<EMI ID=1.1>
De uitvinding heeft betrekking op de omzetting van lagere 1-alkenen tot epoxyden. Meer in het bijzonder heeft de uit-
<EMI ID=2.1>
propeen-bevattende fabrieksstromen via de inwerking van zuurstof en
<EMI ID=3.1>
waarde doordat zij onder thermische omstandigheden of door ionische en vrije radicaal-katalysatoren kunnen polymeriseren en epoxyhamo-
<EMI ID=4.1>
octrooischrif'ten.nrs. 20.370 en 22.241.
In het Nederlandse oetrooischrift 291.163 wordt een
<EMI ID=5.1>
zijn te groeien op koolwaterstoffen en daaruit koolstof te assimileren. Het octrooischrift leert dat het micro-organisme bij voorkeur groeit in koolwaterstoffen die nagenoeg hetzelfde aantal koolstofatcmen bezitten als het 1-alkeen dat aan epoxydatie wordt onder-
<EMI ID=6.1>
alkenen met 2 - 30 koolstofatomen omvat,.. toont het enige voorbeeld
<EMI ID=7.1>
<EMI ID=8.1>
<EMI ID=9.1> atmosferen liet oxyderen. De aansluitende waarneming van methaangestimuleerde NADH-oxydatie gekatalyseerd door extracten van Methyl-
<EMI ID=10.1>
systemen gedeeltelijk gezuiverd uit Methylosinus trichosporium OB3b
<EMI ID=11.1> <EMI ID=12.1>
past in zijn breedste betekenis en omvat niet alleen bacteriën,
maar tevens gisten, draadvormige schimmels, actincmyceten en protozoa. Bij voorkeur omvatten. de micro-organismen bacteriën en met de meeste
<EMI ID=13.1>
kunnen hetzij in droge of vloeibare vorm aanwezig zijn. De uitdrukking omvat tevens de onbeweeglijk gemaakte vorm van het enzym, b.v. de hele cellen van de op methaan groeiende micro-organismen of enzym-
<EMI ID=14.1>
matrix door covalente chemische bindingen, sorptie en invangen van het enzym binnen een gel netwerk dat poriën heeft groot genoeg om de moleculen van het substraat en het produkt vrij te laten passeren,
<EMI ID=15.1>
preparaat" omvat tevens -enzymen die vastgehouden worden binnen holle vezelmembranen (Rony-Biotechnology en Bio-engineering. juni <1>97<1>)-
De uitdrukking "fijnverdeelde fractie" heeft betrek-
<EMI ID=16.1>
menteerde materiaal wanneer de vloeistofbovenlaag na het centrifugeren van gebroken cellen met 10.000 g gedurende 30 min gedurende een
<EMI ID=17.1>
De uitvinding omvat de verdere volgende bijzonderheden: <EMI ID=18.1> overeenkomstige 1,2-epoxyden.
- De produkt 1,2-epoxyden worden niet verder gemetaboliseerd en hopen zich extracellulair op. <EMI ID=19.1> noch hydrolylatie activiteit. Onder de gasvormige substraat-alkenen wordt propeen met de grootste snelheid geoxydeerd.
- Methaan remt de epoxydatie van propeen.
- De stoecheometrie van het verbruik van propeen en <EMI ID=20.1> methaan gegroeide methylotrofen geen gelijktijdig gedurende opslag verloren en worden sterk geremd door verschillende metaalbindende middelen.
- De stoecheometrie' van het verbruik van substraat <EMI ID=21.1> <EMI ID=22.1>
ocystis , Methylomonas, Methylobacter en Methylococcus. Bacteriën
<EMI ID=23.1>
vorming van cysten en exosporen met een complexe fijnstructuur en een complexe inwendige structuur.
<EMI ID=24.1> <EMI ID=25.1>
Deze subculturen zi jn volgens de voorschriften van het Department van Landbouw zonder enige beperking gedeponeerd zodat kweken van deze
<EMI ID=26.1>
micro-organismen als gedeponeerd zijn als volgt geïdentificeerd:
<EMI ID=27.1>
<EMI ID=28.1>
<EMI ID=29.1>
vezigheid van methaanof methanol. De organismen zijn bewegelijk, staafvormig, gram-negatief en aëroob. Er worden veelvuldig rozetten
<EMI ID=30.1>
een vibriovorm aannemen. Organische verbindingen anders dan methaan en methanol onderhouden de groei niet. Heeft een type II membraanstructuur.
