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Antigène! stabilises et procédés permettant de les préparer.
La présente invention concerne des perfectionnements aux antigènes de virus telsque les vaccina de virus, et des procédés de préparation de matières à propriété. antigéniques, Plus particulièrement, l'invention concerne des matériel. vi- rulents dont le pouvoir antigénique a une stabilité accrue.
Etant donne que les matériels virulents du commerce tendent généralement à perdre leur potentiel antigénique pr conservation, on a proposé d'y incorporer un stabilisant pour maintenir ou stabiliser le potentiel antigénique. Divers stabilisants ont été décrits à cette fin.
Dans le cas de la production de vaccins,le problème se complique du fait qu'on peut être oblige de recourir à des opérations au cours desquelles
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le vaccin est lyophilisa pour obtenir un produit non aqueux,
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ou simplement coing,-.le pour rn11f1.r une condition de maximum e stabilité puis décongelé au moment opportun pour donner un produit fluide pour le rempli a snge des ampoules, Dans le cas habituel de la fabrication industrielle où la quantité de vaccin préparé est supérieure à la quantité requise pour le condition. notent immédiate l'excès de vaccin doit être gelé une nouvelle fois, puis conservé jusqu'au moment d'un nouveau conditionne.
Ment du vaccin. Il en résulte inévitablement un certain nombre
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de cycles de con(l!lt:lon-d{cot1glation ayant un effet défavo- rrble en l'absence d'un stabilisant approprié et conduisant à une perte pr<"naturpe du potentiel antigénique. Sous ce rapport, il ert connu que des concratrntions élevées en sels ont un effet nuisible sur le pott ntIQ1 antigénique.
Par conBrquent,+'ut111sa- tion de salacomme stabilisant* est contre-indiquée, La concen- tration en self' est un problème particulier de la dessiccation, parce qu'elle augmente progressivement pendant 1' élimination de l'enu du produit aqueux et. expose ainsi de plus en plus les facteurs antagoniques à une détérioration possible. En outre,
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l'addition de sels a. i,ae .a température à laquelle un produit fluide peut être amené à l'état solide.
Des matières hygros- copiques sont également contre-indiquées, parée qu'en concentra-'
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tion élevée elles t!ohf't3nt des sirops qui sont difficiles à l'\"n1- puler, en particulier pendant la dessiccation.
La présente invention a pour but de procurer des maté- riels virulents dont le potentiel antigénique a une stabilité
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accrue surtout PUl1.,..nt lr lyophilisation, la conservation ou les traitement proloI1r.{. 19.
Elle a également pour but de procurer des matériels virulents fluides qui puissent être soumis à des congélations
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et des décongél1on excessives sans perte sensible du poten- tiel antic'nique.
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Elle a aussi pour but de procurer des vaccina stabili- ses.
Elle a encore pour but de procurer des matériels viru- lente fluides qui puissent être transformée en solides non hy- groscopiques, sans formation de sirops et qui, après reconsti- tution par de l'eau ou à la suite d'un autre traitement, puis- sent être utilisas comme vaccins immunogènes ou prophylactiques.
L'invention a en outre pour but de procurer des moyens permettant de stabiliser les matériels virulents.
Ces buts et d'autres de l'invention qui ressortent, ainsi que ses particularités et les avantages qu'elle assure de sa description ci-après sont atteints à l'aide d'antigènes de virus comprenant une proportion mineure de sel appelé laoto- bionate de calcium. Avantageusement, les produits suivant l'in- vention contenant du lactobionate de calcium ont un potentiel antigénique stable et conservent longtemps leur potentiel désire.
Etant donné que la présence des sels ajoutés aux vaccins et aux matériels antigéniques est habituellement indésirable, il est surprenant que les produits suivant l'invention contenant un sel ajouté, à savoir le lactobionate de calcium, soient de loin su- périeure par la stabilité de leur potentiel antigénique aux produits semblables ne contenant pas de lactobionate de calcium.
En outre, les antigènes fluides de l'invention peuvent être amenés à l'état de paillettes poudreuses sèches, sans formation de sirops difficiles à manipuler ou d'autres forme;! hygrosco- piques. Il est généralement nécessaire de congeler de nombreuses variétés de vaccins et de les maintenir à une température extrê- mement basse pour obtenir le maximum de stabilité à la conser- vation, mais les produits suivant l'invention présentent l'aven...
'.age inattendu de pouvoir être conservés longtemps à l'état congelé à une température nettement plus élevée, sans perte sensible de leur potentiel antigénique, Par exemple, le vaccin ordinaire de la rougeole, qui contient normalement un faible
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pourcentage de chlorure de calcium, doit être maintenu à des températures inférieures à environ -60 C; à une température supérieure la perte du pouvoir antigénique est rapide et essen- tiellement complète. Tout au contraire, le vaccinde larougeole suivant la présente invention peut être conservé avantageusement à des températures pouvant s'élever à environ -20 C; et à ces températures plus élevées, le maximum de stabilité est atteint.
En outre, les produits de l'invention peuvent être soumis à des cycles de congélation-décongélation successifs sans perte gênante du potentiel antigénique.
L'invention s'applique de façon générale aux matériels virulents antigéniques et plus particulièrement aux matériels virulents sous forme sèche ou aqueuse, qui sont des vaccins qui peuvent être utilisés pour la production de vaccins ou d'anti- sérums.
Ainsi, l'invention s'applique aux vaccins de virus comprenant de façon générale les vaccins de virus atténués vivants et les vaccins de virus tués. Des exemples des nombreux vaccins auxquels s'applique l'invention sont les vaccins de la poliomyélite, de la rougeole, de l'hépatite infectieuse, de la. fièvre jaune, des oreillons, de la rage et de la variole. Ces vaccins qui aux fins de l'invention, peuvent ne pas être stabili- ses ou être stabilisasen partie, s'obtiennent par des procédas classiques. L'invention s'applique également à la stabilisation de matériels de départ de vaccins de virus, comme les produits de filtration et de centrifugntion de cultures de virus, etc.,,les vaccins de virus en cours de préparation, les réserves de vaccins et d'autres matériels antigéniques en cours de traitement.
