Compositions <EMI ID=1.1>
priétés antibiotiques et un procédé pour les préparer.
<EMI ID=2.1>
décrit et revendiqué des peptides de formule générale
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<EMI ID=4.1>
ou un groupe alcoyle inférieur, cycloalcoyle inférieur, cycloalcoyle inférieur-alcoyle inférieur, aryle ou aryl-alcoyle inférieur (lesdits groupes pouvant être, le cas échéant, substitués par un
ou plusieurs groupes amino, hydroxy, thio, méthylthio, carboxy ou guanidino pour former le groupe caractéristique d'un L-a-amino-acide existant dans la nature) ; R <2> et R3 représentent individuellement
<EMI ID=5.1>
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peut pas représenter un atome d'hydrogène quand
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groupe phényle) ; R4 représente le groupe hydroxy ou méthyle ; n = 0, 1, 2 ou 3 ; un astérisque seul signifie que l'atome de carbone a la configuration
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cation autre qu'un atome d'hydrogène ; et un double
<EMI ID=9.1>
tion autre qu'un atome d'hydrogène, la configuration à l'atome de carbone est (R) (comme défini ciaprès),
et leurs sels thérapeutiquement compatibles. Ces peptides et leurs sels thérapeutiquement compatibles potentialisent l'activité d'antibiotiques, et possèdent également une activité antibactérienne.
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compositions comprenant un peptide de formule générale I, ou l'un de ses sels d'addition d'acides thérapeutiquement compatibles, et un antibiotique choisi parmi les suivants :
céphalothine,céphal.exine, carbénicilline, ampicilline, pénicilline G, sulbénicilline, céphazoline, céfoxitine,
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amino}pénicillanate de (pivaloyloxy)méthyle, céphamandole, céphaloridine, céphaloglycine, phénéthicilline, méthicilline, propicilline, ticarcilline, sel d'amoxycilline-arginine, phosphonomycine, vancomycine et kanamycine sont particulièrement intéressants au point de vue de la potentialisation obtenue
de l'antibiotique.
La présente invention est basée sur cette découverte
et elle a donc trait à une composition ayant des propriétés antibiotiques, cette composition comprenant un peptide de
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compatibles,ainsi qu'un antibiotique,comme décrit ci-dessus.
Dans le contexte, le terme "alcoyle inférieur" couvre un groupe alcoyle linéaire ou ramifié contenant de préférence 1 à 6 atomes de carbone (par exemple méthyle, éthyle, propyle, isobutyle, etc.). Le terme "cycloalcoyle inférieur" couvre des groupes alcoyle cycliques contenant de 3 à 6 atomes de carbone. Le terme "aryle" couvre de préférence des groupes mononucléaires, tels que phényle, pouvant être substitués
en une ou plusieurs positions par un groupe hydroxy, halogéno, nitro, alcoyle inférieur ou alcoxy inférieur. Le terme "halogène" couvre les atomes de fluor, chlore, brome et iode,
et le terme "alcoxy inférieur" couvre des groupes de structure -0-(alcoyle inférieur), dans lesquels le groupe alcoyle inférieur a la même signification que ci-dessus. Le terme "groupe caractéristique d'un a-amino-acide du type de ceux
se trouvant habituellement dans les protéines" signifie que le radical R d'un a-amino-acide naturel de formule générale
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<EMI ID=14.1>
exemple, si l'amino-acide est la glycine, le radical R sera un atome d'hydrogène; dans l'alanine, le radical R représentera le groupe méthyle ; dans la leùcine, le radical
R représentera le groupe isobutyle et dans l'acide glutamique, le radical R représentera le groupe 2-carboxyéthyle. R peut aussi représenter un radical relié à l'atome d'azote du groupement amino (avec la perte d'un des atomes d'hydrogène attachés à celui-ci), formant ainsi un cycle azoté comme dans la proline et l'acide pyroglutamique.
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autre qu'un atome d'hydrogène, la configuration de l'atome de carbone marqué d'un double astérisque sera R, c'est-à-dire celle que l'on obtiendrait en remplaçant le groupe carboxy d'un L-a-amino-acide existant dans la nature par un atome de phosphore.
On notera que dans la formule générale I, lorsque n =
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Les peptides de formule générale I préférés sont ceux dans lesquels R2 et R3 représentent indépendamment un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, isopropyle, isobutyle,
<EMI ID=17.1>
<EMI ID=18.1>
groupe hydroxy et n = 0 ou 1.
Comme exemples de peptides de formule générale I, on peut citer :
acide (L-alanylamino)-méthylphosphonique,
acide (L-valylamino)-méthylphosphonique,
<EMI ID=19.1> <EMI ID=20.1>
spécialement préféré.
Les sels thérapeutiquement compatibles de peptides
<EMI ID=21.1>
acides forts tels que les acides méthane-sulfonique, paratoluène-sulfonique, chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, etc., et avec des bases telles que l'hydroxyde de sodium etc.
Les antibiotiques mentionnés plus haut sont des substances connues et peuvent être obtenus selon des procédés connus.
Le rapport de poids du peptide de formule générale I, <EMI ID=22.1> l'antibiotique peut varier dans de larges limites. En général, les compositions peuvent contenir le dérivé peptidique, ou
<EMI ID=23.1>
dans un rapport compris entre environ 100:1 et 1:100, de préférence de 1:64 à 64:1, et spécialement de 1:16 à 16:1.
Le procédé de la présente invention pour la préparation des compositions sus-mentionnées consiste à mélanger le peptide de formule générale I, ou l'un de ses sels thêrapeutiquement compatibles,avec l'un des antibiotiques sus-mentionnés. Ce procédé peut être exécuté de manière connue. Dans une mise
en oeuvre préférée de 'ce procédé, le peptide de formule générale I, ou l'un de ses sels thérapeutiquement compatibles, et l'antibiotique sont utilisés dans un rapport de poids de 1:100 à 100:1, particulièrement de 1:64 à 64:1 et, de préférence, de 1:16 à 16:1.
Les compositicns de la présente invention sont actives contre un large spectre de bactéries à Gram positif et Gram négatif, comme par exemple Escherichia coli, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, 'Streptococcus faecalis, Klebsiella aerogenes et Klebsiella pneumoniae. Ils sont donc utiles pour combattre et prévenir
un grand spectre d'infections bactériennes et peuvent être administrés oralement ou parentéralement, la voie orale étant préférée.
L'activité in vitro des compositions de la présente invention peut être démontrée comme suit :
On prépare des solutions concentrées au rapport désiré des mélanges du peptide de formule générale I et de l'antibiotique. On dilue ensuite afin d'obtenir un spectre approprié de concentration totale des mélanges. Des portions de ces dilutions sont mélangées avec un milieu agar nutritif approprié dans des coupelles de petri, puis on laisse l'agar
se déposer. On prépare des coupelles similaires en utilisant
le milieu nutritif d'agar contenant le peptide seul et l'antibiotique seul. On inocule ensuite les organismes-test sur
i <EMI ID=24.1>
Les coupelles sont ensuite maintenues à 37[deg.] pendant 24 heures, après quoi la concentration inhibitrice minimum (C.I.M.)
est constatée, puis les indices fractionnels de concentration inhibitrice (I.F.C.I.) calculés. Les résultats obtenus au moyen d'un peptide de formule générale I représentatif,
<EMI ID=25.1>
et des antibiotiques représentatifs sus-mentionnés sont donnés dans les tableaux I et II ci-après :
Tableau I
Activité de combinaisons de divers antibiotiques avec
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Staphylococcus aureus
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<EMI ID=28.1>
souches de Klebsiella aerogenes et Proteus mirabilis
<EMI ID=29.1>
L'activité in vivo des compositions selon l'invention peut être démontrée comme suit :
Des souris sont infectées par voie intrapéritonéale
<EMI ID=30.1>
intervalles (déterminés à l'avance) après l'infection, on traite des groupes de souris par voie sous-cutanée avec des doses graduelles d'antibiotique, de peptide et de combinaisons
des deux. Pour chaque traitement, on compte le nombre de souris survivant 7 jours à compter du début de l'infection, puis calcule la dose empêchant la mort dans 50% des cas (DC50)' boa"
<EMI ID=31.1>
pour une combinaison d'antibiotique et de peptide est calculé de manière normale. Les résultats obtenus avec l'acide
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peptide de formule générale I et les antibiotiques représentatifs sus-mentionnés sont indiqués au tableau III ciaprès :
<EMI ID=33.1>
<EMI ID=34.1>
<EMI ID=35.1>
administrées sous forme de préparations pharmaceutiques, qui font également partie de la présente invention et comprennent un peptide de formule générale I, ou un sel thérapeutiquement compatible, un antibiotique comme défini ci-dessus et un support pharmaceutiquement acceptable.
