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L'invention a pour objet des procédés de fermenta- tion pour l'obtention de nucléotides-5'. Plus particulière- ment, elle a pour objet des procédés visant à obtenir l'acide guanylique-5' en cultivant des bactéries dans des milieux pro- pres à la croissance de celles-ci.
Les nucléotides-5' tels que l'acide guanylique-5' et l'acide inosinique-5' sont des arômes utiles, en petites quantités, pour rehausser le goût des aliments, boissons et condiments. On a trouvé qu'il est possible d'obtenir ces nu- cléotides par dégradation enzymatique do l'acide ribonucléi- que. Toutefois, ce procéda ne convient pas particulièrement à la fabrication commerciale de nueléctides, car la matière première est coûteuse et les produits individuels sont diffi- ciles à isoler et à séparer. En conséquence, on a recherché d'autres méthodes plus appropriées à la préparation des nucléo- tides-5' et en particulier de l'acide guanylique-5',
L'un des buts de l'invention est d'indiquer un procédé de préparation de nucléotides-5' qui utilise des ma- tières premières peu coûteuses et facilement sccessibles.
Un autre but est d'indiquer un procédé de fabrication commerciale d'acide guanylique-5'. Un autre but est encore d'indiquer un procédé de fabrication commerçiale de l'acide adénylique-5'.
D'autres, buts apparaîtront dans la description détaillée de l'invention, donnée ci-après.
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Suivant l'invention, on a trouvé que de nouvelles souches de bactéries isolées de sources naturelles au moyen d'un procédé de triage utilisant une mutante avide de guanine, peuvent être cultivées dans des milieux appropriés et donner de l'acide guanylique-5', seul ou joint à d'autres nucléotids- 5'.
On a trouvé ainsi que les souches de bactéries productrices d'acide guanylique-5' et isolées par le procédé de triage de l'invention peuvent être cultivées sur des milieux appropriés contenant des sources d'azote, de carbone et de sels minéraux essentiels nécessaires au microorganisme pour produire de l'a- cide guanylique-5', isolément ou joint à d'autres nucléotides- 5' comme les acides adényliques-5',cytidylique-5', uridyli- que-$' et xanthylique-5', Dans la réalisation des pro:édés de l'invention, on peut utiliser différentes espèces de bacté- ries.
Par exemple on a trouvé que des souches de bactéries appartenant à l'ordre des eubactériales et à celui des pseudo- monadales, comme les souches de brévibactériacées, de bacil- lacées, d'entérobactériacées, de micrococcacées et de pseudo- monadacées isolées par le procédé de triage suivant l'inven- tion sont utiles dans la préparation de l'acide guanylique-5' et d'autres nucléotides-5' suivant l'invention.
Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ces bactéries particulières @ car toutes les espèces de bactéries que l'on peut isoler sui- vant le procédé de triage décrit, ainsi que leurs mutantes obtenues par l'action des rayons X, des rayons ultra-violets, etc., peuvent servir à produire de l'acide guanylique-5'et d'autres nucléotides-5'suivant l'invention. Ainsi, l'invention indiqua un procédé commode pour la préparation de l'acte* guanylique-5' et d'autres nucléotides-5' 4 'échelle commercia- le, à partir de matières premières peu coûteuses et facilement accessibles.
L'acide guanylique-5' et certains autres nucléo- tidës-5' sont utiles comme arômes et en outre ce sont d'impor- @ tante intermédiaires métaboliques; On peut facilement conver- tir l'acide adénylique-5' en acide inosinique-5' qui est
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un important composé aromatisant, en le traitant par l'acide nitreux ou par la déaminase adénylique.
Bien que l'on ait fait des recherches considéra. blés pour trouver des procédés de préparation de nucléotides par fermentation, il n'était pas connu, avant l'invention, d'accumuler l'acide guenylique-5' ou des mélanges de celui-ci et d'autres nucléotides-5'. On a trouvé qu'en isolant de sources naturelles des souches nouvelles de bactéries pré- sentant trois caractéristiques particulières, grâce au pro- cédé de triage de l'invention qui utilise une souche auxo- tropique avide de guanidine, et en cultivant ces miccoorga- nismos dans des milieux de culture appropriés, on peut obtenir l'acide guanylique-5',seul ou avec un ou plusieurs autres nucléotides-5'.
