Procédé de préparation de l'antibiotique FR- 02A, l'antibiotique ainsi obtenu et son application au traitement d'infections bactériennes.
La présente invention concerne la production nouvelle par fermentation et isolement d'une substance antibiotique utile qui jusqu'à présent n'a pas été rapportée dans la technique antérieure. Plus particulièrement, la présente invention concerne la préparation d'un antibiotique dit FR-02A par fermen-
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lées, suivie de l'isolement de cet antibiotique non décrit jusquici qu'on a appelé FR-02A.
On obtient l'antibiotique FR-02A en cultivant dans des conditions contrôlées le microorganisme déjà connu, Streptomyces lactamdurans, dans un bouillon de fermentation et en soumettant le bouillon entier à une extraction par un solvant organique polaire non miscible avec l'eau pour obtenir l'antibiotique. La fermentation peut être effectuée dans des milieux contenant une matière nutritive en suspension ou dans des milieux principalement clairs, le milieu étant sensiblement exempt de matière nutritive en suspension.
Dans le cas où la fermentation est conduite dans des milieux contenant de la matière nutritive en suspension, on trouve l'antibiotique à la fois dans les matières solides constituant le mycélium et la matière nutritive en suspension et dans le bouillon. On isole l'antibiotique à partir des matières solides en séparant les matières solides du bouillon de fermentation par filtration, centrifugation ou d'autres moyens appropriés et en soumettant le gâteau comprenant les matières solides à une extraction par un solvant organique, de préférence un solvant organique polaire. L'antibiotique restant dans le bouillon est isolé à partir du bouillon, duquel les matières solides ont été préalablement séparées, par extraction par un solvant organique polaire non miscible avec l'eau. On comprendra que lors-d'une récolte retardée
la quantité totale de matières solides dans le bouillon de fermentation sera réduite et une plus faible proportion de l'antibiotique se trouvera dans les matières solides recueillies à partir du bouillon.
Dans des milieux ne contenant pas de matière nutritive en suspension, on tr.ouve la majeure partie du FR-02A dans le bouillon de fermentation principalement clair. Dans ces cas, on soumet le bouillon entier à une extraction par un solvant organique polaire non miscible avec l'eau comme du chloroforme
pour obtenir l'antibiotique. En variante, toutes matières solides comme du mycélium, peuvent être séparées du bouillon avant que le bouillon ne soit soumis à l'extraction par un solvant organique non miscible avec l'eau. De plus, pour obtenir tout FR-02A résiduel, on soumet le mycélium séparé du bouillon à une extraction par un solvant organique polaire approprié de manière à obtenir l'antibiotique FR-02A.
Un procédé préféré pour obtenir l'antibiotique selon la présente invention consiste à cultiver dans des conditions contrôlées, le microorganisme déjà connu, Streptomyces lactamdurans, dans un milieu contenant une matière nutritive en suspension ou dans un milieu clair sensiblement exempt de matière nutritive en suspension et à soumettre le bouillon entier à une extraction par un solvant organique polaire non miscible avec l'eau. On effectue l'extraction en réglant le pH du bouillon a
un pH acide et en ajoutant le solvant au bouillon. Après mélange, les matières solides sont séparées du bouillon. On laisse reposer le bouillon jusqu'à ce que la couche de solvant se sépare. On
fait écouler la couche de solvant, on la lave à l'eau, on la sèche à l'aide d'un agent desséchant approprié et on l'évaporé sous vide. Le résidu est lavé avec un solvant organique non polaire approprié comme de l'éther de pétrole ou de l'hexane et séché à l'air pour donner l'antibiotique FR-02A.
Le procédé particulièrement préféré pour obtenir l'antibiotique FR-02A consiste à cultiver, dans des conditions contrôlées, le microorganisme déjà connu, Streptomyces lactamdurans, dans un milieu contenant une matière nutritive en suspension.
On filtre le bouillon de fermentation pour recueillir les matières solides comprenant du mycélium et de la matière nutritive en suspension. Après soufflage du gâteau de filtration comprenant les matières solides de manière à le sécher autant que possible,- on agite le gâteau dans un solvant organique polaire et on filtre de nouveau. Après lavage du gâteau avec du solvant supplémentaire, l'extrait au solvant et le liquide de lavage combinés sont évaporés sous vide pour laisser une bouillie aqueuse. Le pH est rendu acide. La bouillie aqueuse est lavée avec un solvant organique non polaire comme de l'éther de pétrole, de l'hexar.e, etc, jusqu'à ce que les liquides de lavage soient incolores. La bouillie aqueuse est traitée de nouveau par extraction avec un solvant organique polaire.
L'extrait au solvant est séché, filtré et évaporé sous vide pour donner l'antibiotique FR-02A. Par exemple, selon le procédé de l'invention l'antibiotique ?R-02A peut être obtenu à une forme d'une pureté
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En variante, la fermentation peut être conduite dans un milieu sensiblement exempt de matière nutritive en suspension. On filtre le bouillon de fermentation pour recueillir le mycélium. On soumet le mycélium à une extraction par un solvant organique polaire. L'extrait est séché et évaporé à sec sous vide. On secoue le résidu avec un solvant organique non polaire comme de l'éther de pétrole, de l'hexane, etc. On décante le solvant organique après centrifugation de manière que le résidu se dépose. Le résidu est séché à l'air pour donner l'antibiotique FR-02A.
Un procédé encore préféré pour obtenir l'antibiotique selon la présente invention consisté à cultiver dans des
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dans un bouillon de fermentation et à traiter le bouillon par extraction après sépara-ion des matières solides comprenant du mycélium ou du mycélium et de la matière nutritive en suspension. Le pH du bouillon de fermentation est rendu acide et on sépare les matières solides comprenant du mycélium ou du mycélium et de la matière nutritive en suspension. Le bouillon de fermentation exempt de matières solides est mélangé avec un solvant organique polaire non miscible avec l'eau. Après mélange, on permet aux couches de se séparer. On fait écouler la couche organique, on
la sèche à l'aide d'un agent desséchant approprié et on l'évapore à sec sous vide. Le résidu est lavé avec un solvant organique
non polaire comme de l'éther de pétrole ou de l'hexane et séché
à l'air pour donner l'antibiotique FR-02A.
Dans les procédés décrits ci-dessus dans lesquels des extractions sont effectuées avec des solvants organiques polaires non miscibles avec l'eau, des exemples représentatifs de ces solvants comprennent des esters d'alcoyle d'acides alcanoiques inférieurs comme le formiate de méthyle, le formiate d'éthyle, l'acétate de méthyle, l'acétate d'éthyle, l'acétate de n-butyle l'acétate d'isobutyle, le propionate d'éthyle, une cétone comme le cyclohexanone, ou un hydrocarbure inférieur halogéné comme
le chloroforme, le chlorure de méthylène, le tétrachlorure de carbone, le dichlorure d'éthylène, le 1-chloro-2,2-diméthylpropane, le tétrachloroéthylè e ou le bromoforme.
Dans les procédés décrits ci-dessus dans lesquels des extractions sont effectuées avec des solvants organiques polaires, des exemples représentatifs de ces solvants comprennent des esters d'alcoyle inférieur d'acides alcanoïques inférieurs comme le formiate ce méthyle, le formiate d'éthyle, l'acétate de méthyle, l'acétate d'éthyle, l'acétate de n-butyle, l'acétate d'isobutyle, le propionate d'éthyle, une cétone comme l'acétone, la méthyléthylcétone ou la cyclohexanone, ou un hydro-
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méthylène, du tétrachlorure de carbone, du dichlorure d'éthylène, du 1-chloro-2,2-diméthylpropane, du tétrachloroéthylène ou du bromoforme.
En plus de la production de FR-02A, il a été rapporté dans la documentation technique publiée que S. lactam-
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et brevet belge n[deg.] 764.160). Comme conséquence de ce que le FR-02A est très soluble dans les solvants organiques non miscibles avec l'eau tandis que la Céphamycine C est pratiquement insoluble dans les solvants organiques non miscibles avec l'eau, les deux ma-
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l'extraction du bouillon avec un solvant non miscible avec l'eau permet d'obtenir chaque antibiotique dans une forme exempte de contamination par l'autre.
L'antibiotique FR-02A isolé du bouillon de fermentation est soumis à une purification supplémentaire par chromatographie à travers un tamis moléculaire suivie d'une chromatographie sur un agent adsorbant tensio-actif. Un tamis moléculaire approprié est un dextrane réticulé comme le tamis moléculaire connu sous la désignation Sephadex LH-20 produit par la firme pharmacia fine chemicals Inc. Le FR-02A peut être élué par un alcanol inférieur comme le méthanol. Un agent adsorbant tensioactif approprié est un copolymère macroporeux non-ionique hydrophobe de polystyrène réticulé avec du divinylbenz�ne connu sous les désignations Amberlite XAD-1 à XAD-12 produit par Rohm and Haas. Une résine préférée pour purifier le FR-02A est la résine XAD-2.
