"Séparation rapide d'isoenzymes de créatine-kinase du plasma" La présente invention concerne le domaine de la chimie clinique et plus particulièrement, un procédé in vitro pour la séparation rapide des isoenzymes de créatine-kinase MM et MB dans le sérum ou le plasma sanguin, tout en déterminant les activités relatives des isoenzymes séparées.
Trois isoenzymes (MM, MB et BB) de créatinephosphokinase (CPK) du sérum ont été décelées dans le plasma et
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650 (1974)). L'activité de l'isoenzyme MB augmente après l'in- farctus du myocarde et l'importance de l'accroissement de cette activité semble refléter le degré de lésion du myocarde. On
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après des injections intramusculaires ou après des opérations dans lesquelles le coeur n'est pas concerné. En raison de sa spécificité relative en tant qu'indice des lésions du myocarde, un dosage quantitatif rapide de l'activité de l'isoenzyme MB serait particulièrement utile.
Dans la technique antérieure, les procédés adoptés pour mesurer les activités de ces isoenzymes sont des
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ou de chromatographie en colonne ("Clin. Chem. Acta.", 38, 285
(1972)), ces procédés étant quelque peu complexes pour une utilisation clinique de routine. De même, dans la technique antérieure, il existe un procédé ("Clin. Chem.", 20, 36 (1974)) dans
<EMI ID=4.1> inconvénients. Par exemple, dans ce procédé, on doit manipuler de faibles quantités d'un gel humide, tandis que l'on doit effectuer des centrifugations fastidieuses et répétées pour éliminer
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outre, dans ce procédé, on doit former des colonnes assurant des débits assez rapides, une élution progressive et une récupération fractionnée. De même, chaque détermination.nécessite 1 ml de plasma.
Dès lors, bien que les progrès récents aient facilité la détection des isoenzymes de créatine-phosphokinase, les techniques existantes impliquent inévitablement des ::imitations tant du point de vue quantitatif que du point de vue procédé. En conséquence, il est toujours nécessaire de trouver un procédé simple et rapide pour la quantification des isoenzymes
de créatine-kinase dans le sérum ou le plasma sanguin.
La présente invention a pour objet de
fournir un procédé commode, simple et rapide en vue de séparer les isoenzymes MM et MB de créatine-kinase dans le sérum ou le plasma sanguin, en déterminant les activités relatives des isoenzymes séparées, un procédé dans lequel les étapes de séparation peuvent être effectuées dans une seule éprouvette, évitant ainsi les pertes résultant du transfert de la matière soumise à l'essai, un procédé du type décrit dans lequel on emploie avantageusement une matière support échangeuse d'ions constituée de perles de verre poreuses d'une nature spécifiée, de même qu'un procédé dans lequel l'isoenzyme MB est adsorbée quantitativement sur la matière support échangeus� d'ions, tandis que l'isoenzyme MM reste libre en solution. D'autres objets et caractéristiques ressortiront
à la lecture de la description ci-après.
En conséquence, la présente invention concerne un procédé in vitro en vue d'effectuer la séparation rapide des isoenzymes MM et MB de créatine-kinase dans le sérum ou le plasma sanguin, tout en déterminant les activités relatives des iso-enzymes ainsi séparées. Ce procédé comprend les étapes consistant à mettre un échantillon de sérum ou de plasma sanguin et un tampon à faible concentration ionique en contact avec un support échangeur d'ions constitué de perles de verre poreuses sur les surfaces desquelles une phase fixe est couplée par un agent de couplage intermédiaire, incuber le mélange obtenu pour effectuer l'adsorp-
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MM et MB dans les fractions liquides respectives ainsi obtenues.
Dans les dessins annexés :
la figure 1 est un graphique illustrant la <EMI ID=7.1>
procédé d'électrophorèse cinétique, et l'activité de l'iscenzyme MB, mesurée par le procédé d'adsorption sur le gel de "DEAE
<EMI ID=8.1> le procédé d'adsorption sur des perles de verre conformément
à la présente invention ; la figure 3 est un graphique illustrant la relation entre l'activité de 1'isoenzyme MB, mesurée par le procédé d'électrophorèse cinétique, et l'activité mesurée par le procédé d'adsorption sur des perles de verre suivant la présente invention ; la figure 4 est un graphique illustrant les résultats du dosage quantitatif des isoenzymes de créatine- phosphokinase par le procédé d'adsorption sur des perles de verre suivant la présente invention, et la figure 5 est un graphique illustrant les résultats des dosages d'isoenzymes de créatine-phosphokinase effectués par le procédé d'adsorption sur des perles de verre suivant la présente invention comparativement aux résultats obtenus par un dosage d'électrophorèse cinétique connu antérieurement.