En tant que support pharmaceutiquement acceptable, on peut utiliser n'importe quel véhicule solide ou liquide compatible avec les peptides de formule générale I, leurs
sels thérapeutiquement compatibles, et avec les antibiotiques spécifiés ci-dessus, et appropriés pour l'administration thérapeutique. Il peut s'agire de substances organiques
ou inorganiques appropriées pour l'application antérale
(par exemple orale) ou parentérale, comme par exemple l'eau,
la gélatine, le lactose, les amidons, le stéarate de magnésium, le talc, les huiles végétales, la gomme arabique,
les polyalcoylèneglycols, la vaseline etc.
Les préparations pharmaceutiques peuvent être préparées de manière connue et peuvent se présenter sous
forme solide (par exemple comprimer, dragées, suppositoires
ou capsules), ou sous forme liquide (par exemple de solutions suspensions ou émulsions). Ces préparations pharmaceutiques peuvent être soumises à tout traitement pharmaceutique conventionnel tel que stérilisation et peuvent contenir des adjuvants tels que des agents conservateurs, stabilisants, mouillants, émulsifiants, des sels régularisant la pression osmotique ou des composés-tampons. Lorsqu'un tampon est utilisé, le pH de la préparation variera naturellement dans
de larges limites bien connues dans la pratique pharmaceutique.
La quantité de peptide de formule générale I, ou d'un
de ses sels thérapeutiquement compatibles, et d'antibiotique présents dans la préparation pharmaceutique de l'invention variera dans de larges limites en fonction de facteurs tels
que le peptide choisi ou son sel, l'antibiotique choisi, la voie d'administration et l'infection à traiter. Le dosage administré quotidiennement variera également dans de larges limites et sera adapté aux besoins individuels et aux conditions <EMI ID=36.1>
du médecin. Par exemple, un dosage quotidien pour administration orale peut comporter de 750 mg à 1500 mg d'une combinaison d'ingrédients actifs (par exemple un peptide
de formule générale I,ou un sel thérapeutiquement compatible de ce dernier,et un antibiotique). En outre, une dose quotidienne parentérale pourra par exemple comporter environ
200 mg à 2000 mg d'une combinaison de substances actives. Les doses quotidiennes peuvent être administrées par dose unique ou subdivisée .
Les peptides de formule générale I et leurs sels thérapeutiquement compatibles sont préparés par un procédé caractérisé en ce qu'on a) scinde le(s) groupe(s) protecteur(s) d'un composé de formule générale
<EMI ID=37.1>
dans laquelle R , R et R ont respectivement les mêmes significations que R , R<2> et R<3> sauf que tout groupe amino présent peut être sous forme protégée et tout autre groupe fonctionnel pouvant être présent se présente le cas échéant sous forme
40 41 protégée, R représente le groupe méthyle ou R , R41 représente un groupe hydroxy ou un groupe alcoxy
<EMI ID=38.1>
drogène ou un groupe protecteur et l'astérisque
simple ou double et n ont la même signification
que ci-dessus,
selon des méthodes connues
ou b) sépare un peptide diastéréo-isomère (R,S) de formule générale I en ses diastéréo-isomères et isole le diastéréoisomère (R), et convertit le cas échéant un composé de formule <EMI ID=39.1> générale I obtenu en un sel thérapeutique'
Le(s) groupe(s) amino éventuellement présent(s) dans
<EMI ID=40.1>
peuvent être protégés par tout groupe protecteur d'amino bien connu en chimie des peptides. Comme groupes protecteurs d'amino particulièrement appropriés aux buts de l'invention, on peut citer les groupes aralcoxycarbonyle, notamment benzyloxycarbonyle, et t.-butoxycarbonyle. Le groupe protecteur d'amino peut aussi être un groupe formyle, trityle, ou trifluercacëtyle. Tout groupe carboxy ou hydroxy pouvant
<EMI ID=41.1>
générale II peut être protégé respectivement par un groupe protecteur classique de carboxy ou d'hydroxy. Un groupe carboxy peut par exemple être protégé par conversion en un ester alcoyliaue (par exemple l'ester t.-butylique) ou un ester aralcoylique (par exemple l'ester benzylique). De plus, un
groupe hydroxy peut par exemple être protégé au moyen d'un
groupe aralcoxy-carbonyle (par exemple benzyloxy-carbonyle), alcanoyle (par exemple acétyle, propionyle, etc.), aroyle (par exemple benzoyle), alcoyle (par exemple t.-butyle) ou aralcoyle
(par exemple benzyle). La protection d'autres groupes fonctionnels
<EMI ID=42.1>
<EMI ID=43.1>
la formule générale II peut être tout groupe protecteur d'amino
<EMI ID=44.1>
La scission du (ou des) groupe(s) protecteur(s) présent(s) dans un composé de formule générale II est effectuée selon des méthodes connues, c'est-à-dire des méthodes effectivement utilisées ou décrites dans la littérature sur la scission de groupes protecteurs. Ainsi,'par exemple, un groupe aralcoxy-carbcnyle
(par exemple benzyloxy-carbonyle) ou t.-butoxycarbonyle peut être scindé par hydrolyse (c'est-à-dire par traitement avec un mélange de bromure d'hydrogène et d'acide acétique glacial). Un groupe aralcoxy-carbonyle (par exemple benzyloxy-carbonyle) peut aussi être scindé par hydrogénolyse (par exemple en présence de charbon palladié ).-Le groupe t.-butoxy-carbonyle peut <EMI ID=45.1>
Un groupe alcoxy inférieur représenté par R et/ou R peut être converti en un groupe hydroxy par. traitement avec un mélange de bromure d'hydrogène dans de l'acide acétique glacial ou au moyen de triméthylchlorosilane, suivi d'une hydrolyse aqueuse. On notera que la scission des groupes protecteurs peut être effectuée en une seule ou plusieurs phases selon la nature des groupes protecteurs présents.
<EMI ID=46.1>
diastéréo-isomère (R) _peuvent être effectuées selon des méthodes
<EMI ID=47.1>
chromatographie liquide à haute pression.
Les substances de départ de formule générale II peuvent par exemple être préparées par condensation d'un composé de formule générale
<EMI ID=48.1>
<EMI ID=49.1>
double et simple ont la même signification que cidessus,
avec un a-amino-acide, un dipeptide, un tripeptide ou un tétrapeptide protégés de manière adéquate, ou un de leurs dérivés réactifs, selon le cas.