Des solvants utilisables pour éluer le FR-02A absorbé sont des solutions aqueuses d'alcanols inférieurs, par exemple des solutions aqueuses de méthanol, d'éthanol, d'isopropanol, de butanol, etc. Le solvant préféré pour éluer le FR-02A hors de la résine XAD-2 est un mélange à 50% isopropanol-eau.
L'organisme qui produit le FR-02A est une souche
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et à été placée en dépôt permanent sans restrictions à sa disponibilité avec la collection de cultures de la Northern Utilization Research and Development Division Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture (auparavant Northern Regional Research Laboratories), Peoria Illinois 61604 et est disponible pour le public sous le n[deg.] de culture NRRL 3802.
Des études complètes de taxonimie et de morphologie de Streptomyces lactamdurans sont rapportées dans le brevet belge n[deg.] 764.160. D'après les études taxonomiques, Streptcmyces lactamdurans a été identifié comme étant un riouvel actinomycète. On a trouvé qu'il appartient au genre Streptomyces et qu'il possède de nombreux attributs de l'espèce connue Streptomyces fradiae. Biochimiquement, les deux sont presque identiques, mais morphologiquement il y a des différences importantes. Par exemple,
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et d'autres caractéristiques, on a attribué à cet organisme le nom d'espèce Streptomyces lactamdurans.
Streptomyces lactamdurans est seulement un exem-
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dans la production de FR-02A et il y a lieu de comprendre que la présente invention n'est pas limitée aux organismes satisfaisant à ces descriptions particulières. La présente invention comprend l'utilisation des autres microorganismes, y compris des souches ' ' actinomycètes isolées à partir de la nature ou obtenues par mu.ation, comme par exemple celles obtenues par sélection naturelle ou celles produites par des agents mutants, par exemple par irradiation aux rayons X,irradiation à l'ultraviolet, des ypérites azotées, etc, qui dans des conditions appropriées donneront du FR-02A.
Le FR-02A est produit durant la fermentation aérobie de milieux nutrifits aqueux appropriés dans des conditions
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rans. Des milieux aqueux tels que ceux utilisés pour la production d'autres antibiotiques sont utilisables pour la production de l'antibiotique FR-02A. De tels milieux contiennent des sources de carbone, d'azote et de sels inorganiques assimilables par le microorganisme. Le choix des milieux n'est pas critique et la fermentation peut être effectuée dans des milieux contenant de
la matière nutritive en suspension ou dans des milieux principalement clairs, le milieu étant sensiblement exempt de matière nutritive en suspension.
En général, des hydrates de carbone tels que des sucres, par exemple du dextrose, du glucose, de l'anabinose, du
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amidons comme des céréales, par exemple de l'avoine, du seigle, de l'addon de maïs, de la farine de mais, etc,.peuvent être utilisés isolément ou en combinaison comme sources de carbone assimilable dans le milieu nutritif. La quantité exacte de la
source ou des sources d'hydrate de carbone qu'on utilise dans le milieu dépend en partie des autres ingrédients du milieu, mais en général la quantité d'hydrate de carbone varie habituellement entre 1% et 6% environ du poids du milieu.
Ces sources de carbone peuvent être utilisées individuellement ou plusieurs sources de carbone peuvent être combinées dans le milieu. En général, de nombreuses matières protéiques peuvent être utilisées comme sources d'azote dans le pro-cessus de fermentation. Des sources d'azote appropriées comprennent, par exemple, du bouillon nutritif, de l'extrait de levure,
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de soja, de la farine de graines de coton, des hydrolysats de caséine, de la liqueur de macération de mais, des résidus solubles de distillation, de la pâte de tomate, etc. Les sources d'azote, isolément ou en,combinaison, sont utilisées dans des quantités comprises entre 0,2 et 6% environ du poids du milieu aqueux.
Les milieux décrits dans les exemples sont seulement des illustrations de la grande variété de milieux qui peuvent être utilisés, et ne doivent pas être considérés comme limitatifs.
La fermentation est conduite à des températures comprises entre 20 et 37[deg.]C environ, toutefois, pour les meilleurs résultats, il est préférable de conduire la fermentation à des températures comprises entre 24 et 32[deg.]C environ. Le pH des milieux nutritifs appropriés pour développer la culture de Strep-
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être compris entre 6,0 et 8,0 environ.
Une fermentation à petite échelle de l'antibiotique est effectuée commodément en inoculant la culture produisant l'antibiotique dans un milieu nutritif approprié et, après transfert à un milieu de production, en permettant à la fermentation de s'effectuer à une température constante de 28[deg.]C environ sur une secoùeuse pendant plusieurs jours. A la fin de la période d'incubation, le mycélium et la matière nutritive en suspension peuvent être recueillis par centrifugation ou filtration et soumis à une extraction par un solvant, ou le bouillon entier peut être traité par extraction au chloroforme ou avec d'autres solvants non miscibles avec l'eau ou en variante le bouillon peut être soumis à une extraction après qu'on en a séparé les matières solides comprenant du mycélium ou du mycélium et de la matière nutritive en suspension.
La fermentation à petite échelle est conduite dans un flacon stérilisé par un développement de germes à un, deux ou trois ou quatre étages. Le milieu nutritif pour l'étage d'ensemencement peut être une combinaison appropriée quelconque <EMI ID=14.1>
ment des étages intermédiaires, quand on en utilise, sont développés essentiellement de la même manière, c'est-à-dire qu'on utilise une partie du contenu du flacon pour inoculer le milieu de production. Les flacons inoculés sont secoués à une température constante pendant plusieurs jours et à la fin de la période d'incubation l'antibiotique FR-02A est isolé comme on l'a déjà décrit.
Pour un travail à grande échelle, il est préférable de conduire la fermentation dans des cuves appropriées équipées d'un agitateur et d'un moyen pour aérer le milieu de fermen-r tation. Selon ce procédé, le milieu nutritif est composé dans la cuve et stérilisé par chauffage à des températures allant jusqu'à
120[deg.]C environ. Après refroidissement, on inocule au milieu stérilisé une semence développée précédemment de la culture productrice et on permet à la fermentation de s'effectuer pendant une pédiode de plusieurs jours, par exemple de deux à quatre jours, tout en agitant et/ou en aérant le milieu nutritif et en maintenant la température à 28[deg.]C environ. La production de FR-02A est
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de production, comme déterminé par bio-essai.
Technique d'essai.
On effectue des essais par la techniques des disques et des plaques en utilisant des disques de papier-filtre de 9,5 mm de diamètre. On prépare les plaques d'essai en utilisant de la gélose nutritive Difco plus 2,0g/l d'extrait de levures Difco à raison de 10 cm<3> par plaque. Une culture d'une nuit de l'organisme d'essai, vibrio percolans american type culture collection (ATCC
8461) dans du bouillon nutritif plus 0,2% d'extrait de levures est diluée dans une solution saline stérile de manière à donner une suspension ayant un facteur de transmission de 40% à une
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de 20 cm par litre de milieu avant coulée des plaques.
Les plaques d'essai sont maintenues à 4[deg.]C jusqu'à leur utilisation (5 jours au maximum). Après l'application des disques d'essai saturés d'antibiotique, les plaques sont
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On note les zones d'inhibition par leur diamètre en mm. On utilise ces résultats pour déterminer les puissances relatives ou, par comparaison avec un étalon de référence purifié, la puissan-
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tation, du mycélium et de la matière nutritive en suspension séparés du bouillon de fermentation et dans des bouillons exempts
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mètre ont montré des zones d'inhibition de 16 mm. Quand on effectue un tel essai d'une manière quantitative, on peut détecter de
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le FR-02A présente une activité contre des bactéries Gram-négatives et Gram-positives, des coccidies et des espèces de Mycoplasma. Dans des essais in vitro, le FR-02A est efficace contre E. acervulina, Bordetella, Streptococcus faecalis streptococcus faecum, Streptococcus afalactiae, Streptococcus
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Le FR-02A est utile à la fois comme antibiotique et comme agent favorisant la croissance chez des animaux.
Quand le FR-02A est utilisé comme antibiotique, le moyen particulier utilisé pour l'administrer à l'animal n'est pas critique et n'importe lesquels des procédés actuellement utilisés ou disponibles pour traiter des animaux infectés ou des animaux susceptibles d'infestation sont satisfaisants.
Le FR-02A peut être utilisé comme antibiotique, par exemple sous la forme de compositions pharmaceutiques qui
le contiennent en mélange ou conjointement avec un excipient pharmaceutique organique ou inorganique, solide ou liquide convenable pour administration intestinale, parentérale ou locale. Des excipients appropriés sont des substances qui ne réagissent pas avec l'antibiotique, par exemple l'eau, la gélatine, le lactose, des
amidons, l'alcool stéarylique, le stéarate de magnésium, le talc, des huiles végétales les alcools benzyliques, des gommes le propylène-glycol, des polyalcoylène-glycols, de la vaseline, du cholestérol ou d'autres excipients médicinaux connus.