Les caractéristiques de ces souches de bactéries propres à servir dans le procédé nouveau sont les suivantes :
1) on accumule une grande quantité d'acide guany- lique-5' en cultivant les souches sur des milieux appropriés, et suivant la souche particulière de bactérie et le milieu utilisé, on peut obtenir concuremment un ou plusieurs autres nucléotides. Le fait que l'on obtienne des nucléotides-5' en cultivant ces souches de bactéries suggère que ces souches doivent avoir des systèmes de régulation métabolique parti. culière dans le processus de biosynthèse de purine. De plus on ne savait pas antérieurement qu'il était possible d'accu- muler à la fois l'acide guanylique-5' et l'acide adénylique- 5' en grandes quantités dans les conditions usuelles de cul. ture.
2) le fait que la guanine, l'adénine, et d'au- tres produits de dégradation des nucléotides-5' ne se trou- vent pas en quantités appréciables dans les bouillons donn @ pa.a culture des microorganismes, suggère que les nucléo- tides-5' fermés dans la cellule sont excrétés et s'accumu-
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lent dans le bouillon sans dégradation et que les cellules des souches isolées par les inventeurs n'opposent pas une barrière de perméabilité aux nucléotides. De façon gé- nérale, la perméabilité des microorganismes est très sélec- tive et les nucléosides et autres produits de dégradation des nucléotides sont relativement perméables alors que les nucléotides ne se sont pas.
En fait, on a signalé que les nucléosides et d'autres produits basiques de dégradation des nucléotides étaient excrétés hors des cellules. Cependant, dans le cas où l'on cultive les nouveaux microOrganismes de l'invention, on trouve que seules les nucléotides sont excrétés en assez grandes quantités.
3) le fait que l'acide guany?.ique-5' et les au- tres nucléotides-5' accumulés dans le bouillon ne soient pas dégradés dans une mesure notable indique que les nouvelles souches qui produisent l'acide guanylique-5' n'or,t pas d'ac- tion enzymatique sur les nucléotides accumulés.
C'est donc là une caractéristique importante des souches de l'invention*
Suivant une autre forme de réalisation de l'inven- tion, on a trouvé que l'on peut isoler de sources naturel- les les bactéries particulières propres à la production d'acide guanylique-5' suivant l'invention en utilisant une mutante de B. subtilis avide de guanine, de la façon suivantes avec les bactéries isolées, on inocule des milieux solides dans des boites de Pétri et on tue les colonies obtenues par irradiation à l'ultra-violet et on les couvre d'un mi- lieu solide contenant la mutante de B. subtilis avide de guanine mentionnée plus haut. Après la culture, on examine la zone de halo ou zone de croissance de la mutante.
La grandeur et 1* épaisseur du halo formé autour de la colonie de bactéries dépend de la quantité de dérivés de guanine produite par la bactérie particulière. Aussi, les souche* de bactéries productrices d'acide guanylique-5' qui conviennent
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rdail 1'tlon de l'inirention Dont chointes dtaprès la eraredour st S L épeiaaaur du halo formé autotir de la colo- nie de la Che "'"" trouvé que chaque souche tl par la têthode ci.-deaata accumule de grandes quan- tltés de auba ,nc8a absorbant les rayons ultra-violets dans Un milieu qui V"'"#1"' pluo de sources de mutante i..ieabla qui- n'en faut pour développer la culture dans des iniiieux A'6ré3,\,Iti a trouvé que les substances absorvant *< J-eyDM u3txa-vi' t a conr,,
ernent 1acide guanylLque contiennent de lucide guanylique- 'soit 1901(Mont -c...... nucléotides comme l'acide adénylique-5t. , facilement Isoler ces com- PO 48 du milieu de ###### les purifier suivant des ,11 Cmm"' A1M1> on a trouvé une procédé de bio a3rnthésa permettant de préparer 1acide guanylique-590 seul ou joint à d'être,
nucléotides.- tableau sui^vant don4e brèves explications sur certaines des principales carmctériqtiquen morphologi- que& des bouche* UtilO6 tYPiques Isolées auivant bzz
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EMI6.1
<tb> souche <SEP> forme <SEP> dea <SEP> spores <SEP> Colora- <SEP> Sou- <SEP> Forme <SEP> Spores <SEP> Colona-
<tb>
<tb> n <SEP> cellu- <SEP> tion <SEP> che <SEP> des <SEP> tion
<tb>
EMI6.2
les Ctîm t cel- Gram Iules ¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI6.3
<tb> 0 <SEP> 103 <SEP> bâtonnets <SEP> - <SEP> - <SEP> G <SEP> 1202 <SEP> bâton- <SEP> - <SEP>
<tb>
<tb> nets
<tb>
EMI6.4
G 208 Il - - G 1632 " 0443 " ; - G 1956 M G 826 \ - G 1959 " 0 2262 Il i - - G 2282 w G 408 If 1 - + G 296 " -t- + G 409 M + G 493 z 1......