L'in- vention est décrite ci-après à titre d'illustration en se référant particulièrement à des vaccins finis et à leur production, nais ilva de soi qu'elle concerne de façon générale les matériels virulents stobilisés, snns se limiter aux vaccins finis,
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Le lactobionate de calcium est relativement peu onéreux et disponible dans le commerce sous une forme très pure. Les qualités techniques sont satisfaisantes, mais les qualités pures donnant à peu près l'analyse typique suivante ou une analyse meilleure sont préférées.
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<tb>
Calcium <SEP> 4,94 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> Humidité <SEP> 5,14 <SEP> %
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> Substances
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<tb> rédactrices
<tb>
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<tb> totales <SEP> sous
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<tb> forme <SEP> de
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<tb> lactose <SEP> H20 <SEP> 0,27 <SEP> % <SEP>
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<tb> Métaux <SEP> lourde <SEP> 10 <SEP> ppM
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<tb>
<tb>
<tb>
<tb> solution
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<tb>
<tb>
<tb> à <SEP> 10 <SEP> % <SEP> 6,5-7,5
<tb>
La proportion de lactobionate de calcium à incorporer aux produite virulents pour les stabiliser est variable suivant la nature du vaccin, l'instabilité relative de l'antigène et d'aubes facteurs analogues.
Avantageusement, le lactobionate de calcium sous forme d'une poudre sèche ou d'une solution aqueuse diluée est incorporée au matériel virulent fluide, sous agitation à basse température, pour obtenir une suspension ou une solution homogène. En général, on utilise uno concentration d'au moins environ 0,1% (poids/volume). Pour atteindre le maximum de sta- bilité, on préfère une concentration de 1% (poids/volume).
Des concentrations atteignant 5% (poids/volume) sont également sntis- faisantes, et il entre dans le cadre de l'invention d'utiliser des concentrations élevées, bien que l'effet de stabilisation re- quis devienne de moins en moins net lorsque la concentration augmente.Les produits stabilisés secs sont préparés avantageuse- ment à partir des produits fluides ci-dessus par les procédés de dessiccation classiques comme la lyophilisation.
Sur base pon- dérale, ces produits non aqueux ont une concentration en lacto- bionate de calcium qui est élevée par rapport à la teneur en solides totaux. L'invention, comme indiqué, concerne non seule- ment les matériels virulents aqueux fluides et les vaccins,
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mais également les produits non aqueux ce qui peuvent être préparés par dessiccation de ces produits fluides.
Pour augmenter l'effet antigénique, on peut éventuelle- ment suivant l'invention ajouter aux produits de faibles quanti- tés de protéines ou de polypeptides compatibles du point de vue immunologique comme de l'albumine humaine, de la protamine, de la peptone, etc. Par exemple, on peut utiliser environ 1à 5% (poids/volume) de protéine ou de polypeptide.
Suivant une nutre forme de réalisation de l'invention s'appliquant à la desidention de produite fluides et assurant non seulement une plus grande commodité de manipulation mais également un meilleur effet de stabilisation, un faible pour- centage [par exemple d'environ 2 à 10% (poids/volume), et de préférence d'environ 5% (poids/volume)] de lactose est incor- pore, outre le lactobionate de calcium, au produit fluide avant la dessiccation. La dessiccation est ainsi facilitée parce que le lactose constitue avantageusement un support compatible et manipulable. En outre, les produits secs contenant du lactose ont en général une meilleure stabilité du potentiel antigénique que les produits n'en contenant pas.
De façon classique, les produits suivant l'invention sont trnités dans des conditions aseptiques, en utilisant des consti- tuants ayant subi au préalable la stérilisation bactériologique.
La stérilité en cours de conservation petit être entretenue en ajoutant un germicide compatible avec les antigènes, comme le t.himérosal ou le chlorure de benzéthonium. Toutefois, pour des produits qui sont amenés à l'état non nqueux sec, l'utilisation d'un germicide ou agent stérilisant n'est habituellement pas nécessaire. Sauf indication contraire, les substances antigel- ques sont de préférence et dans la mesure du possible maintenues froides (environ 4 C) pendant la production.
L'invention est illustrée sans être limitée par les exemples suivants. Les concentrations des constituants sont
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données en pour-cent en poids par volume sauf indication con- traire.
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.I&J...- a) Préparation de cellules de culture de tissu
Des cellules de culture de tissu, préparées à partir d'oeufs de poule embryonnés do 11 à 12 Jours en utilisant dois
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procédé classiques de trypsinisat1on, sont mises en culture dans des flacons immobiles (28 onces soit 829 OIT1') pendant 3 à 5 jours.
Le milieu de croissance des cellules est le milieu synthétique No.199, Les couches monocellulaires sont lavées
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deux fols avec 100 am du milieu 199 à pH z-7,6 contenant 1 mierogramme de streptomycine. b) Inaci;lr.t3o,"c?,e",.e7.1v,1 Après lavage, 50 crp d'une solution contenant 1000 à 10.COO doses infectieuses 50 pour culture de tissu (TCID,,) de virus de la rougeole atténué:; de souches Edmonston en sus- pension dans le milieu 199 sont ajoutés dans chaque flacon de culture do tissu, La souche de virus peut être obtenue.de
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Rerearch Division of Infect1ou8 Visesses, The Childron's Medionl Center, Boston, mais. voir Am..e..rJ.r; ournl 2'- EublIQ floal-fo 47:275-282 (1957).
Connecticut eâlc1no, 23:561-567 (1959).
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c) Incubez on
Les cultures inoculées sont incubées à l'état immobile à 32 C jusqu'à ce qu'environ 2/3 à 3/3 de la couche unique de cellule accuse un effet cytopnthologique habituellement 7 à
14 jours aprs l'inoculation, moment auquel le rendement en virus est optimum.
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d) {l<col te
Les pellicules de cellule des culturef incubées sont mises en suspension dans les fluides et rassemblées dans un récipient refroidi. La suspension obtenue est centrifugée à
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4 C pendant 10 minutes h 1500 tours/minute.