A présent, suivant l'invention,on a trouvé que l'on pouvait séparer rapidement et d'une manière fiable les isoenzymes de créatine-kinase du.plasma sanguin en déterminant les activités respectives des isoenzymes MM et MB en utilisant
un support échangeur d'ions constitué de perles de verre poreuses sur les surfaces desquelles une phase fixe est couplée par un agent de couplage intermédiaire. Il est hautement préférable
que l'agent de couplage soit un agent à base d'un silane encore que, d'une.manière moins préférée cependant, l'agent de couplage puisse être formé à partir d'un réactif de Grignard de formule RMgX dans laquelle R représente un groupe alcényle inférieur, tandis que X représente un atome d'halogène. Plus spécifiquement et, de préférence, l'invention consiste à utiliser un support échangeur d'ions dans lequel l'agent de couplage intermédiaire
à base d'un silane est constitué d'un organosilane avec un groupe fonctionnel de silicium capable de se lier aux surfaces des perles de verre, de même qu'un groupe fonctionnel organique capable de se lier à la phase fixe. Le groupe fonctionnel organique peut être un simple carbohydrate ou un dérivé d'un carbohydrate et,
de préférence, ce groupe est le glycérol. De préférence, l'agent de couplage intermédiaire à base d'un organosilane est le glycidoxypropyltriméthoxysilane et, de préférence également, la phase fixe dérive de la diéthylamine ou du diéthylaminoéthanol.
Sous son aspect le plus large, la présente invention concerne un procédé en vue d'effectuer une séparation rapide des isoenzymes MM et MB de créatine-kinase dans le sérum ou le plasma sanguin en déterminant les activités relatives des isoenzymes ainsi séparées, ce procédé comprenant les étapes con-sistant à mettre un échantillon de sérum ou de plasma sanguin et un tampon à faible concentration ionique en contact avec un support échangeur d'ions constitué de perles de verre poreuses sur les surfaces desquelles une phase fixe est couplée par un agent de couplage intermédiaire, incuber le mélange obtenu pour effectuer
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isoenzymes MM et MB dans les fractions liquides respectives ainsi obtenues.
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et rapide, tandis qu'il fournit un moyen permettant d'effectuer toutes les étapes de séparation dans une seule éprouvette et en quelques minutes. Ces caractéristiques sont d'une importance capi- tale pour la détermination rapide du degré de lésion du myocarde.
Contrairement aux procédés décrits antérieurement, les matières supports échangeuses d'ions (perles de verre) utilisées lors de la mise en oeuvre de la présente invention ne nécessitent aucun gonflement préalable comme c'est le cas pour une matière telle
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outre, les séries de verre décrites ci-après peuvent être distribuées à sec, elles forment rapidement un sédiment sans centrifugation, elles n'adhèrent pas aux parois des éprouvettes et elles ne s'agglomèrent pas au cours de la filtration. En outre, les perles de verre peuvent être conservées à sec et elles peuvent être utilisées im- médiatement contrairement à de nombreux autres milieux de chromato- graphie.
Les matières supports échangeuses d'ions utiles suivant la présente invention peuvent être caractérisées en ce qu'elles sont constituées de perles de verre poreuses sur les surfaces desquelles une phase fixe est couplée par un agent de couplage intermédiaire et, de préférence, par un agent de couplage intermédiaire à base d'un silane. Du point de vue structural, l'agent de couplage à base d'un silane est un organosilane comportant un groupe fonctionnel de silicium capable de se lier
à la surface du support, ainsi qu'un groupe fonctionnel organique capable de se lier à la phase fixe. Cette structure composite
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dans laquelle R représente un simple carbohydrate ou un dérivé d'un
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Comme on l'a indiqué, l'agent de couplage préféré à base d'un organosilane est le glycidoxypropyltriméthoxysilane, le groupe fonctionnel organique préféré est le glycérol et la phase fixe préférée dérive de la diéthylamine ou du diéthylaminoéthanol. L'agent de couplage de glycidoxypropyltriméthoxysilane vient se fixer au support conformément à la réaction suivante :
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Le verre est un verre disponible dans le commerce
(vendu par "Corning Glass", numéro de code 7930 des verres poreux
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3% et Na20 = 1% (Filbert, A.M., "Immobilized Enzymes for Industrial Reactors", R.A. Messing (ed.), pages 39-61, Academic Press, New York
(1975)).
A titre d'exemple, on prépare le support de glycidoxypropylsilyle (II) ci-dessus de la manière suivante : on prépare une solution aqueuse à 5% du réactif de silylation en ajoutant goutte à goutte du glycidoxypropyltriméthoxysilane à de l'eau tout en agitant constamment et en maintenant le pH de la solution entre 5,5
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quantité du support organique indiqué ci-dessus (perles de verre) et on fait le vide pour éliminer l'air des pores. La solution de silylation doit avoir un volume suffisant pour couvrir toutes les particules supports contenues dans le ballon réactionnel. On chauffe cette bouillie à 90[deg.]C pendant 30 minutes et tout en brassant toutes les 5 minutes. Ensuite, on filtre le support, on le lave successivement avec de l'eau et de l'acétone, pour le soumettre ensuite à un séchage sous vide.
On prépare des supports échangeurs d'anions à couplage aminé conformément aux réactions suivantes dans lesquelles on utilise du diméthylformamide comme solvant :
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Lors de la préparation du support IV, le rapport diéthylamine/diméthylformamide n'est pas critique. La capacité d'échange d'ions de tous les supports ci-dessus est comparable lorsque la concentration de diéthylamine dans la réaction est de
10% ou plus. La durée nécessaire pour l'incorporation maximale de l'amine est d'environ 8 heures lorsque la réaction est effectuée
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tionnelle plus longue n'exerce aucun effet apparent sur la capacité d'échange d'ions des produits finals.
Lors de la préparation des matières supports de diéthylamine et de diéthylaminoéthanol IV et V, on ajoute une quantité du support de glycidoxypropylsilyle II dans un ballon contenant de la diéthylamine ou du diéthylaminoéthanol dans du diméthylformamide. On brasse la bouillie obtenue et on la laisse reposer à la température ambiante ou à une température élevée pendant une période
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et d'acétone, puis on sèche sous vide. Ces supports ont une haute capacité d'échange d'ions.