Ainsi, quand on emploie un composé de formule générale III dans laquelle n = 0, un tel composé peut être condensé avec un a-amino-acide protégé de manière adéquate ou l'un de ses dérivés <EMI ID=50.1>
laquelle n = 0, ou avec un dipeptide protégé de manière adéquate ou l'un de ses dérivés réactifs pour donner un composé de.formule générale II,dans laquelle n = 1, ou avec un tripeptide protégé de manière adéquate ou l'un de ses dérivés réactifs pour donner un composé de formule générale Il,dans laquelle
n = 2, ou avec un tétrapeptide protégé de manière adéquate ou l'un de ses dérivés réactifs,pour donner un composé de formule générale II dans laquelle n = 3.
<EMI ID=51.1>
n = l,peut être condensé avec un a-amino-acide protégé de Tanière approprier ou un de ses dérivés réactifs pour donner un composé de formule générale II,dans laquelle n = 1, ou avec un dipeptide protégé de manière appropriée ou l'un de ses dérivés réactifs, pour donner un composé de formule générale II,dans laquelle
n = 2, ou avec un tripeptide protégé de manière appropriée ou l'un de ses dérivés réactifs pour donner un composé de formule 'générale II,dans laquelle n = 3.
D'autre part, un composé de formule générale III,dans laquelle n = 2,peut être condensé avec un a-amino-acide protégé de manière adéquate ou l'un de ses dérivés réactifs pour donner un composé de formule générale II,dans laquelle n = 2, ou avec un dipeptide protégé de manière appropriée ou l'un de ses dérivés réactifs pour donner un composé de formule générale II, dans laquelle n = 3.
Enfin, un composé de formule générale III,dans laquelle n = 3,peut être condensé avec un a-amino-acide protégé de manière adéquate ou l'un de ses dérivés réactifs pour donner un composé de formule générale II,dans laquelle n = 3:
Par ailleurs, on peut préparer les composés de formule générale II en effectuant la condensation ci-dessus au moyen <EMI ID=52.1>
manière connue le composé (R) du produit (R,S) résultant,
par exemple par cristallisation, chromatographie ou cristallisation fractionnée au moyen d'une base appropriée, par exemple
<EMI ID=53.1>
La condensation mentionnée ci-dessus peut être effectuée selon des méthodes connues en chimie des peptides, par exemple par la méthode de l'anhydride mixte, de l'azide, de l'ester activé ou du chlorure d'acide.
Selon une méthode, un composé approprié de formule générale III peut être condensé avec un amino-acide (di-, tri- ou tétrapeptidique selon le cas) protégé de manière appropriée, la fonction carboxy terminale étant un radical d'anhydride mixte formé avec un acide organique ou inorganique. Avantageusement, un tel amino-acide di-, tri- ou tétrapeptidique portant une fonction carboxy libre est traité avec une base tertiaire telle qu'une trialcoylamine inférieure (par exemple une triéthylamine) ou une N-éthylmorpholine dans un
<EMI ID=54.1>
1,2-diméthoxyéthane, dichlorométhane, toluène, éther de pétrole ou des mélanges de ceux-ci) et le sel résultant est mis en réaction avec un ester d'acide chloroformique (par exemple ester butylique ou isobutylique) à basse température. L'anhydride mixte obtenu est ensuite condensé avantageusement in situ avec le composé de formule générale III.
Dans une autre méthode, un composé de formule générale III approprié peut être condensé avec un amino-acide (di-,
<EMI ID=55.1>
priée, le groupe carboxy final étant sous forme d'un
azide d'acide. Cette condensation est effectuée de préférence dans un solvant organique inerte tel que le diméthylformamide ou l'acétate d'éthyle à basse température.
<EMI ID=56.1>
formule générale III approprié avec un amino-acide, (di-, tri- ou tétrapeptidique selon le cas) protégé de manière appropriée.. la fonction carboxy finale étant sous forme d'un groupe ester actif (par exemple p-nitrophényle, 2,4,5-trichlorophényle
<EMI ID=57.1>
effectuée avantageusement dans un solvant organique inerte tel
<EMI ID=58.1>
représentent un groupe alcoxy inférieur, dans un'alcanol aqueux (par exemple éthanol aqueux).
Selon encore une autre méthode, un composé approprié de formule générale III peut être condensé avec un amino-acide
(di-, tri- ou tétrapeptidique selon le cas), protégé de manière appropriée, la fonction carboxy finale se présentant sous forme de chlorure d'acide. Cette condensation est effectuée
<EMI ID=59.1>
<EMI ID=60.1>
O* 0 . 90
On prépare des capsules de gélatine dure de la teneur suivante :
<EMI ID=61.1>
<EMI ID=62.1>
la céphalexine sont individuellement moulus, mélangés et granulés avec une pâte à 10% d'amidon de mais contenant l'aérosol OT. Le granulé humide est séché, passé à travers un tamis, mélangé avec l'aérosil et finalement mis en capsules de gélatine dure.
Exemple 2
On prépare des caspules de gélatine dure de la teneur suivante :
<EMI ID=63.1>
Ces capsules sont préparées de manière analogue à celle décrit à l'exemple 1.
<EMI ID=64.1>
Un mélange poudreux pour la préparation d'une solution d'injection contient les ingrédients suivants :
<EMI ID=65.1>
Les ingrédients sont moulus individuellement et bien mélangés. Le mélange est placé dans des récipients appropriés sous conditions stériles, puis les récipients sont scellés.
Afin de préparer une solution d'injection, le mélange poudreux ci-dessus est dissous dans 2 ml d'eau pour injection.
Exemple 4
On prépare une solution d'injection en dissolvait 1,0 g de pénicilline G dans 2 ml d'une solution contenant 100 mg
<EMI ID=66.1>
tampon approprié. Un tampon approprié contient les ingrédients suivants :
<EMI ID=67.1>
Les exemples suivants illustrent en détail la manière
<EMI ID=68.1>
<EMI ID=69.1>
14,1 g (0,168 mole) de bicarbonate de sodium solide sont ajoutés à une solution de 7 g (0,056 mole) d'acide
(lR,S)-l-aminoéthylphosphonique dans 280 ml d'eau et 140 ml d'éthanol sous agitation à 0[deg.]. Tandis que l'on agite ce mélange
<EMI ID=70.1>
succinimidique de N-benzyloxycarbonyl-L-alanine dans 140 ml d'éthanol chaud est ajoutée goutte à goutte en l'espace d'environ
15 minutes. Cette dernière solution est rincée avec 70 ml d'éthanol. Le mélange-hétérogène est agité pendant 1 heure
à 0[deg.], puis pendant encore 16 heures à la température ambiante,
<EMI ID=71.1> <EMI ID=72.1> <EMI ID=73.1>
avec 500 ml, puis 2 fois 250 ml de chloroforme, acidifiée à pH 2 avec environ 80 ml d'acide chlorhy-
<EMI ID=74.1>
puis 2 fois 250 ml de chloroforme. La phase aqueuse
est concentrée et passée à travers une colonne de résine échangeuse de cations (B.D.H., Zerolit 225, SRC 13, RS03H ;-750 g ; fraîchement régénéré dans le cycle acide). La colonne est
éluée avec de l'eau et l'on recueille 6 fractions de 250 ml.
Les 4 premières fractions sont combinées,évaporées et ré-évaporées avec de l'eau pour éliminer l'acide chlorhydrique. On obtient
un résidu final d'acide (lR,S)-l-[(N-benzyloxycarbonyl-L-
<EMI ID=75.1>
Ce dernier résidu est dissous dans 400 ml d'eau et titré à pH 4,5 avec de la benzylamine 1M; titre 75 ml ; théorie
56 ml. La solution résultante est concentrée et cristallisée dans l'eau pour donner 5,3 g de sel de benzylamine de l'acide
<EMI ID=76.1>
<EMI ID=77.1>
puis recristallisation dans l'eau, on obtient le sel de
<EMI ID=78.1>
<EMI ID=79.1> ........
