"Technique fluorométrique pour détermination de concentrations en isoenzymes" <EMI ID=1.1>
La présente invention concerne une-méthode fluorométrique pour déterminer les activités individuelles d'isoenzymes, ainsi qu'une méthode électrophbrétique pour séparer la créatinine phosphokinase.
Les techniques fluorométriques pour déterminer la présence d'isoenzymes sont bien connues de ceux qui sont compétents en la matière, par exemple dans "Fluorescent
<EMI ID=2.1>
de A. L. Sherwin, Clinica Chemica Acta, 17: 245 à 249
(1967). La technique fluorométrique standard employée par
ceux qui sont compétents en la matière consiste à détecter
la présence de NADH, NADPH, leurs dérivés et leurs mélanges
(appelés ci-après "produit fluorométrique"), dans un
milieu électrophorétique. On peut également voir "Démonstration of Sérum Creatine Kinase Isoenzyme by Fluorescence
Technique", de H. Somer, Clinica Chemica Acta, 40 :
133 à-138 (1972) ; "Characterization of Tissue Alkaline Phosphatases and their Partial Purification by Starch-Gel Electrophoresis", de D.W Moss, Biochem. J.,81 : 414 à 447
(1961); et."Fluorometric Techniques in Clinical Chemistry"
<EMI ID=3.1>
(1973). Plusieurs problèmes sont inhérents à la détection du produit fluorométrique dans le milieu électrophorétique. Ces problèmes comprennent la présence d'un artéfact d'albumine (J. Goldberg, "Enzymes in Medicine", Vol.7
N[deg.] 3,526 (1973); Helena Update, vol 18 (Août 1973) ; et
R. Wong "Cellulose Acétate Electrophoresis of Creatine Phosphokinase Isoenzymes in the Diagnosis of Myocardial Infraction", A. J. C. P., 64 : 209 à 216 (1975). ; la présence d'un artéfact de beta-lipoprotéines (C.R. Rowe "Combined Isoenzyme Analysis in the Diagnosis of Myocardial Injury : Application of Electrophorètic Methods for the Détection and Quantitation of the Creatine Phosphokinase MB Isoenzyme", J. Lab. Clin. Med., Vol. 8, n[deg.] 4, 577 à
590 (1972) ; l'interférence de drogues dans une détection fluorométrique (F. R.' Elevitch, citation ci-dessus) ; et des imprécisions produites par la diffusion de bandes
(Rowe, citation ci-dessus et Wong, citation ci-dessus).
Un autre problème présent dans les méthodes fluorométriques selon l'art antérieur, pour détecter les produits fluorométriques, est le problème bien connu de l'affaiblissement
ou fading, c'est-à-dire la disparition d'une partie de la fluorescence des bandes pendant le séchage. On peut voir
H. Somer, citation ci-dessus.
La détection des isoenzymes produits dans le
milieu du substrat est bien connue dans l'art de la colorimétrie. On peut voir S. S. Kind, "Stable Test-Papers for Seminal Acid Phosphatase", Nature, vol. 182, n[deg.] 4646
(15 Novembre 1958) ; J. Clausen "Immunochemical Techniques.
for Identification and Estimation of Macromolecules"; North-Holland Publishing Co., Amsterdam (1969), et G.J.
Bremer et C. F Singer "An Introduction to Isoenzyme Techniques", Academic Press, New York, N. Y. Des méthodes fluorométriques dans lesquelles les produits fluorométriques sont détectés
dans le milieu du substrat sont également connues, on peut
voir le brevet germanique n[deg.] 2 136 880.
<EMI ID=4.1>
ment forment tous deux un défaut important dans les déterminations fluorométriques des isoenzymes, depuis l'introduction
<EMI ID=5.1>
aux environs des années 1972.
La présente invention a surmonté le problème
de la diffusion, par la découverte qu'en précipitant le produit fluorescent dans du papier filtre ou autre milieu formant substrat approprié, les bandés sont localisées et
la sensibilité de la technique fluorométrique est ainsi accrue. Par ailleurs, on a également découvert, selon la présente invention,que le phénomène de l'affaiblissement ou fading pouvait être fortement diminué en déshydratant le milieu du substrat par remplacement du solvant.
