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L'invention a pour objet des procédés de fermenta- tion pour l'obtention de nucléotides-5'. Plus particulière- ment, elle a pour objet des procédés visant à obtenir l'acide guanylique-5' en cultivant des bactéries dans des milieux pro- pres à la croissance de celles-ci.
Les nucléotides-5' tels que l'acide guanylique-5' et l'acide inosinique-5' sont des arômes utiles, en petites quantités, pour rehausser le goût des aliments, boissons et condiments. On a trouvé qu'il est possible d'obtenir ces nu- cléotides par dégradation enzymatique do l'acide ribonucléi- que. Toutefois, ce procéda ne convient pas particulièrement à la fabrication commerciale de nueléctides, car la matière première est coûteuse et les produits individuels sont diffi- ciles à isoler et à séparer. En conséquence, on a recherché d'autres méthodes plus appropriées à la préparation des nucléo- tides-5' et en particulier de l'acide guanylique-5',
L'un des buts de l'invention est d'indiquer un procédé de préparation de nucléotides-5' qui utilise des ma- tières premières peu coûteuses et facilement sccessibles.
Un autre but est d'indiquer un procédé de fabrication commerciale d'acide guanylique-5'. Un autre but est encore d'indiquer un procédé de fabrication commerçiale de l'acide adénylique-5'.
D'autres, buts apparaîtront dans la description détaillée de l'invention, donnée ci-après.
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Suivant l'invention, on a trouvé que de nouvelles souches de bactéries isolées de sources naturelles au moyen d'un procédé de triage utilisant une mutante avide de guanine, peuvent être cultivées dans des milieux appropriés et donner de l'acide guanylique-5', seul ou joint à d'autres nucléotids- 5'.
On a trouvé ainsi que les souches de bactéries productrices d'acide guanylique-5' et isolées par le procédé de triage de l'invention peuvent être cultivées sur des milieux appropriés contenant des sources d'azote, de carbone et de sels minéraux essentiels nécessaires au microorganisme pour produire de l'a- cide guanylique-5', isolément ou joint à d'autres nucléotides- 5' comme les acides adényliques-5',cytidylique-5', uridyli- que-$' et xanthylique-5', Dans la réalisation des pro:édés de l'invention, on peut utiliser différentes espèces de bacté- ries.
Par exemple on a trouvé que des souches de bactéries appartenant à l'ordre des eubactériales et à celui des pseudo- monadales, comme les souches de brévibactériacées, de bacil- lacées, d'entérobactériacées, de micrococcacées et de pseudo- monadacées isolées par le procédé de triage suivant l'inven- tion sont utiles dans la préparation de l'acide guanylique-5' et d'autres nucléotides-5' suivant l'invention.
Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ces bactéries particulières @ car toutes les espèces de bactéries que l'on peut isoler sui- vant le procédé de triage décrit, ainsi que leurs mutantes obtenues par l'action des rayons X, des rayons ultra-violets, etc., peuvent servir à produire de l'acide guanylique-5'et d'autres nucléotides-5'suivant l'invention. Ainsi, l'invention indiqua un procédé commode pour la préparation de l'acte* guanylique-5' et d'autres nucléotides-5' 4 'échelle commercia- le, à partir de matières premières peu coûteuses et facilement accessibles.
L'acide guanylique-5' et certains autres nucléo- tidës-5' sont utiles comme arômes et en outre ce sont d'impor- @ tante intermédiaires métaboliques; On peut facilement conver- tir l'acide adénylique-5' en acide inosinique-5' qui est
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un important composé aromatisant, en le traitant par l'acide nitreux ou par la déaminase adénylique.
Bien que l'on ait fait des recherches considéra. blés pour trouver des procédés de préparation de nucléotides par fermentation, il n'était pas connu, avant l'invention, d'accumuler l'acide guenylique-5' ou des mélanges de celui-ci et d'autres nucléotides-5'. On a trouvé qu'en isolant de sources naturelles des souches nouvelles de bactéries pré- sentant trois caractéristiques particulières, grâce au pro- cédé de triage de l'invention qui utilise une souche auxo- tropique avide de guanidine, et en cultivant ces miccoorga- nismos dans des milieux de culture appropriés, on peut obtenir l'acide guanylique-5',seul ou avec un ou plusieurs autres nucléotides-5'.
Les caractéristiques de ces souches de bactéries propres à servir dans le procédé nouveau sont les suivantes :
1) on accumule une grande quantité d'acide guany- lique-5' en cultivant les souches sur des milieux appropriés, et suivant la souche particulière de bactérie et le milieu utilisé, on peut obtenir concuremment un ou plusieurs autres nucléotides. Le fait que l'on obtienne des nucléotides-5' en cultivant ces souches de bactéries suggère que ces souches doivent avoir des systèmes de régulation métabolique parti. culière dans le processus de biosynthèse de purine. De plus on ne savait pas antérieurement qu'il était possible d'accu- muler à la fois l'acide guanylique-5' et l'acide adénylique- 5' en grandes quantités dans les conditions usuelles de cul. ture.
2) le fait que la guanine, l'adénine, et d'au- tres produits de dégradation des nucléotides-5' ne se trou- vent pas en quantités appréciables dans les bouillons donn @ pa.a culture des microorganismes, suggère que les nucléo- tides-5' fermés dans la cellule sont excrétés et s'accumu-
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lent dans le bouillon sans dégradation et que les cellules des souches isolées par les inventeurs n'opposent pas une barrière de perméabilité aux nucléotides. De façon gé- nérale, la perméabilité des microorganismes est très sélec- tive et les nucléosides et autres produits de dégradation des nucléotides sont relativement perméables alors que les nucléotides ne se sont pas.
En fait, on a signalé que les nucléosides et d'autres produits basiques de dégradation des nucléotides étaient excrétés hors des cellules. Cependant, dans le cas où l'on cultive les nouveaux microOrganismes de l'invention, on trouve que seules les nucléotides sont excrétés en assez grandes quantités.
3) le fait que l'acide guany?.ique-5' et les au- tres nucléotides-5' accumulés dans le bouillon ne soient pas dégradés dans une mesure notable indique que les nouvelles souches qui produisent l'acide guanylique-5' n'or,t pas d'ac- tion enzymatique sur les nucléotides accumulés.
C'est donc là une caractéristique importante des souches de l'invention*
Suivant une autre forme de réalisation de l'inven- tion, on a trouvé que l'on peut isoler de sources naturel- les les bactéries particulières propres à la production d'acide guanylique-5' suivant l'invention en utilisant une mutante de B. subtilis avide de guanine, de la façon suivantes avec les bactéries isolées, on inocule des milieux solides dans des boites de Pétri et on tue les colonies obtenues par irradiation à l'ultra-violet et on les couvre d'un mi- lieu solide contenant la mutante de B. subtilis avide de guanine mentionnée plus haut. Après la culture, on examine la zone de halo ou zone de croissance de la mutante.
La grandeur et 1* épaisseur du halo formé autour de la colonie de bactéries dépend de la quantité de dérivés de guanine produite par la bactérie particulière. Aussi, les souche* de bactéries productrices d'acide guanylique-5' qui conviennent
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rdail 1'tlon de l'inirention Dont chointes dtaprès la eraredour st S L épeiaaaur du halo formé autotir de la colo- nie de la Che "'"" trouvé que chaque souche tl par la têthode ci.-deaata accumule de grandes quan- tltés de auba ,nc8a absorbant les rayons ultra-violets dans Un milieu qui V"'"#1"' pluo de sources de mutante i..ieabla qui- n'en faut pour développer la culture dans des iniiieux A'6ré3,\,Iti a trouvé que les substances absorvant *< J-eyDM u3txa-vi' t a conr,,
ernent 1acide guanylLque contiennent de lucide guanylique- 'soit 1901(Mont -c...... nucléotides comme l'acide adénylique-5t. , facilement Isoler ces com- PO 48 du milieu de ###### les purifier suivant des ,11 Cmm"' A1M1> on a trouvé une procédé de bio a3rnthésa permettant de préparer 1acide guanylique-590 seul ou joint à d'être,
nucléotides.- tableau sui^vant don4e brèves explications sur certaines des principales carmctériqtiquen morphologi- que& des bouche* UtilO6 tYPiques Isolées auivant bzz
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EMI6.1
<tb> souche <SEP> forme <SEP> dea <SEP> spores <SEP> Colora- <SEP> Sou- <SEP> Forme <SEP> Spores <SEP> Colona-
<tb>
<tb> n <SEP> cellu- <SEP> tion <SEP> che <SEP> des <SEP> tion
<tb>
EMI6.2
les Ctîm t cel- Gram Iules ¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI6.3
<tb> 0 <SEP> 103 <SEP> bâtonnets <SEP> - <SEP> - <SEP> G <SEP> 1202 <SEP> bâton- <SEP> - <SEP>
<tb>
<tb> nets
<tb>
EMI6.4
G 208 Il - - G 1632 " 0443 " ; - G 1956 M G 826 \ - G 1959 " 0 2262 Il i - - G 2282 w G 408 If 1 - + G 296 " -t- + G 409 M + G 493 z 1......