Les préparations pharmaceutiques peuvent être, par exemple, des comprimés des dragées, des pommades, des crèmes ou des capsules, ou à l'état liquide ce peuvent être des solutions, des suspensions ou des émulsions. Elles peuvent être stérilisées et/ou contenir des adjuvants, tels que des agents de conservation ou des agents stabilisants, mouillants ou émulsionnants, des solubilisants,
des sels pour régler la pression osmotique ou des tampons.
Quand on désire administrer l'antibiotique sous une forme de dosage unitaire solide sèche, on utilise des capsules des bols ou des comprimés contenant la quantité désirée d'antibiotique. On prépare ces formes de dosage en mélangeant intimement et uniformément l'ingrédient actif avec des diluants finement divisés appropriés, des charges, des agents de désagrégation et/ou des liants comme de l'amidon, du lactose, du talc, du stéarate de magnésium, des gommes végétales, etc. Ces compositions
en doses unitaires peuvent varier beaucoup en ce qui concerne
leur poids total et leur .teneur en FR-02A en fonction de facteurs tels que le type d'animal hôte à traiter, la sévérité et le type d'injection et le poids de l'hôte. L'antibiotique peut être administré à raison de 5 à 100 mg environ par jour et par kilogramme de poids du corps.
Sont inclus dans la présenté invention les sels non toxiques pharmaceutiquement acceptables de FR-02A par exemple les sels de métaux alcalins et de métaux alcalino-terreux comme ceux dérivés du sodium, du potassium, de l'ammonium et du calcium ou des sels avec des bases organiques, par exemple la triéthylamine, la N-éthylpipéridine, la dibenzyléthylènediamine.
En plus de son utilisation comme antibiotique,
le FR-02A est utile comme additif à la nourriture pour favoriser la croissance d'animaux comme la volaille, les moutons et les bestiaux. L'utilisation de FR-02A raccourcit le temps nécessaire pour amener les animaux à un poids de vente courante.
Quand on utilise le F;�-02A comme agent favorisant la croissance chez des animaux, il peut être administré com-
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sout ou mis en suspension dans l'eau de boisson.
Quand on utilise le FR-02A comme constituant de la nourriture des animaux, on l'incorpore d'abord dans un supplément pour la nourriture. Dans de tels suppléments pour la nourriture, le FR-02A est présent en quantités relativement concentrées dispersées dans un véhicule ou diluant inerte. Le supplément pour la nourriture peut être ajouté directement à la nourriture ou il peut être incorporé dans un prémélange par une étape intermédiaire de dilution ou de mélange. On appelle "véhicule inerte" un véhicule qui ne réagira pas avec l'antibiotique et qui peut être administré:sans danger aux animaux. De préférence, le véhicule est une substance qui est ou qui peut être un ingrédient de la ration des animaux.
Des véhicules ou diluants typiques utilisables pour de telles compositions sont, par exemple, des crains séchés de distillerie, de la farine de mais, de la farine de citron, des résidus de fermentation, des coquilles d'huitres broyées, des résidus de meunerie, des fractions solubles de mélasse, de la farine d'épis de mais, une nourriture aux fèves comes-
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etc. L'antibiotique est intimement dispersé dans tout le véhicule par des techniques telles que par broyage, brassage, malaxage ou culbutes. Des compositions contenant de 5 à '50% environ en poids de l'antibiotique sont particulièrement utilisables comme suppléments pour la nourriture.
Des exemples typiques de suppléments pour la nourriture contenant du FR-02A dispersé dans un véhicule solide sont les suivants:
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On prépare ces suppléments pour la nourriture
et d'autres mélangeant uniformément l'antibiotique avec.le véhicule.
Le supplément pour la nourriture peut être ajouté directement à la nourriture ou incorporé dans un prémélange par une étape intermédiaire de dilution ou de mélange avec un véhicule susceptible d'ingestion orale. Des compositions contenant de 0,03% à 5% en poids de l'antibiotique sont particulièrement utilisables comme prémélanges. On prépare ces prémélanges en mélangeant uniformément l'antibiotique avec un véhicule susceptible d'ingestion orale.
On ajoute ces suppléments ou prémélanges à la nourriture des animaux en quantité convenable pour donner à la nourriture finie la concentration de FR-02A désirée pour favoriser la croissance. Pour la volaille, on utilise FR-02A à une concentration finale comprise entre 50 et 300 g par tonne de nourriture pour obtenir le résultat désiré d'activation de la croissance. Dans le cas de porcs, y compris les porcs infestés de M. hyorhinis, le FR-02A peut être administré dans la nourriture dans des proportions similaires.
Dans les explications ci-dessus concernant la
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dans lesquelles le FR-02A est mélangé avec un véhicule comestible dans un supplément pour la nourriture, dans ce qu'on appelle
un prémélange ou dans la pâtée finale. C'est le mode préféré d'administration du FR-02A. Une autre façon consiste à dissoudre
le FR-02A ou à le mettre en suspension dans l'eau de boisson
des animaux. La quantité qui peut être mise en suspension dans l'eau sans dédimentation excessive est limitée. Pour y remédier,
on peut utiliser des émulsionnants ou des agents tensio-actifs.
L'homme de l'art comprendra aussi que des compositions spéciales de suppléments pour la nourriture et de nourritures finies pour animaux contenant du FR-02A peuvent comprendre aussi des vitamines; d'autres antibiotiques et agents favorisant la croissance et d'autres substances nutritives.
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à des doses de 5 à 100 mg/kg. Un intervalle préféré pour une dose unique est celui de 35 à 45 mg/kg. Pour des raisons de commodité un mode préféré d'administration de l'antibiotique dans le traitement de PPLO consiste à mélanger le FR-02A avec la nourriture des animaux. Des proportions préférées pour le traitement de PPLO sont des proportions de 0,0055% à 0,02% en poids dans la nourriture.
Dans le traitement de la maladie des sacs à air
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conséquence, des doses utiles de FR-02A peuvent varier de 10 à
150 mg/kg.
Une solution ou suspension pour injection souscutanée pour traitement de la maladie des sacs à air des poulets peut être préparée comme suit:
Ampoule de solution ou suspension pour administration sous-cutanée contenant 20 mg de FR-02A.
FR-02A 20 mg
Diluant: eau stérile pour injection 2 cm<3>
Dans le traitement de la coccidiose, le mode préféré d'administration du FR-02A est l'administration dans la nourriture à raison de 0,05 à 2% environ du poids de la nourriture.
On comprendra que les doses à administrer dé-
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La voie préférée d'administration du FR-02A pour favoriser la croissance est par mélange dans la nourriture.
Les exemples ci-après illustrent des procédés par lesquels le produit de la présente invention peut être obtenu. Le
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cations et en conséquence tout écart mineur par rapport à ce procédé ou toute extension mineure du procédé sont considérés comme étant à la portée de l'homme de l'art et comme compris dans le cadre général de la présente invention.
Exemple 1
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désignation HA-2908 est utilisée comme inoculum.
La culture lyophilisée est ouverte dans un erlenmeyer de
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ment de premier étage :
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Le flacon d'ensemencement de premier étage et les flacons suivants de deuxième étage et de production sont mis en incubation à 28[deg.]C sur une secoueuse rotative tournant à 220 tpm.
Après deux jours dans le milieu d'ensemencement de pre-
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Le flacon d'ensemencement de deuxième étage est mis en incubation pendant un jour, puis on inocule la culture, à raison
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pour accélérer la filtration. Le filtrat est abandonné à lui-même jusqu'à ce que la couche de chloroforme se sépare. On fait écou-
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l'eau rendue basique au pH 10 avec de l'hydroxyde d'ammonium.
.près le séchage par congélation, le produit pèse 140 mg.
Comme le FR-02A est présent en association avec le mycé-
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rer le mycélium et la matière nutritive en suspension par filtration du bouillon de fermentation et extraire le FR-02A du gâteau de filtration avec un solvant organique polaire miscible dans l'eau comme l'acétone. Cette autre technique d'isolement du FR-02A estla suivante :
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de nouveau. On lave le gâteau avec 15 cm<3> d'acétone. L'extrait acétonique et les liquides de lavage associés sont évaporés sous vide à 30[deg.]C pour élimination de l'acétone. Le résidu est repris
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drique.
On ajouté un volume égal d'hexane et on agite pendant
10 minutes. Après sédimentation, on décante l'hexane et on s'en débarrasse. On effectue deux extractions supplémentaires avec des volumes égaux d'hexane, la dernière étant incolore.
La bouillie aqueuse est ensuite traitée par extraction avec un volume égal de chloroforme. On effectue ensuite une deuxième extraction avec un volume égal et on combine les deux extraits. On se débarrasse de la phase aqueuse.
L'extrait chloroformique est séché sur du sulfate de sodium anhydre, filtré et évaporé sous vide pour donner 106 mg de FR-02A.