La présente invention concerne une méthode pour augmenter la sensibilité d'une technique fluorométrique, en précipitant un produit fluorescent in situ dans le milieu du substrat. Le réactif utilisé pour effectuer cette précipitation in situ, est choisi dans un groupe consistant en une composition comprenant de 90 à 100% en poids d'alcool par volume unitaire, cet alcool contenant de 1 à 6 atomes de carbone, et de 0 à 10% en poids d'urée par volume unitaire ;. des cétones contenant de 3 à 8 atomes de carbone ; une solution inorganique 'comprenant de l'ordre de 90 à 99,99% ' d' un solvant choisi dans un groupe consistant en eau et solvants organiques polaires inertes et de l'ordre de 0,01 à environ
<EMI ID=6.1>
<EMI ID=7.1>
<EMI ID=8.1>
La présente invention concerne également une amélioration supplémentaire se rapportant à la détection fluorométrique des isoenzymes de créatinine phosphokinase Quand l'enzyme créatinine phosphokinase est séparé de-façon électrophorétique, en ses isoenzymes constituants, la technique de détection fluorométrique ci-dessus est encore améliorée en employant un tampon électrophorétique comprenant.
<EMI ID=9.1>
laquelle ri est un nombre entier de 1 à 4, du tri-(hydroxyméthyl) aminométhane et de l'eau. Ce tampon a un pH de 7 à 8,5 à
23[deg.]C, et une force ionique de 0,02 à 1,5.
L'invention sera mieux comprise et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages,de celle-ci apparaîtront plus clairement au cours de la-description explicative qui va suivre, faite en référence au dessin schématique annexé,
donné uniquement à titre d'exemple, illustrant un mode de réalisation de l'invention et dans .lequel :
- la figure 1 est une comparaison de la séparation électrophorétique de créatinine phosphokinase obtenue en utilisant un tampon de tris-aspartate par rapport à un tampon barbital.'
Le procédé selon la présente invention peut être utilisé pour mesurer la concentration de tout isoenzyme
capable de réagir directement pour produire un produit fluorescent ou de faire partie d'une séquence réactionnelle donnant un produit fluorescent. Des enzymes que l'on peut
citer comme ayant des-isoenzymes pouvant répondre à la nécessité ci-dessus comprennent la créatine phosphokinase,
la lactate déhydrogénase, la glucose-6-phosphate déhydrogénase, l'hexokinase,. la malate déhydrogénase, l'isocitrate déhydrogé-
<EMI ID=10.1> .leur utilisation courante dans des laboratoires cliniques, la créatinine phosphokinase et la lactate déhydrogénase sont de préférence utilisées dans la présente invention.
L'analyse générale des isoenzymes peut être divisée en trois étapes de base. L'étape 1 est la mise en place de l'échantillon contenant un enzyme sur un moyen de support et la séparation physique de l'enzyme en ses divers isoenzymes
) constituants par l'un des divers moyens de séparation bien
connus de ceux qui sont compétents en la matière. L'étape 2 est la localisation de chaque isoenzyme composant. Cela consiste en une série de réactions chimiques catalysées par les isoenzymes composants pour produire un produit chimique détectable, comme un produit fluorescent, dont la quantité
est proportionnelle à la quantité d'isoenzyme présent. L'étape 3 est une détermination de la.'quantité de-chaque isoenzyme composant. Cela est accompli en explorant soit le moyen de support ou le moyen formant substrat avec un fluoromètre ou un densitomètre, pour déterminer la quantité du produit
chimique obtenu par chaque isoenzyme composant.