G 416 h + G 549 " + # G 425 t1! - ... G 613 + # G 478 If - + G 628 + it Q 505 " 1... + 0 630 " + 1 G 620 + G 849 " + + Q 845 " - + G 2293 * + + G 847 " 1...... G 172 cocci + G 848 ni'" + G 418 " + G 1958 " - t G 629 " - + G 105 " 1 + + G 1288 # - + G 393 8t ! 1"'''' G 2558 u - + G 395 ..,...... G 2833 - +
D'après la forme cellulaire, la coloration Gram et les caractéristiques de sporulation, on peut diviser ces bacté- ries 'on trois groupes, à savoir : 1) les souches Gram* for- mant des bâtonnets (avec.ou sans sporulation), 2) les sou-
EMI6.5
ches (firam4" formant des bâtonnets, et z) les souches for- mant en cocoï. La plupart des souches de bactéries obtenues par le prcl(h1dl.( de triage de l'invention :...ont du premier groupe et le troisième groupe contient le plus petit nombre de souches.
Toutefois , cela n'est pas important et il faut déduire du tableau ci-dessus que la classification des sou-
EMI6.6
chefs n'est pas en relation directe avec la productivité spécifique d'acide euanylique-5' et d'autres nucléotidea-
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$'. Autrement dit, on considère que cette productivité est basée sur la spécificité physiologique de la souche indivi- duelle. Donc, l'invention n'est paa limitée par la classifi- cation bactérienne, mais elle peut s'appliquer à toutes les bactéries présentant des caractéristiques physiologiques telles qu'elles accumulent de l'acide guanylique-5', seul ou joint à d'autres nucléotides-5'.
On a trouvé que huit souches de bactéries, à savoir G 620, G 408, G 409, G 416, G 478, G 845, G 847 et G 1958, indiquées au tableau ci-desus, représentent une nouvelle espèce de Kurbhia. Les caractéristiques morpholo- giques et physiologiques de ces souches isolées de différentes sources ne se trouvent pas dans le Manual of Determinative Baeteriology" de Bergey, 7ème édition. Donc, ces souches sont reconnues comme tant une espèce nouvelle. Voici les caractéristiques de l'une de ces souches, la G 620, selon le schéma donné dans le "Manual of Microbiological Methods", 1957.
(1) Forme des cellules, culture de 18 heures sur agar-agar à l'extrait de boeuf à 30 C;
1. Cellules végétatives: bâtonnets de 0,8 - 0,9 x 4-7 microns, à extrémités arrondies non ramifiées, apparaissant indivuellement ou paires, et occasionnellement par chaînes de trois bâtonnets.
2. filaments formés dans le milieu usuel et dans un large intervalle de température. La formation n'est pan inhibée par l'addition d'agents nutritifs spéciaux comme la biotine.
Les filaments formés se subdivisent ensuite en cellules végétatives de type usuel. Les filaments ont en- viron 30 - 300 microns de longueur.
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EMI8.1
3. Mobilité S mot.a 4. Enclos pore s pas dA formation . Coloration Gram 1 posit1v.
Z) Strie sur agar-agar ! culture de 20 heures sur agar-agar à l'extrait de boeuf à 0' : 1. Croissance : abondante 2. forme : étalée ou échinulée 3. Eclat : terne
EMI8.2
4. Chromog6nâse grill-blanc faible à jaune- bltJ.tL1ai ble
5. Odeur : putride ou ammoniacal*
6. Consistance } butyreuse ou légèrement vis- queuse 7. Milieu :inchangé 3) Colonie sur agar-agar : culture de 48 heures sur agar-agar à l'extrait de boeuf à 30 C :
1.Forme :circulaire
2. Surface : légèrement lisse
EMI8.3
3. Bord : ., lacér6 ' 4. Relief ; légèrement convexe
5. Densité ; opaque 4) Bouillon à l'extrait de boeuf :culture de 24 heures à 30 C.
1, Croissance superficielle; forme un anneau fragile
2. Trouble : léger
3. Degré de croissance :modérée
4. Sédiment : léger précipité nuageux
5. Caractères physiologiques
EMI8.4
1. Liquéfaction de la gélatine : rapidement liquéfiée, stria- tiforcae.
2. Fermentation des sucres :
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EMI9.1
<tb> Production <SEP> d'acide <SEP> Production
<tb>
EMI9.2
' ¯-¯¯¯-- # # -¯# # . de gaa Glucose - *11 Lactose # m a Sucras ¯.¯ z.¯ ¯ op 1.1.-* -- %;" 3. Fermentation anaérobie du glooose : négative.
4. Action sur le lait de tournesol.
EMI9.3
.¯pH ,¯ . ¯ ¯ " --- alcalin caillot acide @ négatif caillot présure @ négatif peptonisation positive réduction négative
5. Réduction des nitrates :négative b. Production d'indole : négative
7. Production d'hydrogène sulfuré: positive 8. Ralation avec l'oxygène : aérobie
9. Température:
Température de croissance optimum au voisinage
EMI9.4
de 33*C ; pas de croissance à 440C ; bonne croissance à 20 - 37 C :
EMI9.5
point de mort thermique : 10 minutes à 5t'C.
10. pH optimal 1,0,0 critique de croissance 5,0 11. Chromogénèse : sur'gélatine jaune marguerite sur agar-agar blanc-gris faible à blanc . jaune faible sur pomme de terre chamois vif
EMI9.6
12. Réaction de Voge8-Prosauer: négative.
13. Réaction du rouge méthyle : négative 14. Utilisation de citrate positive 15. Utilisation d'acide urique :positive 16. Hydrolyse de 1* amidon ; faible.
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17. Hydrolyse de la caséine:positive 18. Uréase : positive 19. Catalase :positive 20. Accumulation d'acide guanylique-5' (et d'acide adénylique-5') ; positive ( grande accumulation), l'accumu- lation de nucléosides ou de dérivés inférieures d'acides nucléiques est négative.
21. Source : isolé d'un échantillon de sol.
Il est reconnu que cette souche 6 620 appartient à la famille des Brévibactéracées décrite dans le "Manual of Determinative Bacteriology " de Bergey, 7ème édition, parce qu'elle est Gram+, en bâtonnets non ramifiés, ne forme pas de spores et n fait pas fermenter le glucose dans des conditions anaérobies. Cotte famille se divise en,deux gen- res : Brevibacterium et Kurthia .Le premier est formé de courts bâtonnets non ramifiée , presque coccoides, non fi- lamenteux et produisant habituellement de l'acide à partir d'hydrates de carbone simples. Par contre, la souche 6 620 considérée n'est pas ramifiée, forme de longs bâtonnets et filaments et ne produit pas d'acide à partir d'hydrates de carbone simples. Ainsi, il est évident que la souche G 620 n'appartient pas au genre Brevibacterium mais au genre Kurthia.
Suivant le"Manual od Determinative Bacteriology" de Berger, 7ème édition, il existe trois espèces dans le genre Kurhia. L'une, la Kurthia bessonii, est capable de liquéfier la gélatine mais les deux autres espèces en sont incapables, Etant donné que la souche considérée liquéfiée la gélatine, l'espèce à laquelle elle ressemble le plus parmi les trois espèces de Kurthia décrites est la Kurthia bessonii. Toute- fois, la souche- G 620 est différente de la Kurthia besonii par les deux caractériqtiques suivantes:
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EMI11.1
<tb> Kurthis <SEP> bessonii <SEP> G <SEP> 620
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ,1. <SEP> Hydrogène <SEP> sulfuré <SEP> non <SEP> produit <SEP> produit
<tb>
<tb>
<tb> 2. <SEP> Relief <SEP> de <SEP> la <SEP> colonie
<tb>
<tb>
<tb> sur <SEP> agar-agar <SEP> @ <SEP> ombiliquée <SEP> ombonée
<tb>
<tb>
<tb>
Il est donc reconnu que cette souche est une nouvelle espèce du genre Kurthia. Non seulement cette souche accumule de grandes quantités d'acides guanylique-5' et adé- nylique-5', mais encore au moins un composé du groupe qui comprend les acides utidylique-5', cytidylique-5' et xanthy- lique-5', dans les conditions de culture appropriées.
Les caractères physiologiques et morphologiques des sept autres souches sont presque semblables à ceux de la souche G 620, Aussi, ces sept souches, G 408, G 409, G 416, G 478, G 845, G 847 et G 1958, aussi bien que G 620, sont reconnues comme- une nouvelle espèce de Kurthia. Il est inutile de dire que l'invention comprend l'utilisation de cette espèce nouvelle.