On détermine que la masse moléculaire du FR-02A est de
1000 environ en soumettant la matière obtenue par la fermentation décrite ci-dessus à une chromatographie sur du Sephadex LH-20. La matière obtenue par ce traitement est rechromatographiée sur de l'Amberlite XAD pour donner un échantillon analytiquement pur. Chromatographie sur �el Sephadex LH-20
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LH-20 dans du méthanol (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, N.J.). La colonne est développée avec du méthanol. Le courant d'éluat est contrôlé avec un réfractomètre différentiel Meeco et l'enregistrement présente trois pics de masse. Des fractions sont soumises à des bio-essais à une dilution de 1-10 avec des disques en papier de 1,27 cm de diamètre sur des plaques d'essai de diffusion dans la gélose ensemencées de Vibrio percolans. On obtient des zones d'inhibition correspondant au troisième pic de masse détecté (KD = 0,3). Les fractions correspondant au troisième pic de masse sont combinées et évaporées pour donner 43 mg de FR-02A.
Le produit quand on le soumet aux bio-essais ci-dessus
de diffusion dans la gélose en utilisant Vibrio percolans donne
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L'absorption U.V. dans un tampon phosphate au pH 7,0 est :
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de sodium) et filtré pour éliminer la matière insoluble et que le filtrat est séché par congélation.
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pH 2 pour la transformer en l'acide libre avant de l'appliquer à la colonne. La colonne est contrôlée par un réfractomètre différentiel Meeco et l'enregistrement indique deux pics de masse. Des bio-essais par diffusion dans la gélose en utilisant des disques de 0,635 cm de diamètre et des plaques au Vibrio percolans indi-
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lide jaune pâle, stable à la manipulation normale et analytiquement pure,
Exemple 2
Production d'antibiotique FR-02A par fermentation de Streptomyces lactamdurans dans des flacons secoués
Une culture lyophilisée de Streptomyces lactamdurans de la désignation hA-2908 est utilisée comme inoculum.
On ouvre la culture lyophilisée dans un erlenmeyer
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cement de premier étage :
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Le flacon d'ensemencement de premier étage et les flacons suivants de deuxième étage et de production sont mis en incubation à 28[deg.]C sur une secoueuse rotative tournant à 220 tpm.
Après deux jours dans le milieu d'ensemencement de premier étage, on inocule 1 cm<3> du contenu du flacon d'ensemencement de premier étage dans 40 cm<3> d'un milieu d'ensemencement de dixième étage dans un erlenmeyer de 250 cm<3> à trois chicanes.
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Le flacon d'ensemencement de deuxième étage est mis en incubation pendant un jour, puis on inocule la culture, à raison de 1 cm<3> chaque fois, dans dix erlenmeyers de 250 cm<3> sans chicane contenant 40 cm<3> de milieu de production ayant la composition suivante :
<EMI ID=51.1>
On ajoute une goutte d'additif antimousse P-2000 dans chaque flacon avant passage à l'autoclave.
On prépare une solution de thiosulfate de sodium
<EMI ID=52.1>
Cette solution est stérilisée par filtration, puis on en ajoute 0,5 cm<3> dans chacun des flacons de production après passage à l'autoclave.
<EMI ID=53.1>
sont ensuite mis en incubation pendant cinq jours à 28[deg.]C et récoltés.
On assemble les contenus des dix flacons, on abaisse le pH à 5,5 avec de l'acide chlorhydrique, puis on ajoute
500 cm<3> de chloroforme et on agite le mélange pendant une demiheure à la température ambiante. On centrifuge ensuite le mélange pour séparer les phases et on se débarrasse de la phase aqueuse. La couche chloroformique est séchée sur du sulfate de magnésium anhydre et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu est secoué avec 30 cm<3> d'hexane. On décante l'hexane après séparation du
<EMI ID=54.1>
rendue basique au pH 10 avec de l'hydroxyde d'ammonium, pour obtenir une solution légèrement trouble. Pour effectuer des bioessais, on abaisse ensuite le pH à 8,5 avec HC1 et on dilue la solution dans de l'eau au pH 8,3 pour les essais par disques. Les bio-essais indiquent que la production dans le flacon de fermentation a été de 327 microgrammes de FR-02A par cm<3> de bouillon de fermentation ou 130 mg au total.
Exemple 3
Production d'antibiotique FR-02A par fomentation de Streptomyces lactamdurans dans des flacons secoués
Une culture lyophilisée de Streptomyces lactamdurans
<EMI ID=55.1>
cement de premier étage:
<EMI ID=56.1>
Le flacon d' ensemencement de premier étage et les flacons suivants de production sont mis en incubation à 28[deg.]C sur une secoueuse rotative tournant à 220 tpm.
Après deux jours dans le milieu d'ensemencement de premier étage, on inocule le contenu du flacon d'ensemencement
de premier étage, à raison de 1 cm<3> chaque fois, dans dix erlenmeyers de 250 cm<3> sans chicane contenant 40 cm<3> de milieu de production sensiblement ex��pt de matière nutritive en suspension et ayant la composition suivante :
<EMI ID=57.1>
On ajoute une goutte d'additif antimousse P-2000 dans chaque flacon avant passage à l'autoclave.
Les dix flacons de production sont ensuite mis en incubation pendant cinq jours à 28[deg.]C et récoltés. Isolement de FR-02A
<EMI ID=58.1>
au total) sont rassemblés, on abaisse le pH à 5,5 avec de l'acide chlorhydrique et on filtre le bouillon pour éliminer le mycélium.
<EMI ID=59.1>
et agité pendant une demi-heure. On centrifuge ensuite le mélange pour séparer les phases et on se débarrasse de la phase aqueuse. La couche chloroformique est séchée sur du sulfate de magnésium anhydre et évaporée à sec sous vide. Le résidu est lavé avec 30cm<3> d'hexane et séché à l'air pour donner l'antibiotique FR-02A.
Exemple 4
Production d'antibiotique FR-02A par fermentation de Streptomyces lactamdurans dans des flacons secoués
Une culture lyophilisée de Streptomyces lactamdurans de la désignation MA-2908 est utilisée comme inoculum.
On ouvre la culture lyophilisée dans un erlenmeyer
<EMI ID=60.1>
cement de premier étage.
Milieu d'ensemencement de premier étage
<EMI ID=61.1>
dans de l'eau distillée
pH réglé à 7,0 avec NaOH
Le flacon d'ensemencement de premier étage et les flacons de production qui suivent sont mis en incubation à 28[deg.]C sur une secoueuse rotative tournant à 220 tpm.
Après deux jours dans le milieu d'ensemencement de premier étage, on inocule le contenu du flacon d'ensemencement de premier étage, à raison de 1 cm<3> chacun, dans dix erlenmeyers
<EMI ID=62.1>
sensiblement exempt de matière nutritive en suspension et ayant la composition approximative suivante :
<EMI ID=63.1>
On ajoute une goutte d'additif antimousse P-2000 dans chaque flacon avant passage à l'autoclave.
Les dix flacons de production sont ensuite mis en incubation pendant cinq jours à 28[deg.]C et récoltés.
Isolement de FR-02A
On rassemble les contenus des dix flacons (400 cm<3> au total), on abaisse le pH à 5,5 avec de l'acide chlorhydrique et on filtre le mélange poui/recueillir le mycélium. On traite le mycélium par extraction avec 500 cm<3> de chloroforme. L'extrait chloroformique est séché sur du sulfate de magnésium anhydre et évaporé à sec sous vide. Le résidu est lavé avec 30 cm<3> d'hexane et séché à l'air pour donner l'antibiotique FR-02A.
Exemple 5
<EMI ID=64.1>
étage :
<EMI ID=65.1>
Le flacon d'ensemencement de premier étage et les flacons de production qui suivent sont mis en incubation à 28[deg.]C sur une secoueuse rotative tournant à 220tpm.
<EMI ID=66.1>
premier étage, on inocule le contenu du flacon d'ensemencement de premier étage, à raison de 1 cm3 chacun, dans dix erlenmeyers de 250 cm3 sans chicane contenant 40 cm3 de milieu de production sensiblement exempt de matière nutritive en suspension et ayant la composition suivante ;
<EMI ID=67.1>
On ajoute une goutte d'additif antimousse P-2000 dans chaque flacon avant passage à l'autoclave.
Les dix flacons de production sont ensuite mis en incubation pendant cinq jours à 28[deg.]C et récoltés.
Isolement de FR-02A
On rassemble les contenus des dix flacons de production (400 cm3 au total), on abaisse le pH à 5,5 avec de l'acide chlorhydrique. On ajoute 500 cm3 de chloroforme et on agite
le mélange pendant une demi-heure à la température ambiante.
On centrifuge ensuite le mélange pour séparer les phases et on se
<EMI ID=68.1>
séchée sur du sulfate de magnésium anhydre et évaporée à sec sous vide. Le résidu est lavé avec 30 cm3 d'hexane et séché à l'air pour donner l'antibiotique FR-02A.
<EMI ID=69.1>
<EMI ID=70.1>
Le flacon d'ensemencement de premier étage et les flacons suivants de deuxième étage et de production sont mis en incubation � 28[deg.]C sur une secoueuse rotative tournant à 220 tpm.
