FR2546907A1 - Riboflavin prepn. - Google Patents
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Abstract
Description
La présente invention concerne un procédé de production de la riboflavine employée, par exemple, comme additif au fourrage du bétail ou dans les industries alimentaire et pharmaceutique. The present invention relates to a process for the production of riboflavin used, for example, as an additive to animal fodder or in the food and pharmaceutical industries.
On connait un procédé de production microbiologique de la riboflavine à l'aide d'une culture du champignon
Eremothecium ashbyii sur un milieu de fermentation de soja contenant de l'hydrol et de l'extrait de mais (Certificat d'Auteur de l'URSS NO 389132). Il s'accumule jusqu'à 2000-2500 mg/1 de riboflavine en 96 heures de fermentation.We know a microbiological production process of riboflavin using a mushroom culture
Eremothecium ashbyii on a soy fermentation medium containing hydrol and corn extract (Author's certificate from the USSR NO 389132). It accumulates up to 2000-2500 mg / 1 of riboflavin in 96 hours of fermentation.
Ce procédé est caractérisé par une longue période de croissance de la culture, d'où découle une durée prolongée de la fermentation, ainsi que par une sensibilité élevée de la culture la contamination avec une microflore étrangère.This process is characterized by a long period of growth of the culture, from which follows a prolonged duration of the fermentation, as well as by a high sensitivity of the culture contamination with a foreign microflora.
On connait également un procédé de production de la riboflavine par culture de microorganismes producteurs de l'espèce Bacillus subtilis sur un milieu nutritif contenant 8% de glucose comme source de carbone, les sels minéraux nécessaires et des sources de substances de croissance telles que. extrait de levure, peptone, acide glutamique, préparations de l'ARN, purines et composés analogues aux purines (Brevet des Etats Unis d'Amérique NO 3900368). Il s'est accumulé jusqu'à 560 mg/l de riboflavine après 44 heures de fermentation. There is also known a process for producing riboflavin by culturing microorganisms producing the species Bacillus subtilis on a nutritive medium containing 8% glucose as a source of carbon, the necessary mineral salts and sources of growth substances such as. yeast extract, peptone, glutamic acid, RNA preparations, purines and purine-like compounds (U.S. Patent No. 3,900,368). Up to 560 mg / l of riboflavin has accumulated after 44 hours of fermentation.
Ce procédé de production de la riboflavine est caractérisé par une grande vitesse de croissance des bacilles et, par conséquent, par une réduction de la durée de fermentation. Cependant les inconvénients de ce procédé sont un niveau relativement bas de l'activité de la culture de Bacillus subtilis et la nécessité d'utiliser des milieux de fermentation et de croissance compliqués quant à leur composition. This riboflavin production process is characterized by a high rate of growth of the bacilli and, consequently, by a reduction in the fermentation time. However, the drawbacks of this process are a relatively low level of activity in the culture of Bacillus subtilis and the need to use fermentation and growth media complicated in terms of their composition.
On s'est donc proposé en utilisant une nouvelle souche productrice de la riboflavine d'élever le rendement en ce produit et de rendre plus simple la technologie de sa production. It has therefore been proposed, using a new riboflavin-producing strain, to increase the yield of this product and to simplify the technology of its production.