D'autre part, on a trouvé que les bactéries sporulentes, G 105, G 393, G 396, G 493, 0 549, G 618, G 628 et G 2293, qui ont été isolées de différentes sources, sont une nouvelle espèce de genre Bacillus. Les caractères morphologiques et physiologiques de ces souches ne se trou- vent pas dans l'ouvrage de Bergay déjà cité. Ces souches représentent donc une nouvelle espèce. Les caractères d'une souche, G 396, de la nouvelle espèce de Bacillus, sont dé- crits ci-après selon le schéma descriptif du "Manual of Microbiological Methods" , 1957 : (1) Forme des cellules, culture de 20 heures sur agar-agar à l'extrait de boeuf à 30 C:
1. Cellules végétatives ;bâtonnets de 1,0 - 1,3 sur 3-5 microns en moyenne, à extrémités arrondies, non ramifiés, se présentant individuellement ou par paires.
Sur agar-agar nutritif au glucose, la croissance est plus abondante, les Bâtonnets sont plus larges, plus longs et plus vacuoles et forment des fuseaux ou des coins plus faci- lament que sur l'agar-agar nutritif.
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2. Mobilité : faiblement mobiles
3. Sporanges :pas nettement gonflés
4. Spores: 1, Dxi, 2 microns en moyenne, ovales, centrales ou terminales, nombreuses en 48 heures.
5. Coloration Gram : positive.
(2) Strie sur agar-agar, culture de 20 heures sur agar-agar à l'extrait de boeuf à 30 C.
1. Croissance ! : abondante 2. Forme : S lisse, étalée ( les vieille. cellules sont ridees).
3. Eclat brillant
4. Chromogénèse :blanc crémeux à jaune clair.
5. Consistance butyreuse 6. Milieu 1 Inchangé (3) Bouillon d'extrait de boeuf, culture de 48 heures à 30 C. il- Croissance superficielle nulle
2. Trouble : prononce, uniforme
3. Degré da croissance :abondante @ 4. Sediment: Modéra , (4) Colonie sur agar-agar, culture de 20 heures sur agar- agar à l'extrait de boeuf à 30 C.
1. Forme :circulaire
2. Surface :lisse
3. Bord: entier
4. Relief ; convexe à élevé
5. Densité : opaque (5) Culture inclinée sur agar-agar au soja ; croissance abondante.
(5) Bouillon NaCl : pas de croissance dans NaCl à 2%.
(7) Propriétés physiologiques
1. Liquéfaction de la gélatine liquéfiée lentement, infondibuliforme.
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2. Fermentation des sucres ( milieu d'Ayers)
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<tb> Production <SEP> Production
<tb>
<tb> d'acide <SEP> de <SEP> pais
<tb>
<tb> arabinose
<tb>
<tb>
<tb> xylose <SEP> 4 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> glucose <SEP> + <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> galactose <SEP> + <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> fructose <SEP> + <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> sucrcse <SEP> + <SEP> on <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> Mannitol <SEP> + <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> lactose <SEP> @ <SEP> + <SEP> -
<tb>
3. induction des nitrates ; positive 4. Production anaérobie de gaz à partir de ni- trate :positive
5, Réaction de Voges-Proskauer (co) t faiblement positive 6. Réaction du rouge-méthyle :post tive
7. Utilisation de citrate:positive
8. Hydrolyse de l'amidon ; faible
9.
Hydrolyse de le, caséine :positive
10 Culture inclinée sur agar-agar à latyrosine: inchangée.
11. Catalase :positive
12. Accumulation d'acide guanylique-5' et d'a- cide adénylique-5' : positive( forte accumulation) l'accu- mulation de nucléosides ou de dérivés inférieures d'acide nucléique est négative.
13. Source :isolée d'un sol.
(oo) Milieu peptone-eau parce que le G 396 ne peut pas se développer dans le milieu protéose-peptone-glucose.
Cette souche G 396 est reconnue comme appar- tenant au genre Bacillus décrit dans l'ouvrage de Bargey déjà cité, parce qu'elle contient des cellules en bâtonnets,
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Gram\ formatrices de spores, qui ont un test de catalase positif. Les sporanges de cette zouche ne sont pas nettement gonflés et le protoplasme des jeunes cellules présente des vacuoles si elles sont légèrement colorées. De plus, la dia- mètre de la cellule végétative est de 0,9 micron ou davan- tag. Cette souche G 396 est donc surtout proche du Bacillus megaterium ou du Bacillus ceraus.
Toutefois, elle diffère de ceux-ci pâr les caractères suivants;
EMI14.1
<tb> Bacillus <SEP> Bacillus <SEP> G <SEP> 396
<tb> megaterium <SEP> cereus
<tb>
<tb> Cellules <SEP> normales <SEP> en <SEP> bâ- <SEP> normales <SEP> en <SEP> bâ- <SEP> au <SEP> jeune <SEP> Age,
<tb> végéta- <SEP> tonnet, <SEP> non <SEP> en <SEP> tonnet, <SEP> non <SEP> en <SEP> normales <SEP> en <SEP> bâtives <SEP> fuseau <SEP> ni <SEP> en <SEP> fuseau <SEP> ni <SEP> en <SEP> tonnât <SEP> mais
<tb> coin <SEP> coin <SEP> plus <SEP> tard,
<tb> cellules <SEP> en
<tb> fuseau <SEP> ou
<tb> en <SEP> coin
<tb>
<tb> Colonie <SEP> entière <SEP> et <SEP> con- <SEP> plate <SEP> et <SEP> ir- <SEP> entière <SEP> et
<tb> sur <SEP> agar-agr <SEP> vexe <SEP> ou <SEP> en <SEP> re- <SEP> régulière <SEP> convexe <SEP> ou
<tb> lief <SEP> en <SEP> relief
<tb>
<tb>
<tb> Réaction <SEP> de <SEP> négative <SEP> positive <SEP> faiblement
<tb> Voges <SEP> Pros- <SEP> positive
<tb> kauer
<tb>
<tb> hydrolyse <SEP> positive <SEP> positive <SEP> légère
<tb> de <SEP> l'amidon
<tb>
<tb> fermentation <SEP> négative <SEP> positive
<tb> du <SEP> mannitol
<tb>
<tb> Production <SEP> négative <SEP> positive <SEP> @ <SEP> "
<tb> anaérobie
<tb> de <SEP> gaz <SEP> à <SEP> partir <SEP> de
<tb> nitrate
<tb>
<tb> Accumulation <SEP> " <SEP> négative <SEP> "
<tb> d'acides
<tb> guanylique-5'
<tb> et <SEP> adénylique-51
<tb>
La souche G
396 est donc reconnue comme n'étant ni un B. mJgaterium ni un B. cereus mais une nouvelle espèce du genre Bacillus. Cette souche est capable d'accumuler à la Tois l'acide guanylique-5' et l'acide adénylique-3'et de plus, elle peut accumuler aussi au moins un composé du
<Desc/Clms Page number 15>
groupe qui comprend les acides cytidylique-5', uridylique-5' et xanthylique-5', dans des conditions appropriées.
Les caractères physiologiques et morplologiques des sept autres souches sont presque similaires à ceux du G 396. Donc, ces sept souches ainsi que le G 396 sont recon- nues comme étant une nouvelle espèce appartenant au genre Bacillus. Il est inutile de dire que l'invention comprend l'utilisation de cette nouvelle espèce de Bacillus.
Les exemples suivants illustrent le procédé de l'invention.
EXEMPLE
On cultive avec agitation la souche de Bacillus G 396 dans un milieu comprenant, par litre:
EMI15.1
<tb> K2HPO4 <SEP> 7,0 <SEP> g
<tb>
<tb> KH2P04 <SEP> 3,0 <SEP> g
<tb> (NH4)2S04 <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> MgS04.7H20 <SEP> 0,2 <SEP> g
<tb> citrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb>
<tb> hydrolysat <SEP> de <SEP> caséine <SEP> 10,0 <SEP> g
<tb>
<tb> glucose <SEP> 20,0 <SEP> g
<tb>
<tb> thiamine <SEP> 100 <SEP> g
<tb>
<tb> riboflavine <SEP> 100 <SEP> g
<tb>
<tb> pyridoxine <SEP> 200 <SEP> g
<tb>
<tb> pentothénate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb> acide <SEP> nicotinique <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb> acide <SEP> p-aminobenzoique <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
<tb> biotine <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb>
Après 4 jours de culture & 28 C, on élimine les cellules,
et on tire du milieu de culture les acides guanylique-5' et adénylique-5' suivant des méthodes connues.
Les rendements sont les suivants :
<Desc/Clms Page number 16>
EMI16.1
pH initial pH final acide guanylique-5 acide adény11que.5' mg/1PO cm3 mg/100 cm) 6,8 6 20,6 17,6 EXEMPLE 2
EMI16.2
On cultive avec agitation la souche de Bac11lul 0 2293 dans le milieu décrit à l'exemple 1. Après 3 jours
EMI16.3
de culture à 2Ô C, on tire du milieu de culture les acides gUany11que-' 'et adénylique-5' suivant des méthodes connues.