Après deux jours dans le milieu du premier étage, on inocule la culture du flacon d'ensemencement de premier
<EMI ID=71.1>
<EMI ID=72.1>
Le flacon d'ensemencement de deuxième étage est mis en incubation pendant un jour, puis on inocule la culture, à
<EMI ID=73.1>
chicane contenant 40 cm3 de milieu de production ayant la composition suivante ;
<EMI ID=74.1>
dans de l'eau du robinet le pH
est réglé à 7,3 avec NaOH
-On ajoute une goutte d'additif antimousse P-2000 dans chaque flacon avant passage à l'autoclave.
On prépare une solution de thiosulfate de sodium en <EMI ID=75.1>
à l'autoclave.
Les dix flacons de production (400 cm3 au total) sont ensuite mis en incubation pendant cinq jours à 28[deg.]C et récoltes. Isole-nent de FR-02A
On rassemble les contenus des dix flacons, on abaisse le pH à 5,5 avec de l'acide chlorhydrique et le mycélium et
la matière nutritive en suspension sont séparés du bouillon
de fermentation par filtration. On mélange le filtrat avec 500 cm3 de chloroforme et on agite pendant une demi-heure. On centrifuge ensuite le mélange pour séparer les phases et on
se débarrasse de la phase aqueuse. La couche chloroformique
est séchée sur du sulfate de magnésium anhydre et le solvant est évaporé sous vide. Le résidu est lavé avec 30 cm3 d'hexane et séché à l'air pour donner l'antibiotique FR-02A.
Propriétés physiques. L'analyse élémentaire de FR-02A est la suivante :
<EMI ID=76.1>
<EMI ID=77.1>
obtenue par spectrométrie de masse.
FR-02A sous la forme du sel d'ammonium est soluble dans l'alcool et le chloroforme. Il est modérément soluble dans l'eau à un pH de 7,0 ou plus élevé. Un spectre U.V du sel d'ammonium dans l'eau indique :
<EMI ID=78.1>
Le spectre de résonance magnétique nucléaire de l'anti-
<EMI ID=79.1>
et du tétraméthylsilane comme étalon interne. Des particularités représentatives du spectre ont été des doublets à 1,21, 1,31 et
<EMI ID=80.1>
La figure 1 montre le spectre d'absorption infrarou- <EMI ID=81.1>
Bande large à : 3400
Bandes intenses à : 1640, 1460, 1380, 1080, 1020 Bandes fortes à : 1550, 1505, 1240, 1195, 940, 860,
720, 620
On a soumis le FR-02A à divers systèmes d'analyse et les résultats sont présentés ci-dessous :
<EMI ID=82.1>
Le FR-02A est une matière sensiblement pure, à en
<EMI ID=83.1>
chromatographie sur couches minces et à un seul profil de forme gaussienne détecté par contrôle au réfractomètre des colonnes d'analyse de LH-20 et de XAD-2.
Pour caractériser encore le FR-02A in vitro, on a obtenu des résultats d'activité le concernant en utilisant un profil de spectre antibiotique. L'essai comporte des applications
<EMI ID=84.1>
pas de zones d'inhibition. Les résultats sont rapportés dans le Tableau 1 en mm de zones d'inhibition.
TABLEAU 1
<EMI ID=85.1>
essais par diffusion dans la gélose
<EMI ID=86.1>
* Résistant à la streptomycine, à la streptothricine
à la néomycine et à la viomycine.
<EMI ID=87.1>
<EMI ID=88.1>
TABLEAU
<EMI ID=89.1>
<EMI ID=90.1>
* Les quantités dans le tableau soir: exprimées
<EMI ID=91.1>
de 5 à 10 mg/souris, sont toxiques.
i
REVENDICATIONS
1. Un procédé pour produire l'antibiotique FR-02A, selon
<EMI ID=92.1>
dans un bouillon de fermentation contenant un milieu composé de sources assimilables d'hydrate de carbone, d'azote et de sels inorganiques dans des conditions aérobies jusqu'à ce qu'une quantité notable de FR-02A soit produite et on soumet le bouillon entie-r à une extraction par un solvant organique polaire non miscible avec l'eau pour obtenir l'antibiotique FR-02A.
Process for preparing the antibiotic FR-02A, the antibiotic thus obtained and its application to the treatment of bacterial infections.
The present invention relates to the novel production by fermentation and isolation of a useful antibiotic substance which heretofore has not been reported in the prior art. More particularly, the present invention relates to the preparation of an antibiotic called FR-02A by fermen-
<EMI ID = 1.1>
lées, followed by the isolation of this previously undescribed antibiotic called FR-02A.
Antibiotic FR-02A is obtained by culturing under controlled conditions the already known microorganism, Streptomyces lactamdurans, in fermentation broth and subjecting the whole broth to extraction with a polar organic solvent immiscible with water to obtain the 'antibiotic. Fermentation can be carried out in media containing suspended nutrient material or in predominantly clear media, the medium being substantially free of suspended nutrient material.
In the case where the fermentation is carried out in media containing suspended nutrient material, the antibiotic is found both in the solids constituting the mycelium and in the suspended nutrient material and in the broth. The antibiotic is isolated from the solids by separating the solids from the fermentation broth by filtration, centrifugation or other suitable means and subjecting the cake comprising the solids to extraction with an organic solvent, preferably a solvent. polar organic. The antibiotic remaining in the broth is isolated from the broth, from which the solids have been previously separated, by extraction with a polar organic solvent immiscible with water. It will be understood that during a delayed harvest
the total amount of solids in the fermentation broth will be reduced and a lower proportion of the antibiotic will be in the solids collected from the broth.
In media containing no suspended nutrient material, most of the FR-02A is found in the predominantly clear fermentation broth. In these cases, the whole broth is subjected to extraction with a polar organic solvent immiscible with water such as chloroform.
to get the antibiotic. Alternatively, any solids, such as mycelium, can be separated from the broth before the broth is subjected to extraction with an organic solvent immiscible with water. In addition, to obtain any residual FR-02A, the mycelium separated from the broth is subjected to extraction with an appropriate polar organic solvent so as to obtain the antibiotic FR-02A.
A preferred method for obtaining the antibiotic according to the present invention is to cultivate under controlled conditions the already known microorganism, Streptomyces lactamdurans, in a medium containing a suspended nutrient material or in a clear medium substantially free of suspended nutrient material and subjecting the whole broth to extraction with a polar organic solvent immiscible with water. The extraction is carried out by adjusting the pH of the broth to
an acidic pH and adding the solvent to the broth. After mixing, the solids are separated from the broth. The broth is allowed to stand until the solvent layer separates. We
The solvent layer is drained, washed with water, dried with a suitable desiccant and evaporated in vacuo. The residue is washed with a suitable nonpolar organic solvent such as petroleum ether or hexane and air dried to give the antibiotic FR-02A.
The particularly preferred method for obtaining the antibiotic FR-02A consists in cultivating, under controlled conditions, the already known microorganism, Streptomyces lactamdurans, in a medium containing a suspended nutrient material.
The fermentation broth is filtered to collect solids including mycelium and suspended nutrient material. After blowing the filter cake comprising the solids so as to dry it as much as possible, the cake is stirred in a polar organic solvent and filtered again. After washing the cake with additional solvent, the combined solvent extract and washing liquid are evaporated in vacuo to leave an aqueous slurry. The pH is made acidic. The aqueous slurry is washed with a non-polar organic solvent such as petroleum ether, hexar, etc., until the washings are colorless. The aqueous slurry is further treated by extraction with a polar organic solvent.
The solvent extract is dried, filtered and evaporated in vacuo to give the antibiotic FR-02A. For example, according to the process of the invention the antibiotic? R-02A can be obtained in a form of a purity
<EMI ID = 2.1>
Alternatively, the fermentation can be carried out in a medium substantially free of suspended nutrient material. The fermentation broth is filtered to collect the mycelium. The mycelium is subjected to extraction with a polar organic solvent. The extract is dried and evaporated to dryness under vacuum. The residue is shaken with a nonpolar organic solvent such as petroleum ether, hexane, etc. The organic solvent is decanted after centrifugation so that the residue settles. The residue is air dried to give the antibiotic FR-02A.
A still preferred method of obtaining the antibiotic according to the present invention consists in culturing in
<EMI ID = 3.1>
in fermentation broth and treating the broth by extraction after separation of solids comprising mycelium or mycelium and suspended nutrient material. The pH of the fermentation broth is made acidic and the solids including mycelium or mycelium and suspended nutrient material are separated. The solids-free fermentation broth is mixed with a polar organic solvent immiscible with water. After mixing, the layers are allowed to separate. We drain the organic layer, we
it is dried using a suitable desiccant and evaporated to dryness in vacuo. The residue is washed with an organic solvent
nonpolar like petroleum ether or hexane and dried
to air to give the antibiotic FR-02A.
In the processes described above in which extractions are carried out with polar organic solvents immiscible with water, representative examples of such solvents include alkyl esters of lower alkanoic acids such as methyl formate, formate. ethyl acetate, methyl acetate, ethyl acetate, n-butyl acetate isobutyl acetate, ethyl propionate, a ketone such as cyclohexanone, or a lower halogenated hydrocarbon such as
chloroform, methylene chloride, carbon tetrachloride, ethylene dichloride, 1-chloro-2,2-dimethylpropane, tetrachlorethylene or bromoform.