Dans le procédé selon l'invention de production de la riboflavine par culture submergée dans des conditions aérobies du microorganisme producteur de la riboflavine de l'espèce Bacillus subtilis sur un milieu nutritif contenant les sources de carbone et d'azote, les sels minéraux, les stimulateurs de croissance, avec isolement ultérieur de la riboflavine on utilise en qualité de microorganisme producteur de la riboflavine la souche de Bacillus subtilisde VNIIgenetika 304/pMX 45, obtenue par une méthode d'ingénièrie génétique et déposée au
Tsentralny muzei promyshlennykh mikroorganizmov (TsMPM)
Vsesojuznogo nauchno-issledovatelskogo instituta genetiki i selektsii promyshlennykh mikroorganismov (VNIIgenetika) sous le numéro d'enregistrement TsMPM B-2694.Pour augmenter le rendement en riboflavine, on introduit la source de carbone dans le milieu nutritif d'abord à raison de 5 à 7% en masse du milieu, et on l'ajoute ensuite à raison de 3 à 5% en masse de 12 à 18 heures après le début de la culture. Pour augmenter le rendement en riboflavine, il est rationnel de réaliser le processus de culture à une température de 39 à 410C.In the process according to the invention for producing riboflavin by submerged culture under aerobic conditions of the microorganism producing riboflavin of the species Bacillus subtilis on a nutritive medium containing the sources of carbon and nitrogen, mineral salts, growth stimulators, with subsequent isolation of riboflavin, the microorganism producing riboflavin is used the strain of Bacillus subtilisde VNIIgenetika 304 / pMX 45, obtained by a method of genetic engineering and deposited in
Tsentralny muzei promyshlennykh mikroorganizmov (TsMPM)
Vsesojuznogo nauchno-issledovatelskogo instituta genetiki i selektsii promyshlennykh mikroorganismov (VNIIgenetika) under registration number TsMPM B-2694. To increase the yield of riboflavin, the carbon source is first introduced into the nutrient medium at a rate of 5 to 7 % by mass of the medium, and it is then added at a rate of 3 to 5% by mass 12 to 18 hours after the start of the culture. To increase the riboflavin yield, it is rational to carry out the culture process at a temperature of 39 to 410C.
Le procédé de l'invention permet d'élever de 4 à 8 fois le rendement en riboflavine par rapport à celui des méthodes connues, grâce à l'utilisation d'une souche productrice hautement active. De plus, le procédé permet d'utiliser des milieux nutritifs simples facilement accessibles. La souche nouvelle Bacillus subtilis VNIIgenetika 304/pMX 45 productrice de la riboflavine utilisée dans le présent procédé a été obtenue par les méthodes d'ingénierie génétique. The process of the invention makes it possible to increase the yield of riboflavin from 4 to 8 times compared to that of known methods, thanks to the use of a highly active producing strain. In addition, the process makes it possible to use simple, easily accessible nutrient media. The new Bacillus subtilis VNIIgenetika 304 / pMX 45 strain producing riboflavin used in the present process was obtained by genetic engineering methods.
Le travail de "construction" de la souche de VNIIgenetika 304/pMX 45 comprend plusieurs étapes:
1. Construction du plasmide hybride portant l'opéron de riboflavine de B.subtilis par les méthodes d'ingénièrie génétique.The "construction" work of the VNIIgenetika 304 / pMX 45 strain includes several stages:
1. Construction of the hybrid plasmid carrying the riboflavin operon of B. subtilis by the methods of genetic engineering.
2. Introduction du plasmide ainsi obtenu dans la souche réceptrice. 2. Introduction of the plasmid thus obtained into the receptor strain.
3. Vérification de l'expression de l'opéron de riboflavine dans la composition du plasmide dans la cellule pacteuse. 3. Verification of the expression of the riboflavin operon in the composition of the plasmid in the pact cell.
Au vecteur ou porteur pMX 33 déterminant la résistance des bacilles à l'érythromycine et ayant un poids moléculaire de 12 MD (M Dalton) on a additionné un fragment de l'acide desoxyribonucléique contenant les gènes de l'opéron de riboflavine de Bacillus subtilis. Il en résulte un plasmide hybride désigné par pMX 45 assurant la résistance à 20)eg/ml d'érythromycine (poids moléculaire 18 MD). To the vector or carrier pMX 33 determining the resistance of the bacilli to erythromycin and having a molecular weight of 12 MD (M Dalton) was added a fragment of the deoxyribonucleic acid containing the genes of the riboflavin operon of Bacillus subtilis. This results in a hybrid plasmid designated by pMX 45 ensuring resistance to 20) eg / ml of erythromycin (molecular weight 18 MD).