Les rendements sont les suivants:
EMI16.4
pH initial pH iinal acide 4uanylique-5' acide adénylique-5 ,¯¯ ,# ¯ # m"1U cm 3 mg/10Q cm3 6,5 5,6 25,, 23,9
EMI16.5
Ek-E14PI$ - '3- On cultiver avec agitation une oouche 4'Eocheri- chia Ci 443 isolée du 8o# dans le mfirae milieu que dans l'exemple 1. Après 4 jours de culture à 2Ô*C, on tire les acides guanylique-5' et ad6nylique-59 du milieu de culture suivant des méthodes connues, les rendements sont les suivant*!
EMI16.6
pH initial pH final acide guanylique-5' acide adénylique-5' ¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯ m/100 cm3 mp/LQQ cm3 608 5t4 liez 8,9 EXEMPLE 4
On cultive avec agitation, dans le milieu de l'exemple 1, une souche d'Escherichia G 1959 isolée du
EMI16.7
sol.
Au bout de 3 jours de culture à 3000, on tire les acides guanylique-5' et adénylique-5' du milieu de culture par des méthodes connues. Les rendements sont les suivants
EMI16.8
pH initial pH final acide guanylique-5' acide adénylique-5' ##¯#¯ 'm/7,U0 cm3 MR/100 cm3 6,5 5,0 9,7 8,0
EMI16.9
' KX&-1PLE 5
On cultive avec agitation, dans le milieu de l'exemple l'une souche d'Aerobacter G 103 isolée
EMI16.10
du sol . Après 14 jours de culture à 4?' C, on tire du milieu da culture les'acides E,uanyliyue-5' et adénylique-5i,' par des méthodes connues.
Les rendements sont les suivants;
<Desc/Clms Page number 17>
EMI17.1
pH initial pH final acide uanylique-5 acide adénylique-5' ¯¯¯¯¯ .. p'R:/100 cm) 111IdlOQ qm3 6,8 596 51,3 44,2 EXEMPTS 6,
On cultive avec agitation, dans le milieu de l'exemple 1, une couche de Paeudomonaa 0 1956 isolée du sol. Après 3 jours de culture à 28 C, on tire les acides
EMI17.2
guanylique-59 et adénylique-5' du milieu de culture par des méthodes connues. Les rendements sont les suivants 4 pH initial oH final acide Kuanvllaue-5' acide adénvliaue-5
EMI17.3
#####¯# # ¯¯ mr:/100 cm3¯¯¯ nip./lOU crn3 6gg 5,0 13,2 lie$
EMI17.4
!')ÇF1!fll.z
On cultive avec agitation, dans le milieu de l'exemple 1, une souche de Serratia G 2262 isolée du sol.
Au bout de 3 jours de culture à 28 C. on tire du milieu de
EMI17.5
culture les acides guanylique-5' et adényli.que-5 par des méthodes connues. Les rendements sont les suivants: pH initial pH final acide guanylique5 acide adénylique-5'
EMI17.6
-¯¯¯¯¯-- ..¯.r. m/10'J cm3¯¯¯¯. mgllüj cmj 7,0 6,8 15,) 1708 - EXEMPLE
Un cultive avec agitation dans le milieu de
EMI17.7
l'exemple 1/4 une souche de l3revibactsrium G 42$ isolée du 601.
Après 4 jours de culture à 30 C, on tire du milieu de cul-
EMI17.8
ture les acides guanylique-5' et ade::nyliqua-5' par des mô- thodesfconnues. Les rendements sont les suivants: pH initial pH final acide puanylique-51 acide adénylique-5'
EMI17.9
#¯¯¯¯ ¯¯ ¯ ¯¯ MF,11() CM3 wriluu cno
EMI17.10
<tb> 6,8 <SEP> 5,8 <SEP> 22,9 <SEP> 16,8
<tb>
EMI17.11
E..#. iPl.E 9
On cultive avec agitation dans le milieu de l'exemple laine souche de Brevibacterium G 565 isolée du sol.
Après 4 jours de culture à 28 C, on tire du milieu de culture, par des méthodes connues, les acides guanylique-5' et adé-
<Desc/Clms Page number 18>
EMI18.1
nylique-5'* Les rendements sont les suivante :
EMI18.2
pH initial pH final acide guanylique-5* acide adénylique-5' ; . 'im ",/la0 , cm, <nc/100 cm 7,0 5,0 32,5 30,1 EXEMPLE 10
On cultive avec agitation, dans le milieu de l'exemple 1, une bouche de Micrococcus G 418 isolée du
EMI18.3
soi, Après 3 jours de culture à 28 C, on tire du milieu de culture , , par des méthodes com:s, lea acides ;uanylique-.5 et addnyt idue-5 .
Les rendements sent les suivants: pH initial pH final acide gu..-inyliqtie-5? acide adényiQt1e-5't
EMI18.4
<tb> 7,0 <SEP> 6,2 <SEP> 13,7 <SEP> 15,2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> @ <SEP> EXEMPLE <SEP> 11
<tb>
<tb>
<tb> ' <SEP> ######
<tb>
On cultive avec agitation, dans le milieu de
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l'exemple le une souche d'Escherhhia G 2282 isolée . ci. ' . 1.
Après 2 jours de culture à 28 C, on tire l'acide guanyliqu,, @ 5' du milieu de culture, par des méthodes connues, le rende- ment est le suivant;
EMI18.6
pH initial pH final acide guanylique-51 L n)f';/lUO cm3 792 692 807
EMI18.7
,#dP'Pt: - 12 On cultive avec agitation, dans le milieu de l'exemple'1, la souche de Uacillus ü 493 Au bout de 3 jours de culture à 28 C, on tire l'acide guanylique-5' du milieu de culture par des méthodes connues.
Le rendement est le suivant:
EMI18.8
pH initial pH final acide guanylique-51
EMI18.9
<tb> mg/100 <SEP> cm3
<tb>
<tb> 6,8 <SEP> 4,4 <SEP> 15,2
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
EXEMPLE 13
On cultive avec agitation la nouvelle espèce de Kurthia G 620 dans un milieu comprenant 80 g/l de glucose, 20 g/1 d'hydrolysat acide de caséine et dont les autres con- stituants sont les! mêmes que dans l'exemple 1. Après 5 jours de culture à 28 C, on tire du milieu : de culture, par des méthodes connues, les acides guanylique-5'et adénylique- 5'.
Les rendements sont les suivants;
EMI19.1
<tb> pH <SEP> initial <SEP> pH <SEP> final <SEP> acide <SEP> guanylique-5' <SEP> acide <SEP> adénylique-5'
<tb> mg/100 <SEP> cm3 <SEP> mg/coo <SEP> cm3
<tb>
<tb> 7,0 <SEP> 5,8 <SEP> 48,1 <SEP> 85,3
<tb>
EXEMPLE 14
On cultive avec agitation la nouvelle espèce de Kurthia G 620 ci-dessus dans un milieu comprenant 250 g/1 de liqueur de macération de mats à la place de l'hydrolysa- ge de caséine, 40 g/1 de glucose et les autres constituants indiqués à l'exemple 1. Au bout de 9 jours de culture à 28 C, on tire du milieu de culture, par des méthodes connues, les acides guanylique-5', adénylique-5', cytidylique-5', uridylique-5' et xanthylique-5'.
Les rendements sont les suivants : @
EMI19.2
<tb> pH <SEP> initial <SEP> pH <SEP> final <SEP> acide <SEP> guanylique-5' <SEP> acide <SEP> adénylique-5'
<tb>
<tb> mg/100 <SEP> cm3 <SEP> mg/luu <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6,8 <SEP> 9,2 <SEP> 70,4 <SEP> 110,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acide <SEP> cutidylique-5' <SEP> acide <SEP> uridylique-51 <SEP> acide <SEP> xanthylique-5'
<tb>
<tb> mg/100 <SEP> cm3 <SEP> mg/100 <SEP> cm3 <SEP> mg/100 <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 69,0 <SEP> 48,6 <SEP> 17,5
<tb>
EXEMPLE 15
On cultive avec agitation la nouvelle espèce de Kurthia G 620 dans un milieu comprenant 10 g/1 d'hydroly- sat de caséine, 80 g/1 de glucose, 0,4 g/1 de MgSO4.7H2O et les autres constituants indiqués à l'exemple 1 .
Après 7 jours de culture à 28 C, on tire seulement de l'acide quanylique-5' du milieu par des méthodes usuelles. Le ren- dement est le suivant:
<Desc/Clms Page number 20>
EMI20.1
pH initial pH final acide guanylique-5 ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ - mf7l00 cm3
EMI20.2
<tb> 6,8 <SEP> 5,8 <SEP> 10,3
<tb>
EXEMPLE 16
On cultive avec agitation la nouvelle espèce de Kurthia G 1958 dans le milieu de l'exemple 13. Après 6 jours de culture à 28 C, on tire du milieu de culture les
EMI20.3
acides guanylique-5' et adénylïque-5v par lea méthodes usuel- les.