L fluide sur- @
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nageant est séparé des débris de cellule sédimentés et passé travers un filtre (verre fritte moyen) tandis qu'il est encore froide pour éliminer les débris de cellule restants éventuels, Le liquide surnageant convient comme vaccin de la rougeole, mais son potentiel antigénique est relativement instable lorsqu'il est conservé longtemps et soumis à des cycles successifs de con- gélation et décongélation, à la lyophilisation, etc.
On trouvera ci-après une description de la production de vaccins stabilises de la rougeole à partir de matériels anti-
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g{.iques de départ préparés ppr le procédé ci-dessus. On donne également une comparaison du comportement antigr-n1que des vaccins do la rougeole stabilisés et non stabilisée lorsqu'ils sont sou- mis à diverses conditions de congélation, de dessiccation et de conservation.
Les vaccins non stabilisés utilisés sont les fluides surnageants du type obtenu par le procédé 1 d), et
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appelés ci-après t:z4insn et les mimes liquides additionnés d'albumine humaine (1,) appelés ci-après "témoins avec albumine"* 'ac cin 6. ¯ jstnMs s.
Des aliquotes du fluide surnageant virulent de la rou- geole obtenus par le procédé 1 d) sont mélangée respectivement
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avec du lactoblonate de calcium (1; qualité ! t pur,8hef",s.d Cl!IJ'''1icol Plu... Sheffield Ferras Ca., inc,0 Norvich, Conn<)j( du lactobionate de calcium (1% et 5) et de l'albumine humaine 42) et avec du Isctobionnte de calcium 1^') de l'albumine hrmaine 1 s du lactose (5,n. dans chaque cas, les constituants sont mélangé, intimement à
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froid pour obtenir du liquide homogène.
Les produits obtenu* ont la composition SU1Vl'Ate, sur la base du volume total du vaccin.
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Vaccin As lactobionate de calcium (1%) Vaccin Etf lactobionate de calcium (1%) albumine humaine 1% Vaccin et lnctobionnte de calcium (5 ) ulbuuine humaine 1%
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Vaccin D: lactobionate de calcium (1;) albunine hwnnine (1%) lactose 5%)
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La résistance à la perte du pouvoir antigénique pen- dpnt la lyophilisation est établie en soamettnnt les vaccins C et Ds ot un vaccin témoin à un prue4de do lyophilisation classique ooC; appareil Virt1!, modela Dito. P-.''4-PRe Virtis Company, lno,; Gardiner, N.Y, Le potentiel avant et après séchage, en termes de titre infec- tieux.. est déterminé pour chaque vaccin.
La extermination eot exécutée en inoculant des couches uniques de culture de cel- lules d'embryon de poulet à l'aide d'une aliquote des vaccins respectifs ,et en observant l'évolution de la formation de pla- ques comme décrit par Dulbecco et collaborateurs, J.Exper. Med., 99:167, 1954. Le titre infectieux, qui est en relation directe
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avec le potentiel ant1gt.nique de l'agent inoculant, est donn en unités de formation de plaques (UI'Pi par centimètre cube do vaccin. On obtient les résultats suivants :
TABLEAU i
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<tb> Titre <SEP> infectieux <SEP> UFP/cm3
<tb>
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3LS±SAû l)rrs6ché .9,2he -
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<tb> Témoin <SEP> avec <SEP> albumine <SEP> 33110 <SEP> 5888
<tb>
<tb> Vaccin <SEP> C <SEP> 10000 <SEP> 8511
<tb>
<tb> Vaccin <SEP> D <SEP> 19950 <SEP> 18200
<tb>
Ces résultats montrent que les vaccins de la rougeole stabilises C et D ne subissent qu'une légère perte de potentiel
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anti)S''nique au cours de la dessiccation, mais que le vaccin témoin sans stabilisant perd plus ae 80% de son potentiel.
L'effet do stabilisation dans les conditions de la des- siccation (sublimation sous vide) et de la conservation pendant 7 jours est également montré. A cette fin, divers lots de vaccin B et un témoin avec albumine sont exposas à diverses
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températures de dessiccation (aoc, - 40 C, et un intervalle
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de 0 à "40 C) et à des tenp<rturf8 de conservation (+ 15 et -80*C).
Le potentiel ant!gn1\lueJl en titre infectieux.. est déterminé au début et à la fin de chaque essai. On obtient les résultait suivants 1411, LMU
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t tre jJ1t1QU\JX ;W" (VP/C1J1)
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<tb> Temps <SEP> de <SEP> subli- <SEP> Temps <SEP> do <SEP> Témoin <SEP> avec <SEP> albumine <SEP> Vaccin <SEP> B
<tb>
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nation conservation Valeur Initinlei valeur lnt 8,913.000 tinles ¯¯¯¯¯¯¯¯ ###### 11\ T 1 1;.
S..OOQ...
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<tb> 0 <SEP> 15 <SEP> 5248 <SEP> 2.138.000
<tb>
<tb> 0 <SEP> -80 <SEP> 31620 <SEP> 2.951.000
<tb>
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-40 15 5248 1.2B8.000
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<tb> 40 <SEP> 80 <SEP> < <SEP> 5012 <SEP> 2.239.000
<tb>
<tb> 0 <SEP> -40 <SEP> 15 <SEP> < <SEP> 5012 <SEP> 1.693.000
<tb>
<tb> 0 <SEP> -40 <SEP> -80 <SEP> < <SEP> 5012 <SEP> 2.512.000
<tb>
Ces résultats montrent que le vaccin témoin perd plus de 99% de son potentiel initial dans tous les cas, par contre, ils montrent également qu'un vaccin stabilisé suivant l'invention conserve un potentiel significatif pendant la dessiccation et la conservation,
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La résistance à la perte du potentiel antig<5nique au cours des cycles de congélation et décongélation est aussi démon- trée.
A cette effet, du vaccin B et un témoin avec albumine sont
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successivement congelas à --7 C et décongelas à +37,!pG à 8 reprises. Le potentiel nntig/n1que de vaccins est déterminé avant le premier cycle et atrès les cycles 1, 2, 4. et 8 pour donner les résultats suivants:
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'" tL..,3..
