultaneous bilateral occlusion of the carotid arteries, which is associated with a slight decrease (8-9 kPa) in blood pressure and is maintained for 60 min. After removal of the occlusion, the post-oligomy period is monitored for several days. In this case, the observation continues until the third day, at which time the accumulation of Ca ++ ions in the brain reaches its maximum.
YS 035 and nicardipine, respectively, are administered to rats 1; 5; 18; 24; 42 and 71 hours after the carotid occlusion was removed. The rats were sacrificed after 72 hours and the tissues were quickly removed to determine their water, calcium and potassium content. The results are summarized in the following Table G.
<Desc / Clms Page number 14>
EMI14.1
TABLE G
EMI14.2
<tb>
<tb> Group <SEP> N <SEP> mg.kg-1 <SEP> Cerebral <SEP> concentration
<tb> P. <SEP> kg
<tb> 7x <SEP> H2O <SEP> K + <SEP> Approx
<tb>% <SEP> mol.kg-1 <SEP> dry <SEP> fabric
<tb> Controls <SEP> 36 <SEP> - <SEP> 78, <SEP> 7 <SEP>:
<SEP> 0, <SEP> 05 <SEP> 499.3 <SEP> 3, <SEP> 45 <SEP> 4.4 <SEP> 0, <SEP> 20
<tb> Post-oligemia <SEP> 80.1 <SEP> 0, <SEP> 37 <SEP> 366, <SEP> 2 <SEP> 12, <SEP> 58 <SEP> 28.2 <SEP> 3, <SEP> 22
<tb> checks <SEP> 11 <SEP> - <SEP> * <SEP> 0.005 <SEP> * <SEP> 0.0001 <SEP> * <SEP> 0.0001
<tb> Nicardipine <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> 79.2 <SEP> ¯ <SEP> 0.42 <SEP> 368.5 <SEP> ¯ <SEP> 19.69 <SEP> 19.3 <SEP> ¯ <SEP> 4.92
<tb> * NS <SEP> ** NS <SEP> * 0.01 <SEP> ** NS <SEP> * NS <SEP> ** NS
<tb> YS <SEP> 035 <SEP> 8 <SEP> 3 <SEP> 79.0 <SEP>: <SEP> 0, <SEP> 44 <SEP> 420.0 <SEP>:
<SEP> t <SEP> 11, <SEP> 85 <SEP> 10.7 <SEP> 2, <SEP> 46
<tb> * <SEP> NS <SEP> * <SEP> 0, <SEP> 0000 <SEP> * <SEP> 0, <SEP> 0500
<tb> ** <SEP> 0, <SEP> 0309 <SEP> ** <SEP> 0, <SEP> 004 <SEP> ** <SEP> 0, <SEP> 0004
<tb>
N = number of rats for each group P = 0.05 according to Student of Cochran's test * against controls ** against post-oligemia controls
The above results show YS 035 is able to reduce the severity of the celebral edema and in particular to significantly reduce the intracellular accumulation of Ca ions.
Nicardipine also appears to act in the same way, although its activity is much less significant, particularly with regard to the accumulation of Ca ions.
Anti-arrhythmia and anti-ischemic activity in rats
The left coronary artery, when tied up, induces premature arrhythmia (30 min) in anesthetized rats, in particular ectopic palpitations, ventricular tachycardia (VT), ventricular fibrillation (VF) according to methods Selye 1960, Clark 1980 and Parratt 1982.
<Desc / Clms Page number 15>
By intravenous injection of YS 035.15 min before tying the coronary artery at a dose between 0.156 mg / kg and 20 mg / kg, the results listed in Table B below were obtained:
TABLE H
EMI15.1
<tb>
<tb> Group <SEP> dose <SEP> N <SEP> Significant <SEP> values <SEP> for <SEP> each <SEP> group
<tb> mg / kg
<tb> I. <SEP> V. <SEP> to-V <SEP> T <SEP> V <SEP> F <SEP> number <SEP> la-% <SEP> latent
<tb> tal <SEP> sec. <SEP> sec.