La souche de B.subtilis VNllgenetika 304, déposée au Tsentralny muzei promyshlennykh mikroorganizmov (TsMPM) Vsesoju2nogo nauchno-issledovatelskogo instituta genetiki i selektsii promyshlenyykh mikroorganizmov (VNIIgenetika) sous le numéro d'enregistrement TsMPM B-2-117 servait de souche réceptrice dans laquelle on a introduit le plasmide pMX 45. Cette souche réceptrice est "construite" par les méthodes d'ingénièrie génétique à partir des mutations obtenues indépendemment, dont chacune améliore le rendement de la synthèse de la riboflavine : rosr ribc-AGR(résistance à la roséoflavine rosr, mutation en gène régulateur ribc, résistance à la 8-azaguanine AGR). The strain of B. subtilis VNllgenetika 304, deposited at the Tsentralny muzei promyshlennykh mikroorganizmov (TsMPM) Vsesoju2nogo nauchno-issledovatelskogo instituta genetiki i selektsii promyshlenyykh mikroorganizmov (VNIIgenetika) on the registration number 2- under the registration number 2- under the number 2- under Ts- 2- no. introduced the plasmid pMX 45. This receptor strain is "constructed" by genetic engineering methods from mutations obtained independently, each of which improves the yield of riboflavin synthesis: rosr ribc-AGR (resistance to rosoflavin rosr , mutation in the ribc regulatory gene, resistance to 8-azaguanine AGR).
On a ensuite réalisé un traitement mutagène par la nitrosoguanidine, la nitrosométhyl-urée, l'irradiation avec un rayonnement ultraviolet et la sélection des variantes actives sur le milieu de fermentation.A mutagenic treatment was then carried out with nitrosoguanidine, nitrosomethyl urea, irradiation with ultraviolet radiation and the selection of the variants active on the fermentation medium.
Le plasmide pMX 45 a été introduit dans la souche réceptrice par les méthodes de transformation génétique. The plasmid pMX 45 was introduced into the receptor strain by genetic transformation methods.
Les souches transformées ont été choisies d'après les indices de résistance à 20g/ml d'érythromycine et d'après l'accroissement du niveau de la biosynthèse de la riboflavine.The transformed strains were chosen according to the resistance indices to 20 g / ml of erythromycin and according to the increase in the level of riboflavin biosynthesis.
Une expression effective de l'opéron de riboflavine dans la composition du plasmide hybride a été observé dans les souches transformées, portant simultanément le plasmide hybride et les gènes, en chromosome, assurant la synthèse de la riboflavine. An effective expression of the riboflavin operon in the composition of the hybrid plasmid has been observed in the transformed strains, carrying simultaneously the hybrid plasmid and the genes, in chromosome, ensuring the synthesis of riboflavin.
La souche B. subtilis VNIIgenetika 304/pMX 45 est capable de synthétiser jusqu'à 4500 mg/1 de riboflavine (vitamine B2). Cette souche présente des propriétés morphologiques et culturales analogues à celles de la souche réceptrice B. subtilis VNllgenetika-304. The B. subtilis VNIIgenetika 304 / pMX 45 strain is capable of synthesizing up to 4500 mg / 1 of riboflavin (vitamin B2). This strain has morphological and cultural properties similar to those of the B. subtilis VNllgenetika-304 receptor strain.
Caractères culturaux et morphologiques de la souche
VNIIgenetika 304/pMX 45
N Morphologie au bâtonnet grampositif de d'ordre microscope 2/3 de longueur
1 2 3
Morphologie dans
divers milieux
1 Agar à peptone de Après 1 à 2 jours de croissance
viande à une températures de 28 à
37 C forme des colonies à bord
irrégulier dentelé de 3-4 mm
de diamètre, en une surface
plate, brillante, de couleur
jaune.Cultural and morphological characteristics of the strain
VNIIgenetika 304 / pMX 45
N Morphology with a gramposive rod of microscope order 2/3 of length
1 2 3
Morphology in
various backgrounds
1 peptone agar after 1 to 2 days of growth
meat at temperatures of 28 to
37 C form colonies on board
jagged irregular 3-4 mm
in diameter, in one area
flat, shiny, colored
yellow.