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Iltre Inter. L1624 . CtIFEZra3) Cycles T1Uoin avec .CoRA''.c?nKIa9 .8..n&......... Vaccin 16.2?0.000 19.050.000 1â.90Ct 18.620.000 2 ll.?20.009 18.620.000
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<tb> 9.333.000 <SEP> 15.140.000
<tb>
<tb> 8 <SEP> 5.129.000 <SEP> 11.480.000
<tb>
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Ces résultats montrant qu'un vaccin suivant l'invention a une bonne stabilité aux cycles de congélation-décongélation. Ce vaccin et le vaccin témoin perdent progressivement de leur poten- tiel antigénique lorsque le nombre de cycles augmente, mais le vaccin suivant l'invention perd son potentiel en moyenne deux fois moins vite que le témoin. "
En outre, la résistance à la perte du potentiel anti- génique par conservation prolongée à 4 C est démontrée pour des produits sèches.
Les produits (vaccins de la rougeole et 8 et témoins) sont conservés après lyophilisation et essayés
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par intervalles pour en établir le potentiel Rnt1gn1.que.. ce qui donne les résultats suivants :
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lAËItË&ÏL-.
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fi tre infect eux úvt;P/C!U31 Durée de Témoin Vaccin A Vaccin B conservation prdseché prséch prdséché /seines) IQJD.Q. .?-.2..5.9.0........ 3162.
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<tb>
692
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> - <SEP> 3467
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 17 <SEP> < <SEP> 10- <SEP> 3800
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 19 <SEP> - <SEP> 870
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 28 <SEP> - <SEP> 646 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 40- <SEP> - <SEP> 3310
<tb>
Ces résultats montrent qu'un vaccin témoin ne contenant pas le stabilisant perd sensiblement tout son potentiel antigé- nique après 4, mois de conservation, tandis que des vaccins suivant l'invention conservent un potentiel antagonique signi- ficatif beaucoup plus longtemps.
La résistance à la perte du potentiel antigénique est autre démontrée par une/expérience,, dans le cas d'un vaccin congèle, conservé et comparé avec un vaccin témoin. On utilise deux tem- pératures de congélation, les résultats étant les suivants:
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TABEBAB. 5.
Titre - infectieux à inteyyglles {UFP/CQ3)
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<tb> Température <SEP> de <SEP> Température <SEP> de <SEP> Vaccin <SEP> témoin <SEP> Vaccin <SEP> B
<tb> congélation <SEP> conservation
<tb>
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congélation cotation 9. 1 se::1"l± mois 0 1 semaine 1 MI ai ¯20 -40 10.230.000 3.162.COO 2.630.000 14.790.000 5.012.000 1Q.000.000 -65 -4Q 12.590.000 794.300 631.000 14.450.000 17-380-WO 15.850.000
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Ces résultats montrent que la vaccin témoin non stabilisé conservé à basse température subit une perte importante de son
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pouvoir antigt-n1que, mais que dans les mêmes conditions le vaccin suivant l'invention conserve, dans les limites des erreurs expé- rimentales, son potentiel antagonique initial.
Les vaccins de rougeole stabilisas obtenus convie
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décrit peuvent tre utilisas directement pour cont4rer l"immuni- té. Un produit préféré est un fluide de culture de rougeole sur tissu et exempt de cellules, additionna de 1% de lactobionte de calcium et de 1% d'albumine humaine puis lyophilisé et conditionna
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aseptiquement en ampoules, en dose unitaires assurant un potentiel minimum de 1000 UFP par ampoule. Un tel produit ayant une bonne stabilité et susceptible dadinistretian npr4o reconstitution avec de l'eau s'est avéré chimiquement efficace.
Le procédé ci-dessus peut être appliqua à la stabilisa- tion d'autres vaccins dérivant d'autres matériels virulents pour vaccins.. Par exemple, au lieu du vaccin pour la rougeole, on peut utiliser un vaccin de virus des oreillons inactivés (100 unités d'agglutination de cellules de poulet (ACP) par cm3) contenant
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du thimérosal (1:10.000). Spécifiquement, le lactobionate de calcium (1,) et l'albumine humaine (1%) sont ajoutés à ce vaccin et le mélange est agite à froid pour obtenir une solution homogène.
Le solution est conservée à 4 C et conditionnée au moment opportun en ampoules pour la dispensation.
EXEMPLE 2.
On prépare de la façon suivante un fluide surnageant et exempt de cellules provenant de la culture du virus de la vaccine sur tissus: en appliquant les procédés classiques de
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tryp.ginisation, on prépare des cultures en cuuche unique de 7 jours de membranes embryonnaires de bovidé. Le milieu synthé- tique Nô, 199 est ajouté aux cultures et chaque culture est inoculée a l'aide de 50 em.3 d'une suspension contenant du virus de la vaccine (1000 TCID50" Les cultures inoculées sont incubées
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pendant 4à 7 jours et les fluides sont recueilli., rassemblée et
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N1i tri rURt<e.
Pour déterminer l'effet de stabilisation du lactobionate de calcium sur le vaccin du virus de la vaccin*, une aliquote du
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fluide mtrns'el1nt est conservée comme témoin et une autre aliquote ert stabilisée pnr m'lnge avec du lectoL1onAte de calcium à la concentration de 1%. Le vaccin stabilisa et le vaccin témoin sont congelas et desséchas dans un apparuil Vistis.
Le potentiel
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antig(n1.que, exprimé en titre infectieux est déterminé1 avant et après la lyophilisation, ce qui donne les rêsultatu 8UlvAnts Titre, 1qfc1x (/çmt
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<tb> avant <SEP> lyophill <SEP> après <SEP> lyophili-
<tb>
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Yjioo " C! 1io.n
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<tb> Vaccin <SEP> témoin <SEP> 3.981.000 <SEP> 1.!Sa,.000
<tb>
<tb> Vaccin <SEP> stabilisé <SEP> pnr <SEP> 4.169.000 <SEP> 5.000.000+
<tb> 1% <SEP> de <SEP> lactobionate
<tb> de <SEP> cnlcium..