In the processes described above in which extractions are carried out with polar organic solvents, representative examples of such solvents include lower alkyl esters of lower alkanoic acids such as methyl formate, ethyl formate, l. 'methyl acetate, ethyl acetate, n-butyl acetate, isobutyl acetate, ethyl propionate, a ketone such as acetone, methyl ethyl ketone or cyclohexanone, or a hydro-
<EMI ID = 4.1>
methylene, carbon tetrachloride, ethylene dichloride, 1-chloro-2,2-dimethylpropane, tetrachlorethylene or bromoform.
In addition to the production of FR-02A, it has been reported in the published technical documentation that S. lactam-
<EMI ID = 5.1>
and Belgian patent n [deg.] 764,160). As a consequence of the fact that FR-02A is very soluble in organic solvents immiscible with water while Cephamycin C is practically insoluble in organic solvents immiscible with water, both ma-
<EMI ID = 6.1>
extracting the broth with a solvent immiscible with water allows each antibiotic to be obtained in a form free from contamination by the other.
Antibiotic FR-02A isolated from the fermentation broth is subjected to further purification by chromatography through a molecular sieve followed by chromatography on a surfactant adsorbent. A suitable molecular sieve is a crosslinked dextran such as the molecular sieve known under the designation Sephadex LH-20 produced by the firm of pharmacia fine chemicals Inc. FR-02A can be eluted with a lower alkanol such as methanol. A suitable surfactant adsorbent is a hydrophobic nonionic macroporous copolymer of polystyrene crosslinked with divinylbenz (known as Amberlite XAD-1 to XAD-12 produced by Rohm and Haas. A preferred resin for purifying FR-02A is XAD-2 resin.
Solvents which can be used to elute the absorbed FR-02A are aqueous solutions of lower alkanols, for example aqueous solutions of methanol, ethanol, isopropanol, butanol, etc. The preferred solvent for eluting FR-02A from the XAD-2 resin is a 50% isopropanol-water mixture.
The organism that produces FR-02A is a strain
<EMI ID = 7.1>
and has been placed in permanent repository without restrictions on availability with the crop collection of the Northern Utilization Research and Development Division Agricultural Research Service, US Department of Agriculture (formerly Northern Regional Research Laboratories), Peoria Illinois 61604 and is available to the public under the culture nr NRRL 3802.
Complete studies of the taxonomy and morphology of Streptomyces lactamdurans are reported in Belgian patent n [deg.] 764,160. From taxonomic studies, Streptcmyces lactamdurans has been identified as a new actinomycete. It was found to belong to the genus Streptomyces and to possess many attributes of the known species Streptomyces fradiae. Biochemically the two are almost identical, but morphologically there are some important differences. For example,
<EMI ID = 8.1>
and other characteristics, this organism has been given the species name Streptomyces lactamdurans.
Streptomyces lactamdurans is only an example
<EMI ID = 9.1>
in the production of FR-02A and it should be understood that the present invention is not limited to organisms meeting these particular descriptions. The present invention encompasses the use of other microorganisms, including actinomycete strains isolated from nature or obtained by mutation, such as for example those obtained by natural selection or those produced by mutant agents, for example by X-ray irradiation, ultraviolet irradiation, nitrogenous yperites, etc., which under suitable conditions will give FR-02A.
FR-02A is produced during the aerobic fermentation of suitable aqueous nutrified media under conditions
<EMI ID = 10.1>
rans. Aqueous media such as those used for the production of other antibiotics are useful for the production of the antibiotic FR-02A. Such media contain sources of carbon, nitrogen and inorganic salts which can be assimilated by the microorganism. The choice of media is not critical and fermentation can be carried out in media containing
the nutrient material in suspension or in predominantly clear media, the medium being substantially free of nutrient in suspension.
In general, carbohydrates such as sugars, for example dextrose, glucose, anabinose,
<EMI ID = 11.1>
starches such as cereals, eg oats, rye, corn addon, corn flour, etc., can be used singly or in combination as sources of assimilable carbon in the nutrient medium. The exact amount of
The source or sources of carbohydrate used in the medium will depend in part on the other ingredients in the medium, but in general the amount of carbohydrate will usually vary between about 1% and 6% by weight of the medium.
These carbon sources can be used individually or several carbon sources can be combined in the medium. In general, many protein materials can be used as sources of nitrogen in the fermentation process. Suitable nitrogen sources include, for example, nutrient broth, yeast extract,
<EMI ID = 12.1>
soybean, cottonseed flour, casein hydrolysates, corn maceration liquor, soluble distillation residues, tomato paste, etc. The sources of nitrogen, singly or in combination, are used in amounts ranging from about 0.2 to 6% by weight of the aqueous medium.
The media described in the examples are only illustrations of the wide variety of media that can be used, and should not be construed as limiting.
Fermentation is carried out at temperatures between approximately 20 and 37 [deg.] C, however, for best results it is best to conduct fermentation at temperatures between approximately 24 and 32 [deg.] C. The pH of the nutrient media suitable for growing the Strep culture
<EMI ID = 13.1>
be between 6.0 and 8.0 approximately.
Small-scale fermentation of the antibiotic is conveniently carried out by inoculating the culture producing the antibiotic into a suitable nutrient medium and, after transfer to a production medium, allowing the fermentation to take place at a constant temperature of 28 [deg.] C approximately on a shaker for several days. At the end of the incubation period, the mycelium and suspended nutrient material can be collected by centrifugation or filtration and subjected to solvent extraction, or the whole broth can be processed by extraction with chloroform or others. solvents immiscible with water or alternatively the broth can be subjected to extraction after the solids comprising mycelium or mycelium and suspended nutrient material have been separated therefrom.
The small-scale fermentation is carried out in a sterilized flask by a development of germs at one, two or three or four stages. The nutrient medium for the inoculation stage can be any suitable combination <EMI ID = 14.1>
The intermediate stages, when used, are developed in essentially the same way, that is, part of the contents of the vial are used to inoculate the production medium. The inoculated vials are shaken at a constant temperature for several days and at the end of the incubation period the FR-02A antibiotic is isolated as has already been described.
For large-scale work, it is preferable to conduct the fermentation in suitable tanks equipped with an agitator and a means for aerating the fermentation medium. According to this process, the nutrient medium is composed in the tank and sterilized by heating at temperatures up to
120 [deg.] C approx. After cooling, the sterilized medium is inoculated with a previously grown seed of the producing culture and the fermentation is allowed to take place over a period of several days, for example two to four days, while stirring and / or aerating the nutrient medium and maintaining the temperature at approximately 28 [deg.] C. The production of FR-02A is
<EMI ID = 15.1>
production, as determined by bioassay.
Test technique.
Disc and plate tests were performed using 9.5 mm diameter filter paper discs. Test plates were prepared using Difco Nutrient Agar plus 2.0g / L Difco Yeast Extract at 10cm <3> per plate. An overnight culture of the test organism, Vibrio Percolans American Type Culture Collection (ATCC
8461) in nutrient broth plus 0.2% yeast extract is diluted in sterile saline to give a suspension having a transmission factor of 40% at a
<EMI ID = 16.1>
20 cm per liter of medium before pouring the plates.
The test plates are kept at 4 [deg.] C until use (5 days maximum). After application of the antibiotic saturated test discs, the plates are
<EMI ID = 17.1>
The zones of inhibition are noted by their diameter in mm. These results are used to determine the relative potencies or, by comparison with a purified reference standard, the potency.
<EMI ID = 18.1>
tion, mycelium and suspended nutrient separated from the fermentation broth and in free broths
<EMI ID = 19.1>
meter showed zones of inhibition of 16 mm. When such a test is carried out in a quantitative manner, it is possible to detect
<EMI ID = 20.1>
FR-02A exhibits activity against Gram-negative and Gram-positive bacteria, coccidia and Mycoplasma species. In in vitro assays, FR-02A is effective against E. acervulina, Bordetella, Streptococcus faecalis, Streptococcus faecum, Streptococcus afalactiae, Streptococcus
<EMI ID = 21.1>
FR-02A is useful both as an antibiotic and as a growth promoting agent in animals.
When FR-02A is used as an antibiotic, the particular means used to administer it to the animal is not critical and any of the methods currently used or available to treat infected animals or animals susceptible to infestation are satisfactory.
FR-02A can be used as an antibiotic, for example in the form of pharmaceutical compositions which
contain it in admixture or together with an organic or inorganic, solid or liquid pharmaceutical excipient suitable for intestinal, parenteral or local administration. Suitable excipients are substances which do not react with the antibiotic, for example water, gelatin, lactose,
starches, stearyl alcohol, magnesium stearate, talc, vegetable oils, benzyl alcohols, gums propylene glycol, polyalkylene glycols, petrolatum, cholesterol or other known medicinal excipients.