La matière support échangeuse d'ions de diéthylaminoéthanol préparée ci-dessus est vendue dans le commerce sous
la désignation "DEAE-Glycophase-G" par "Corning Glassworks", Biological Products Department, Medfield, Mass. La matière support échangeuse d'ions de diéthylamine est connue sous le nom de "DEA-Glycophase-G".
Les matières supports échangeuses d'ions du type décrit ci-dessus forment, dès lors, une monocouche de carbohydrate
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recouvrant les sièges actifs du support de verre. Ces matières supports sont physiquement stables et elles ne subissent ni un retrai ni un gonflement en présence de changements survenant dans le pH,
la molarité ou le solvant. Elles possèdent des propriétés d'écoulement supérieures et reproductibles, elles sont aisément nettoyées
et elles ne nécessitent aucun gonflement préalable.
Suivant une forme de réalisation moins préférée
de l'invention, l'agent de couplage intermédiaire peut être formé
à partir d'un réactif de Grignard de formule RMgX dans laquelle R est un groupe alcényle inférieur et X, un atome d'halogène. Dans une illustration de cette forme de réalisation de l'invention, le groupe hydroxy de la surface siliceuse des perles de verre est chloré :
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On peut avantageusement préparer le réactif de Grignard de la manière suivante :
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que l'on transforme ensuite comme suit :
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lequel est ensuite mis à réagir avec du diéthylaminoéthanol de la manière suivante :
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Lors de la mise en oeuvre de l'invention, on met tout d'abord la matière support échangeuse d'ions du type décrit ci-dessus sous forme de perles de verre en contact avec un échantillon de sérum ou de plasma sanguin et un tampon à faible concentration ionique, c'est-à-dire un tampon ne contenant pas d'électrolyte fort tel que le chlorure de sodium. Le tampon peut être constitué, par exemple, de 100 millimolès de tris(hydroxyméthyl)-aminométhane (base)/litre, de 56 millimoles de HCl/litre (pH : 8,0 à 22[deg.]C) et de 3 millimolès de dithiothréitol/litre. De préférence, le pH
du tampon à faible concentration ionique se situe entre environ
7,1 et 9,0.
Ensuite, on incube le mélange obtenu pendant une courte période (par exemple : 3 minutes) pour effectuer l'adsorption de l'isoenzyme MB par la matière support échangeuse d'ions constituée de perles de verre. Ensuite, de la matière support, on sépare la fraction liquide surnageants contenant l'isoenzyme MM.
Après l'étape de séparation, on lave les perles
de verre pour en éliminer l'isoenzyme MM résiduelle. On peut effectuer plusieurs opérations de lavage afin que l'élimination
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1.000 fois et avantageusement de 10.000 fois de l'activité de l'isoenzyme MM dans l'échantillon initial de plasma sanguin.
Après l'étape de lavage, on ajoute ensuite une solution tamponnée d'un électrolyte fort au support afin d'en
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du type décrit ci-dessus contenant, en outre, un électrolyte fort. Comme électrolyte fort, on peut utiliser diverses matières, par exemple, des halogénures de métaux alcalins tels que le chlorure
de sodium et le chlorure de potassium, de même que des halogénures alcalino-terreux. On peut également utiliser d'autres électrolytes forts connus de l'homme de métier. De préférence, la solution tamponnée a une concentration ionique se situant entre environ 0,25 et 0,5, tandis que la concentration de 1'électrolyte fort dans la solution tamponnée se situe entre 250 et 500 millimoles/litre.
Ensuite, on sépare la fraction liquide surnageante contenant l'isoenzyme MB désorbée de la matière support, puis on dose l'activité des isoenzymes MM et MB des fractions liquides respectives obtenues comme décrit ci-dessus par la technique de dosage cinétique fluorométrique décrite ci-après.
Lors de la mise en oeuvre du procédé de l'invention tel qu'il a été décrit ci-dessus, il est préférable, mais non essentiel d'utiliser un dispositif de prélèvement d'échantillons à filtre tel que celui vendu sous la désignation commerciale "Unichem" (par <EMI ID=30.1>
1 décrit ci-après, l'utilisation d'un dispositif de prélèvement d'échantillons à filtre de-ce type facilite et accélère la réalisation du procédé, tout en réduisant les transferts de la ratière d'essai.
Dès lors, la présente invention fournit un procédé simple, rapide et commode en vue de séparer les isoenzymes de créatine-kinase du sérum ou du plasma sanguin en déterminant les activités relatives des isoenzymes MM et MB ainsi séparées. Tout le procédé de séparation peut être effectué dans une seule éprouvette et l'on peut aisément fractionner jusqu'à 60 échantillons en une heure. En outre, pour le traitement d'échantillons multiples, on peut traiter simultanément jusqu'à 36 éprouvettes et dispositifs
de prélèvement d'échantillons à filtre sur un râtelier. En conséquence, le procédé de la présente invention offre des avantages
le rendant approprié pour une utilisation clinique de routine.