Divers moyens de. séparation des isoenzymes sont bien connus de ceux qui sont compétents en la matière. Ces méthodes comprennent une électrophorèse en gel ( couramment appelée plus simplement "méthode de séparation électrophorétique"), une chromatographie en gel en couche mince, une électrophorèse en couche mince, et une focalisation isoélectrique en couche mince. La technique la plus couramment utilisée de nos jours dans des laboratoires cliniques, et par conséquent la technique utilisée de préférence dans la présente invention puur la détection de produits fluorométriques; est la
méthode de séparation.électrophorétique. En général', la séparation électrophorétique des isoenzymes est accomplie
en appliquant un écnantillon, comme du sérum humain, à un milieu électrophorétique. Le milieu électrophorétique est placé dans une chambre ou enceinte ou cellule électrophorétique, qui contient un tampon aqueux connu sous'le nom de tampon
<EMI ID=11.1> -contact direct avec le tampon électrophorétique qui, à son tour, est en contact direct avec deux électrodes séparées
(une cathode et une anode). Les électrodes sont connectées à une alimentation en courant continu, ainsi le procédé électrophorétique a lieu quand du courant continu est appliqué au milieu électrophorétique.. Pour bien séparer les divers isoenzymes constituants, le procédé électrophorétique a habituellement lieu à un potentiel électrique établi , par exemple, de l'ordre de 50 à environ 500 volts, et pendant un temps suffisamment long, par exemple de l'ordre de 0,1 à environ 2 heures.
La localisation de chaque isoenzyme composant nécessite une mise en. contact des-isoenzymes sépares avec des réactifs pouvant réagir pour donner un produit détectable. Une méthode bien connue de ceux qui sont compétents en la matière consiste à mettre les isoenzymes séparés en contact avec un milieu formant substrat contenant ces réactifs. Le milieu formant substrat est préparé en incorporant le substrat chimique
<EMI ID=12.1>
du gel agarose et autres. Le milieu stabilisant préféré pour la présente invention est du papier filtre et du papier chromatographique, ce dernier étant le milieu stabilisant choisi. Habituellement, on ajoute au milieu stabilisant, un tampon de substrat, des ions métalliques comme activateurs, des réactifs spécifiques ou substrats, et un coenzyme,
<EMI ID=13.1>
qui sert de substrat fluorogénique.
Après éleçtrophorèse, le milieu électrophorétique,
comme ceux qui sont compétents en la matière le savent, est placé dans une enceinte et le milieu formant substrat est
placé en contact direct avec la surface du milieu électrophorétique. Les milieux électrophorétique et formant substrat sont incubés à une température et pendant un temps prédéterminés. Bien que la température et le temps d'incubation ne soient . pas critiques, le procédé d'incubation utilisé dans la présente invention a de' préférence lieu à une température de 1 ' ordre de <EMI ID=14.1>
pendant une période de l'ordre de 30 à 90 mn et mieux de
<EMI ID=15.1>
la formation de produits fluorométriques spécifiques. Les produits fluorométriques formés dans les zones .où sont
placés les isoenzymes, sont libres de se rediffuser dans le milieu du substrat. Les protéines, les lipides et les drogues liées ne se diffusent pas à une quantité appréciable dans le milieu du substrat, étant donné leur dimension physique importante, c'est-à-dire leur poids moléculaire. A la fin de la phase d'incubation, le milieu formant substrat est séparé du milieu électrophorétique.
La détection du produit fluorescent est accomplie en excitant le produit fluorescent par une lumière/ultraviolette dans l'étendue de 300 à 400 nm, avec une absorbance maximum
à 340-350 nm.. Le produit fluorescent entre en fluorescence avec une lumière visible à 400-500 nm, avec une fluorescence maximum à environ 460 nm. La détection de la lumière fluorescente visible peut être effectuée à l'oeil avec un fluoromètre ou un densitomètre fluorescent. Une autre technique de détection que l'on peut également employer consiste à découper les zones du milieu formant substrat,
qui contiennent le produit fluorescent et à placer chaque section dans une solution aqueuse pour redissoudre et
éluer le produit fluorescent du milieu formant substrat. Une fois que cela a eu lieu, le produit fluorescent élué peut
être mesuropar absorbance, fluorescence ou par une méthode
de détermination.chimique. La quantité et la position du produit fluorescent détecté sont proportionnelles aux isoenzymes placés dans le milieu électrophorétique, et par conséquent à la quantité d'isoenzymes dans l'échantillon qui est examiné.
Deux autres méthodes de détection du produit fluorométrique sont la technique de reproduction photographique
et la technique d'exploration négative photographique.