Les rendements sont les suivants: riz initial pH final acide imanylique-5' acide adénylioue-5
EMI20.4
vawrrrrrlrr mrnrm tnp/100 CM3 MI?/100 CM3
EMI20.5
<tb> 6,8 <SEP> 5,8 <SEP> 50,5 <SEP> 82,3
<tb>
EXEMPLE 17
On cultive avec agitation la nouvelle espèce de Bacillus o 396 dans un milieu comprenant 100 g/1 de li- queur de macération/le maïs à la place de l'hydrolysat de caséine, 30 g/1 de glucose et les autres constituants con- formes à l'exemple 1.
Après 9 jours de culture à 28 C, on tire du milice de culture, par les méthodes usuelles, les acides suivants avec les rendements suivants:
EMI20.6
pH initial pH final acide guanylique-5* acide adényliqile-59 ¯¯¯¯¯¯ m, y/1C)b cm3 mg/100 cni3 7,0 3,8 43#2 z acide cytidylique-5@ acide uridylique-5* ' 'acide xat-ithylique-5 mpr/10Q cm3 MF/100 cm3 m:/l0U xm, 40,5 ,1 805
EXEMPLE 18
On cultive avec agitation la nouvelle es pèce de Bacillua C 396 dans un milieu comprenant 5 g/1 de !peptone,
EMI20.7
5 g/1 d'acide 'succinique, 7,353 g/1 de (NH4)2HP04o 0,493 g/1 de Mg04.7i20 z9 g/1 de KC1, 0,147 g/1 de.CaCl2*2H200 40 g/1 de glucose et 1 litre de solution d'extrait de soja qui sert de solvant dans ce milieu.
On opère la solution d'extrait de soja de la façon suivante; on extrait pen - dant 1 heure 5 g/l de soja dégraissé au moyen de 100 cm3
<Desc/Clms Page number 21>
de solution à 0,1% de NaOH dans un bain d'eau bouillante et on dilue à 1 litre de liquide qui surnage en ajoutant de'l'eau distillée. Après 8 jours de culture à 28 C, on tirs du milieu de culture l'acide guanylique-5' par les méthodes usuelles.
Le rendement est le suivant :
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<tb> pH <SEP> initial <SEP> pH <SEP> final <SEP> acide <SEP> guanylique-5'
<tb> - <SEP> - <SEP> mg/100 <SEP> cm3
<tb>
<tb> 7,2 <SEP> 5,8 <SEP> 13,7
<tb>
REVENDICATIONS 1. - Procédé de préparation d'acide guanylique-5', @ caractérisé en ce qu'on cultive une souche de bactérie appro @ priée dans des conditions aérobies , en milieu nutritif aqueux, pendant un temps suffisant.
<Desc / Clms Page number 1>
The invention relates to fermentation processes for obtaining 5 'nucleotides. More particularly, it relates to processes aimed at obtaining guanylic acid-5 'by culturing bacteria in media suitable for their growth.
Nucleotides-5 'such as guanylic acid-5' and inosinic acid-5 'are useful flavors, in small amounts, to enhance the taste of foods, beverages and condiments. It has been found that it is possible to obtain these nucleotides by enzymatic degradation of ribonucleic acid. However, this process is not particularly suitable for the commercial manufacture of nuclear acids, since the raw material is expensive and the individual products are difficult to isolate and separate. Consequently, other methods more suitable for the preparation of nucleotides-5 'and in particular of guanylic acid-5' have been sought.
One of the aims of the invention is to indicate a process for preparing 5 ′ nucleotides which uses inexpensive and easily accessible raw materials.
Another object is to indicate a process for the commercial manufacture of 5 'guanylic acid. Yet another object is to indicate a process for the commercial manufacture of adenylic acid-5 '.
Other objects will appear in the detailed description of the invention, given below.
<Desc / Clms Page number 2>
According to the invention, it has been found that new strains of bacteria isolated from natural sources by means of a screening process using a guanine-hungry mutant, can be cultured in suitable media and yield guanylic acid-5 '. , alone or together with other 5 'nucleotids.
It has thus been found that the strains of bacteria producing 5 'guanylic acid and isolated by the screening method of the invention can be cultured on suitable media containing sources of nitrogen, carbon and essential mineral salts required. to the microorganism to produce guanyl-5 ', singly or together with other 5' nucleotides such as adenyl-5 ', cytidyl-5', uridyl- $ 'and xanthyl-5' In carrying out the methods of the invention, different species of bacteria can be used.
For example, it has been found that strains of bacteria belonging to the order of eubacteria and to that of pseudo-monadales, such as strains of brevibacteriaceae, bacillaceae, enterobacteriaceae, micrococcaceae and pseudo-monadaceae isolated by The sorting method according to the invention are useful in the preparation of guanylic-5 'and other 5' nucleotides according to the invention.
However, the invention is not limited to these particular bacteria because all the species of bacteria which can be isolated by the sorting method described, as well as their mutants obtained by the action of X-rays, ultraviolet rays, etc., can be used to produce 5 'guanylic acid and other 5' nucleotides according to the invention. Thus, the invention provided a convenient process for the preparation of guanylic-5 'act and other commercial scale 5' 4 'nucleotides, from inexpensive and easily accessible raw materials.
Guanylic acid-5 'and certain other nucleotides-5' are useful as flavorings and furthermore are important metabolic intermediates; Adenylic acid-5 'can be easily converted to inosinic acid-5' which is
<Desc / Clms Page number 3>
an important flavoring compound, by processing it with nitrous acid or adenyl deaminase.
Although some research has been done, consider. Wheats to find methods of preparing nucleotides by fermentation, it was not known, prior to the invention, to accumulate guenylic-5 'or mixtures thereof and other nucleotides-5'. It has been found that by isolating from natural sources new strains of bacteria exhibiting three particular characteristics, thanks to the sorting process of the invention which uses an auxotropic strain hungry for guanidine, and by cultivating these miccoorga- nismos in suitable culture media, guanylic acid-5 'can be obtained, alone or with one or more other nucleotides-5'.
The characteristics of these strains of bacteria suitable for use in the new process are as follows:
1) A large amount of guanylic-5 'acid is accumulated by culturing the strains on suitable media, and depending on the particular strain of bacteria and the medium used, one or more other nucleotides can be obtained concurrently. The fact that 5 'nucleotides are obtained by culturing these strains of bacteria suggests that these strains must have metabolic regulatory systems gone. in the process of purine biosynthesis. Furthermore, it was not previously known that it was possible to accumulate both guanylic acid-5 ′ and adenylic acid-5 ′ in large amounts under usual bottling conditions. ture.
2) the fact that guanine, adenine, and other degradation products of 5 'nucleotides are not found in appreciable amounts in broths given by culturing microorganisms, suggests that Closed 5 'nucleotides in the cell are excreted and accumulate
<Desc / Clms Page number 4>
slow in the broth without degradation and that the cells of the strains isolated by the inventors do not oppose a barrier of permeability to the nucleotides. Generally, the permeability of microorganisms is very selective and the nucleosides and other degradation products of the nucleotides are relatively permeable while the nucleotides are not.
In fact, nucleosides and other basic nucleotide degradation products have been reported to be excreted out of cells. However, in the case where the new microOrganisms of the invention are cultivated, it is found that only the nucleotides are excreted in relatively large quantities.
3) The fact that guanylic acid-5 'and other 5' nucleotides accumulated in the broth are not degraded to any significant extent indicates that the new strains which produce guanylic acid-5 ' or, no enzymatic action on the accumulated nucleotides.
This is therefore an important characteristic of the strains of the invention *
According to a further embodiment of the invention, it has been found that the particular bacteria suitable for the production of 5 'guanylic acid according to the invention can be isolated from natural sources by using a mutant of B. subtilis greedy for guanine, as follows with the bacteria isolated, solid media are inoculated into petri dishes and the colonies obtained are killed by ultraviolet irradiation and covered with medium A solid containing the guanine-hungry mutant of B. subtilis mentioned above. After cultivation, the halo area or growth area of the mutant is examined.
The size and thickness of the halo formed around the colony of bacteria depends on the amount of guanine derivative produced by the particular bacteria. Also, the strains * of bacteria producing guanylic acid-5 'which are suitable
<Desc / Clms Page number 5>
EMI5.1
rdail 1'tlon of the invention Whose chointes after the eraredour st SL épeiaaaur of the halo formed autotir of the colony of Che "'" "found that each strain tl by the method ci.-deaata accumulates large quantities de auba, nc8a absorbing ultraviolet rays in a medium which V "'" # 1 "' more sources of mutant i..ieabla which does not need to develop the culture in iniiieux A'6ré3, \, Iti found that the substances absorbing * <J-eyDM u3txa-vi 'ta conr ,,
ernent 1 acid guanylLque contain lucid guanylique- 'either 1901 (Mont -c ...... nucleotides as adenylic acid-5t., easily isolate these compounds PO 48 from the medium of ###### purify them according des, 11 Cmm "'A1M1> we have found a process of bio a3rnthésa making it possible to prepare guanylic acid-590 alone or together to be,
nucleotides.- following table giving brief explanations on some of the main morphological and mouth characteristics * UseO6 tYPicsIsolated by bzz
<Desc / Clms Page number 6>
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<tb> strain <SEP> form <SEP> dea <SEP> spores <SEP> Colora- <SEP> Sou- <SEP> Form <SEP> Spores <SEP> Colona-
<tb>
<tb> n <SEP> cellu- <SEP> tion <SEP> che <SEP> des <SEP> tion
<tb>
EMI6.2
the Ctîm t cells Gram Iules ¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI6.3
<tb> 0 <SEP> 103 <SEP> sticks <SEP> - <SEP> - <SEP> G <SEP> 1202 <SEP> stick- <SEP> - <SEP>
<tb>
<tb> net
<tb>
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G 208 II - - G 1632 "0443"; - G 1956 M G 826 \ - G 1959 "0 2262 Il i - - G 2282 w G 408 If 1 - + G 296" -t- + G 409 M + G 493 z 1 ......