G 416 h + G 549 " + # G 425 t1! - ... G 613 + # G 478 If - + G 628 + it Q 505 " 1... + 0 630 " + 1 G 620 + G 849 " + + Q 845 " - + G 2293 * + + G 847 " 1...... G 172 cocci + G 848 ni'" + G 418 " + G 1958 " - t G 629 " - + G 105 " 1 + + G 1288 # - + G 393 8t ! 1"'''' G 2558 u - + G 395 ..,...... G 2833 - +
D'après la forme cellulaire, la coloration Gram et les caractéristiques de sporulation, on peut diviser ces bacté- ries 'on trois groupes, à savoir : 1) les souches Gram* for- mant des bâtonnets (avec.ou sans sporulation), 2) les sou-
EMI6.5
ches (firam4" formant des bâtonnets, et z) les souches for- mant en cocoï. La plupart des souches de bactéries obtenues par le prcl(h1dl.( de triage de l'invention :...ont du premier groupe et le troisième groupe contient le plus petit nombre de souches.
Toutefois , cela n'est pas important et il faut déduire du tableau ci-dessus que la classification des sou-
EMI6.6
chefs n'est pas en relation directe avec la productivité spécifique d'acide euanylique-5' et d'autres nucléotidea-
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$'. Autrement dit, on considère que cette productivité est basée sur la spécificité physiologique de la souche indivi- duelle. Donc, l'invention n'est paa limitée par la classifi- cation bactérienne, mais elle peut s'appliquer à toutes les bactéries présentant des caractéristiques physiologiques telles qu'elles accumulent de l'acide guanylique-5', seul ou joint à d'autres nucléotides-5'.
On a trouvé que huit souches de bactéries, à savoir G 620, G 408, G 409, G 416, G 478, G 845, G 847 et G 1958, indiquées au tableau ci-desus, représentent une nouvelle espèce de Kurbhia. Les caractéristiques morpholo- giques et physiologiques de ces souches isolées de différentes sources ne se trouvent pas dans le Manual of Determinative Baeteriology" de Bergey, 7ème édition. Donc, ces souches sont reconnues comme tant une espèce nouvelle. Voici les caractéristiques de l'une de ces souches, la G 620, selon le schéma donné dans le "Manual of Microbiological Methods", 1957.
(1) Forme des cellules, culture de 18 heures sur agar-agar à l'extrait de boeuf à 30 C;
1. Cellules végétatives: bâtonnets de 0,8 - 0,9 x 4-7 microns, à extrémités arrondies non ramifiées, apparaissant indivuellement ou paires, et occasionnellement par chaînes de trois bâtonnets.
2. filaments formés dans le milieu usuel et dans un large intervalle de température. La formation n'est pan inhibée par l'addition d'agents nutritifs spéciaux comme la biotine.
Les filaments formés se subdivisent ensuite en cellules végétatives de type usuel. Les filaments ont en- viron 30 - 300 microns de longueur.