La première est une méthode qualitative qui'consiste à examiner à l'oeil une image prise du milieu formant substrat. La .
. dernière est une méthode quantitative consistant à analyser de façon densitométrique, le négatif d'une photographie du milieu formant substrat.
La technique de détection fluorométrique selon la
présente invention consiste à modifier les étapes ci-dessus d'analyse des isoenzymes, de façon qu'avant l'étape de détection fluorométrique, le produit fluorométrique soit précipité in situ dans le milieu formant substrat. La j précipitation du produit fluorescent peut être amenée en utilisant un réactif choisi dans un groupe consistant en une composition comprenant de l'ordre de 90 à 100, de préférence'1.00% en poids d'alcool par volume unitaire, l'alcool contenant de 1 à 10, de préférence de 1 à 3 atomes de carbone et.de 0 à 10, de préférence 0%. en poids d'urée
par volume unitaire ; des cétones contenant de 3 à 8 atomes
de carbone, de préférence de 3 à 5 atomes de carbone ; une
solution d'un sel inorganique comprenant de l'ordre de 90
à 99,9 et de préférence de,l'ordre de 98 à 99% d'un solvant
choisi dans un groupe consistant en eau et solvants organiques polaires inertes, de préférence du groupe consistant en
alcool contenant de 1 à 6 atomes de carbone et cétones
contenant 3 à 8 atomes de carbone, et mieux du groupe
consistant.en alcools contenant de 1 à 3 atomes de carbone,
et environ 0,01 à environ 10, de préférence de 1 à 2% d'un sel inorganique ayant pour formule R(Y)2, où R est choisi dans
<EMI ID=16.1>
et leurs mélanges. On peut citer comme autres solvants organiques polaires inertes; le diméthylformamide et le diméthylacétamide.
Le seul critère qu les solvants organiques polaires inertes doivent'satisfaire est qu'ils soient capables de solubiliser
<EMI ID=17.1>
Les réactifs ci-dessus peuvent être utilisés avec addition d'un polymère, par exemple du polypropylène glycol, du polyéthylène glycol, et autres, pour améliorer la précipitation et contrôler les caractéristiques de surface (c'est-à-dire pour empêcher le gondolement ou le plissement) du milieu formant substrat.
Il est également souhaitable de déshydrater le milieu formant susbtrat, pour augmenter l'intensité de la fluorescence du produit fluorescent. La déshydratation peut être
accomplie par évaporation de l'eau du milieu formant substrat, ou de préférence par remplacement du solvant, comme un remplacement de l'eau par de l'alcool et de l'éther.
Pour éliminer le phénomène d'affaiblissement ou fading non souhaitable ci-dessus indiqué, il est préférable de cnmbiner la précipitation et la déshydratation en une seule étape, en plaçant le milieu formant substrat dans de l'alcool pendant une courte période de temps. A ce point, le produit fluorescent peut être détecté par fluorescence, mais pour aider la manipulation, on laisse de préférence l'alcool s'évaporer, ce qui donne un milieu formant substrat sec contenant un produit fluorescent localisé, et ne s'affaiblissant relativement pas.
Bien qu'il y ait de nombreux tampons électrophorétiques appropriés connus de ceux qui sont compétents en la matière, que l'on peut utiliser dans l'étape de séparation électrophoré- tique des isoenzymes ci-dessus décrite, quand on sépare par électrophorèse de la créatinine phosphokinase en ses isoenzymes constituants, il est préférable d'utiliser un tampon électrophorétique particulier comprenant (a) un acide ayant pour formule HOOC(CH2)nCH(NH2)COOH, dans laquelle n est un nombre entier de l'ordre de 1 à 4, de préférence de 1 à 2, (b)
du tris(hydrométhyl) aminométane, et (c) de l'eau, et de préférence de l'eau distillée ou désionisée et leurs mélanges.
<EMI ID=18.1>
de préférence de l'ordre de 7,2 à environ 7,7, et mieux de
7,5 à 23[deg.]C et une force ionique de l'ordre de 0,02 à environ 1,5, de préférence de l'ordre de 0,03 à environ 0,07/et mieux de l' ordre .de 0,05.