Afin d'assurer une séparation rapide et complète
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concentration de l'électrolyte fort dans la solution tamponnée décrite ci-dessus est calculée de telle sorte que l'isoenzyme BB soit également désorbée. Dès lors, si elle est présente, l'activité d'isoenzyme: BB doit être ajoutée à l'activité d'isoenzyme MB lors du dosage de cette dernière, ce qui ne semble toutefois pas constituer un sérieux inconvénient du point de vue procédé, car l'activité de l'isoenzyme BB est rarement démontrable dans le plasma humain (Anido et al., "Diagnostic efficacy of myocardial creatine phosphokinase using polyacrylamide disk gel electrophoresis" (= Efficacité diagnostique de la créatine-phosphokinase du myocarde en utilisant une électrophorèse sur un gel de polyacryla-
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activités démontrables de l'isoenzyme BB ont été observées dans l'hyperthermie maligne avec des activités totales très élevées (Anido et al., ci-dessus), ainsi que dans un cas de nécrose tubu- laire rénale (Smith, "Séparation of tissue and serum creatine kinase isoenzymes on polyacrylamide gel slabs" (= Séparation dlisoenzymes
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polyacrylamide), "Clin. Chim. Acta", 39, 351 (1972)). En théorie,
on peut s'attendre à obtenir un accroissement des activités de l'isoenzyme BB lors d'un infarctus ou d'une intervention chirurgicale pratiquée sur n'importe quel organe riche en isoenzyme BB
(cerveau, reins,intestins, vessie, utérus). Toutefois, de tels cas ne sont habituellement pas susceptibles d'être confondus avec un infarctus aigu du myocarde.
Comme le démontrent les données expérimentales reprises ci-après, les résultats des mesures d'isoenzymes dans des échantillons de sérum ou de plasma sanguin prélevés chez des patients atteints d'tm . infarctus aigu du myocarde ont été comparés avec ceux obtenus moyennant un procédé de dosage quantitatif indépendant mentionné dans la technique antérieure. Des mesures supplémentaires ont été effectuées sur des échantillons classiques de sérum ou de plasma sanguin contenant des mélanges d'isoenzymes MM et MB purifiées et prélevées du myocarde humain. Les résultats obtenus par les différents procédés concordaient parfaitement au même titre que les activités dlisoenzymes mesurées et les activités prévues d'après
les quantités d'isoenzyme ajoutée. Les activités de l'isoenzyme MB dans un plasma normal étaient, en moyenne, de 1,6 + 0,28 U/litre
(moyenne + écart type).
Une trousse emballée contenant le tampon à faible concentration ionique, la matière support échangeuse d'ions, la solution tamponnée d'un électrolyte fort et un dispositif de prélè-
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la mise en oeuvre de l'invention dans une utilisation clinique de routine, cette trousse rentrant dans le cadre de la présente inven- tion.
Les exemples suivants illustrent davantage la mise en oeuvre de l'invention.
Exemple 1
Prélèvement d'échantillons de sang.
On prélève du sang chez des patients cardiaques ou des sujets volontaires sains. On recueille des échantillons de 5 ml dans des tubes contenant 20 /moles d'acide éthylène-glycol-
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de mercaptoéthanol, puis on sépare le plasma et on le conserve à
-20[deg.]C avec addition de mercaptoéthanol, l'activité enzymatique diminuant à raison de moins de 5% après conservation pendant 6 mois. Préparation d'isoenzymes MM et MB à partir de myocarde humain.
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dans les 12 heures qui ont suivi la mort, on broie environ 100 g de myocarde dans un broyeur à viande refroidi et on les homogénéise dans un mélangeur de Waring et dans deux volumes d'une solution contenant 10 millimoles de chlorure de potassium/litre et 1 millimole de mercaptoéthanol/litre. Après centrifugation (15 minutes, 600 x g.), on fait passer la fraction surnageante à travers 4 couches d'étamine. On ajoute du chlorure d'ammonium solide pour obtenir une concentra-
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d'ammonium concentré (5 moles/litre). Après centrifugation, on élimine le précipité. A la fraction surnageante, on ajoute de l'éthanol absolu jusqu'à une concentration finale de 400 ml/litre.
On élimine le précipité et on soumet le produit surnageant à une dialyse avec un becher "Biofiber" contre un tampon 1 constitué
de 50 millimoles de tris(hydroxyméthyl)-aminométhane/litre (pH :
7,4), de 50 millimoles de chlorure de sodium/litre et de 1 millimole de mercaptoéthanol/litre. On laisse décanter un gel vendu sous l'appellation commerciale "DEAE-Sephadex A50" par "Pharmacia",
équilibré dans le même tampon, puis on élimine le tampon en excès.
;
On mélange le gel de "Sephadex" humide et la préparation soumise à la dialyse, 1 g de gel hydraté étant utilisé pour 5 mg de protéine. Tout en agitant lentement pendant 40 minutes, on adsorbe l'isoenzyme MB sur le gel, tandis'que l'isoenzyme MM reste libre. On filtre la bouillie dans un entonnoir de BUchner à travers un papier filtrant
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mercaptoéthanol/litre. On soumet le filtrat à haute teneur en sel et contenant l'isoenzyme MB à une dialyse contre le tampon 1 et on le concentre avec le dispositif "Biofiber". On soumet les fractions à faible teneur en sel (isoenzyme MM) et à haute teneur en sel
(isoenzyme MB) à une deuxième adsorption en discontinu avec le gel "Sephadex".