<tb>
Ces résultats montrent que le vaccin témoin non stabilisé perd plus de la moitié de son potentiel antigénique pendant la lyophilisation, pans les cernes conditions, le vaccin stabilisé par du lactobionate de calcium conserve son potentiel antigé- nique sans perte apparente.
Le procédé ci-dessus peut s'appliquer à la stabilisa- tion d'autres matériels antagoniques. Par exemple, au lieu du fluide du virus de la vaccine, on peut utiliser un milieu aqueux contenant l'antigène du virus poliomyélitique, par exemple le filtrat de culture de tissu de reins de singe contenant un ou
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plusieurs virus pollomyéti tiques des types 1, 2 ou 3 tués en partie par traitement par du formaldihyde et en partie par expo&ition à la lumière ultraviolette (voir brevet anglais )a.a..3 on peut utiliser égaloient le produit de la contre- fugation du fluide de culture amniotique de l'embryon de poulet contenant du virus des oreillons ayant un titre infectieux
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(hémagglutination) de .''*.
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Bien que divers Mode? et détails d'exécution aient été décrits pour illustrer l'invention, il va de soi que celle-ci est susceptible de nombreuses variantes et modifications sans sertir de son cadre,
REVENDICATIONS- --------------
1,- Matériel virulent antigénique fluide stabilisé, caractérisé en ce qu'il comprend au moins 0,1% en poids de lacto- bionate de calcium.
2.- Vaccin, fluide stabilisé caractérisé en ce qu'il contient au moins 0,1% en poids de lactobionate de calcium.
3.- Matériel virulent antigénique fluide stabilisé, caractérisé en ce qu'il contient au moins 0,1% en poids de lactobionats de calcium et 2 à 10% en poids de lactose.
4.- Vaccin stable sec préparé par lyophilisation d'un matériel virulent antigénique fluide caractérisé en ce qu'il contient au aoins 0,1% en poids de lactobionate de calcium et 2 à 10% en poids de lactose,
5;- Vaccin de la rougeole stable et sec, préparé par lyophilisation d'un fluide de culture de rougeole exempt de cellules, caractérisé en ce qu'il contient 1% en poids de lacto- bionate de calcium et . 1% en poids d'albumine humaine,
6.- procédé de stabilisation de matériels virulents antigéniques instables, caractérisé en ce qu'on incorpore à un matériel virulent antigénique fluide au moins 0,1% en poids de lactobionate de calcium.
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Antigen! stabilizers and methods of preparing them.
The present invention relates to improvements to the antigens of viruses such as virus vaccina, and methods of preparing proprietary materials. More particularly, the invention relates to antigenic materials. viruses whose antigenic power has increased stability.
Since virulent commercial materials generally tend to lose their antigenic potential for storage, it has been proposed to incorporate a stabilizer therein to maintain or stabilize the antigenic potential. Various stabilizers have been described for this purpose.
In the case of vaccine production, the problem is compounded by the fact that it may be necessary to resort to operations during which
<Desc / Clms Page number 2>
the vaccine is lyophilized to obtain a non-aqueous product,
EMI2.1
or simply quince, -. for rn11f1.r a condition of maximum stability and then thawed at the opportune moment to give a fluid product for filling it in ampoules, In the usual case of industrial manufacture where the quantity of vaccine prepared is greater than the quantity required for the condition. Immediately note the excess vaccine should be frozen again, then stored until ready to re-package.
Ment of the vaccine. This inevitably results in a number
EMI2.2
cycles of con (lt: lon-d {cot1ation) having an adverse effect in the absence of a suitable stabilizer and leading to a prior loss of antigenic potential. In this connection, it is known that high salt concretions have a deleterious effect on the antigenic potency.
Therefore, the use of sala as a stabilizer is contraindicated. The self-concentration is a particular problem in desiccation, because it increases progressively during the removal of the water from the aqueous product and. . thus increasingly exposes the antagonistic factors to a possible deterioration. In addition,
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addition of salts a. i, ae .a temperature at which a fluid can be brought to the solid state.
Hygroscopic materials are also contraindicated, being that in concentra- '
EMI2.4
High concentration they produce syrups which are difficult to pulp, especially during desiccation.
The object of the present invention is to provide virulent materials the antigenic potential of which has a stable stability.
EMI2.5
increased especially PUl1., .. nt lyophilization, preservation or prolonged treatment. {. 19.
It also aims to provide virulent fluid materials that can be subjected to freezing
EMI2.6
and excessive thawing without appreciable loss of anticnic potential.
<Desc / Clms Page number 3>
It also aims to provide stabilized vaccines.
It also aims to provide virulently fluid materials which can be transformed into non-hygroscopic solids without the formation of syrups and which, after reconstitution with water or following another treatment, can be used as immunogenic or prophylactic vaccines.
Another object of the invention is to provide means making it possible to stabilize virulent materials.
These and other objects of the invention which emerge, as well as its peculiarities and the advantages which it provides from its description below, are achieved with the aid of virus antigens comprising a minor proportion of salt called laoto- calcium bionate. Advantageously, the products according to the invention containing calcium lactobionate have a stable antigenic potential and retain their desired potential for a long time.
Since the presence of salts added to vaccines and antigenic materials is usually undesirable, it is surprising that the products according to the invention containing an added salt, namely calcium lactobionate, are far superior in stability. their antigenic potential to similar products not containing calcium lactobionate.
In addition, the fluid antigens of the invention can be brought to the state of dry powdery flakes, without the formation of difficult-to-handle syrups or other forms; hygroscopic. It is generally necessary to freeze many varieties of vaccines and to keep them at an extremely low temperature to obtain maximum storage stability, but the products of the invention have the advantage ...
Unexpectedly, they can be stored frozen for a long time at a significantly higher temperature, without appreciable loss of their antigenic potential, For example, the ordinary measles vaccine, which normally contains a low
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percentage of calcium chloride, should be maintained at temperatures below about -60 C; at a higher temperature the loss of antigenicity is rapid and essentially complete. On the contrary, the measles vaccine according to the present invention can be advantageously stored at temperatures which may rise to about -20 ° C .; and at these higher temperatures, maximum stability is achieved.