Il y a plusieurs raisons pour lesquelles le tampon électrophorétique ci-dessus est préféré pour la séparation par électrophorèse des isoenzymes de créatinine phosphokinase.
Une raison est que l'utilisation de tampons au barbital, ou. autres tampons semblables, donne un artefact d'application. L'artéfact d'application provient de l'enzyme" créatinine <EMI ID=19.1>
au point d'application de la limite/de l'échantillon, produisant ainsi un contour de la zone d'application-quand le milieu électrophorétique est exploré par densitométrie. De même, ces'tampons selon l'art antérieur séparent électrophorétiquement l'isoenzyme créatinine phosphokinase connu par
<EMI ID=20.1>
B..A. Nealson , J. Clin. Pathol., 28 (10), pages 834 à 836
(1975). Par ailleurs,le pH des tampons selon l'art antérieur est de l'ordre de 7,5 à 9, tandis que le pH optimum pour
la détermination des isoenzymes de créatinine phosphokinase est de 6,8. Contrairement aux inconvénients ci-dessus, en utilisant le tampon ci-dessus décrit, l'artefact de l'échantillon est éliminé, parce que l'isoenzyme CPK3
est localisé totalement du côté cathode du point d'application .de l'échantillon. De même, l'interférence de l'albumine du <EMI ID=21.1>
que' cet isoenzyme de créatinine phosphokinase est placé totalement du côté anode de la zone occupée par l'albumine du sérum. Par ailleurs, bien que la courbe de titrage du
pH du tampon ci-dessus décrit soit semblable à la courbe
du tampon au barbital, le pH plus faible du tampon ci-dessus, en comparaison du pH élevé du tampon au barbital, permet d'utiliser moins de tampon de substrat, pour abaisser le pH du milieu électrophorétique à la gamme optimale de pH pour les isoenzymes de créatinine phosphokinase.
Les exemples qui suivent sont donnés pour mieux illustrer la présente invention sans en restreindre le cadre.
EXEMPLE 1
<EMI ID=22.1>
détection fluorométrique de NAD réduit.
I. Technique électrophorétique
1. Tampon électrophorétique : Pour préparer le tampon électrophorétique, dissoudre les réactifs qui suiventdans un litre d'eau distillée.
a) 6,7 g de tris(hydroxyméthyl)aminométhane b) 6,0 g d'acide DL-aspartique <EMI ID=23.1>
2. Gel agarose : Pour préparer un gel agarose,
on dissout un g d'agarose dans 1.00 ml de tampon électrophorétique à la chaleur. On applique 12 ml de la solution d'agarose tamponnée chaude à une feuille de 70 x 165 mm d'une pellicule de polyester de marque Mylar (Mylar est une marque de
fabrique de la firme du Pont de Nemours & Co, Wilmington, Delaware), qui a été enduite d'une couche de résine hydrophile. On place dans la solution d'agarose chaude 4 tiges en acier
de 12,7 x 0,79 mm d'une façon linéaire, sur la largeur et a peu près à 75 mm à partir de l'extrémité de la feuille en Mylard. Une fois que la solution d'agarose s'est solidifiée pour former un gel, on enlève les quatre tiges en acier-avec un aimant, formant ainsi quatre fentes dans la matrice en gel, qui peuvent être utilisées pour contenir les échantillons
pour la séparation électrophorétique. La surface du gel
est légèrement séchée avec une feuille de papier chromato-graphique Whatman n[deg.]2, avant-que les échantillons ne soient appliqués au gel.
3. Echantillon a) Sérum d'un sang fraîchement coagulé <EMI ID=24.1> c) Extraits de tissu <EMI ID=25.1>
de l'échantillon à chaque'fente du gel, avec une seringue
d'un microlitre. Placer le gel dans une cellule électrophorétique qui contient un tampon électrophorétique.
5. Paramètres électriques : Accomplir la
séparation électrophorétique à 150 volts pendant 30 mn.
II. Technique de recouvrement du substrat . 1. Substrat : utiliser tout réactif de créatinine phosphokinase commercialisé.