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isoenzymes des filtrats finals démontre qu'il n'y a aucune activité MB dans la fraction MM et qu'il n'y a qu'une trace (moins de 1%) d'activité MM dans la fraction MB. On soumet les fractions MM et
MB à une dialyse contre un tampon de glycine (10 millimoles/litre, pH : 9,0), on les concentre avec le dispositif à fibres creuses
et on les soumet à une lyophilisation. Les activités spécifiques
(U/mg protéine) des préparations lyophilisées des isoenzymes MM et MB sont accrues d'au moins 50 fois comparativement aux activités spécifiques présentes dans la fraction surnageante du produit initial d'homogénéisation. Les récupérations sont d'environ 50% pour l'iso� enzyme MM et de 28% pour l'isoenzyme MB. Les préparations lyophilisées peuvent être conservées pendant plusieurs mois à -20[deg.]C avec peu de perte d'activité.
Préparation d'extraits de cerveaux et de muscles squelettiques humains.
On utilise des muscles squelettiques (quadriceps femoris) et des cerveaux (cerebrum) de cadavres humains pour former des préparations brutes d'isoenzymes MM et BB. On homogénéise les tissus dans un mélangeur de Waring et dans 3 volumes d'un milieu contenant 10 millimoles de chlorure de potassium/litre et 2 millimoles de mercaptoéthanol/litre. On récupère les fractions surnageantes (15.000 x g.) de ces produits d'homogénéisation et on les utilise dans des expériences pilotes destinées à étudier la possibilité de séparer des isoen�ymes de créatine-kinase par-des procédés rapides d'adsorption en discontinu.
Dosage de l'activité de créatine-kinase
On dose l'activité de créatine-kinase par voie spectrophotométrique conformément à la technique de Rosalki, S.B.
(procédé amélioré pour la détermination de la créatine-phosphokinase
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mètre d'enregistrement, on dose des activités de moins de 5 U/litre en utilisant un filtre primaire n[deg.] 7-60 et un filtre secondaire n[deg.] 3-73. La température (30[deg.]C) et le réactif (réactif de Rosalki) sont identiques à la température et au réactif utilisés pour le dosage spectrophotométrique. On entame la réaction en ajoutant des échantillons de 10 à 100 ul dans des cuvettes fluorométriques contenant
1 ml de réactif. Avec une activité comprise entre 0,5 et 1,0 mU dans la cuvette, la vitesse réactionnelle est linéaire entre la cinquième et la dixième minute du dosage, les mesures étant basées sur le changement de fluorescence survenant au cours de cet intervalle. Pour la mesure de l'activité de l'isoenzyme MB du plasma provenant de sujets normaux, l'échantillon est porté à 200/il et la durée réactionnelle est prolongée à 20 minutes. Les activités contenues dans les cuvettes se situent entre 0,05 et 0,1 mU. Les
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Séparation d'isoenzymes de créatine-kinase par électrophorèse sur de l'acétate de cellulose.
Un dosage fluorométrique cinétique quantitatif d'isoenzymes de créatine-kinase séparées par électrophorèse sur
de l'acétate de cellulose a été décrit par Roberts et al., "Am. J. Cardiol.", 33, 650 (1974). Bien que ce procédé ne soit pas approprié pour le traitement rapide de nombreux échantillons, il est utilisé au cours de cette étude comme norme de comparaison. On sépare les isoenzymes par électrophorèse classique sur de l'acétate de cellulose. Ensuite, on incube des segments des bandes électrophorétiques comportant les isoenzymes individuelles tout
en agitant continuellement et modérément dans des cuvettes fluorométriques contenant le mélange réactionnel. A des intervalles minutés et en retirant les bandes du parcours lumineux du fluoromètre, on effectue les lectures de fluorescence. Bien que la protéine reste fixée dans une large mesure à l'acétate de cellulose, elle a un comportement enzymatique tout comme si elle était libre en solution., Dans les conditions choisies, au moyen d'une pipette, on introduit directement une partie aliquote de l'enzyme dans le
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la soumet à une électrophorèse et à un dosage dans un milieu aqueux, puis on constate qu'elle a presque la même activité.
Séparation d'isoenzymes de créatine-kinase par adsorption avec le gel "DEAE-Sephadex A50".
On équilibre le gel de "DEAE-Sephadex A 50" dans
20 millimoles de glycylglycine /litre (pH : 9,0, réglé avec de l'hydroxyde de sodium à 22[deg.]C) et 5 millimoles de dithiothréitol/ litre, ce mélange étant appelé "tampon de glycylglycine". On laisse décanter le gel et on élimine le tampon en excès. On verse 0,5 g du gel humide dans un tube de culture (capacité : 1 ml) et, dans
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On scelle les tubes avec du "Parafilm" et on les fait tourner pen-
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minute. Ce procédé de mélange est nécessaire pour adsorber complètement ltisoenzyme MM. Après centrifugation pendant 2 minutes à
600 x g, on récupère quantitativement la fraction surnageante contenant l'isoenzyme MM non adsorbée (isoenzyme MM surnageante). On lave le gel une fois avec le tampon de glycylglycine et 3 fois avec le tampon de glycylglycine contenant 50 millimoles de chlorure de sodium/litre en remplissant le tube, en mélangeant par des retournements répétés et en récupérant le gel par centrifugation. Après la quatrième centrifugation, on ajout le tampon de glycylglycine et le chlorure de sodium (5 moles/litre) pour porter la concentration en chlorure de sodium à 300 millimoles/litre dans un volume
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rotatif, on soumet les tubes à une centrifugation pendant 2 minutes
à 1.250 x g. et l'on récupère le produit surnageant à haute concen- tration ionique contenant ltisoenzyme MB désorbée (isoenzyme MB surnageante). On soumet les activités de kinase des isoenzymes MM
et MB surnageantes à un dosage par voie spectrophotométrique. Séparation d'isoenzymes de créatine-kinase par adsorption avec des perles de verre de "DEAE-Glycophase-G".