<EMI ID=80.1>
acétique)] et une seconde récolte de 0,825 g [point de fusion
<EMI ID=81.1>
Par recristallisation de la première récolte dans l'eau, on <EMI ID=82.1>
<EMI ID=83.1>
l'acide acétique).
<EMI ID=84.1>
<EMI ID=85.1>
est dissous dans 4 ml d'hydroxyde d'ammonium 2N, passé dans une colonne de résine échangeuse de cations (B.D.H.. Zerolit
225, SRC 13, RS03H ; 120 g ; fraîchement regénéré dans le
<EMI ID=86.1>
acide qui est concentré à 100 ml. A ceci, on ajoute successivement 100 ml de méthanol, 0,3 g de catalyseur de charbon palladié à 5% et 3 gouttes d'acide acétique glacial. Le mélange est hydrogéné à la température ambiante et à la pression atmosphérique. Le catalyseur est séparé par filtration et le solvant
<EMI ID=87.1>
50 ml de n-propanol pour donner 0,6 g d'un solide gommeux fondant à environ 275-280[deg.] (déc.). Après une recristallisation ultérieure dans l'eau et l'éthanol, on obtient 0,2 g d'acide
(lR)-l-(L-alanylamino)-éthylphosphonique fondant à 295-296[deg.]
<EMI ID=88.1>
Exemple B
Une solution de 30 g (0,24 mole) d'acide (1R,S)-1-
<EMI ID=89.1>
sodium 4N est agitée à 14[deg.] tandis que 180 ml (0,72 mole) d'une solution d'hydroxyde de sodium 4N et 102 g (0,60 mole) de
<EMI ID=90.1>
est poursuivie et au bout de 2 heures la température atteint
rJf, <EMI ID=91.1>
température ambiante. 600 ml d'éther sont ensuite ajoutés et le mélange est agité vigoureusement pendant 2 heures pour extraire le chloroformiate de benzyle en excès. Les phases
<EMI ID=92.1>
<EMI ID=93.1>
rature est maintenue en-dessous de 10[deg.] . On concentre fortement la pâte obtenue pour éliminer le gaz carbonique. Le résidu
est dissous dans 100 ml d'hydroxyde de sodium 2N et 50 ml d'eau, passé dans une colonne de résine échangeuse de cations
(B.D.H., Zerolit <2><2>5, SRC 13, RS03H ; 750 g ; fraîchement régénéré dans le cycle acide) et élué avec de l'eau. On obtient ainsi environ 3,2 litres d'éluat acide qui sont évaporés à la température ambiante et ré-évaporés avec 3 fois 500 ml d'eau.
On dissout le résidu dans l'eau et le laisse cristalliser.
Les cristaux sont séparés par filtration, lavés avec de
l'eau glacée et séchés ; rendement 39,2 g ; point de fusion
111-113[deg.] (déc. ). Par évaporation des filtrats combinés, puis recristallisation dans 75 ml d'eau et 10 ml de méthanol et réfrigération, on obtient une autre récolte de 6,51 g ; point de fusion 110-112[deg.] (déc.). On obtient un total de 45,71 g
<EMI ID=94.1>
qui est identifié comme étant le sel d.e monobenzylamine fondant à 196-197[deg.] (déc.).
42,2 g (163 mmoles) d'acide (lR,S)-l-(benzyloxycarbonylamino)-éthylphosphonique sont dissous dans 100 ml de méthanol. La solution est traitée avec une solution de 30,8 g (81,5 mmoles)
<EMI ID=95.1>
est agité pendant 3 heures à la température ambiante, puis pendant la nuit à 0[deg.]. Le sel de quinine de l'acide (1S)-1'(benzyloxycarbonylamino)-éthylphosphonique est séparé par filtration et lavé avec du méthanol. Les filtrats combinés sont évaporés et le résidu est dissous dans 300'ml d'hydroxyde d'ammonium 2N. La solution est extraite avec 3 fois 300 ml
de chloroforme. Chaque extrait de chloroforme est relavé avec
150 ml d'eau. Les extraits aqueux sont combinés, concentrés, <EMI ID=96.1>
(B.D.H., Zerolit. 225, SRC 13, RS03H ; 750 g; fraîchement régénéré dans le cycle acide). Par élution avec de l'eau, on obtient environ 2,3 litres d'éluat acide qui sont évaporés. Le résidu est ré-évaporé, d'abord avec 3 fois 200 ml d'eau, puis avec 3 fois 300 ml de méthanol pour donner environ 24 g d'un résidu gommeux. Cette gomme est dissoute dans 100 ml de
<EMI ID=97.1>
[82 mmoles ; fraîchement régénéré dans 28,4 g (82 mmoles) d'acé-
<EMI ID=98.1>
monium/éther de pétrole]. Le mélange est laissé au repos
à 0[deg.], filtré et le filtrat est lavé avec du méthanol et de
<EMI ID=99.1>
brut d'acide (lR)-l-(benzyloxycarbonylamino)-éthylphosphonique
<EMI ID=100.1>
le méthanol). Par recristallisation ultérieure dans du méthanol et de l'eau, on obtient 33,0 g de sel de déhydroabiétylamine
de l'acide (lR)-l-(benzyloxycarbonyl-amino)-éthylphosphonique
<EMI ID=101.1>
le méthanol).
8,0 g (14 mmoles) de l'acide obtenu au paragraphe précédent sont répartis entre 100 ml d'hydroxyde d'ammonium 2N et 100 ml d'éther de pétrole (domaine d'ébullition 60-80[deg.]). Le mélange est agité vigoureusement, puis les phases sont . séparées. La phase aqueuse est extraite avec deux fois 50 ml d'éther de pétrole. Chaque extrait d'éther de pétrole est ré-extrait avec deux fois 50 ml d'eau. Les extraits aqueux sont combinés et évaporés à la température ambiante pour donner une huile. Cette huile est dissoute dans de l'eau, passée dans une colonne de résine échangeuse de cations
(B.D.H., Zerolit 225, SRC 13, RS03H ; 250 g fraîchement régénéré dans le cycle acide) et éluée avec de l'eau. On obtient 800 ml d'une fraction acide qui est ensuite concentrée à 400 ml. A ce concentré, on ajoute successivement 2 g de
<EMI ID=102.1>
0,2 ml d'acide acétique glacial. Le-mélange est ensuite hydro-� � � fc �
<EMI ID=103.1>
a et 6 évaporé. Le résidu est ré-évaporé avec 3 fois 100 ml de n-propanol et trituré avec de l'éther pour donner un solide fondant à environ 285-288[deg.] (déc.). Par recristallisation dans l'eau et
<EMI ID=104.1>
<EMI ID=105.1>
<EMI ID=106.1>
0,4 g (3,2 mmoles) de l'acide obtenu au paragraphe précédent dans 14 ml d'eau et 7 ml d'éthanol est agité à
10[deg.] tandis que 0,806 g (9,6 mmoles) de bicarbonate de sodium sont ajoutés graduellement. Le mélange est ensuite agité à 0[deg.] , tandis qu'une solution chaude de 1,024 g (3,2 mmoles) d'ester N--hydroxysuccinimique de N-benzyloxycarbonyl-L-alanine dans
<EMI ID=107.1>
est agité pendant 3 heures à 0[deg.], puis pendant 16 heures à la température ambiante. Le mélange est élaboré d'une manière analogue à celle de l'exemple A) par passage dans une colonne de résine échangeuse de cations et conversion en sel de benzylamine. On obtient 0,26 g de sel de benzylamine de
<EMI ID=108.1>
<EMI ID=109.1>
<EMI ID=110.1>
D'une manière analogue à celle de l'exemple A), à partir de l'acide obtenu au paragraphe précédent, on obtient l'acide (lR)-l-(L-alanylamino)-éthylphosphonique fondant à 295-
<EMI ID=111.1>
<EMI ID=112.1>
139,7 g (0,5 mole) de chlorhydrate de 1-benzylaminoéthyl-phosphonate de diméthyle sont dissous dans 1000 ml de méthanol. La solution est hydrogénée à la température. ambiante et à la pression atmosphérique en présence de 15 g de charbon
<EMI ID=113.1>
l'absorption d'hydrogène. Le catalyseur est séparé par filtration et le filtrat évaporé sous vide. Le résidu de chlorhydrate de 1-aminoéthylphosphonate de diméthyle est dissous dans
500 ml de diméthylformamide sec, puis traité avec 160 g (0,5 mole) d'ester N-hydroxysuccinimidique de N-benzyloxycarbonylL-alanine. Tandis que l'on agite et maintient la température en-dessous de 0[deg.], on ajoute goutte � goutte 70 ml de triéthylamine sèche. Le mélange est ensuite agité pendant 16 heures
à la température ambiante, le chlorhydrate de triéthylamine
est séparé par filtration et lavé avec un peu de diméthylformamide. Le filtrat est évaporé sous le vide d'une pompe
à huile et à une température de bain inférieure à 40[deg.]. L'huile résiduelle est traitée avec 40 ml d'eau et le mélange résultant extrait avec 4 fois 40 ml de chloroforme. Les phases organiques combinées sont lavées avec du carbonate de potassium, puis séchées sur du sulfate de sodium et concentrées
à siccité.