2. Recouvrement de substrat <EMI ID=26.1> chromatographique Whatman n[deg.]542, de 1,5 ml de solution du substrat.
<EMI ID=27.1>
enlever le gel agarose de la cellule électrophorétique et le placer dans une petite boite d'incubation'en matière plastique. Avec une feuille de papier chromatographique <EMI ID=28.1> recouvrement du substrat sur la -surface du gel, en un mouvement roulant pour éviter que des bulles d'air ne soient piégées entre la surface du gel et le papier de recouvrement du substrat. ' .
Placer un couvercle sur la botte d'incubation
<EMI ID=29.1>
du substrat-gel à 37[deg.]C pendant 60 mn.
3. Précipitation et déshydratation La précipitation et la déshydratation du NAD réduit sont accomplies en enlevant le papier de recouvrement du substrat de la surface du gel, et en immergeant ce papier dans
<EMI ID=30.1>
recouvrement sur. une serviette en papier, et on le laisse sécher.
III. Détection de la fluorescence
1. Source d'excitation '
Exposer le papier de recouvrement de substrat séché à une source de lumière ultraviolette dans la région spectrale de 300 à 400 nm. '
*2. Détection de la fluorescence a) Observation visuelle directe b) Densitomètre fluorescent d'exploration c) Fluoromètre d) Reproduction-photographique
EXEMPLE 2
Analyse des isoenzymes de lactate déhydrogénase par détection fluorométrique de NAD réduit.
I. Technique électrophorétique
1. Tampon électrophorétique : pour.préparer le tampon électrophorétique, dissoudre le réactif suivant dans
<EMI ID=31.1> a) 2,6g,de sodium barbital b) 1,i5g d'acide citrique c) 3,5 g de tris-(hydroxyméthyl)-aminométhane <EMI ID=32.1>
3. Echantillon : voir exemple 1
4. Application de l'échantillon.: voir exemple 1 5. Paramètres électriques : accomplir la séparation électrophorétique à 150 volts pendant 45 mn.
II. Technique de recouvrement du substrat
1. a) 30 mg de lactage de L-lithium b) 15 mg de fi -nicotinamide adénine dinucléotide
(NAD) c) 1,5 ml de tampon électrophorétique
2. Recouvrement du substrat : voir exemple 1
3. Précipitation ét déshydratation : voir exemple 1
<EMI ID=33.1>
D'autres enzymes, par exemple glucose-6-phosphatè déhydrogénase, hexôkinase, malate déhydrogénase, isocitrate déhydrogénàse, aldolase, et alcool déhydrogénase peuvent être analysés par fluorométrie d'une façon analogue à ce qui est indiqué aux exemples 1 et 2.
EXEMPLE 3.
Pour démontrer la capacité de divers tampons de s'approcher du pH optimum pour la détermination de l'isoenzyme
<EMI ID=34.1>
des tampons électrophorétiques des exemples 1 et 2, à .1 ml de substrat de créatinine phosphokinase et on mesura le pH dû mélange. Les résultats dérivés de-ces expériences sont indiqués au tableau I.
tx.
<EMI ID=35.1>
<EMI ID=36.1>
Le tableau = indique clairement que le tampon électrophorétique selon la présente invention, représenté par le tampon électrophorétique de l'exemple.-1, se rapproche plus du pH souhaitable du substrat de créatinine phosphokinase que ne le fait le tampon électrophorétique selon l'art
<EMI ID=37.1>
<EMI ID=38.1>
L'enzyme créatinine phosphokinase présent dans un échantillon de sérum humain fut séparé par électrophorèse
sous un courant électrique de 1,4 volt par centimètre
pendant 30 mn. Cette séparation fut accomplie dans un tampon tris-aspartique et un tampon de barbital. Le tampon de barbital se composait de 5,1 g en poids de barbituate de diéthyl-sodium et de 0,92 g en poids d'acide diéthyl-barbiturique. Le tampon tris-aspartique employé était le tampon électrophorétique
de l'exemple 1. Les localisations des divers isoenzymes
sont illustrées graphiquement sur la figure 1 et numériquement sur le tableau II.