On utilise les solutions suivantes :
Tampon A : 100 millimoles de tris(hydroxyméthyl)-aminométhane
(base)/litre, 56 millimoles de HCl/litre (pH : 8,0 à 22[deg.]C) et 3 millimoles de dithiothréitol/litre.
Tampon B : tampon A avec 3,8 millimoles de NaCl/litre.
Le procédé de séparation comprend les étapes suivantes qui sont toutes effectuées à la température ambiante :
1. On verse des perles de verre vendues sous l'appellation commerciale "DEAE-Glycophase-G" (300 mg ; 120-200 mailles ; dimension des pores : 15 mm) dans des tubes de culture
de 20 ml (diamètre extérieur : 16 mm ; longueur : 150 mm) et, dans chaque tube, on introduit un dispositif de prélèvement d'échantillons à filtre vendu sous la désignation commercial "Unichem" (diamètre extérieur : 16 mm ; longueur : 155 mm). Ensuite, on pèse le tube d'essai pour déterminer le "poids total à sec". Les tubes pesés peuvent être conservés indéfiniment à la température ambiante.
2. Dans chaque tube d'essai, on ajoute 1 ml de tampon A, puis 125 /),Il de plasma.
3. On incube les tubes pendant 3 minutes dans un
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4. On pousse le dispositif de prélèvement d'échantillons à filtre "Unichem" au fond du tube en soumettant les perles
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à travers les filtres. On récupère la fraction surnageante filtrée
(isoenzyme MM surnageante), tandis que les perles restent enfermées en dessous du filtre du dispositif de prélèvement d'échantillons.
5. Afin de laver les perles, on remplit le dispositif de prélèvement d'échantillons à filtre "Unichem" jusqu'à son sommet avec le tampon A. En poussant le dispositif de prélèvement d'échantillons vers le haut, on chasse le tampon à travers ce dispositif vers le fond du tube. On élimine le tampon en retournant le tube. Par ce procédé de lavage, on dilue, à plus de 10 fois, le fluide résiduel initial contenu dans le tube à'essai. On répète deux fois le lavage. L'ensemble du procédé de lavage nécessite environ 1 minute. La dilution initiale et les lavages donnent une dilution
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tillon initial.
6. Le dispositif de prélèvement d'échantillons occupant la position inférieure et alors qu'il reste environ 1,4 ml de tampon dans le tube, on pèse à nouveau chaque tube. La différence entre ce poids et le "poids total initial à sec" donne le poids
(et le volume en supposant une densité relative de 1) du fluide présent dans le tube et dans le dispositif de prélèvement d'échantillons.
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tube. En ajoutant ce tampon d'électrolyte fort à haute teneur en sel, on désorbe l'isoenzyme MB des perles de verre. On mélange convenablement la phase fluide contenue dans le tube à essai et
le dispositif de prélèvement d'échantillons en imprimant deux fois un mouvement ascendant et descendant à ce dernier. La concentration de NaCl obtenue est d'environ 390 millimoles/litre. On récupère la fraction surnageante à haute concentration ionique
(isoenzyme MB surnageante) en poussant le dispositif de prélèvement d'échantillons vers le bas environ 2 minutes après l'addition du sel.
Dans des essais complémentaires, on supprime la mesure gravimétrique en utilisant des tubes gradués pour indiquer le volume occupé par 1,5 ml de tampon plus 300 mg de perles de verre. Après l'étape de lavage, on comprime les perles avec le dispositif de prélèvement d'échantillons à filtre, on repousse le fluide dans ce dernier et on l'aspire, puis on retire le dispositif de prélèvement d'échantillons. Ensuite, on remplit le tube jusqu'au repère avec le tampon A contenant 885 millimoles de NaCl/litre. Après dilution avec le fluide enfermé dans les perles (environ
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être mélangée et récupérée en utilisant un deuxième dispositif de prélèvement d'échantillons à filtre.
On dose l'activité de créatine-kinase des fractions surnageantes d'isoenzymes MM et MB par le dosage cinétique fluorométrique décrit ci-dessus. Oa mesure 1 ' activité totale de créatinekinase des échantillons de plasma par voie spectrophotométrique et l'on suppose qu'elle représente la somme des activités des isoenzymes
<EMI ID=52.1> basant sur le rapport entre les activités des isoenzymes MM et MB déterminées par voie fluorométrique et l'activité totale mesurée par voie spectrophotométrique. Ce calcul présuppose que l'activité
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cliniques. La corrélation entré les résultats obtenus par les procédés fluorométriques et spectrophotométriques est établie quotidiennement avec des échantillons dilués en série..