2. Bouillon à pepto- La croissance suivant la pi
ne de viande qure est modérée, principa
lement sur la surface du
milieu. La croissance est sans
fluctuation sous forme de
pellicule sur la surface.2. Peptide broth - Growth following pi
only moderate meat, mainly
on the surface of the
middle. The growth is without
fluctuation in the form of
film on the surface.
3. Milieu minimal Au 2e jour de la croissance se
de Specizen conte- forment des colonies rondes
nant du glucose de 2-3 mm de diamètre, bril
lantes,de couleur jaune vif,
fluorescentes en jaune sous
irradiations U.V.3. Minimum medium On the 2nd day of growth,
of Specizen contain round colonies
with 2-3 mm diameter glucose, shine
lantes, bright yellow in color,
fluorescent in yellow under
UV irradiations
4. Caractères phy- Il croît à une température de
siologiques et 28 à 42 C, optimum à 37 C,
biochimiques pH 5,0-9,0. Sources de car
bone : utilise bien le gluco
se, le saccharose, l'amidon.4. Physical characters- It grows at a temperature of
siological and 28 to 42 C, optimum at 37 C,
biochemical pH 5.0-9.0. Coach sources
bone: use gluco well
se, sucrose, starch.
Sources d'azote: assimile
bien l'ammonium, l'urée, leS
nitrates. Il fluidifie la géla
tine. Nitrogen sources: assimilates
well ammonium, urea, leS
nitrates. It thins the gela
tine.
Le procédé selon l'invention de production de la riboflavine est mis en oeuvre de la manière suivante. The process according to the invention for producing riboflavin is carried out as follows.
Une culture âgée de 1 jour, cultivée sur l'agar de viande-peptone incliné ou agar de viande-peptone avec 20flg/ml d'érythromycine, est placée dans des fioles avec le milieu d'ensemencement, contenant de la mélasse ou du saccharose, de la biomasse de levures de fourrage desséchés et des sels minéraux. On cultive le milieu ensemencé à la température de 370C pendant 17 à 24 heures dans des conditions aérobies et on l'introduit à raison de 10z en masse au maximum dans le milieu de fermentation principal. On réalise la fermentation à une température de 37 à 410C dans un fermenteur sous agitation et aération intensives.Le milieu de fermentation renferme comme source de carbone du glucose ou du saccharose ou de la mélasse ou de l'amidon, des sources d'azote minéral, par exemple, de l'urée ou des sels d'ammonium ou des nitrates, ainsi que des sels minéraux nécessaires. On peut utiliser comme source de facteurs de croissance dans le milieu nutritif la biomasse desséchée de levures de fourrage ou alimentaires, un extrait de levure, de la peptone, de l'hydrolysat de caséine, de l'extrait de mais. On peut effectuer la fermentation par deux procédés.Suivant le premier procédé, on introduit dans le milieu en une fois les quantités de carbone nécessaire, suivant l'autre procédé le milieu au début de la fermentation contient 5-7 - en masse de source de carbone, et on introduit encore 3-5%- en masse 12 à 18 heures après que la culture ait atteint la phase de croissance stationnaire. Après 40 à 48 heures de culture de la souche de B.subtilis VNIIgenetiMa 304/pMX 45, il s'accumule dans le liquide de culture de 1600 à 4500 mg/1 de riboflavine. A 1-day-old culture, cultivated on inclined meat-peptone agar or meat-peptone agar with 20 μg / ml of erythromycin, is placed in flasks with the seeding medium, containing molasses or sucrose , dried fodder yeast biomass and mineral salts. The inoculated medium is cultivated at a temperature of 370C for 17 to 24 hours under aerobic conditions and is introduced at a rate of 10z by mass at most into the main fermentation medium. Fermentation is carried out at a temperature of 37 to 410C in a fermenter with intensive stirring and aeration. The fermentation medium contains as source of carbon glucose or sucrose or molasses or starch, sources of mineral nitrogen , for example, urea or ammonium salts or nitrates, as well as necessary mineral salts. Can be used as a source of growth factors in the nutritive medium the dried biomass of fodder or food yeasts, a yeast extract, peptone, casein hydrolyzate, corn extract. Fermentation can be carried out by two processes. Following the first process, the necessary quantities of carbon are introduced into the medium at once, according to the other process the medium at the start of fermentation contains 5-7 - by mass of source of carbon, and another 3-5% mass is introduced 12 to 18 hours after the culture has reached the stationary growth phase. After 40 to 48 hours of culture of the B. subtilis VNIIgenetiMa 304 / pMX 45 strain, it accumulates in the culture liquid from 1600 to 4500 mg / 1 of riboflavin.