<EMI ID=31.1>
bewegelijk, kokvormige bacillen, gram-negatief en aeroob. De organismen vormen cysten die uitdrogingsbestendig zijn, maar niet warmtebestendig. Groeit ten koste van methaan of methanol. Organische verbindingen anders dan methaan en methanol onderhouden de groei niet.
<EMI ID=32.1>
<EMI ID=33.1>
lijk, staafvormig, gram-negatief en aëroob. Produceert slijmachtige capsules. Zij groeien ten koste van methaan en methanol. Organische verbindingen anders dan methaan en methanol onderhouden de groei niet.
<EMI ID=34.1>
Produceert witte kolonies, op zout-agarplaten in aanwezigheid van methaan of methanol. 'De organismen zijn bewegelijk,
<EMI ID=35.1>
les, groeit ten koste van methaan en methanol. Organische verbindingen anders dan methaan en methanol' onderhouden de groei niet. Heeft een type I membraan-structuur.
<EMI ID=36.1>
Produceert witte tot bruinachtige kolonies op zout-agarplaten in aanwezigheid van methaan of methanol. Organismen zijn
<EMI ID=37.1>
achtige capsules. Groeit ten koste van methaan en methanol. Organische verbindingen, anders dan methaan en methanol onderhouden de groei
<EMI ID=38.1>
bronnen van koolstof en energie, terwijl daarentegen facultatieve "methylotrofen die organismen zijn die verbindingen, die geen kool-
<EMI ID=39.1>
bij 10.000 g gedurende 30 min) of in onbewegelijke vorm worden ge- <EMI ID=40.1>
micro-organismen is het in het algemeen noodzakelijk in trappen te werken. Er kunnen enkele of vele trappen zijn, afhankelijk van de aard van de methode en de eigenschappen van de micro-organismen. Ge-
<EMI ID=41.1> liteit van de micro-organismen, geschikte voedingsmiddelen, pH, osmotische verhoudingen, beluchtingsgraad, temperatuur en handha-
<EMI ID=42.1>
verkrijgen van maximale opbrengsten van het alkeenepoxydase kan
<EMI ID=43.1>
enigszins te wijzigen van die velke worden toegepast voor het verkrij-
<EMI ID=44.1>
wordt uitgevoerd onder aërobe omstandigheden zoals in het geval van
<EMI ID=45.1>
gestart in een grote fermentator, zal een betrekkelijk lange tijdsperiode nodig zijn cm een aanmerkelijke opbrengst van micro-organismen en/of alkeenepoxydase enzym daarvan te bereiken. Dit verhoogt uiteraard de mogelijkheid van verontreiniging van het medium en mutatie van de micro-organismen.
<EMI ID=46.1>
voorkeur 5 - 8,5, met de meeste voorkeur 6,0 - 7,5. De fermentatie kan worden uitgevoerd bij atmosferische druk hoewel hogere drukken tot ongeveer 5 atmosfeer en nog hoger bruikbaar zijn.
Voor het kweken van de methylotrofe micro-organismen
<EMI ID=47.1>
die voorzien is met hetzij inwendige koeling of een uitwendige recirculatie koelkringloop. Vers medium kan continu in de kweek worden ge-pompt in hoeveelheden equivalent aan 0,02 - 1 kweekvolume per uur, waarbij de kweek met zodanige snelheid kan worden verwijderd dat
het volume ervan constant blijft. Een gasmengsel dat methaan en zuurstof en eventueel kooldioxyde of andere gassen bevat wordt bij voorkeur met het medium in aanraking gebracht door dit continu door een doorblaasinrichting bij de basis van het vat in te borrelen. De zuurstofbron voor de kweek kan lucht, zuurstof of met zuurstof ver- rijkte lucht zijn. Verbruikt gas kan uit de kop van het vat worden verwijderd. Het verbruikte gas kan hetzij worden gerecirculeerd via een uitwendige kringloop of inwendig door middel van een gas aangedreven roerder. De gas stromen en het recirculaat dienen zodanig te worden gerangschikt dat een maximale groei van micro-organismen en een maximale benutting van methaan wordt verkregen.
Het oxygenase enzymsysteem kan als bovenbeschreven worden verkregen als een ruw extract of een celvrij fijnverdeelde fractie, d.w.z. het materiaal dat zich afzet of sedimenteert wanneer de vloeistof-bovenlaag na centrifugeren van gebroken cellen bij 10.000 g gedurende 30 min, gedurende een uur bij 10.000 g of meer wordt gecentrifugeerd. '
De microbiële cellen kunnen uit het groeimedium. wor-
<EMI ID=48.1>
een dergelijk preparaat te verkrijgen uit een van de vi j f genera van micro-organismen beschreven in het Whittenbury artikel of van de
<EMI ID=49.1> <EMI ID=50.1>
schreven door Whittenbury et al. of bij voorkeur het kweekmedium beschreven door Foster en Davis, J. Bacteriol, 91, 1924 - 1931 (1966).