On obtient un résidu qui, traité avec_600 ml d'éther
<EMI ID=114.1>
amino]-éthylphosphonate de diméthyle fondant à 134-1350 [a] = + 14,9[deg.] (c = 1% dans le méthanol). L'évaporation des liqueur-mères donne environ 100 g de gomme composée en majeure partie de l'isomère R correspondant.
<EMI ID=115.1>
traités pendant 5 heures à la température ambiante avec 250 ml
<EMI ID=116.1>
acétique glacial. 750 ml d'éther sont ensuite ajoutés sous agitation, puis l'éther est décanté. Ce procédé est répété avec deux fois 250 ml d'éther. Le résidu es-- dissous dans
250 ml de méthanol et à la solution résultante, on ajoute une
-solution de 50 ml d'oxyde de propylène dans 50 ml de méthanol. Un repos de plusieurs heures, le précipité obtenu est séparé par filtration et lavé avec du méthanol et de l'éther. Le produit séché a un poids constant de 46,1 g et un point de fusion de 283-285 (déc.). La recristallisation dans le mélange <EMI ID=117.1>
<EMI ID=118.1>
1% dans l' eau) .
Compositions <EMI ID = 1.1>
antibiotic prieties and a method of preparing them.
<EMI ID = 2.1>
describes and claimed peptides of the general formula
<EMI ID = 3.1>
<EMI ID = 4.1>
or a lower alkyl, lower cycloalkyl, lower cycloalkyl-lower alkyl, aryl or aryl-lower alkyl group (said groups possibly being substituted by a
or more amino, hydroxy, thio, methylthio, carboxy or guanidino groups to form the characteristic group of a naturally occurring L-a-amino acid); R <2> and R3 individually represent
<EMI ID = 5.1>
<EMI ID = 6.1>
cannot represent a hydrogen atom when
<EMI ID = 7.1>
phenyl group); R4 represents the hydroxy or methyl group; n = 0, 1, 2 or 3; an asterisk alone means that the carbon atom has the configuration
<EMI ID = 8.1>
cation other than a hydrogen atom; and a double
<EMI ID = 9.1>
tion other than a hydrogen atom, the configuration at the carbon atom is (R) (as defined below),
and their therapeutically compatible salts. These peptides and their therapeutically compatible salts potentiate the activity of antibiotics, and also possess antibacterial activity.
<EMI ID = 10.1>
compositions comprising a peptide of general formula I, or one of its addition salts with therapeutically compatible acids, and an antibiotic chosen from the following:
cephalothin, cephal.exin, carbenicillin, ampicillin, penicillin G, sulbenicillin, cephazolin, cefoxitin,
<EMI ID = 11.1>
amino} (pivaloyloxy) methyl penicillanate, cephamandole, cephaloridin, cephaloglycin, phenethicillin, methicillin, propicillin, ticarcillin, amoxycillin-arginine salt, phosphonomycin, vancomycin and kanamycin are particularly interesting from the point of view of the potentiation obtained
antibiotic.
The present invention is based on this finding
and it therefore relates to a composition having antibiotic properties, this composition comprising a peptide of
<EMI ID = 12.1>
compatible, as well as an antibiotic, as described above.
In the context, the term "lower alkyl" covers a linear or branched alkyl group preferably containing 1 to 6 carbon atoms (eg methyl, ethyl, propyl, isobutyl, etc.). The term "lower cycloalkyl" covers cyclic alkyl groups containing from 3 to 6 carbon atoms. The term "aryl" preferably covers mononuclear groups, such as phenyl, which may be substituted.
in one or more positions with a hydroxy, halo, nitro, lower alkyl or lower alkoxy group. The term "halogen" covers the atoms of fluorine, chlorine, bromine and iodine,
and the term "lower alkoxy" covers groups having the structure -O- (lower alkyl), in which the lower alkyl group has the same meaning as above. The term "group characteristic of an α-amino acid of the type of those
usually found in proteins "means that the radical R of a natural α-amino acid of the general formula
<EMI ID = 13.1>
<EMI ID = 14.1>
example, if the amino acid is glycine, the radical R will be a hydrogen atom; in alanine, the radical R will represent the methyl group; in leucine, the radical
R will represent the isobutyl group and in glutamic acid, the radical R will represent the 2-carboxyethyl group. R can also represent a radical attached to the nitrogen atom of the amino group (with the loss of one of the hydrogen atoms attached to it), thus forming a nitrogen ring as in proline and pyroglutamic acid .
<EMI ID = 15.1>
other than a hydrogen atom, the configuration of the carbon atom marked with a double asterisk will be R, i.e. that which would be obtained by replacing the carboxy group of a La-amino -acid existing in nature by a phosphorus atom.
Note that in general formula I, when n =
<EMI ID = 16.1>
The preferred peptides of general formula I are those in which R2 and R3 independently represent a hydrogen atom or a methyl, isopropyl or isobutyl group,
<EMI ID = 17.1>
<EMI ID = 18.1>
hydroxy group and n = 0 or 1.
As examples of peptides of general formula I, there may be mentioned:
(L-alanylamino) -methylphosphonic acid,
(L-valylamino) -methylphosphonic acid,
<EMI ID = 19.1> <EMI ID = 20.1>
especially preferred.
Therapeutically compatible salts of peptides
<EMI ID = 21.1>
strong acids such as methanesulphonic, paratoluenesulphonic, hydrochloric, hydrobromic, sulfuric, etc., and with bases such as sodium hydroxide etc.
The antibiotics mentioned above are known substances and can be obtained according to known methods.
The weight ratio of the peptide of general formula I, <EMI ID = 22.1> the antibiotic can vary within wide limits. In general, the compositions may contain the peptide derivative, or
<EMI ID = 23.1>
in a ratio of from about 100: 1 to 1: 100, preferably from 1:64 to 64: 1, and especially from 1:16 to 16: 1.