<SEP> phases <SEP> tente <SEP> death time
<tb> ecto-VF <SEP> (%) <SEP> time <SEP> to <SEP> mortal <SEP> to
<tb> knock- <SEP> (min)
ping
<tb> Controls-12 <SEP> 1324 <SEP> 113 <SEP> 71 <SEP> 75 <SEP> 14 <SEP> 59 <SEP> 20
<tb> 0, <SEP> 156 <SEP> 5 <SEP> 907 <SEP> 34 <SEP> 4 <SEP> 40 <SEP> 22 <SEP> 20 <SEP> 26
<tb> 0.625 <SEP> 5 <SEP> 646 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 30 <SEP> 0 <SEP>> <SEP> 30
<tb> 1.25 <SEP> 5 <SEP> 684 <SEP> 29 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 30 <SEP> 0 <SEP>> <SEP> 30
<tb> YS <SEP> 035
<tb> 2.5 <SEP> 5 <SEP> 725 <SEP> 34 <SEP> 9 <SEP> 20 <SEP> 26 <SEP> 0 <SEP>> <SEP> 30
<tb> 5 <SEP> 2 <SEP> 1287 <SEP> 62 <SEP> 5 <SEP> 50 <SEP> 21 <SEP> 0 <SEP>> <SEP> 30
<tb> 10 <SEP> 3 <SEP> 474 <SEP> 9 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 30 <SEP> 0 <SEP>> <SEP> 30
<tb> 20 <SEP> 2 <SEP> 777 <SEP> 22 <SEP> 10 <SEP> 50 <SEP> 20 <SEP> 0 <SEP>> <SEP> 30
<tb>
As the table shows,
the administration by the endovenous route of the substances YS 035 prevents the onset of most severe arrhythmias such as VF and VT and strength at a dose between 0.625 and 10 mg / kg. There is no relationship between the dose and the observed effect because above a certain dose of 10 mg / kg there is a decrease in results.
Effect on myocardial infarction in the subacute phase in dogs
EMI15.2
Closing the intravertricular coronary artery by Harris's method causes the following actions: a) a decrease in coronary blood flow b) an increase in coronary vascular resistance c) a decrease in the working index of the left ventricle d) an increase in the DPTI / TTI ratio
<Desc / Clms Page number 16>
e) a decrease in the aortic flow index f) a decrease in the glucose, oxygen and lactate consumption on the part of the myocardium g) a decrease in the absorption of free fatty acids by the myocardium.
The intravenous treatment with YS 035 at a dose of 0.1 mg / kg, performed after tying the coronary artery and three times within 48 hours at the same dose, produced the following results: a) Coronary blood flow remained comparable to that of
Control groups, or at most, tended to a moderate increase during the experiment. b) The coronary vascular resistance is not only decreased, but becomes smaller than that of the control group. c) The working index of the left ventricle is significantly higher than that in the dogs with the infarct. d) The DPTI / TTI ratio is not changed. e) The aortic flow index is not changed. f) The consumption of glucose in the myocardium is not changed, while the consumption of oxygen increases significantly and the consumption of lactate tends to return to normality.
g) The uptake of the free fatty acids increases and also reaches a value of twice the basal flow, measured in healthy control animals.
The present invention also encompasses all applicable industrial aspects associated with the use of compounds of formula 1 in cardiovascular therapy.
An essential aspect of the invention therefore lies in pharmaceutical preparations which contain as active components a compound according to formula 1, which can also be used together with conventional excipients usually used in preparations.
The compounds of the invention can be administered by the oral or parenteral route. In the case of YS 035, the mean daily dose by the oral route is between 20 and 150 mg in two or three administrations.
Treatment can be continued for a long period of time. In case of an acute condition, the substance YS 035 can also be administered by slow infusion into the veins at a dose between 10 and 20 mg / kg.
<Desc / Clms Page number 17>
As examples of the pharmaceutical preparations according to the present invention can be mentioned: - coated gelatin capsules containing 10 mg YS 035; compress containing 20 mg of YS 035 in addition to excipients commonly used in pharmaceutical preparations; - sterile vials suitable for parenteral administration containing 1 mg / cm3
YS 035 hydrochloride in sterile apyrogenic distilled water.