G 416 h + G 549 "+ # G 425 t1! - ... G 613 + # G 478 If - + G 628 + it Q 505" 1 ... + 0 630 "+ 1 G 620 + G 849" + + Q 845 "- + G 2293 * + + G 847" 1 ...... G 172 cocci + G 848 ni '"+ G 418" + G 1958 "- t G 629" - + G 105 "1 + + G 1288 # - + G 393 8t! 1 "'' '' G 2558 u - + G 395 .., ...... G 2833 - +
Based on cell shape, Gram stain and sporulation characteristics, these bacteria can be divided into three groups, namely: 1) Gram * rod-forming strains (with or without sporulation), 2) the sub-
EMI6.5
ches (firam4 "forming rods, and z) strains forming cocoi. Most of the strains of bacteria obtained by the prcl (h1dl. (sorting of the invention: ... are from the first group and the third group contains the smallest number of strains.
However, this is not important and it must be deduced from the table above that the classification of the
EMI6.6
heads is not directly related to the specific productivity of euanylic-5 'and other nucleotidea-
<Desc / Clms Page number 7>
$ '. In other words, this productivity is considered to be based on the physiological specificity of the individual strain. Therefore, the invention is not limited by the bacterial classification, but it can be applied to all bacteria having physiological characteristics such that they accumulate guanylic acid-5 ', alone or together. 'other nucleotides-5'.
Eight strains of bacteria, namely G 620, G 408, G 409, G 416, G 478, G 845, G 847 and G 1958, shown in the table above, were found to represent a new species of Kurbhia. The morphological and physiological characteristics of these strains isolated from different sources are not found in Bergey's Manual of Determinative Baeteriology ", 7th edition. So these strains are recognized as a new species. Here are the characteristics of one. of these strains, G 620, according to the scheme given in the "Manual of Microbiological Methods", 1957.
(1) Form of cells, culture for 18 hours in beef extract agar at 30 ° C;
1. Vegetative cells: rods of 0.8 - 0.9 x 4-7 microns, with rounded unbranched ends, appearing individually or in pairs, and occasionally in chains of three rods.
2. filaments formed in the usual medium and over a wide temperature range. The formation is not inhibited by the addition of special nutrients like biotin.
The filaments formed then subdivide into vegetative cells of the usual type. The filaments are about 30 - 300 microns in length.
<Desc / Clms Page number 8>
EMI8.1
3. Mobility S mot.a 4. Enclosures pore s no training. Gram 1 posit1v stain.
Z) Streak on agar-agar! 20 hour culture on 0 'beef extract agar: 1. Growth: abundant 2. shape: spread or echinulate 3. Luster: dull
EMI8.2
4. Chromogenic grill - weak white to yellow - bltJ.tL1ai ble
5. Odor: putrid or ammoniacal *
6. Butyrous or slightly viscous consistency 7. Medium: unchanged 3) Colony on agar-agar: culture for 48 hours on agar-agar with beef extract at 30 C:
1.Shape: circular
2. Surface: slightly smooth
EMI8.3
3. Edge:., Lacér6 '4. Relief; slightly convex
5. Density; opaque 4) Beef extract broth: culture for 24 hours at 30 C.
1, Shallow growth; forms a fragile ring
2. Trouble: mild
3. Degree of growth: moderate
4. Sediment: light cloudy precipitate
5. Physiological characters
EMI8.4
1. Liquefaction of gelatin: rapidly liquefied, stria- tiforcae.
2. Fermentation of sugars:
<Desc / Clms Page number 9>
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<tb> Production <SEP> of acid <SEP> Production
<tb>
EMI9.2
'¯-¯¯¯-- # # -¯ # #. de gaa Glucose - * 11 Lactose # m a Sucras ¯.¯ z.¯ ¯ op 1.1 .- * -%; "3. Anaerobic fermentation of glooose: negative.
4. Action on sunflower milk.
EMI9.3
.¯pH, ¯. ¯ ¯ "--- alkaline acid clot @ negative rennet clot @ negative peptonization positive reduction negative
5. Reduction of nitrates: negative b. Indole production: negative
7. Production of hydrogen sulphide: positive 8. Slowdown with oxygen: aerobic
9. Temperature:
Optimum growth temperature in the vicinity
EMI9.4
from 33 ° C; no growth at 440C; good growth at 20 - 37 C:
EMI9.5
thermal break-even point: 10 minutes at 5 ° C.
10. Optimal pH 1.0.0 Critical Growth 5.0 11. Chromogenesis: Daisy yellow gelatin on weak to white white-gray agar. faint yellow on bright buff potato
EMI9.6
12. Voge8-Prosauer reaction: negative.
13. Reaction of methyl red: negative 14. Use of citrate positive 15. Use of uric acid: positive 16. Hydrolysis of starch; low.
<Desc / Clms Page number 10>
17. Hydrolysis of casein: positive 18. Urease: positive 19. Catalase: positive 20. Accumulation of guanylic acid-5 '(and adenylic acid-5'); positive (large accumulation), the accumulation of nucleosides or lower nucleic acid derivatives is negative.
21. Source: isolated from a soil sample.
This strain 6,620 is recognized to belong to the Brevibacteraceae family described in Bergey's "Manual of Determinative Bacteriology", 7th Edition, because it is Gram +, unbranched, non-spore forming, and non-branching. ferment glucose under anaerobic conditions. This family is divided into two genera: Brevibacterium and Kurthia. The first is formed of short, unbranched rods, almost coccoidal, non-filamentous and usually producing acid from simple carbohydrates. On the other hand, the strain 6,620 considered is unbranched, forms long rods and filaments and does not produce acid from simple carbohydrates. Thus, it is evident that the strain G 620 does not belong to the genus Brevibacterium but to the genus Kurthia.
According to Berger's "Manual od Determinative Bacteriology", 7th edition, there are three species in the genus Kurhia. One, Kurthia bessonii, is able to liquefy gelatin but the other two species are unable, Since the strain considered to be liquefied gelatin, the species to which it most closely resembles among the three described Kurthia species is the Kurthia bessonii. However, the G 620 strain is different from Kurthia besonii by the following two characteristics:
<Desc / Clms Page number 11>
EMI11.1
<tb> Kurthis <SEP> bessonii <SEP> G <SEP> 620
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>, 1. <SEP> Hydrogen <SEP> sulphide <SEP> not <SEP> product <SEP> product
<tb>
<tb>
<tb> 2. <SEP> Relief <SEP> of <SEP> the <SEP> colony
<tb>
<tb>
<tb> on <SEP> agar-agar <SEP> @ <SEP> umbilicated <SEP> umbilicated
<tb>
<tb>
<tb>
It is therefore recognized that this strain is a new species of the genus Kurthia. Not only does this strain accumulate large amounts of guanylic-5 'and adenyl-5', but also at least one compound from the group which includes utidyl-5 ', cytidyl-5' and xanthyl-5. ', under the appropriate culture conditions.
The physiological and morphological characters of the other seven strains are almost similar to those of strain G 620, Also, these seven strains, G 408, G 409, G 416, G 478, G 845, G 847 and G 1958, as well as G 620, are recognized as- a new species of Kurthia. Needless to say, the invention includes the use of this novel species.
On the other hand, it has been found that the sporulating bacteria, G 105, G 393, G 396, G 493, 0 549, G 618, G 628 and G 2293, which have been isolated from different sources, are a new species of genus Bacillus. The morphological and physiological characters of these strains are not found in the work by Bergay already cited. These strains therefore represent a new species. The characters of a strain, G 396, of the new species of Bacillus, are described below according to the descriptive scheme of the "Manual of Microbiological Methods", 1957: (1) Shape of cells, 20 hour culture on beef extract agar at 30 C:
1. Vegetative cells; rods 1.0 - 1.3 by 3-5 microns on average, rounded-tipped, unbranched, occurring singly or in pairs.
Growth is more abundant on Nutrient Glucose Agar, Rods are wider, longer and more vacuolated and form spindles or wedges more easily than on Nutrient Agar.
<Desc / Clms Page number 12>
2. Mobility: weakly mobile
3. Sporangia: not markedly swollen
4. Spores: 1, Dxi, 2 microns on average, oval, central or terminal, numerous in 48 hours.
5. Gram stain: positive.
(2) Streak on agar, 20 hour culture on beef extract agar at 30 C.