Résultats
Les activités des isoenzymes MM et MB des échantillons de plasma provenant de patients atteints et non atteints d'infarc-
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trique, tandis que l'on détermine ensuite les activités d'isoenzymes des mêmes échantillons de la manière décrite par le
<EMI ID=55.1> la figure 1 annexée, les résultats obtenus par les deux procédés sont en corrélation étroite. Dans des essais pilotes effectués avec des mélanges d'iso enzymes MB et BB (extrait de cerveau), on n'observe.aucune concentration de sel à laquelle la désorption <EMI ID=56.1>
mitante de l'isoenzyme BB. Etant donné que l'activité de llisoenzyme BB est habituellement négligeable dans le plasma humain, aucune tentative particulière n'est effectuée pour définir les conditions qui pourraient donner une séparation complète et rapide des isoenzymes MB et BB. En conséquence, si elle est présente, l'activité de l'isoenzyme BB devrait être mesurée comme l'activité de l'isoenzyme MB. Le bon accord existant en�re les deux procédés de dosage suggère que l'activité de l'isoenzyme BB est négligeable dans les échantillons soumis à l'essai et qu'il n'y a pas d'accroissements anormaux de l'activité de l'isoenzyme MB suite au procédé d'adsorption sur gel.
L'absence virtuelle de l'activité de l'isoenzyme BB-dans le plasma (moins de 0,5 U/ litre) est confirmée par le procédé électrophorétique fluorométrique dans huit échantillons présentant des activités anormalement élevées des isoenzymes MM et MB.
Le procédé d'adsorption sur perles de verre suivant la présente invention a été évalué avec une large gamme d'activités d'isoenzymes MM et MB en constituant des échantillons d'essai par l'addition, à des échantillons de plasma normal, de mélanges sélectionnés d'isoenzymes MM et MB purifiées et provenant de myocarde humain comme décrit ci-dessus. Comme on peut le constater en se référant à la figure 2, dans l'intervalle habituel des activités rencontrées cliniquement, l'activité de l'isoenzyme MB a été mesurée avec précision et les valeurs ne semblent pas avoir été influencées par une large
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Dans une autre évaluation du procédé d'adsorption sur perles de verre suivant l'invention, on dose des échantillons de plasma prélevés chez des patients atteints d'un infarctus aigu du myocarde à la fois par le procédé électrophorétique fluorométrique et le procédé d'adsorption sur perles de verre. Comme le montre la figure 3, les résultats obtenus par ces deux procédés-concordent étroitement. Dans huit échantillons prélevés chez des patients présentant de hautes activités d'isoenzymes MM et MB, la séparation des isoenzymes avec les perles de verre est contr8lée par électrophorèse. Après adsorption de l'isoenzyme MB (isoenzyme surnageante à faible concentration ionique), les
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Dans ces électrophorégrammes, on n'observe aucune bande des produits surnageants résultant du lavage des perles..Après désorption (produit surnageant à haute teneur en sel), on observe une
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aucune bande lorsque les bandelettes électrophorétiques sont soumises à une incubation sans substrat de créatine-phosphate.
Dans des expériences préliminaires effectuées avec des mélanges des isoenzymes MM et BB (extraits de cerveaux), on ne trouve aucune condition de concentration en sel et de pH dans laquelle l'isoenzyme MB serait complètement désorbée sans qu'il y ait également une libération partielle de l'isoenzyme BB. En conséquence, on effectue la désorption à une concentration en sel donnant une libération rapide et complète de l'isoenzyme MB. L'absence de bandes d'isoenzyme BB dans les produits surnageants
à haute teneur en sel concorde avec les indications antérieures selon lesquelles on ne peut habituellement pas détecter d'activité d'isoenzyme BB dans le plasma humain ("Am. J. Clin. Pathol."
61, 599 (1974)).
Afin de déterminer la récupération d'activité après adsorption sur les perles de verre, on mesure l'activité totale de créatine-kinase dans des échantillons de plasma par voie fluorométrique et l'on compare les résultats obtenus avec
la somme des activités d'isoenzymes MM et MB détectées par
voie fluorométrique après séparation des isoenzymes par adsorption discontinue. Dans dix échantillons, la somme des activités d'isoenzymes est , en moyenne, de 104 + 13% (moyenne + écart type) de l'activité totale dans les échantillons de départ.
Afin de déterminer la précision de la méthode, on soumet des échantillons de plasma prélevés chez des patients atteints d'un infarctus aigu du myocarde à des mesures quadruples, les résultats obtenus étant repris dans le tableau 1 ci-après.
La sensibilité du dosage fluorométrique permet de mesurer l'acti-
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en concordance avec les résultats obtenus par le procédé électrophorétique fluorométrique décrit ci-dessus.
TABLEAU 1
f
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la mesure étant effectuée par le procédé aux perles de verre suivant la présente invention dans quatre échantillons.
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a. moyenne de quatre déterminations ; chaque échantillon fait
l'objet d'une analyse à quatre jours différents.
Exemple 2
Préparation des isoenzymes MM et MB à partir de myocarde humain.
En guise de première étape, on purifie des isoenzymes de créatine-phosphokinase provenant de sujets humains en vue de les utiliser comme témoins, de même que pour former des échantillons d'essai d'une composition connue d'isoenzymes.