The process of the present invention for the preparation of the above-mentioned compositions consists in mixing the peptide of general formula I, or one of its therapeutically compatible salts, with one of the above-mentioned antibiotics. This process can be carried out in a known manner. In a bet
preferred embodiment of this process, the peptide of general formula I, or a therapeutically compatible salt thereof, and the antibiotic are used in a weight ratio of 1: 100 to 100: 1, particularly 1:64. to 64: 1 and preferably from 1:16 to 16: 1.
The compositions of the present invention are active against a broad spectrum of Gram positive and Gram negative bacteria, such as, for example, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Klebsiella aerogenes and Klebsiella pneumoniae. They are therefore useful for combating and preventing
a wide spectrum of bacterial infections and can be administered orally or parenterally, the oral route being preferred.
The in vitro activity of the compositions of the present invention can be demonstrated as follows:
Solutions concentrated in the desired ratio of mixtures of the peptide of general formula I and the antibiotic are prepared. The mixture is then diluted in order to obtain an appropriate spectrum of total concentration of the mixtures. Portions of these dilutions are mixed with an appropriate nutrient agar medium in petri dishes, then the agar is left
drop off. Similar cups are prepared using
the agar nutrient medium containing the peptide alone and the antibiotic alone. The test organisms are then inoculated on
i <EMI ID = 24.1>
The cups are then maintained at 37 [deg.] For 24 hours, after which the minimum inhibitory concentration (C.I.M.)
is observed, then the fractional inhibitory concentration indices (I.F.C.I.) calculated. The results obtained by means of a representative peptide of general formula I,
<EMI ID = 25.1>
and representative antibiotics mentioned above are given in Tables I and II below:
Table I
Activity of combinations of various antibiotics with
<EMI ID = 26.1>
Staphylococcus aureus
<EMI ID = 27.1>
<EMI ID = 28.1>
strains of Klebsiella aerogenes and Proteus mirabilis
<EMI ID = 29.1>
The in vivo activity of the compositions according to the invention can be demonstrated as follows:
Mice are infected intraperitoneally
<EMI ID = 30.1>
intervals (predetermined) after infection, groups of mice are treated subcutaneously with gradual doses of antibiotic, peptide and combinations
both. For each treatment, the number of mice surviving 7 days from the onset of infection is counted, then the dose preventing death in 50% of cases (DC50) 'boa' is calculated.
<EMI ID = 31.1>
for a combination of antibiotic and peptide is calculated in the normal way. The results obtained with the acid
<EMI ID = 32.1>
peptide of general formula I and the representative antibiotics mentioned above are shown in Table III below:
<EMI ID = 33.1>
<EMI ID = 34.1>
<EMI ID = 35.1>
administered in the form of pharmaceutical preparations, which also form part of the present invention and comprise a peptide of general formula I, or a therapeutically compatible salt, an antibiotic as defined above and a pharmaceutically acceptable carrier.
As a pharmaceutically acceptable carrier, one can use any solid or liquid vehicle compatible with the peptides of general formula I, their
therapeutically compatible salts, and with the antibiotics specified above, and suitable for therapeutic administration. They can be organic substances
or inorganics suitable for anterior application
(eg oral) or parenteral, such as water,
gelatin, lactose, starches, magnesium stearate, talc, vegetable oils, gum arabic,
polyalkylene glycols, petroleum jelly, etc.
Pharmaceutical preparations can be prepared in a known manner and can be presented as
solid form (e.g. compress, dragees, suppositories
or capsules), or in liquid form (for example suspension or emulsion solutions). These pharmaceutical preparations can be subjected to any conventional pharmaceutical treatment such as sterilization and can contain adjuvants such as preservatives, stabilizers, wetting agents, emulsifiers, salts regulating the osmotic pressure or buffer compounds. When a buffer is used, the pH of the preparation will naturally vary within
broad limits well known in pharmaceutical practice.
The amount of peptide of general formula I, or a
of its therapeutically compatible salts, and of antibiotic present in the pharmaceutical preparation of the invention will vary within wide limits depending on factors such as
the peptide chosen or its salt, the antibiotic chosen, the route of administration and the infection to be treated. The dosage administered daily will also vary within wide limits and will be tailored to individual needs and conditions <EMI ID = 36.1>
of the doctor. For example, a daily dosage for oral administration may include from 750 mg to 1500 mg of a combination of active ingredients (for example a peptide
of general formula I, or a therapeutically compatible salt thereof, and an antibiotic). In addition, a parenteral daily dose may for example include approximately
200 mg to 2000 mg of a combination of active substances. Daily doses can be administered as a single or divided dose.
The peptides of general formula I and their therapeutically compatible salts are prepared by a process characterized in that one has) cleaved the protective group (s) of a compound of general formula
<EMI ID = 37.1>
in which R, R and R respectively have the same meanings as R, R <2> and R <3> except that any amino group present may be in protected form and any other functional group which may be present is, where appropriate, in the form
40 41 protected, R represents the methyl group or R, R41 represents a hydroxy group or an alkoxy group
<EMI ID = 38.1>
drogen or a protective group and the asterisk
single or double and n have the same meaning
as above,
according to known methods
or b) separates a diastereomeric (R, S) peptide of general formula I into its diastereoisomers and isolates the (R) diastereomer, and optionally converts a compound of formula <EMI ID = 39.1> general I obtained in a therapeutic salt '
The amino group (s) possibly present in
<EMI ID = 40.1>
can be protected by any amino protecting group well known in peptide chemistry. As amino protecting groups which are particularly suitable for the purposes of the invention, mention may be made of aralkoxycarbonyl, in particular benzyloxycarbonyl, and t.-butoxycarbonyl groups. The amino protecting group can also be a formyl, trityl, or trifluercacetyl group. Any carboxy or hydroxy group which may
<EMI ID = 41.1>
General II can be protected respectively by a conventional carboxy or hydroxy protecting group. A carboxy group may, for example, be protected by conversion to an alkyl ester (eg t-butyl ester) or an aralkyl ester (eg benzyl ester). In addition, a
hydroxy group can for example be protected by means of a
aralkoxy-carbonyl (eg benzyloxy-carbonyl), alkanoyl (eg acetyl, propionyl, etc.), aroyl (eg benzoyl), alkyl (eg t.-butyl) or aralkyl group
(eg benzyl). Protection of other functional groups
<EMI ID = 42.1>
<EMI ID = 43.1>
general formula II can be any amino protecting group
<EMI ID = 44.1>
The cleavage of the protective group (s) present in a compound of general formula II is carried out according to known methods, that is to say methods actually used or described in the literature on cleavage of protecting groups. Thus, for example, an aralkoxy-carboxyl group
(eg benzyloxycarbonyl) or t.-butoxycarbonyl can be cleaved by hydrolysis (i.e. by treatment with a mixture of hydrogen bromide and glacial acetic acid). An aralkoxy-carbonyl group (eg benzyloxy-carbonyl) can also be cleaved by hydrogenolysis (eg in the presence of palladium-carbon) .- The t.-butoxy-carbonyl group can <EMI ID = 45.1>
A lower alkoxy group represented by R and / or R can be converted to a hydroxy group by. treatment with a mixture of hydrogen bromide in glacial acetic acid or with trimethylchlorosilane, followed by aqueous hydrolysis. It will be noted that the cleavage of the protecting groups can be carried out in one or more phases depending on the nature of the protecting groups present.
<EMI ID = 46.1>
(R) diastereomer can be made according to methods
<EMI ID = 47.1>
high pressure liquid chromatography.
The starting substances of general formula II can for example be prepared by condensation of a compound of general formula
<EMI ID = 48.1>
<EMI ID = 49.1>
double and single have the same meaning as above,
with an adequately protected α-amino acid, dipeptide, tripeptide or tetrapeptide, or a reactive derivative thereof, as appropriate.