1. Growth! : abundant 2. Form: S smooth, spreading (old cells are wrinkled).
3. Brilliant shine
4. Chromogenesis: creamy white to light yellow.
5. Buttery consistency 6. Medium 1 Unchanged (3) Beef extract broth, culture for 48 hours at 30 C. il- No surface growth
2. Trouble: pronounced, uniform
3. Degree of growth: abundant @ 4. Sediment: Modera, (4) Colony on agar-agar, culture for 20 hours on agar-agar with beef extract at 30 C.
1. Shape: circular
2. Surface: smooth
3. Edge: whole
4. Relief; convex to high
5. Density: opaque (5) Tilted culture on soy agar-agar; abundant growth.
(5) NaCl broth: no growth in 2% NaCl.
(7) Physiological properties
1. Liquefaction of slowly liquefied gelatin, infondibuliform.
<Desc / Clms Page number 13>
2. Fermentation of sugars (Ayers medium)
EMI13.1
<tb> Production <SEP> Production
<tb>
<SEP> thick <SEP> acid <tb>
<tb>
<tb> arabinose
<tb>
<tb>
<tb> xylose <SEP> 4 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> glucose <SEP> + <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> galactose <SEP> + <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> fructose <SEP> + <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> sucrcse <SEP> + <SEP> on <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> Mannitol <SEP> + <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> lactose <SEP> @ <SEP> + <SEP> -
<tb>
3. induction of nitrates; positive 4. Anaerobic gas production from nitrate: positive
5, Voges-Proskauer (co) t reaction weakly positive 6. Red-methyl reaction: post tive
7. Use of citrate: positive
8. Starch hydrolysis; low
9.
Hydrolysis of casein: positive
10 Slant culture on latyrosine agar: unchanged.
11. Catalase: positive
12. Accumulation of guanylic acid-5 ′ and adenylic acid-5 ′: positive (high accumulation) the accumulation of nucleosides or lower nucleic acid derivatives is negative.
13. Source: isolated from a ground.
(oo) Peptone-water medium because G 396 cannot grow in the proteose-peptone-glucose medium.
This strain G 396 is recognized as belonging to the genus Bacillus described in the work by Bargey already cited, because it contains cells in rods,
<Desc / Clms Page number 14>
Grams of spore formers, which have a positive catalase test. The sporangia of this zouche are not markedly swollen and the protoplasm of young cells shows vacuoles if they are lightly stained. In addition, the diameter of the vegetative cell is 0.9 microns or more. This strain G 396 is therefore above all close to Bacillus megaterium or Bacillus ceraus.
However, it differs from these in the following characters;
EMI14.1
<tb> Bacillus <SEP> Bacillus <SEP> G <SEP> 396
<tb> megaterium <SEP> cereus
<tb>
<tb> Normal <SEP> cells <SEP> in <SEP> b- <SEP> normal <SEP> in <SEP> b- <SEP> at <SEP> young <SEP> Age,
<tb> vegeta- <SEP> tonnet, <SEP> no <SEP> in <SEP> tonnet, <SEP> no <SEP> in <SEP> normal <SEP> in <SEP> sticks <SEP> zone <SEP> neither <SEP> in <SEP> zone <SEP> nor <SEP> in <SEP> thunder <SEP> but
<tb> coin <SEP> coin <SEP> later <SEP>,
<tb> <SEP> cells in
<tb> zone <SEP> or
<tb> in <SEP> corner
<tb>
<tb> Colony <SEP> whole <SEP> and <SEP> con- <SEP> plate <SEP> and <SEP> ir- <SEP> whole <SEP> and
<tb> on <SEP> agar-agr <SEP> vexe <SEP> or <SEP> en <SEP> re <SEP> regular <SEP> convex <SEP> or
<tb> relief <SEP> in <SEP> relief
<tb>
<tb>
<tb> Reaction <SEP> of <SEP> negative <SEP> positive <SEP> weakly
<tb> Voges <SEP> Pros- <SEP> positive
<tb> kauer
<tb>
<tb> hydrolysis <SEP> positive <SEP> positive <SEP> mild
<tb> from <SEP> starch
<tb>
<tb> fermentation <SEP> negative <SEP> positive
<tb> from <SEP> mannitol
<tb>
<tb> Production <SEP> negative <SEP> positive <SEP> @ <SEP> "
<tb> anaerobic
<tb> from <SEP> gas <SEP> to <SEP> from <SEP> from
<tb> nitrate
<tb>
<tb> Accumulation <SEP> "<SEP> negative <SEP>"
<tb> acids
<tb> guanylic-5 '
<tb> and <SEP> adenyl-51
<tb>
Strain G
396 is therefore recognized as being neither a B. mgaterium nor a B. cereus but a new species of the genus Bacillus. This strain is capable of accumulating at the time of guanylic acid-5 'and adenylic acid-3' and in addition, it can also accumulate at least one compound of
<Desc / Clms Page number 15>
a group which comprises cytidyl-5 ', uridyl-5' and xanthyl-5 'acids, under appropriate conditions.
The physiological and morphological characters of the other seven strains are almost similar to those of G 396. Therefore, these seven strains as well as G 396 are recognized as being a new species belonging to the genus Bacillus. Needless to say, the invention includes the use of this new species of Bacillus.
The following examples illustrate the process of the invention.
EXAMPLE
The strain of Bacillus G 396 is cultured with agitation in a medium comprising, per liter:
EMI15.1
<tb> K2HPO4 <SEP> 7.0 <SEP> g
<tb>
<tb> KH2P04 <SEP> 3.0 <SEP> g
<tb> (NH4) 2S04 <SEP> 1.0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> MgS04.7H20 <SEP> 0.2 <SEP> g
<tb> <SEP> sodium <SEP> citrate <SEP> 0.5 <SEP> g
<tb>
<tb> hydrolyzate <SEP> of <SEP> casein <SEP> 10.0 <SEP> g
<tb>
<tb> glucose <SEP> 20.0 <SEP> g
<tb>
<tb> thiamine <SEP> 100 <SEP> g
<tb>
<tb> riboflavin <SEP> 100 <SEP> g
<tb>
<tb> pyridoxine <SEP> 200 <SEP> g
<tb>
<tb> <SEP> calcium <SEP> pentothenate <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb> <SEP> nicotinic acid <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb> p-aminobenzoic acid <SEP> <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
<tb> biotin <SEP> 2.5 <SEP> g
<tb>
After 4 days of culture & 28 C, the cells are eliminated,
and the 5 ′ guanylic and 5 ′ adenylic acids are obtained from the culture medium according to known methods.
The returns are as follows:
<Desc / Clms Page number 16>
EMI16.1
initial pH final pH 5-guanylic acid adenylic acid. 5 mg / 1 PO cm3 mg / 100 cm) 6.8 6 20.6 17.6 EXAMPLE 2
EMI16.2
The strain of Bac11ll 0 2293 is cultured with agitation in the medium described in Example 1. After 3 days
EMI16.3
At 20 ° C, the culture medium is obtained guany11 '' and adenyl-5 'acids according to known methods.
The returns are as follows:
EMI16.4
initial pH iinal pH 4uanylic-5 'adenylic acid-5, ¯¯, # ¯ # m "1U cm 3 mg / 10Q cm3 6.5 5.6 25 ,, 23.9
EMI16.5
Ek-E14PI $ - '3- A 4'Eocherichia Ci 443 isolated from 80% is cultivated with shaking in the medium as in Example 1. After 4 days of culture at 20 ° C., the acids are removed. guanyl-5 'and ad6nyl-59 of the culture medium according to known methods, the yields are as follows *!
EMI16.6
initial pH final pH guanylic acid-5 'adenylic acid-5' ¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯ m / 100 cm3 mp / LQQ cm3 608 5t4 bind 8.9 EXAMPLE 4
Is cultured with agitation, in the medium of Example 1, a strain of Escherichia G 1959 isolated from
EMI16.7
ground.
After 3 days of culture at 3000, the guanylic-5 ′ and adenyl-5 ′ acids are removed from the culture medium by known methods. The returns are as follows
EMI16.8
Initial pH Final pH Guanylic Acid-5 'Adenylic Acid-5' ## ¯ # ¯ 'm / 7, U0 cm3 MR / 100 cm3 6.5 5.0 9.7 8.0
EMI16.9
'KX & -1PLE 5
Is cultured with agitation, in the medium of the example an isolated Aerobacter G 103 strain
EMI16.10
of the ground . After 14 days of cultivation at 4? ' C, E, uanyliyue-5 'and adenylic-5i acids are obtained from the culture medium by known methods.