On extrait les isoenzymes de créatine-phosphokinase d'un myocarde humain prélevé à l'autopsie, on les sépare et on les purifie partiellement comme suit : on broie environ 100 g de myocarde dans un broyeur à viande refroidi, on homogénéise dans deux
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1 mM dans un mélangeur de Waring, puis on centrifuge pendant
15 minutes à 600 x g. On filtre la fraction surnageante à travers une étamine et on la précipite avec du chlorure d'am-
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fraction surnageante, on ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration finale de 40%. On élimine le- précipité et on soumet le produit surnageant à une dialyse contre un tampon constitué
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à un débit de 100 ml/minute pendant 30 minutes. Cette fraction contient à la fois les isoenzymes MM et MB de créatine-phosphokinase. On sépare les isoenzymes MM et MB par adsorption répé-
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enzyme MB fixée avec un tampon contenant du NaCl 30 mM, on la récupère par .filtration et on la soumet à une dialyse contre un milieu à faible teneur en sel afin d'éviter la neutralisation de l'activité de créatine-phosphokinase par exposition prolongée à de hautes concentrations en sel. Le produit de
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des échantillons de sérum.
On dose l'activité de créatine-phosphokinase par
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trifugation de polycarbonate (50 ml) contenant des perles de verre sèches de "DEAE-Glycophase-G" (300 mg ; mailles 120-200). Dans ce tube, on ajoute 1 ml de tampon contenant du tris(hydroxyméthyl)-méthane-HCl 100 mM (pH : 8,0) et du dithiothréitol 3 mM, puis 0,125 ml de l'échantillon à analyser. L'isoenzyme MB de créatine-phosphokinase est complètement adsorbée par mise en équilibre pendant 3 minutes. Après sédimentation des perles,
on récupère quantitativement la fraction surnageante contenant l'isoenzyme MM de créatine-phosphokinase. On lave deux fois les perles avec 45 ml de tampon.
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gramme de phase aqueuse résiduelle dans le tube préalablement pesé, puis en agitant le mélange pendant 2 minutes. La fraction
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MB de créatine-phosphokinase désorbée. Dans les conditions adoptées, lorsque les échantillons de sérum sont constitués des isoenzymes MB et MM de créatine-phosphokinase humaines
(isolées avec le myocarde) dans ur rapport de 1:10 et dans un
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(N = 15).
On étudie la reproductibilité du dosage avec des échantillons prélevés chez des patients atteints d'un infarctus aigu du myocarde comme décrit ci-après : on dose cinq fois chaque échantillon., Au total, on.évalue neuf échantillons différents
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enzyme MB dans l'échantillon particulier en cause.
Résultats La figure 4 donne les résultats obtenus lorsque des échantillons de sérum sont constitués d'isoenzymes MM et MB de créatine-phosphokinase humaines et purifiées pour obtenir des combinaisons connues d'activité de chaque isoenzyme. Comme on peut le constater, la relation entre l'activité d'isoenzyme MB de créatine-phosphokinase ajoutée à l'échantillon et l'activité observée et détectée par le procédé de dosage par adsorption suivant la présente invention est étroite dans une large gamme d'activité d'isoenzyme MB de créatine-phosphokinase. Dans les
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représente 10 à 80% de l'activité totale de créatine-phosphokinase dans un large intervalle d'activité totale dans l'échantillon.
Comme le montre la figure 5, la quantité d'isoenzyme MB de créatine-phosphokinase, déterminée par le procédé
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par la technique compliquée d'électrophorèse cinétique décrite antérieurement. Dès lors, la présente invention permet d'effec-
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enzyme MB de créatine-phosphokinase dans un intervalle se situant entre moins de 5 et 1.000 m U.I./ml.
Exemple 3
Séparation d'isoenzymes MM et MB dans du sérum humain.
On recueille des sérums humains après coagulation et centrifugation d'échantillons de sang. On congèle immédiatement les sérums recueillis jusqu'à ce qu'ils soient prêts à l'emploi.
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tampon A de l'exemple 1. On mélange convenablement le contenu
du tube pendant environ 30 secondes, on introduit un dispositif de prélèvement d'échantillons à filtre et on recueille le filtrat conformément au procédé décrit à l'exemple 1. Le filtrat contient ltisoenzyme MM.
Ensuite'$ on lave trois fois les perles de verre avec environ 4 ml de tampon A de l'exemple 1 et on règle le volume final de la solution à 0,65 ml comme décrit à l'exemple 1.
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le tube à une opération de mélange pendant 30 secondes. On dose l'activité de créatine-phosphokinase dans les fractions séparées des isoenzymes MM et MB avec un auto-analyseur vendu sous la désignation commerciale nABA-100 Chemistry Auto Analyzer".
Par un procédé électrophorétique, on analyse également indépendamment la teneur en isoenzyme MB d'échantillons prélevés chez des patients soupçonnés d'être atteints d'un infarctus du myocarde.
Les résultats sont repris ci-après :
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D'après la description ci-dessus, on constate que les différents objets de l'invention sont réalisés et que l'on obtient d'autres résultats avantageux.
Etant donné que diverses modifications peuvent être apportées aux procédés décrits ci-dessus sans se départir du cadre de l'invention, il est entendu que la description cidessus et les dessins annexés doivent être interprétés à titre d'illustration et sans aucun caractère limitatif.
REVENDICATIONS
1. Procédé in vitro en vue d'effectuer une séparation rapide des isoenzymes MM et MB de créatine-kinase contenues
dans le sérum ou le plasma sanguin, en déterminant les activités relatives des isoenzymes ainsi séparées, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes qui consistent à
mettre un échantillon de sérum ou de plasma sanguin et un tampon
à faible concentration ionique en contact avec un support échangeur d'ions constitué de perles de verre poreuses aux surfaces desquelles
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du support, et
doser l'activité des isoenzymes MM et MB dans les fractions liquides respectives ainsi obtenues.