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EMI8.1
3. Mobilité S mot.a 4. Enclos pore s pas dA formation . Coloration Gram 1 posit1v.
Z) Strie sur agar-agar ! culture de 20 heures sur agar-agar à l'extrait de boeuf à 0' : 1. Croissance : abondante 2. forme : étalée ou échinulée 3. Eclat : terne
EMI8.2
4. Chromog6nâse grill-blanc faible à jaune- bltJ.tL1ai ble
5. Odeur : putride ou ammoniacal*
6. Consistance } butyreuse ou légèrement vis- queuse 7. Milieu :inchangé 3) Colonie sur agar-agar : culture de 48 heures sur agar-agar à l'extrait de boeuf à 30 C :
1.Forme :circulaire
2. Surface : légèrement lisse
EMI8.3
3. Bord : ., lacér6 ' 4. Relief ; légèrement convexe
5. Densité ; opaque 4) Bouillon à l'extrait de boeuf :culture de 24 heures à 30 C.
1, Croissance superficielle; forme un anneau fragile
2. Trouble : léger
3. Degré de croissance :modérée
4. Sédiment : léger précipité nuageux
5. Caractères physiologiques
EMI8.4
1. Liquéfaction de la gélatine : rapidement liquéfiée, stria- tiforcae.
2. Fermentation des sucres :
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EMI9.1
<tb> Production <SEP> d'acide <SEP> Production
<tb>
EMI9.2
' ¯-¯¯¯-- # # -¯# # . de gaa Glucose - *11 Lactose # m a Sucras ¯.¯ z.¯ ¯ op 1.1.-* -- %;" 3. Fermentation anaérobie du glooose : négative.
4. Action sur le lait de tournesol.
EMI9.3
.¯pH ,¯ . ¯ ¯ " --- alcalin caillot acide @ négatif caillot présure @ négatif peptonisation positive réduction négative
5. Réduction des nitrates :négative b. Production d'indole : négative
7. Production d'hydrogène sulfuré: positive 8. Ralation avec l'oxygène : aérobie
9. Température:
Température de croissance optimum au voisinage
EMI9.4
de 33*C ; pas de croissance à 440C ; bonne croissance à 20 - 37 C :
EMI9.5
point de mort thermique : 10 minutes à 5t'C.
10. pH optimal 1,0,0 critique de croissance 5,0 11. Chromogénèse : sur'gélatine jaune marguerite sur agar-agar blanc-gris faible à blanc . jaune faible sur pomme de terre chamois vif
EMI9.6
12. Réaction de Voge8-Prosauer: négative.
13. Réaction du rouge méthyle : négative 14. Utilisation de citrate positive 15. Utilisation d'acide urique :positive 16. Hydrolyse de 1* amidon ; faible.
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17. Hydrolyse de la caséine:positive 18. Uréase : positive 19. Catalase :positive 20. Accumulation d'acide guanylique-5' (et d'acide adénylique-5') ; positive ( grande accumulation), l'accumu- lation de nucléosides ou de dérivés inférieures d'acides nucléiques est négative.
21. Source : isolé d'un échantillon de sol.
Il est reconnu que cette souche 6 620 appartient à la famille des Brévibactéracées décrite dans le "Manual of Determinative Bacteriology " de Bergey, 7ème édition, parce qu'elle est Gram+, en bâtonnets non ramifiés, ne forme pas de spores et n fait pas fermenter le glucose dans des conditions anaérobies. Cotte famille se divise en,deux gen- res : Brevibacterium et Kurthia .Le premier est formé de courts bâtonnets non ramifiée , presque coccoides, non fi- lamenteux et produisant habituellement de l'acide à partir d'hydrates de carbone simples. Par contre, la souche 6 620 considérée n'est pas ramifiée, forme de longs bâtonnets et filaments et ne produit pas d'acide à partir d'hydrates de carbone simples. Ainsi, il est évident que la souche G 620 n'appartient pas au genre Brevibacterium mais au genre Kurthia.