The yields are as follows;
<Desc / Clms Page number 17>
EMI17.1
initial pH final pH uanylic acid-5 adenylic acid-5 '¯¯¯¯¯ .. p'R: / 100 cm) 111IdlOQ qm3 6.8 596 51.3 44.2 EXEMPTS 6,
A layer of Paeudomonaa 0 1956 isolated from the soil is cultivated with agitation in the medium of Example 1. After 3 days of culture at 28 C, we draw the acids
EMI17.2
guanyl-59 and adenyl-5 'of the culture medium by known methods. The yields are as follows 4 initial pH oH final acid Kuanvllaue-5 'acid adénvliaue-5
EMI17.3
##### ¯ # # ¯¯ mr: / 100 cm3¯¯¯ nip./lOU crn3 6gg 5.0 13.2 lie $
EMI17.4
! ') ÇF1! Fll.z
A strain of Serratia G 2262 isolated from the soil is cultivated with agitation in the medium of Example 1.
After 3 days of culture at 28 ° C., medium is taken from
EMI17.5
culture the 5 'guanylic and 5' adenylic acids by known methods. The yields are as follows: initial pH final pH guanylic acid5 adenylic acid-5 '
EMI17.6
-¯¯¯¯¯-- ..¯.r. m / 10'J cm3¯¯¯¯. mgllüj cmj 7.0 6.8 15,) 1708 - EXAMPLE
A cultivates with agitation in the middle of
EMI17.7
Example 1/4 a strain of l3revibactsrium G $ 42 isolated from 601.
After 4 days of culture at 30 C, culture medium is taken
EMI17.8
lures guanylic-5 'and ade :: nyliqua-5' by known methods. The yields are as follows: initial pH final pH puanylic acid-51 adenylic acid-5 '
EMI17.9
# ¯¯¯¯ ¯¯ ¯ ¯¯ MF, 11 () CM3 wriluu cno
EMI17.10
<tb> 6.8 <SEP> 5.8 <SEP> 22.9 <SEP> 16.8
<tb>
EMI17.11
E .. #. iPl.E 9
Cultivated with agitation in the medium of the example wool strain of Brevibacterium G 565 isolated from the soil.
After 4 days of culture at 28 ° C., the culture medium is obtained, by known methods, the 5 ′ guanylic and ade-acids.
<Desc / Clms Page number 18>
EMI18.1
nylique-5 '* The yields are as follows:
EMI18.2
initial pH final pH guanylic acid-5 * adenylic acid-5 '; . 'im ", / la0, cm, <nc / 100 cm 7.0 5.0 32.5 30.1 EXAMPLE 10
Is cultured with agitation, in the medium of Example 1, a mouth of Micrococcus G 418 isolated from
EMI18.3
itself, After 3 days of culture at 28 ° C., the culture medium is obtained by methods com: s, lea acids; uanylique-.5 and addnyt idue-5.
The yields are as follows: initial pH final pH acidic gu ..- inyliqtie-5? adenyiQt1e-5't acid
EMI18.4
<tb> 7.0 <SEP> 6.2 <SEP> 13.7 <SEP> 15.2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> @ <SEP> EXAMPLE <SEP> 11
<tb>
<tb>
<tb> '<SEP> ######
<tb>
We cultivate with agitation, in the middle of
EMI18.5
Example 1a an isolated strain of Escherhhia G 2282. this. '. 1.
After 2 days of culture at 28 ° C., the 5 'guanyl acid is withdrawn from the culture medium, by known methods, the yield is as follows;
EMI18.6
initial pH final pH guanylic acid-51 L n) f '; / lUO cm3 792 692 807
EMI18.7
, # dP'Pt: - 12 The strain of Uacillus ü 493 is cultivated with stirring in the medium of Example 1 After 3 days of culture at 28 ° C., the guanylic acid-5 'is obtained from the culture medium by known methods.
The yield is as follows:
EMI18.8
initial pH final pH guanylic acid-51
EMI18.9
<tb> mg / 100 <SEP> cm3
<tb>
<tb> 6.8 <SEP> 4.4 <SEP> 15.2
<tb>
<Desc / Clms Page number 19>
EXAMPLE 13
The new species of Kurthia G 620 is cultured with agitation in a medium comprising 80 g / l of glucose, 20 g / l of acid hydrolyzate of casein and of which the other constituents are! same as in Example 1. After 5 days of culture at 28 ° C., the culture medium is obtained by known methods, the 5 ′ guanylic and 5 ′ adenylic acids.
The yields are as follows;
EMI19.1
<tb> pH <SEP> initial <SEP> pH <SEP> final <SEP> acid <SEP> guanylic-5 '<SEP> acid <SEP> adenylic-5'
<tb> mg / 100 <SEP> cm3 <SEP> mg / coo <SEP> cm3
<tb>
<tb> 7.0 <SEP> 5.8 <SEP> 48.1 <SEP> 85.3
<tb>
EXAMPLE 14
The new species of Kurthia G 620 above is cultivated with agitation in a medium comprising 250 g / l of mate maceration liquor in place of the hydrolysis of casein, 40 g / l of glucose and the other constituents. indicated in Example 1. After 9 days of culture at 28 ° C., the culture medium is obtained, by known methods, the acids guanylic-5 ′, adenyl-5 ′, cytidyl-5 ′, uridyl-5 'and xanthyl-5'.
The returns are as follows: @
EMI19.2
<tb> pH <SEP> initial <SEP> pH <SEP> final <SEP> acid <SEP> guanylic-5 '<SEP> acid <SEP> adenylic-5'
<tb>
<tb> mg / 100 <SEP> cm3 <SEP> mg / luu <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6.8 <SEP> 9.2 <SEP> 70.4 <SEP> 110.5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> <SEP> cutidylic-5 'acid <SEP> <SEP> uridylic-51' acid <SEP> <SEP> xanthylic-5 'acid
<tb>
<tb> mg / 100 <SEP> cm3 <SEP> mg / 100 <SEP> cm3 <SEP> mg / 100 <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 69.0 <SEP> 48.6 <SEP> 17.5
<tb>
EXAMPLE 15
The new species of Kurthia G 620 is cultured with agitation in a medium comprising 10 g / l of casein hydrolyzate, 80 g / l of glucose, 0.4 g / l of MgSO4.7H2O and the other constituents indicated in example 1.
After 7 days of culture at 28 ° C., only 5 ′ quanylic acid is drawn from the medium by the usual methods. The performance is as follows:
<Desc / Clms Page number 20>
EMI20.1
initial pH final pH guanylic acid-5 ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ - mf7l00 cm3
EMI20.2
<tb> 6.8 <SEP> 5.8 <SEP> 10.3
<tb>
EXAMPLE 16
The new species of Kurthia G 1958 is cultivated with agitation in the medium of Example 13. After 6 days of culture at 28 ° C., the culture medium is taken from the culture medium.
EMI20.3
guanylic-5 'and adenylic-5v acids by the usual methods.
The yields are as follows: initial rice final pH imanylic acid-5 'adenylic acid-5
EMI20.4
vawrrrrrlrr mrnrm tnp / 100 CM3 MI? / 100 CM3
EMI20.5
<tb> 6.8 <SEP> 5.8 <SEP> 50.5 <SEP> 82.3
<tb>
EXAMPLE 17
The new species of Bacillus o 396 is cultured with agitation in a medium comprising 100 g / l of maceration liquid / maize in place of the hydrolyzate of casein, 30 g / l of glucose and the other constituents. shapes in example 1.
After 9 days of culture at 28 ° C., the following acids are obtained from the culture militia, by the usual methods, with the following yields:
EMI20.6
initial pH final pH guanylic-5 * adenylic acid-59 ¯¯¯¯¯¯ m, y / 1C) b cm3 mg / 100 cni3 7.0 3.8 43 # 2 z cytidylic acid-5 @ uridylic acid-5 * '' xat-ithylic-5 mpr / 10Q cm3 MF / 100 cm3 m: / l0U xm, 40.5, 1 805
EXAMPLE 18
The new species of Bacillua C 396 is cultured with agitation in a medium comprising 5 g / l of! Peptone,
EMI20.7
5 g / l of succinic acid, 7.353 g / l of (NH4) 2HPO4o 0.493 g / l of Mg04.7i20 z9 g / l of KC1, 0.147 g / l of CaCl2 * 2H200 40 g / l of glucose and 1 liter of soybean extract solution which serves as a solvent in this medium.
The soybean extract solution is operated as follows; 5 g / l of defatted soybeans are extracted for 1 hour using 100 cm3
<Desc / Clms Page number 21>
of 0.1% NaOH solution in a boiling water bath and diluted to 1 liter of supernatant liquid by adding distilled water. After 8 days of culture at 28 ° C., the culture medium is drawn off with 5 ′ guanylic acid by the usual methods.
The yield is as follows:
EMI21.1
<tb> pH <SEP> initial <SEP> pH <SEP> final <SEP> acid <SEP> guanylic-5 '
<tb> - <SEP> - <SEP> mg / 100 <SEP> cm3
<tb>
<tb> 7.2 <SEP> 5.8 <SEP> 13.7
<tb>
CLAIMS 1. - Process for the preparation of guanylic acid-5 ', @ characterized in that a suitable strain of bacteria is cultivated under aerobic conditions, in an aqueous nutrient medium, for a sufficient time.