<EMI ID=51.1>
b .v. door destillatie enz.
Ter vergemakkelijking van het noodzakelijke effec-
<EMI ID=52.1>
den, bij voorkeur door filtratie of centrifugering. Het verkregen epoxyde kan dan algemeen worden verkregen.
De werkwijze van de uitvinding kan ladingsgevijze,
<EMI ID=53.1> <EMI ID=54.1>
delen en percentages, tenzij anders aangegeven zijn in gewicht. Voorbeeld I
<EMI ID=55.1>
en Davis, J. Bacteriol, 91, 1924 -: 1931 (1966) met de volgende samenstelling per Liter werd bereid.
<EMI ID=56.1>
<EMI ID=57.1> <EMI ID=58.1> sie (2 mg cellen) -werd in 10 ml flesjes bij 40C gedaan die met een rubberdop werden afgesloten. De gasfase uit de flesjes werd onder
<EMI ID=59.1>
geanalyseerd (ionisatie vlamdetectorkolom).
Tabel A toont de omzettingssnelheden voor de hydroxy-
<EMI ID=60.1>
<EMI ID=61.1>
organismen die in staat waren methaan tot methanol te hydroxyleren
<EMI ID=62.1>
<EMI ID=63.1>
<EMI ID=64.1>
<EMI ID=65.1>
��^
<EMI ID=66.1>
<EMI ID=67.1>
<EMI ID=68.1>
<EMI ID=69.1>
albus BG8 (NRRL B-1 1,200) en gewassen celsuspensies van deze methaangekweekte micro-organismen werden met succes toegepast voor de omzetting van etheen in ethyleenoxyde bij omzettingssnelheden van 0,9, 0,95 en 1,2 micromol/mg proteïne bij een 0,2 g/100 ml droog gewicht van de ' cellen per kweek vloeistofbasis.
. Als boven aangetoond is een nieuwe werkwijze ont- <EMI ID=70.1>
zij in staat zijn korte alkanen te hydroxyleren (b.v. methaan tot methanol) en sommige onderzoekers hebben voorgesteld, dat zij in staat zijn etheen te epoxyderen. Er is nu gevonden dat deze methaan-gegroeide micro-organismen en enzympreparaten daarvan het vermogen bezitten
<EMI ID=71.1>
val van etheen, buteen-1 en butadieen te epoxyderen. In ladingsgevijze experimenten onder toepassing van gewassen, methaan gegroeide cel-
<EMI ID=72.1> <EMI ID=73.1>
<EMI ID=74.1>
metaal (ijzer of koper) kunnen vorden toegevoegd voor het vergroten van de activiteit wanneer celvri je of zuivere enzympreparaten vorden toegepast. Bij gebruik van celvrije enzymsystemen volgens de uitvinding
<EMI ID=75.1>
<EMI ID=76.1>
als enige.koolstof en energiebron. De cellen verden geoogst gedurende
<EMI ID=77.1>
greerd door een enkele passage door een French Pressure cel (1050 bar) en gedurende 15 min bij 5000 g gecentrifugeerd ter verwijdering van niet' gebroken bacteriën. De bovendrijvende oplossing (ruwe extracten)
<EMI ID=78.1> <EMI ID=79.1>
en celvormige fractie.
Reactiemengsels verden opgenomen in 10 ml flesjes
<EMI ID=80.1>
<EMI ID=81.1>
v/v verhouding. De oxydatie van andere gasvormige n-alkanen en n-al-
<EMI ID=82.1>
Specifieke activiteiten werden uitgedrukt als "micromol produkten gevormd per uur per mg proteïne. De concentratie van pro-
<EMI ID=83.1> <EMI ID=84.1>
ascorbaat en andere elektronendragers konden tevens worden gebruikt. Beide reacties varen gedurende de eerste 15 min lineair zoals gemeten
<EMI ID=85.1>
<EMI ID=86.1>
<EMI ID=87.1>
<EMI ID=88.1>
<EMI ID=89.1>
<EMI ID=90.1>
<EMI ID=91.1>
<EMI ID=92.1>
<EMI ID=93.1>
(a) Reacties werden uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld I.
<EMI ID=94.1>
rechtstreeks afhankelijk van concentratie van de fijnverdeelde fractie <EMI ID=95.1>
proteïne gevormd.