On isole la riboflavine par les méthodes connues, par évaporation du liquide de culture obtenue avec la biomasse. On obtient alors un concentré de riboflavine. Riboflavin is isolated by known methods, by evaporation of the culture liquid obtained with the biomass. A riboflavin concentrate is then obtained.
La riboflavine peut etre également isolée à l'état pur, sous forme d'une substance cristalline, selon la technologie connue. Le procédé proposé permet d'augmenter de 4 à 8 fois le rendement en riboflavine par rapport à celui des procédés connus et de rendre plus simple la technologie du processus par utilisation de milieux nutritifs simples et d'accès facile.Riboflavin can also be isolated in the pure state, in the form of a crystalline substance, according to known technology. The proposed method makes it possible to increase the yield of riboflavin by 4 to 8 times compared to that of known methods and to simplify the technology of the process by using simple and easily accessible nutrient media.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre d'exemples de réalisation concrets. Other characteristics and advantages of the invention will be better understood on reading the description which will follow of concrete embodiments.
EXEMPLE 1
La culture âgée d'un jour de Bacillus subtilis VNIfgenetika 3O4/pMX 45 cultivée sur l'agar de viandepeptone incliné est placé par piqûre dans un milieu d'ensemencement liquide de composition suivante, en % en masse::
mélasse ................................... 6,0
biomasse desséchée de levures
de fourrage ........................ 1,0
(NH4)2S04 0,1
KH2PO$ ..................................... 0,3
K2HPO4 ..................................... 0,7
MgSO4 ...................................... 0,01
eau complément à ..................... 100
pH = 6,5
On cultive le milieu d'ensemencement dans des fioles d'Erlenmeyer de 750 ml de volume (celui du milieu 25 ml) sur une machine oscillante réglée à 200 alternances par minute à la température de 370C pendant 20 heures et on l'introduit à raison de 10% en masse dans le milieu de fermentation de composition suivante, en % en masse::
mélasse ................................... 12,0
biomasse desséchée de levures de
fourrage .................................. 2,0
(NH4)2S04 .............. 0,4
KH2PO4 0,1
K2HPO4 .................................... 0,1
MgSO4 0,2
eau complément à .................... 100.EXAMPLE 1
The day-old culture of Bacillus subtilis VNIfgenetika 3O4 / pMX 45 cultivated on the inclined viandepeptone agar is placed by injection in a liquid seeding medium of the following composition, in% by mass:
molasses ................................... 6.0
dried yeast biomass
of forage ........................ 1.0
(NH4) 2S04 0.1
KH2PO $ ..................................... 0.3
K2HPO4 ..................................... 0.7
MgSO4 ...................................... 0.01
water supplement to ..................... 100
pH = 6.5
The inoculating medium is cultivated in Erlenmeyer flasks of 750 ml in volume (that of the medium 25 ml) on an oscillating machine set at 200 vibrations per minute at a temperature of 370C for 20 hours and introduced at the right rate. 10% by mass in the fermentation medium of the following composition, in% by mass:
molasses ................................... 12.0
dried biomass of yeast
fodder .................................. 2.0
(NH4) 2S04 .............. 0.4
KH2PO4 0.1
K2HPO4 .................................... 0.1
0.2 MgSO4
water supplement to .................... 100.
pH=7,0. pH = 7.0.