In addition, the products of the invention can be subjected to successive freezing-thawing cycles without disturbing loss of antigenic potential.
The invention applies generally to virulent antigenic materials and more particularly to virulent materials in dry or aqueous form, which are vaccines which can be used for the production of vaccines or antisera.
Thus, the invention applies to virus vaccines generally comprising live attenuated virus vaccines and killed virus vaccines. Examples of the many vaccines to which the invention applies are the vaccines for poliomyelitis, measles, infectious hepatitis,. yellow fever, mumps, rabies and smallpox. These vaccines which for the purposes of the invention may not be stabilized or may be stabilized in part, are obtained by conventional procedures. The invention is also applicable to the stabilization of starting materials for virus vaccines, such as filtration and centrifugation products of virus cultures, etc., vaccines for viruses in preparation, vaccine stocks and other antigenic materials being processed.
The invention is described below by way of illustration with particular reference to finished vaccines and to their production, but it goes without saying that it generally relates to stobilized virulent materials, and not to be limited to finished vaccines. ,
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Calcium lactobionate is relatively inexpensive and commercially available in a very pure form. Technical grades are satisfactory, but pure grades giving approximately the following typical analysis or better analysis are preferred.
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<tb>
Calcium <SEP> 4.94 <SEP>%
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> Humidity <SEP> 5.14 <SEP>%
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<tb> Substances
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<tb> lactose <SEP> H20 <SEP> 0.27 <SEP>% <SEP>
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<tb> Metals <SEP> heavy <SEP> 10 <SEP> ppM
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<tb> solution
<tb>
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<tb>
<tb> to <SEP> 10 <SEP>% <SEP> 6.5-7.5
<tb>
The proportion of calcium lactobionate to be incorporated into the virulent products in order to stabilize them is variable depending on the nature of the vaccine, the relative instability of the antigen and similar factors.
Advantageously, the calcium lactobionate in the form of a dry powder or of a dilute aqueous solution is incorporated into the fluid virulent material, with stirring at low temperature, to obtain a suspension or a homogeneous solution. In general, a concentration of at least about 0.1% (w / v) is used. To achieve maximum stability, a concentration of 1% (w / v) is preferred.
Concentrations up to 5% (w / v) are also useful, and it is within the scope of the invention to use high concentrations, although the stabilizing effect required becomes less and less marked as the stabilization effect becomes less pronounced. the concentration increases. The stabilized dry products are advantageously prepared from the above flowable products by conventional desiccation methods such as lyophilization.
On a weight basis, these non-aqueous products have a calcium lactobionate concentration which is high relative to the total solids content. The invention, as stated, relates not only to fluid aqueous virulent materials and vaccines,
<Desc / Clms Page number 6>
but also non-aqueous products which can be prepared by drying these fluid products.
In order to increase the antigenic effect, it is optionally possible according to the invention to add to the products small amounts of immunologically compatible proteins or polypeptides such as human albumin, protamine, peptone, etc. etc. For example, about 1 to 5% (w / v) protein or polypeptide can be used.
According to another embodiment of the invention applying to the desidention of fluid products and ensuring not only greater convenience of handling but also a better stabilizing effect, a low percentage [for example from about 2 to 10% (w / v), and preferably about 5% (w / v), lactose is incorporated, besides calcium lactobionate, in the fluid prior to drying. The desiccation is thus facilitated because the lactose advantageously constitutes a compatible and manipulable support. In addition, dry products containing lactose generally have better stability of the antigenic potential than products without lactose.
Conventionally, the products according to the invention are treated under aseptic conditions, using constituents which have previously undergone bacteriological sterilization.
Preserving sterility can be maintained by adding a germicide compatible with the antigens, such as t.himerosal or benzethonium chloride. However, for products which are brought to a dry non-aqueous state, the use of a germicide or sterilizing agent is usually not necessary. Unless otherwise specified, antifreeze substances are preferably and as far as possible kept cool (about 4 ° C) during production.
The invention is illustrated without being limited by the following examples. The concentrations of the constituents are
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given in percent by weight per volume unless otherwise indicated.
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.I & J ...- a) Preparation of tissue culture cells
Tissue culture cells prepared from 11-12 day old embryonated chicken eggs using
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conventional methods of trypsinization, are cultured in immobile flasks (28 ounces or 829 OIT1 ') for 3 to 5 days.
The cell growth medium is synthetic medium No.199, Single-cell layers are washed
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two fols with 100 am of medium 199 at pH z-7.6 containing 1 mierogram of streptomycin. b) Inaci; lr.t3o, "c?, e",. e7.1v, 1 After washing, 50 crp of a solution containing 1000 to 10.COO 50 infectious doses for tissue culture (TCID ,,) of virus of measles attenuated :; of Edmonston strains suspended in medium 199 are added to each tissue culture flask. The virus strain can be obtained.
EMI7.4
Rerearch Division of Infect1ou8 Visesses, The Childron's Medionl Center, Boston, but. see Am..e..rJ.r; ournl 2'- EublIQ floal-fo 47: 275-282 (1957).
Connecticut eâlc1no, 23: 561-567 (1959).
EMI7.5
c) Incubate on
Inoculated cultures are incubated in a still state at 32 ° C until about 2/3 to 3/3 of the single cell layer shows a cytopnthological effect usually 7 to
14 days after inoculation when virus yield is optimum.
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d) {l <col te
Cell films from incubated cultures are suspended in fluids and pooled in a cooled container. The suspension obtained is centrifuged at
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4 C for 10 minutes h 1500 revolutions / minute.
L fluid over- @
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swimming pool is separated from the sedimented cell debris and passed through a filter (medium sintered glass) while still cool to remove any remaining cell debris. The supernatant is suitable as a measles vaccine, but its antigenic potential is relatively unstable when stored for a long time and subjected to successive cycles of freezing and thawing, freeze drying, etc.