Thus, when employing a compound of general formula III in which n = 0, such compound may be condensed with a suitably protected α-amino acid or one of its derivatives <EMI ID = 50.1>
where n = 0, or with an adequately protected dipeptide or a derivative thereof reactive to give a compound of general formula II, wherein n = 1, or with an adequately protected tripeptide or one of its reactive derivatives to give a compound of general formula II, in which
n = 2, or with an adequately protected tetrapeptide or a reactive derivative thereof, to give a compound of general formula II in which n = 3.
<EMI ID = 51.1>
n = 1, can be condensed with an appropriate protected α-amino acid or a reactive derivative thereof to give a compound of general formula II, in which n = 1, or with an appropriately protected dipeptide or the one of its reactive derivatives, to give a compound of general formula II, in which
n = 2, or with an appropriately protected tripeptide or one of its reactive derivatives to give a compound of general formula II, in which n = 3.
On the other hand, a compound of general formula III, in which n = 2, can be condensed with an adequately protected α-amino acid or one of its reactive derivatives to give a compound of general formula II, in wherein n = 2, or with an appropriately protected dipeptide or a derivative thereof reactive to give a compound of general formula II, wherein n = 3.
Finally, a compound of general formula III, wherein n = 3, may be condensed with an adequately protected α-amino acid or one of its reactive derivatives to give a compound of general formula II, wherein n = 3:
Furthermore, the compounds of general formula II can be prepared by carrying out the above condensation using <EMI ID = 52.1>
in a known manner, the compound (R) of the resulting product (R, S),
for example by crystallization, chromatography or fractional crystallization by means of a suitable base, for example
<EMI ID = 53.1>
The condensation mentioned above can be carried out according to methods known in peptide chemistry, for example by the mixed anhydride, azide, activated ester or acid chloride method.
According to one method, an appropriate compound of general formula III can be condensed with an amino acid (di-, tri- or tetrapeptide as the case may be) protected in an appropriate manner, the terminal carboxy function being a mixed anhydride radical formed with a organic or inorganic acid. Advantageously, such a di-, tri- or tetrapeptide amino acid bearing a free carboxy function is treated with a tertiary base such as a lower trialkylamine (for example a triethylamine) or an N-ethylmorpholine in a
<EMI ID = 54.1>
1,2-dimethoxyethane, dichloromethane, toluene, petroleum ether or mixtures thereof) and the resulting salt is reacted with an ester of chloroformic acid (eg, butyl or isobutyl ester) at low temperature. The mixed anhydride obtained is then advantageously condensed in situ with the compound of general formula III.
In another method, a suitable compound of general formula III can be condensed with an amino acid (di-,
<EMI ID = 55.1>
required, the final carboxy group being in the form of a
acid azide. This condensation is preferably carried out in an inert organic solvent such as dimethylformamide or ethyl acetate at low temperature.
<EMI ID = 56.1>
general formula III suitable with an amino acid, (di-, tri- or tetrapeptide as appropriate) suitably protected .. the final carboxy function being in the form of an active ester group (for example p-nitrophenyl, 2, 4,5-trichlorophenyl
<EMI ID = 57.1>
advantageously carried out in an inert organic solvent such
<EMI ID = 58.1>
represent a lower alkoxy group, in an aqueous alkanol (eg aqueous ethanol).
According to yet another method, a suitable compound of general formula III can be condensed with an amino acid
(di-, tri- or tetrapeptide as the case may be), suitably protected, the final carboxy function being in the form of acid chloride. This condensation is carried out
<EMI ID = 59.1>
<EMI ID = 60.1>
O * 0. 90
Hard gelatin capsules of the following strength are prepared:
<EMI ID = 61.1>
<EMI ID = 62.1>
cephalexin are individually ground, mixed and granulated with a 10% corn starch paste containing the OT aerosol. The wet granule is dried, passed through a sieve, mixed with the aerosil and finally put into hard gelatin capsules.
Example 2
Hard gelatin capsules of the following content are prepared:
<EMI ID = 63.1>
These capsules are prepared in a manner analogous to that described in Example 1.
<EMI ID = 64.1>
A powder mixture for the preparation of an injection solution contains the following ingredients:
<EMI ID = 65.1>
The ingredients are individually ground and mixed well. The mixture is placed in suitable containers under sterile conditions, then the containers are sealed.
In order to prepare an injection solution, the above powder mixture is dissolved in 2 ml of water for injection.
Example 4
An injection solution is prepared by dissolving 1.0 g of penicillin G in 2 ml of a solution containing 100 mg
<EMI ID = 66.1>
appropriate buffer. A suitable tampon contains the following ingredients:
<EMI ID = 67.1>
The following examples illustrate in detail how
<EMI ID = 68.1>
<EMI ID = 69.1>
14.1 g (0.168 mol) of solid sodium bicarbonate are added to a solution of 7 g (0.056 mol) of acid
(1R, S) -1-aminoethylphosphonic acid in 280 ml of water and 140 ml of ethanol with stirring at 0 [deg.]. While we stir this mixture
<EMI ID = 70.1>
N-benzyloxycarbonyl-L-alanine succinimide in 140 ml of hot ethanol is added dropwise over a period of approximately
15 minutes. This latter solution is rinsed with 70 ml of ethanol. The heterogeneous mixture is stirred for 1 hour
at 0 [deg.], then for a further 16 hours at room temperature,
<EMI ID = 71.1> <EMI ID = 72.1> <EMI ID = 73.1>
with 500 ml, then 2 times 250 ml of chloroform, acidified to pH 2 with approximately 80 ml of hydrochloride
<EMI ID = 74.1>
then 2 times 250 ml of chloroform. The aqueous phase
is concentrated and passed through a column of cation exchange resin (B.D.H., Zerolit 225, SRC 13, RS03H; -750 g; freshly regenerated in the acid cycle). The column is
eluted with water and 6 fractions of 250 ml are collected.
The first 4 fractions are combined, evaporated and re-evaporated with water to remove hydrochloric acid. We obtain
a final acid residue (1R, S) -l - [(N-benzyloxycarbonyl-L-
<EMI ID = 75.1>
This last residue is dissolved in 400 ml of water and titrated to pH 4.5 with 1M benzylamine; titer 75 ml; theory
56 ml. The resulting solution is concentrated and crystallized from water to give 5.3 g of the benzylamine salt of the acid.
<EMI ID = 76.1>
<EMI ID = 77.1>
then recrystallization in water, the salt of
<EMI ID = 78.1>
<EMI ID = 79.1> ........
<EMI ID = 80.1>
acetic)] and a second crop of 0.825 g [melting point
<EMI ID = 81.1>
By recrystallization of the first crop in water, <EMI ID = 82.1>
<EMI ID = 83.1>
acetic acid).
<EMI ID = 84.1>
<EMI ID = 85.1>
is dissolved in 4 ml of 2N ammonium hydroxide, passed through a column of cation exchange resin (B.D.H .. Zerolit
225, SRC 13, RS03H; 120 g; freshly regenerated in the
<EMI ID = 86.1>
acid which is concentrated to 100 ml. To this are successively added 100 ml of methanol, 0.3 g of 5% palladium-on-carbon catalyst and 3 drops of glacial acetic acid. The mixture is hydrogenated at room temperature and at atmospheric pressure. The catalyst is separated by filtration and the solvent
<EMI ID = 87.1>
50 ml of n-propanol to give 0.6 g of a gummy solid melting at about 275-280 [deg.] (Dec.). After a subsequent recrystallization from water and ethanol, 0.2 g of acid is obtained.
(1R) -1- (L-alanylamino) -ethylphosphonic melting at 295-296 [deg.]