On réalise la fermentation dans des fioles de 750 ml de capacité (volume du milieu 25 ml) sur une secoueuse de 200tr/mn à la température de 37 C. Après 48 heures de fermentation le liquide de culture contient 1600 mg/1 de riboflavine. The fermentation is carried out in 750 ml capacity flasks (volume of the medium 25 ml) on a 200 rpm shaker at a temperature of 37 C. After 48 hours of fermentation, the culture liquid contains 1600 mg / 1 of riboflavin.
EXEMPLE 2
On cultive le milieu d'ensemencement comme dans l'exemple 1. Le milieu de fermentation a la composition suivante, en % en masse:
saccharose ....... ... 10,0
biomasse desséchée de levures de
fourrage ...,..,.....,................... 2,0
urée ........................................ 0,6
KH2PO4 ...................................... 0,1 K2HPO4 0 Ó.O 0,1
MgSO4 ......................................... 0,2 eau complément à ... .... .. . 100
pH = 6,5.EXAMPLE 2
The seeding medium is cultivated as in Example 1. The fermentation medium has the following composition, in% by mass:
sucrose ....... ... 10.0
dried biomass of yeast
fodder ..., .., ....., ................... 2.0
urea ........................................ 0.6
KH2PO4 ...................................... 0.1 K2HPO4 0 Ó.O 0.1
MgSO4 ......................................... 0.2 water supplement to .. . .... ... 100
pH = 6.5.
On réalise la fermentation dans un fermenteur de 0,5 l de capacité sous aération intensive (1,5 volume d'air pour 1 volume de milieu) et agitation (700-1000 tr/mn de l'agitateur) à la température de 370C. Fermentation is carried out in a fermenter of 0.5 l capacity under intensive aeration (1.5 volume of air for 1 volume of medium) and stirring (700-1000 rpm of the agitator) at a temperature of 370C .
Après 48 heures de fermentation le liquide de culture contient 2100 mg/l de riboflavine. After 48 hours of fermentation, the culture liquid contains 2100 mg / l of riboflavin.
EXEMPLE 3
La culture âgée d'un jour de Bacillus subtilis
VNIIgenetika 304/pMX 45 cultivée sur l'agar de viandepeptone incliné est transférée par piqûre sur un milieu d'ensemencement de composition suivante, en % en masse;
saocharose ................................... 3,0
biomasse desséchée de levures
de fourrage .................................. 2,0
urée 0 0,6
KH2P04 j 0,1
K2HP04 o 0,1
MgS04 0,2
eau domplément à ............................ 100
pH=6,5. EXAMPLE 3
The day-old culture of Bacillus subtilis
VNIIgenetika 304 / pMX 45 cultivated on the inclined viandepeptone agar is transferred by injection onto a seeding medium of the following composition, in% by mass;
saocharose ................................... 3.0
dried yeast biomass
of fodder .................................. 2.0
urea 0 0.6
KH2P04 d 0.1
K2HP04 o 0.1
MgS04 0.2
domestic water at ............................ 100
pH = 6.5.
On cultive la semence dans des fioles d'Erlenmeyer de 750 ml de capacité (volume du milieu 30 ml) sur une secoueuse de 200 tr/mn à la température de 370C pendant 20 heures et on l'introduit à raison de 5% en masse dans un milieu de fermentation de composition suivante, en % en masse:
saccharose .................................. 7,0
biomasse desséchée de levures
de fourrage .................................. 2,0
urée ......................................... 0,6
KH2PO4 ....................................... 0,1 K2HPO4 0 0,1
MgSO4 ......................................... 0,2 eau complément à D . 100
pH = 6,5.The seed is cultivated in Erlenmeyer flasks of 750 ml capacity (volume of the medium 30 ml) on a shaker of 200 rpm at a temperature of 370C for 20 hours and it is introduced at the rate of 5% by mass in a fermentation medium of the following composition, in% by mass:
sucrose .................................. 7.0
dried yeast biomass
of fodder .................................. 2.0
urea ......................................... 0.6
KH2PO4 ....................................... 0.1 K2HPO4 0 0.1
MgSO4 ......................................... 0.2 water supplement to D. 100
pH = 6.5.