The following is a description of the production of stabilized measles vaccines from anti-
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Starting gics prepared by the above process. A comparison is also given of the antigrinal behavior of stabilized and unstabilized measles vaccines when subjected to various freezing, drying and storage conditions.
The unstabilized vaccines used are the supernatant fluids of the type obtained by method 1 d), and
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hereinafter called t: z4insn and the liquid mimes supplemented with human albumin (1,) called hereinafter "controls with albumin" * 'ac cin 6. ¯ jstnMs s.
Aliquots of the virulent mullet supernatant obtained by method 1 d) are mixed respectively
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with calcium lactoblonate (1; quality! t pure, 8hef ", sd Cl! IJ '' '1icol Plu ... Sheffield Ferras Ca., inc, 0 Norvich, Conn <) j (calcium lactobionate (1% and 5) and human albumin 42) and with calcium isolate 1 ^ ') human albumin 1 s lactose (5, n. in each case the constituents are mixed, intimately with
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cold to obtain a homogeneous liquid.
The products obtained * have the composition SU1Vl'Ate, based on the total volume of the vaccine.
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Vaccine As calcium lactobionate (1%) Vaccine Etf calcium lactobionate (1%) human albumin 1% Vaccine and calcium lnctobionnte (5) human ulbuine 1%
<Desc / Clms Page number 9>
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Vaccine D: calcium lactobionate (1;) albunin hwnnine (1%) lactose 5%)
EMI9.2
Resistance to loss of antigenicity during lyophilization is established by combining vaccines C and Ds and a control vaccine with a conventional ooC lyophilization procedure; Virt1 device !, modela Dito. P -. '' 4-PRe Virtis Company, lno ,; Gardiner, N.Y, The potential before and after drying, in terms of infection titer, is determined for each vaccine.
The extermination was performed by inoculating single layers of chicken embryo cell culture with an aliquot of the respective vaccines, and observing the course of plaque formation as described by Dulbecco et al. collaborators, J. Exper. Med., 99: 167, 1954. The infectious title, which is in direct relation
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with the antigenic potential of the inoculating agent, is given in units of plaque formation (PIU per cubic centimeter of vaccine. The following results are obtained:
TABLE i
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<tb> Title <SEP> infectious <SEP> UFP / cm3
<tb>
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3LS ± SAû l) rrs6ché .9,2he -
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<tb> Witness <SEP> with <SEP> albumin <SEP> 33110 <SEP> 5888
<tb>
<tb> Vaccine <SEP> C <SEP> 10000 <SEP> 8511
<tb>
<tb> Vaccine <SEP> D <SEP> 19950 <SEP> 18200
<tb>
These results show that stabilized measles vaccines C and D undergo only a slight loss of potential.
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anti) Bites during desiccation, but the control vaccine without stabilizer loses more than 80% of its potential.
The effect of stabilization under the conditions of drying (vacuum sublimation) and storage for 7 days is also shown. To this end, various batches of vaccine B and a control with albumin are exposed to various
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drying temperatures (aoc, - 40 C, and an interval
<Desc / Clms Page number 10>
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from 0 to "40 C) and to conservation tenp <rturf8 (+ 15 and -80 ° C).
The ant! Gn1 \ lueJl infectious titer potential is determined at the start and at the end of each test. The following results are obtained 1411, LMU
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t be jJ1t1QU \ JX; W "(VP / C1J1)
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<tb> Time <SEP> of <SEP> subli- <SEP> Time <SEP> do <SEP> Control <SEP> with <SEP> albumin <SEP> Vaccine <SEP> B
<tb>
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nation conservation Initinlei value lnt value 8,913,000 tinles ¯¯¯¯¯¯¯¯ ###### 11 \ T 1 1 ;.
S..OOQ ...
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<tb> 0 <SEP> 15 <SEP> 5248 <SEP> 2.138.000
<tb>
<tb> 0 <SEP> -80 <SEP> 31620 <SEP> 2.951.000
<tb>
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-40 15 5248 1.2B8.000
EMI10.7
<tb> 40 <SEP> 80 <SEP> <<SEP> 5012 <SEP> 2.239.000
<tb>
<tb> 0 <SEP> -40 <SEP> 15 <SEP> <<SEP> 5012 <SEP> 1.693.000
<tb>
<tb> 0 <SEP> -40 <SEP> -80 <SEP> <<SEP> 5012 <SEP> 2.512.000
<tb>
These results show that the control vaccine loses more than 99% of its initial potential in all cases, on the other hand, they also show that a stabilized vaccine according to the invention retains a significant potential during drying and storage,
EMI10.8
Resistance to loss of antigenic potential during freezing and thawing cycles is also demonstrated.
For this purpose, vaccine B and a control with albumin are
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successively freezing at --7 C and thawing at +37,! pG 8 times. The nntig / n1c potential of vaccines is determined before the first cycle and after cycles 1, 2, 4. and 8 to give the following results:
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'"tL .., 3 ..
EMI10.11
Iltre Inter. L1624. CtIFEZra3) T1Uoin cycles with .CoRA ''. C? NKIa9 .8..n & ......... Vaccine 16.2? 0.000 19.050.000 1â.90Ct 18.620.000 2 ll.?20.009 18.620.000
EMI10.12
<tb> 9.333.000 <SEP> 15.140.000
<tb>
<tb> 8 <SEP> 5.129.000 <SEP> 11.480.000
<tb>
<Desc / Clms Page number 11>
These results show that a vaccine according to the invention has good stability in freezing-thawing cycles. This vaccine and the control vaccine gradually lose their antigenic potential as the number of cycles increases, but the vaccine according to the invention loses its potential on average half as quickly as the control. "
In addition, resistance to loss of antigenic potential by prolonged storage at 4 ° C has been demonstrated for dry products.
The products (measles and 8 vaccines and controls) are stored after lyophilization and tested
EMI11.1
at intervals to establish the potential Rnt1gn1.que .. which gives the following results:
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LAËItË & ÏL-.