Temperatuur-effect
<EMI ID=96.1>
mengsels gedurende 10 min bi j verschillende temperaturen. De optimale temperatuur voor de epoxydatie van propeen en hydroocylatie van methaan
<EMI ID=97.1>
ties uitgevoerd als beschreven in voorbeeld I. Het reactieprodukt
<EMI ID=98.1>
Opgemerkt werd dat zowel de activiteit voor de hy- <EMI ID=99.1>
tende enzympreparaten.
<EMI ID=100.1>
<EMI ID=101.1>
<EMI ID=102.1>
TABEL F
<EMI ID=103.1>
<EMI ID=104.1>
<EMI ID=105.1>
<EMI ID=106.1>
<EMI ID=107.1>
<EMI ID=108.1>
Substraat concurrentie proeven
De hydroxylatie van methaan en de epoxydatie van
<EMI ID=109.1>
<EMI ID=110.1>
<EMI ID=111.1>
T A B E L H1
<EMI ID=112.1>
<EMI ID=113.1>
<EMI ID=114.1>
van de methaan- of propeen-afhankelijke NADH oxydatie, het zuurstofverbruik en de produktvorming was bij "benadering 1:1:1 (tabel I).
<EMI ID=115.1>
genering door een mono-oxygenase.
TABEL I
<EMI ID=116.1>
<EMI ID=117.1>
<EMI ID=118.1>
<EMI ID=119.1>
Model W 201) en bleek geen activiteit voor hetzij epoxydatie of hydroxylering te hebben. Wanneer de cellen echter werden gebroken door
<EMI ID=120.1>
<EMI ID=121.1>
datie- als hydroxylering-reacties als aangetoond in tabel J.
<EMI ID=122.1>
<EMI ID=123.1>
(a) De cellen verden gebroken door de French Press als boven be- <EMI ID=124.1>
2,5 mg. Elke analyse bevatte. 0,5 ml reactiemengsel.
Zovel het systeem Pseudomonas aeruginosa gedemon-
<EMI ID=125.1>
propeen, 1-buteen en butadieen door celsuspensies van alle drie onderscheiden groepen methaan-verbruikende bacteriën. Epoxydatie van
<EMI ID=126.1>
zelfs na een verlengde incubatietijd. Van der Linden, supra, heeft de produktie van 1 ,2-epoxyoctaan aangetoond uit 1-octeen door hep-
<EMI ID=127.1> <EMI ID=128.1> ge resultaten verkregen uit de studies van levende celsuspensies van de methaan-verbruikende bacteriën nebben echter aangetoond dat pro-
<EMI ID=129.1>
Fa) heeft aangetoond, dat de epoxydatie- en hydroxyleringsreactie gekatalyseerd, kan worden door hetzelfde of een soortgelijk enzymsysteem. De epoxydatie van propeen tot propyleenoxyde door een celsaspensie van
<EMI ID=130.1> <EMI ID=131.1>
hebben de zuivering van een membraan-getonden methaan mono-oxygenase uit de fijnverdeelde fractie (gesedimenteerd tussen 100 en 150.000 g centrifugering) van Methylosinus .trichosporium OB3b vermeld. Onlangs maar na de onderhavige ontdekking hebben Colby et al., Biochem. J.
<EMI ID=132.1>
een uur).
Differentiële centrifugering van gebroken celsuspen-
<EMI ID=133.1> <EMI ID=134.1>
van koper- of ijzerzouten (tabel G). Dit suggereert de betrokkenheid van een metaal-bevattend enzymsysteem in de oxydatie van beide sub-
<EMI ID=135.1>
rings- en de epoxyderingsreacties geven een aanduiding dat beide reacties door hetzelfde' metaal-bevattende mono-oxygenase systeem kunnen worden gekatalyseerd. Het feit dat de omzetting van propeen in propy-
<EMI ID=136.1>
In tegenstelling tot de voornoemde organismen hebben <EMI ID=137.1>
niet geremd door verschillende metaal-bindende middelen. Onlangs splitsten Colby en Dalton (Biochem. J., 171: 461 - 468 (1978)) met methaan mono-oxygenase van Metbylococcus capsulatus (Bath) in drie componenten waarbij een van deze componenten werd geïdentificeerd als
<EMI ID=138.1>
fractie en is verschillend van de oplosbare activiteit van Methylococ. cus. capsulatus (Bath) vermeld, door Colby en werden niet geoxydeerd
<EMI ID=139.1>
Van der Linden (1963, supra) heeft de produktie
<EMI ID=140.1> <EMI ID=141.1>
(obligate of facultatieve) of de andere micro-organismen worden hetzi j op methaan als enige koolstofbron of op een andere koolstof-
<EMI ID=142.1>