The pharmaceutical preparations can be, for example, tablets, dragees, ointments, creams or capsules, or in the liquid state they can be solutions, suspensions or emulsions. They can be sterilized and / or contain adjuvants, such as preservatives or stabilizers, wetting or emulsifiers, solubilizers,
salts to regulate osmotic pressure or buffers.
When it is desired to administer the antibiotic in a dry solid unit dosage form, capsules, bowls or tablets containing the desired amount of antibiotic are used. These dosage forms are prepared by thoroughly and evenly mixing the active ingredient with suitable finely divided diluents, fillers, disintegrating agents and / or binders such as starch, lactose, talc, magnesium stearate. , vegetable gums, etc. These compositions
in unit doses can vary a lot with regard to
their total weight and their FR-02A content as a function of factors such as the type of host animal to be treated, the severity and type of injection and the weight of the host. The antibiotic can be administered at a rate of approximately 5 to 100 mg per day per kilogram of body weight.
Included in the present invention are the pharmaceutically acceptable non-toxic salts of FR-02A, for example the alkali metal and alkaline earth metal salts such as those derived from sodium, potassium, ammonium and calcium or salts with salts. organic bases, for example triethylamine, N-ethylpiperidine, dibenzylethylenediamine.
In addition to its use as an antibiotic,
FR-02A is useful as a feed additive to promote the growth of animals such as poultry, sheep and cattle. The use of FR-02A shortens the time required to bring animals to a current sale weight.
When F; � -02A is used as a growth promoting agent in animals, it can be administered as
<EMI ID = 22.1>
sout or suspended in drinking water.
When FR-02A is used as a component of animal feed, it is first incorporated into a feed supplement. In such food supplements, FR-02A is present in relatively concentrated amounts dispersed in an inert carrier or diluent. The food supplement can be added directly to the food or it can be incorporated into a premix by an intermediate dilution or mixing step. The term “inert vehicle” is used to refer to a vehicle which will not react with the antibiotic and which can be administered without danger to animals. Preferably, the vehicle is a substance which is or which can be an ingredient in the ration of the animals.
Typical vehicles or diluents which can be used for such compositions are, for example, dried fries from the distillery, corn flour, lemon flour, fermentation residues, crushed oyster shells, mill residues, etc. soluble fractions of molasses, corn ear flour, a bean food
<EMI ID = 23.1>
etc. The antibiotic is intimately dispersed throughout the vehicle by techniques such as grinding, mixing, mixing or tumbling. Compositions containing from about 5 to 50% by weight of the antibiotic are particularly useful as food supplements.
Typical examples of food supplements containing FR-02A dispersed in a solid vehicle are as follows:
<EMI ID = 24.1>
We prepare these supplements for food
and others evenly mixing the antibiotic with the vehicle.
The food supplement can be added directly to the food or incorporated into a premix by an intermediate step of dilution or mixing with a vehicle suitable for oral ingestion. Compositions containing from 0.03% to 5% by weight of the antibiotic are particularly useful as premixes. These premixes are prepared by uniformly mixing the antibiotic with a vehicle capable of oral ingestion.
These supplements or premixes are added to the animal feed in an amount suitable to give the finished feed the desired concentration of FR-02A to promote growth. For poultry, FR-02A is used at a final concentration of between 50 and 300 g per tonne of feed to achieve the desired result of growth activation. In the case of pigs, including pigs infested with M. hyorhinis, FR-02A can be administered in the feed in similar proportions.
In the explanations above concerning the
<EMI ID = 25.1>
in which the FR-02A is mixed with an edible vehicle in a food supplement, in what is called
a premix or in the final mash. This is the preferred mode of administration of FR-02A. Another way is to dissolve
FR-02A or to suspend it in drinking water
animals. The amount that can be suspended in water without excessive dedimentation is limited. To remedy,
emulsifiers or surfactants can be used.
Those skilled in the art will also understand that special food supplement and finished animal feed compositions containing FR-02A may also include vitamins; other antibiotics and growth promoters and other nutrients.
i <EMI ID = 26.1>
at doses of 5 to 100 mg / kg. A preferred range for a single dose is 35-45 mg / kg. For convenience a preferred mode of administration of the antibiotic in the treatment of PPLO is to mix the FR-02A with the animal feed. Preferred proportions for the treatment of PPLO are from 0.0055% to 0.02% by weight in the food.
In the treatment of air sac disease
<EMI ID = 27.1>
Consequently, useful doses of FR-02A may vary from 10 to
150 mg / kg.
A solution or suspension for subcutaneous injection for the treatment of air sac disease in chickens can be prepared as follows:
Ampoule of solution or suspension for subcutaneous administration containing 20 mg of FR-02A.
FR-02A 20 mg
Diluent: sterile water for injection 2 cm <3>
In the treatment of coccidiosis, the preferred mode of administration of FR-02A is administration in the food at about 0.05 to 2% by weight of the food.
It will be understood that the doses to be administered
<EMI ID = 28.1>
The preferred route of administration of FR-02A to promote growth is by mixing in food.
The following examples illustrate methods by which the product of the present invention can be obtained. The
<EMI ID = 29.1>
cations and consequently any minor deviation from this process or any minor extension of the process are considered to be within the abilities of those skilled in the art and as included in the general scope of the present invention.
Example 1
<EMI ID = 30.1>
designation HA-2908 is used as the inoculum.
The lyophilized culture is opened in an Erlenmeyer flask of
<EMI ID = 31.1>
first floor:
<EMI ID = 32.1>
The first stage seed flask and subsequent second stage and production flasks are incubated at 28 [deg.] C on a rotary shaker rotating at 220 rpm.
After two days in the pre- seeding medium
<EMI ID = 33.1>
<EMI ID = 34.1>
The second-stage seed flask is incubated for one day, then the culture is inoculated, at the same time.
<EMI ID = 35.1>
<EMI ID = 36.1>
<EMI ID = 37.1>
to speed up filtration. The filtrate is left on its own until the chloroform layer separates. We listen
<EMI ID = 38.1>
water made basic to pH 10 with ammonium hydroxide.
. after freeze drying, the product weighs 140 mg.
As FR-02A is present in association with the myce-
<EMI ID = 39.1>
Filter the mycelium and suspended nutrient material from the fermentation broth and extract the FR-02A from the filter cake with a water-miscible polar organic solvent such as acetone. This other technique for isolating FR-02A is as follows:
<EMI ID = 40.1>
again. The cake is washed with 15 cm <3> of acetone. The acetone extract and the associated washing liquids are evaporated under vacuum at 30 [deg.] C to remove the acetone. The residue is taken up
<EMI ID = 41.1>
drric.
Add an equal volume of hexane and stir for
10 minutes. After sedimentation, the hexane is decanted and it is discarded. Two more extractions are carried out with equal volumes of hexane, the last being colorless.
The aqueous slurry is then treated by extraction with an equal volume of chloroform. A second extraction is then carried out with an equal volume and the two extracts are combined. We get rid of the aqueous phase.
The chloroform extract is dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and evaporated in vacuo to give 106 mg of FR-02A.
The molecular weight of FR-02A is determined to be
Approximately 1000 by subjecting the material obtained by the fermentation described above to chromatography on Sephadex LH-20. The material obtained by this treatment is rechromatographed on Amberlite XAD to give an analytically pure sample. Chromatography on � el Sephadex LH-20
<EMI ID = 42.1>
LH-20 in methanol (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, N.J.). The column is developed with methanol. The eluate stream is monitored with a Meeco differential refractometer and the recording shows three mass peaks. Fractions are bioassayed at a 1-10 dilution with 1.27 cm diameter paper discs on Vibrio percolans seeded agar diffusion assay plates. Zones of inhibition are obtained corresponding to the third mass peak detected (KD = 0.3). The fractions corresponding to the third mass peak are combined and evaporated to give 43 mg of FR-02A.
The product when subjected to the above bio-tests
diffusion in agar using Vibrio percolans gives
<EMI ID = 43.1>
U.V. absorption in a phosphate buffer at pH 7.0 is:
<EMI ID = 44.1>
<EMI ID = 45.1>
sodium) and filtered to remove insoluble matter and the filtrate is freeze dried.
<EMI ID = 46.1>
pH 2 to convert it to the free acid before applying it to the column. The column is monitored by a Meeco differential refractometer and the recording shows two mass peaks. Agar diffusion bioassays using 0.635 cm diameter discs and Vibrio percolans indi-
<EMI ID = 47.1>
pale yellow, stable to normal handling and analytically pure,
Example 2
Production of FR-02A antibiotic by fermentation of Streptomyces lactamdurans in shaken flasks
A lyophilized culture of Streptomyces lactamdurans of the designation hA-2908 is used as inoculum.
The lyophilized culture is opened in an Erlenmeyer flask
<EMI ID = 48.1>
first floor cement:
<EMI ID = 49.1>
The first stage seed flask and subsequent second stage and production flasks are incubated at 28 [deg.] C on a rotary shaker rotating at 220 rpm.
After two days in the first stage seed medium, 1 cm <3> of the contents of the first stage seed flask are inoculated into 40 cm <3> of a tenth stage seed medium in an Erlenmeyer flask. 250 cm <3> with three baffles.