EMI11.3
fi be infected úvt; P / C! U31 Duration of Control Vaccine A Vaccine B storage pre-dried pre-dried pre-dried / seines) IQJD.Q. .? -. 2..5.9.0 ........ 3162.
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<tb>
692
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> - <SEP> 3467
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 9 <SEP> 50
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 17 <SEP> <<SEP> 10- <SEP> 3800
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 19 <SEP> - <SEP> 870
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 28 <SEP> - <SEP> 646 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 40- <SEP> - <SEP> 3310
<tb>
These results show that a control vaccine not containing the stabilizer loses substantially all of its antigenic potential after storage for 4 months, while vaccines according to the invention retain significant antagonistic potential much longer.
Resistance to loss of antigenic potential is further demonstrated by experience in the case of a frozen vaccine stored and compared with a control vaccine. Two freezing temperatures are used, the results being as follows:
<Desc / Clms Page number 12>
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TABEBAB. 5.
Title - infectious to inteyyglles {UFP / CQ3)
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<tb> Temperature <SEP> of <SEP> Temperature <SEP> of <SEP> Vaccine <SEP> control <SEP> Vaccine <SEP> B
<tb> freezing <SEP> conservation
<tb>
EMI12.3
freezing quotation 9. 1 se :: 1 "l ± month 0 1 week 1 MI ai ¯20 -40 10.230.000 3.162.COO 2.630.000 14.790.000 5.012.000 1Q.000.000 -65 -4Q 12.590.000 794.300 631.000 14.450.000 17-380-WO 15.850.000
<Desc / Clms Page number 13>
These results show that the unstabilized control vaccine stored at low temperature undergoes a significant loss of sound.
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antigenic power, but that under the same conditions the vaccine according to the invention retains, within the limits of experimental errors, its initial antagonistic potential.
The stabilized measles vaccines obtained invite
EMI13.2
described can be used directly to control immunity. A preferred product is a measles tissue culture fluid free of cells, added with 1% calcium lactobiont and 1% human albumin then lyophilized and conditioned.
EMI13.3
aseptically in ampoules, in unit doses ensuring a minimum potential of 1000 PFU per ampoule. Such a product having good stability and capable of adinistretian npr4o reconstitution with water has been shown to be chemically effective.
The above method can be applied to stabilize other vaccines derived from other virulent vaccine materials. For example, instead of the measles vaccine, an inactivated mumps virus vaccine (100 chicken cell agglutination units (PCA) per cm3) containing
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thimerosal (1: 10,000). Specifically, calcium lactobionate (1,) and human albumin (1%) are added to this vaccine and the mixture is stirred cold to obtain a homogeneous solution.
The solution is stored at 4 ° C and packaged at the appropriate time in ampoules for dispensing.
EXAMPLE 2.
A supernatant and cell-free fluid from the tissue culture of vaccinia virus is prepared as follows: by applying the standard methods of
EMI13.5
Tryp.ginization, single 7-day cuvette cultures of bovid embryonic membranes are prepared. Synthetic medium No.199 is added to the cultures and each culture is inoculated with 50 em. 3 of a suspension containing vaccinia virus (1000 TCID50 "The inoculated cultures are incubated.
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for 4-7 days and the fluids are collected, collected and
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N1i sort rURt <e.
To determine the stabilizing effect of calcium lactobionate on the vaccine virus *, an aliquot of the
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The mixed fluid is kept as a control and another aliquot is stabilized by mixing with calcium lectolonAte at a concentration of 1%. The stabilized vaccine and the control vaccine are frozen and dried in a Vistis apparatus.
The potential
EMI14.3
antig (n1.que, expressed in infectious titer is determined1 before and after lyophilization, which gives the results 8UlvAnts Title, 1qfc1x (/ çmt
EMI14.4
<tb> before <SEP> lyophill <SEP> after <SEP> lyophili-
<tb>
EMI14.5
Yjioo "C! 1io.n
EMI14.6
<tb> Vaccine <SEP> control <SEP> 3.981.000 <SEP> 1.! Sa, .000
<tb>
<tb> Stabilized <SEP> vaccine <SEP> pnr <SEP> 4.169.000 <SEP> 5.000.000+
<tb> 1% <SEP> of <SEP> lactobionate
<tb> from <SEP> cnlcium ..
<tb>
These results show that the unstabilized control vaccine loses more than half of its antigenic potential during lyophilization, under dark circles, the vaccine stabilized by calcium lactobionate retains its antigenic potential without apparent loss.
The above method can be applied to the stabilization of other antagonistic materials. For example, instead of vaccinia virus fluid, an aqueous medium containing polio virus antigen can be used, for example, monkey kidney tissue culture filtrate containing one or more
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several pollomyetic viruses of types 1, 2 or 3 killed partly by treatment with formaldihyde and partly by exposure to ultraviolet light (see English patent) aa.3 one can also use the product of the counterfugation of the fluid of amniotic culture of the chick embryo containing mumps virus with an infectious titre
EMI14.8
(hemagglutination) of. '' *.
<Desc / Clms Page number 15>
Although various Fashion? and details of execution have been described to illustrate the invention, it goes without saying that the latter is capable of numerous variants and modifications without crimping its framework,
CLAIMS- --------------
1, - Stabilized fluid antigenic virulent material, characterized in that it comprises at least 0.1% by weight of calcium lactobionate.
2.- Vaccine, stabilized fluid characterized in that it contains at least 0.1% by weight of calcium lactobionate.
3.- Fluid stabilized virulent antigenic material, characterized in that it contains at least 0.1% by weight of calcium lactobionates and 2 to 10% by weight of lactose.
4.- Dry stable vaccine prepared by lyophilization of a virulent antigenic fluid material characterized in that it contains at least 0.1% by weight of calcium lactobionate and 2 to 10% by weight of lactose,
5. Stable and dry measles vaccine, prepared by lyophilization of a cell-free measles culture fluid, characterized in that it contains 1% by weight of calcium lactobionate and. 1% by weight of human albumin,
6. A method of stabilizing unstable antigenic virulent materials, characterized in that at least 0.1% by weight of calcium lactobionate is incorporated into a fluid antigenic virulent material.