On effectue la fermentation dans un fermenteur de 0,5 1 de capacité sous aération (1,5 volume d'air pour 1 volume de milieu) et agitation intensives (1000 tr/mn de l'agitateur) à la température de 400C. Après 16 heures de fermentation on introduit d'une façon stérile 3% en masse de sucre. The fermentation is carried out in a fermenter of 0.5 1 capacity under aeration (1.5 volume of air for 1 volume of medium) and intensive stirring (1000 rpm of the agitator) at the temperature of 400C. After 16 hours of fermentation, 3% by mass of sugar is introduced in a sterile manner.
Après 40 heures de fermentation, le liquide de culture contient 3500 mg/l de riboflavine. After 40 hours of fermentation, the culture liquid contains 3500 mg / l of riboflavin.
EXEMPLE 4
La culture âgée d'un jour de Bacillus subtilis
VNIIgenetika 304/pMX 45 cultivée sur le milieu d'agar de viande-peptone avec de l'érythromycine est incubée pendant 12 heures sur un milieu d'ensemencement nutritif de composition suivante, en % en masse:
sucre alimentaire 0 5,0
biomasse desséchée de levures
de fourrage * 1,0
urée .......................................... 0,6
KH2PO4 ........................................ 0,1
K2HPO4 ........................................ 0,1 MgSO 0,1
eau complément à ............................. 100
pH = 6,5
On réalise la fermentation dans un fermenteur de 630 1 de capacité, le volume du milieu de travail étant de 300 1, la vitesse de la machine oscillante étant 140 alternances par minute et sous aération de 18 m /mn les premières 18 heures de la croissance et de 24 à 27 m3/mn durant les heures suivantes de la croissance et à une température de 39 à 410C. On introduit la semence à raison de 1% en masse dans le milieu nutritif de fermentation de composition suivante, en % en masse: :
sucre alimentaire ............................... 5,0
biomasse desséchée de levures de
fourrage 2,0
urée ............................................. 0,6
MgSO4 ............................................ 0,2
KH2P04 0,1
K2HPO4 .......................................... 0,1
eau complément à .................. 100
pH = 6,5
Après 12 heures de fermentation on ajoute encore 5% en masse de sucre.EXAMPLE 4
The day-old culture of Bacillus subtilis
VNIIgenetika 304 / pMX 45 cultivated on the meat agar-peptone medium with erythromycin is incubated for 12 hours on a nutritive seeding medium of the following composition, in% by mass:
edible sugar 0 5.0
dried yeast biomass
forage * 1.0
urea .......................................... 0.6
KH2PO4 ........................................ 0.1
K2HPO4 ........................................ 0.1 MgSO 0.1
water supplement to ............................. 100
pH = 6.5
Fermentation is carried out in a fermenter of 630 1 capacity, the volume of the working environment being 300 1, the speed of the oscillating machine being 140 vibrations per minute and under aeration of 18 m / min the first 18 hours of growth. and from 24 to 27 m3 / min during the following hours of growth and at a temperature of 39 to 410C. The seed is introduced at a rate of 1% by mass into the nutritive fermentation medium of the following composition, in% by mass:
edible sugar ............................... 5.0
dried biomass of yeast
fodder 2.0
urea ............................................. 0.6
MgSO4 ............................................ 0.2
KH2P04 0.1
K2HPO4 .......................................... 0.1
water supplement to .................. 100
pH = 6.5
After 12 hours of fermentation, another 5% by mass of sugar is added.
Après 25 heures de fermentation le liquide de culture contient 4500 mg/l de riboflavine. After 25 hours of fermentation, the culture liquid contains 4500 mg / l of riboflavin.
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