Sur la figure 1, A indique le tampon de tris-aspartàte et B indique le tampon de barbital. Les signes-négatifs entourés sur la figure 1 représentent la cathode et les
<EMI ID=39.1> la figure 1 est employée pour mesurer la distance que les isoenzymes-parcourent à partir de la limite de l'échantillon
(b)(point d'application de l'échantillon), ainsi que la
-largeur des diverses zones représentées sur la figure 1.
<EMI ID=40.1>
la créatinine phosphokinase et l'albumine (a) est une protéine également présente dans le sérum humain.
La figure 1 indique clairement que lorsque la créatinine phosphokinase est séparée électrophorétiquement en utilisant <EMI ID=41.1>
côtés de la limite de l'échantillon, ce qui produit un artéfact d'application. Cependant, quand la créatinine phosphokinase est séparée électrophorétiquement en utilisant
<EMI ID=42.1>
que du côté cathode de la limite de l'échantillon, ce qui
<EMI ID=43.1> La figure 1 représente également clairement que, quand la créatinine phosphokinase est séparée par électrophorèse en utilisant le tampon au barbital,.la zone occupée par
<EMI ID=44.1>
pas de recouvrement présent quand la créatinine phosphokinase est séparée électrophorétiquement en utilisant le tampon tris-aspartique, cette interférence est totalement éliminée.
Le tableau II représente, sous forme numérique, la même information que celle donnée par la figure 1. Les millimètres indiqués au tableau 1 correspondent à l'échelle métrique sur la figure 1.
La figure 1 et la tableau II montrent clairement que le tampon électrophorétique selon la présente invention, exemplifié par le tampon électrophorétique de l'exemple 1, <EMI ID=45.1>
et l'interférence de l'albumine présents dans la séparation électrophorétique au tampon au barbital selon l'art antérieur.
Tandis que diverses méthodes et réactifs ont été
décrits en détails, on comprendra que des changements et modifications peuvent être faits sans se départir du cadre
de la présente invention. Par exemple, on a décrit ci-dessus
un tampon tris-aspartique comme étant capable d'améliorer
la séparation électrophorétique de la créatinine phosphokinase quand les isoenzymes de créatinine phosphokinase sont
détectés par la technique fluorométrique selon la présente invention, mais il est clair que ce tampon tris-aspartique
peut également être employé pour la séparation électrophorétique de créatinine phosphokinase si les isoenzymes sont détectés
par des techniques fluorescentes et non fluorescentes selon l'art antérieur.
<EMI ID=46.1>
mode de réalisation décrit et représenté qui n'a été donné qu'à titre d'exemple. En particulier, elle comprend tous les moyens constituant des équivalents techniques des moyens décrits, ainsi que leurs combinaisons si celles-ci sont exécutées suivant son esprit et mises en oeuvre dans le cadre'des revendications qui-suivent.
t
REVENDICATIONS
1.- Technique pour mesurer des concentrations en isoenzymes, du type où des enzymes sont placés sur un moyen de support et séparés en isoenzymes constituants
par un moyen de séparation, où ledit moyen de support contenant lesdits isoenzymes séparés est mis en contact avec un milieu formant substrat comprenant un substrat
et un milieu stabilisant, où ledit milieu formant substrat et ledit moyen de support sont séparés, et où un produit fluorescent est détecté par fluorométrie dans ledit milieu formant substrat, caractérisée en ce qu'elle consiste à:
mettre en contact ledit milieu formant substrat, à
la suite de sa séparation dudit moyen formant support, et avant détection fluorométrique, avec un réactif choisi
dans un groupe consistant en une composition comprenant de . 90 à 100 % en poids d'alcool par volume unitaire, ledit alcool contenant de 1 à 6 atomes de carbone, et de 0 à 10 % en poids d'urée par volume unitaire ; des cétones contenant de 3 à 8 atomes de carbone ; une solution d'un sel inorganique comprenant de l'ordre de 90 à 99,99 % d'un solvant choisi dans un groupe. consistant en eau et solvants organiques polaires inertes et de l'ordre de 0,01 à environ 10 % d'un sel inorganique ayant pour formule R(Y)2, où R est choisi <EMI ID=47.1>
rescent soit précipité in situ dans ledit milieu formant substrat, pour localiser ainsi sa présence et augmenter la sensibilité de la technique fluorométrique.