<EMI ID = 88.1>
Example B
A solution of 30 g (0.24 mol) of acid (1R, S) -1-
<EMI ID = 89.1>
4N sodium is stirred at 14 [deg.] while 180 ml (0.72 mol) of a 4N sodium hydroxide solution and 102 g (0.60 mol) of
<EMI ID = 90.1>
is continued and after 2 hours the temperature reached
rJf, <EMI ID = 91.1>
ambient temperature. 600 ml of ether are then added and the mixture is stirred vigorously for 2 hours to extract the excess benzyl chloroformate. The phases
<EMI ID = 92.1>
<EMI ID = 93.1>
rature is kept below 10 [deg.]. The paste obtained is strongly concentrated to eliminate carbon dioxide. The residue
is dissolved in 100 ml of 2N sodium hydroxide and 50 ml of water, passed through a column of cation exchange resin
(B.D.H., Zerolit <2> <2> 5, SRC 13, RS03H; 750 g; freshly regenerated in the acid cycle) and eluted with water. In this way approximately 3.2 liters of acid eluate are obtained which are evaporated at room temperature and re-evaporated with 3 times 500 ml of water.
The residue is dissolved in water and allowed to crystallize.
The crystals are separated by filtration, washed with
ice water and dried; yield 39.2 g; Fusion point
111-113 [deg.] (Dec.). By evaporation of the combined filtrates, then recrystallization from 75 ml of water and 10 ml of methanol and refrigeration, another crop of 6.51 g is obtained; melting point 110-112 [deg.] (dec.). This gives a total of 45.71 g
<EMI ID = 94.1>
which is identified as the monobenzylamine salt melting at 196-197 [deg.] (dec.).
42.2 g (163 mmoles) of (1R, S) -1- (benzyloxycarbonylamino) -ethylphosphonic acid are dissolved in 100 ml of methanol. The solution is treated with a solution of 30.8 g (81.5 mmol)
<EMI ID = 95.1>
is stirred for 3 hours at room temperature, then overnight at 0 [deg.]. The quinine salt of (1S) -1 '(benzyloxycarbonylamino) -ethylphosphonic acid is filtered off and washed with methanol. The combined filtrates are evaporated and the residue is dissolved in 300 ml of 2N ammonium hydroxide. The solution is extracted with 3 times 300 ml
of chloroform. Each chloroform extract is rewashed with
150 ml of water. The aqueous extracts are combined, concentrated, <EMI ID = 96.1>
(B.D.H., Zerolit. 225, SRC 13, RS03H; 750 g; freshly regenerated in the acid cycle). By elution with water, approximately 2.3 liters of acid eluate are obtained which are evaporated. The residue is re-evaporated, first with 3 times 200 ml of water, then with 3 times 300 ml of methanol to give approximately 24 g of a gummy residue. This gum is dissolved in 100 ml of
<EMI ID = 97.1>
[82 mmol; freshly regenerated in 28.4 g (82 mmol) of ac-
<EMI ID = 98.1>
monium / petroleum ether]. The mixture is left to stand
at 0 [deg.], filtered and the filtrate is washed with methanol and
<EMI ID = 99.1>
crude (IR) -1- (benzyloxycarbonylamino) -ethylphosphonic acid
<EMI ID = 100.1>
methanol). By subsequent recrystallization from methanol and water, 33.0 g of dehydroabietylamine salt are obtained.
(lR) -1- (benzyloxycarbonyl-amino) -ethylphosphonic acid
<EMI ID = 101.1>
methanol).
8.0 g (14 mmol) of the acid obtained in the preceding paragraph are distributed between 100 ml of 2N ammonium hydroxide and 100 ml of petroleum ether (boiling range 60-80 [deg.]). The mixture is stirred vigorously, then the phases are. separated. The aqueous phase is extracted with twice 50 ml of petroleum ether. Each petroleum ether extract is re-extracted with twice 50 ml of water. The aqueous extracts are combined and evaporated at room temperature to give an oil. This oil is dissolved in water, passed through a column of cation exchange resin
(B.D.H., Zerolit 225, SRC 13, RS03H; 250 g freshly regenerated in the acid cycle) and eluted with water. 800 ml of an acid fraction are obtained which is then concentrated to 400 ml. To this concentrate, 2 g of
<EMI ID = 102.1>
0.2 ml of glacial acetic acid. The mixture is then hydro - � � � fc �
<EMI ID = 103.1>
a and 6 evaporated. The residue is re-evaporated with 3 times 100 ml of n-propanol and triturated with ether to give a solid melting at about 285-288 [deg.] (Dec.). By recrystallization in water and
<EMI ID = 104.1>
<EMI ID = 105.1>
<EMI ID = 106.1>
0.4 g (3.2 mmol) of the acid obtained in the preceding paragraph in 14 ml of water and 7 ml of ethanol is stirred at
10 [deg.] While 0.806 g (9.6 mmol) of sodium bicarbonate is added gradually. The mixture is then stirred at 0 [deg.], While a hot solution of 1.024 g (3.2 mmol) of N-hydroxysuccinimic ester of N-benzyloxycarbonyl-L-alanine in
<EMI ID = 107.1>
is stirred for 3 hours at 0 [deg.], then for 16 hours at room temperature. The mixture is prepared in a manner analogous to that of Example A) by passing through a column of cation exchange resin and converting to a benzylamine salt. 0.26 g of benzylamine salt of
<EMI ID = 108.1>
<EMI ID = 109.1>
<EMI ID = 110.1>
In a manner analogous to that of Example A), from the acid obtained in the preceding paragraph, the acid (1R) -l- (L-alanylamino) -ethylphosphonic melting at 295- is obtained.
<EMI ID = 111.1>
<EMI ID = 112.1>
139.7 g (0.5 mol) of dimethyl 1-benzylaminoethyl-phosphonate hydrochloride are dissolved in 1000 ml of methanol. The solution is hydrogenated at temperature. ambient and at atmospheric pressure in the presence of 15 g of charcoal
<EMI ID = 113.1>
hydrogen absorption. The catalyst is separated by filtration and the filtrate evaporated in vacuo. The residue of dimethyl 1-aminoethylphosphonate hydrochloride is dissolved in
500 ml of dry dimethylformamide, then treated with 160 g (0.5 mol) of N-benzyloxycarbonylL-alanine N-hydroxysuccinimidic ester. While stirring and maintaining the temperature below 0 [deg.], Add drop. drop 70 ml of dry triethylamine. The mixture is then stirred for 16 hours
at room temperature, triethylamine hydrochloride
is separated by filtration and washed with a little dimethylformamide. The filtrate is evaporated under the vacuum of a pump
in oil and at a bath temperature below 40 [deg.]. The residual oil is treated with 40 ml of water and the resulting mixture extracted with 4 times 40 ml of chloroform. The combined organic phases are washed with potassium carbonate, then dried over sodium sulfate and concentrated.
to dryness.
A residue is obtained which, treated with_600 ml of ether
<EMI ID = 114.1>
Dimethyl amino] -ethylphosphonate melting at 134-1350 [a] = + 14.9 [deg.] (c = 1% in methanol). Evaporation of the mother liquor gives about 100 g of gum composed mainly of the corresponding R isomer.
<EMI ID = 115.1>
treated for 5 hours at room temperature with 250 ml
<EMI ID = 116.1>
glacial acetic. 750 ml of ether are then added with stirring, then the ether is decanted. This process is repeated twice with 250 ml of ether. The residue is dissolved in
250 ml of methanol and to the resulting solution is added a
-solution of 50 ml of propylene oxide in 50 ml of methanol. Standing for several hours, the precipitate obtained is separated by filtration and washed with methanol and ether. The dried product has a constant weight of 46.1 g and a melting point of 283-285 (dec). Recrystallization from the mixture <EMI ID = 117.1>
<EMI ID = 118.1>
1% in water).