<EMI ID = 50.1>
The second-stage seed flask is incubated for one day, then the culture is inoculated, at a rate of 1 cm <3> each time, into ten 250 cm <3> Erlenmeyer flasks without baffle containing 40 cm <3> of production medium having the following composition:
<EMI ID = 51.1>
A drop of P-2000 anti-foam additive is added to each vial before autoclaving.
Prepare a sodium thiosulfate solution
<EMI ID = 52.1>
This solution is sterilized by filtration, then 0.5 cm <3> is added to each of the production vials after autoclaving.
<EMI ID = 53.1>
are then incubated for five days at 28 [deg.] C and harvested.
The contents of the ten vials are assembled, the pH is lowered to 5.5 with hydrochloric acid, then added.
500 cm 3 of chloroform and the mixture is stirred for half an hour at room temperature. The mixture is then centrifuged to separate the phases and the aqueous phase is discarded. The chloroform layer is dried over anhydrous magnesium sulfate and the solvent is evaporated in vacuo. The residue is shaken with 30 cm <3> of hexane. The hexane is decanted after separation of the
<EMI ID = 54.1>
made basic to pH 10 with ammonium hydroxide, to obtain a slightly cloudy solution. To perform bioassays, the pH is then lowered to 8.5 with HCl and the solution is diluted in water at pH 8.3 for the disk tests. Bioassays indicate that the production in the fermentation flask was 327 micrograms of FR-02A per cc of fermentation broth or 130 mg in total.
Example 3
Production of FR-02A antibiotic by fomenting Streptomyces lactamdurans in shake vials
A lyophilized culture of Streptomyces lactamdurans
<EMI ID = 55.1>
first floor cement:
<EMI ID = 56.1>
The first stage seed flask and subsequent production flasks are incubated at 28 [deg.] C on a rotary shaker rotating at 220 rpm.
After two days in the first stage seed medium, the contents of the seed bottle are inoculated
first stage, at the rate of 1 cm <3> each time, in ten erlenmeyer flasks of 250 cm <3> without baffle containing 40 cm <3> of production medium substantially free of nutrient material in suspension and having the following composition:
<EMI ID = 57.1>
A drop of P-2000 anti-foam additive is added to each vial before autoclaving.
The ten production vials are then incubated for five days at 28 [deg.] C and harvested. Isolation of FR-02A
<EMI ID = 58.1>
in total) are combined, the pH is lowered to 5.5 with hydrochloric acid and the broth is filtered to remove the mycelium.
<EMI ID = 59.1>
and stirred for half an hour. The mixture is then centrifuged to separate the phases and the aqueous phase is discarded. The chloroform layer is dried over anhydrous magnesium sulfate and evaporated to dryness in vacuo. The residue is washed with 30cm <3> hexane and air dried to give the antibiotic FR-02A.
Example 4
Production of FR-02A antibiotic by fermentation of Streptomyces lactamdurans in shaken flasks
A lyophilized culture of Streptomyces lactamdurans of the designation MA-2908 is used as inoculum.
The lyophilized culture is opened in an Erlenmeyer flask
<EMI ID = 60.1>
first floor cement.
First stage seeding medium
<EMI ID = 61.1>
in distilled water
pH set to 7.0 with NaOH
The first stage seed flask and subsequent production flasks are incubated at 28 [deg.] C on a rotary shaker rotating at 220 rpm.
After two days in the first-stage inoculating medium, the contents of the first-stage inoculating flask are inoculated, at a rate of 1 cm <3> each, into ten Erlenmeyer flasks.
<EMI ID = 62.1>
substantially free from suspended nutrient matter and having the following approximate composition:
<EMI ID = 63.1>
A drop of P-2000 anti-foam additive is added to each vial before autoclaving.
The ten production vials are then incubated for five days at 28 [deg.] C and harvested.
Isolation of FR-02A
The contents of the ten vials (400 cm 3 in total) were pooled, the pH was lowered to 5.5 with hydrochloric acid and the mixture filtered to collect the mycelium. The mycelium is treated by extraction with 500 cm 3 of chloroform. The chloroform extract is dried over anhydrous magnesium sulfate and evaporated to dryness under vacuum. The residue is washed with 30 cc of hexane and air dried to give the antibiotic FR-02A.
Example 5
<EMI ID = 64.1>
floor:
<EMI ID = 65.1>
The first stage seed flask and subsequent production flasks are incubated at 28 [deg.] C on a rotary shaker running at 220 rpm.
<EMI ID = 66.1>
first stage, the contents of the first stage seed flask are inoculated, at a rate of 1 cm3 each, into ten 250 cm3 erlenmeyer flasks without baffle containing 40 cm3 of production medium substantially free of suspended nutrient material and having the following composition ;
<EMI ID = 67.1>
A drop of P-2000 anti-foam additive is added to each vial before autoclaving.
The ten production vials are then incubated for five days at 28 [deg.] C and harvested.
Isolation of FR-02A
The contents of the ten production flasks (400 cm3 in total) are pooled, the pH is lowered to 5.5 with hydrochloric acid. Add 500 cm3 of chloroform and stir
mixing for half an hour at room temperature.
The mixture is then centrifuged to separate the phases and
<EMI ID = 68.1>
dried over anhydrous magnesium sulfate and evaporated to dryness in vacuo. The residue is washed with 30 cm3 of hexane and air dried to give the antibiotic FR-02A.
<EMI ID = 69.1>
<EMI ID = 70.1>
The first stage seeding flask and subsequent second stage and production flasks are incubated 28 [deg.] C on a rotary shaker rotating at 220 rpm.
After two days in the first stage medium, the culture from the first seed flask is inoculated.
<EMI ID = 71.1>
<EMI ID = 72.1>
The second-stage seed flask is incubated for one day, then the culture is inoculated, at
<EMI ID = 73.1>
baffle containing 40 cm3 of production medium having the following composition;
<EMI ID = 74.1>
in tap water the pH
is set to 7.3 with NaOH
-One drop of P-2000 anti-foam additive is added to each vial before autoclaving.
A sodium thiosulfate solution is prepared in <EMI ID = 75.1>
in an autoclave.
The ten production vials (400 cc in total) are then incubated for five days at 28 [deg.] C and harvested. Insulation from FR-02A
The contents of the ten vials are collected, the pH is lowered to 5.5 with hydrochloric acid and the mycelium and
the suspended nutrient material is separated from the broth
fermentation by filtration. The filtrate is mixed with 500 cm3 of chloroform and stirred for half an hour. The mixture is then centrifuged to separate the phases and
gets rid of the aqueous phase. The chloroform layer
is dried over anhydrous magnesium sulfate and the solvent is evaporated in vacuo. The residue is washed with 30 cm3 of hexane and air dried to give the antibiotic FR-02A.
Physical properties. The elemental analysis of FR-02A is as follows:
<EMI ID = 76.1>
<EMI ID = 77.1>
obtained by mass spectrometry.
FR-02A in the form of the ammonium salt is soluble in alcohol and chloroform. It is moderately soluble in water at pH 7.0 or higher. A U.V spectrum of ammonium salt in water indicates:
<EMI ID = 78.1>
The nuclear magnetic resonance spectrum of the anti-
<EMI ID = 79.1>
and tetramethylsilane as an internal standard. Representative features of the spectrum were doublets at 1.21, 1.31 and
<EMI ID = 80.1>
Figure 1 shows the infrared absorption spectrum- <EMI ID = 81.1>
Wideband to: 3400
Strong bands at: 1640, 1460, 1380, 1080, 1020 Strong bands at: 1550, 1505, 1240, 1195, 940, 860,
720, 620
The FR-02A was subjected to various analytical systems and the results are shown below:
<EMI ID = 82.1>
FR-02A is a substantially pure material, in
<EMI ID = 83.1>
chromatography on thin layers and with a single profile of Gaussian shape detected by refractometer control of analysis columns of LH-20 and XAD-2.
To further characterize FR-02A in vitro, activity results relating to it were obtained using an antibiotic spectrum profile. The trial has applications
<EMI ID = 84.1>
no zones of inhibition. The results are reported in Table 1 in mm of zones of inhibition.
TABLE 1
<EMI ID = 85.1>
agar diffusion assays
<EMI ID = 86.1>
* Resistant to streptomycin, streptothricin
neomycin and viomycin.
<EMI ID = 87.1>
<EMI ID = 88.1>
BOARD
<EMI ID = 89.1>
<EMI ID = 90.1>
* The quantities in the evening table: expressed
<EMI ID = 91.1>
from 5 to 10 mg / mouse, are toxic.
i
CLAIMS
1. A process for producing the antibiotic FR-02A, according to
<EMI ID = 92.1>
in a fermentation broth containing a medium composed of assimilable sources of carbohydrate, nitrogen and inorganic salts under aerobic conditions until a substantial amount of FR-02A is produced and the broth is subjected to whole -r in extraction with a polar organic solvent immiscible with water to obtain the antibiotic FR-02A.