Suivant le"Manual od Determinative Bacteriology" de Berger, 7ème édition, il existe trois espèces dans le genre Kurhia. L'une, la Kurthia bessonii, est capable de liquéfier la gélatine mais les deux autres espèces en sont incapables, Etant donné que la souche considérée liquéfiée la gélatine, l'espèce à laquelle elle ressemble le plus parmi les trois espèces de Kurthia décrites est la Kurthia bessonii. Toute- fois, la souche- G 620 est différente de la Kurthia besonii par les deux caractériqtiques suivantes:
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EMI11.1
<tb> Kurthis <SEP> bessonii <SEP> G <SEP> 620
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ,1. <SEP> Hydrogène <SEP> sulfuré <SEP> non <SEP> produit <SEP> produit
<tb>
<tb>
<tb> 2. <SEP> Relief <SEP> de <SEP> la <SEP> colonie
<tb>
<tb>
<tb> sur <SEP> agar-agar <SEP> @ <SEP> ombiliquée <SEP> ombonée
<tb>
<tb>
<tb>
Il est donc reconnu que cette souche est une nouvelle espèce du genre Kurthia. Non seulement cette souche accumule de grandes quantités d'acides guanylique-5' et adé- nylique-5', mais encore au moins un composé du groupe qui comprend les acides utidylique-5', cytidylique-5' et xanthy- lique-5', dans les conditions de culture appropriées.
Les caractères physiologiques et morphologiques des sept autres souches sont presque semblables à ceux de la souche G 620, Aussi, ces sept souches, G 408, G 409, G 416, G 478, G 845, G 847 et G 1958, aussi bien que G 620, sont reconnues comme- une nouvelle espèce de Kurthia. Il est inutile de dire que l'invention comprend l'utilisation de cette espèce nouvelle.
D'autre part, on a trouvé que les bactéries sporulentes, G 105, G 393, G 396, G 493, 0 549, G 618, G 628 et G 2293, qui ont été isolées de différentes sources, sont une nouvelle espèce de genre Bacillus. Les caractères morphologiques et physiologiques de ces souches ne se trou- vent pas dans l'ouvrage de Bergay déjà cité. Ces souches représentent donc une nouvelle espèce. Les caractères d'une souche, G 396, de la nouvelle espèce de Bacillus, sont dé- crits ci-après selon le schéma descriptif du "Manual of Microbiological Methods" , 1957 : (1) Forme des cellules, culture de 20 heures sur agar-agar à l'extrait de boeuf à 30 C:
1. Cellules végétatives ;bâtonnets de 1,0 - 1,3 sur 3-5 microns en moyenne, à extrémités arrondies, non ramifiés, se présentant individuellement ou par paires.
Sur agar-agar nutritif au glucose, la croissance est plus abondante, les Bâtonnets sont plus larges, plus longs et plus vacuoles et forment des fuseaux ou des coins plus faci- lament que sur l'agar-agar nutritif.
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2. Mobilité : faiblement mobiles
3. Sporanges :pas nettement gonflés
4. Spores: 1, Dxi, 2 microns en moyenne, ovales, centrales ou terminales, nombreuses en 48 heures.
5. Coloration Gram : positive.
(2) Strie sur agar-agar, culture de 20 heures sur agar-agar à l'extrait de boeuf à 30 C.
1. Croissance ! : abondante 2. Forme : S lisse, étalée ( les vieille. cellules sont ridees).
3. Eclat brillant
4. Chromogénèse :blanc crémeux à jaune clair.
5. Consistance butyreuse 6. Milieu 1 Inchangé (3) Bouillon d'extrait de boeuf, culture de 48 heures à 30 C. il- Croissance superficielle nulle
2. Trouble : prononce, uniforme
3. Degré da croissance :abondante @ 4. Sediment: Modéra , (4) Colonie sur agar-agar, culture de 20 heures sur agar- agar à l'extrait de boeuf à 30 C.
1. Forme :circulaire
2. Surface :lisse
3. Bord: entier
4. Relief ; convexe à élevé
5. Densité : opaque (5) Culture inclinée sur agar-agar au soja ; croissance abondante.
(5) Bouillon NaCl : pas de croissance dans NaCl à 2%.
(7) Propriétés physiologiques
1. Liquéfaction de la gélatine liquéfiée lentement, infondibuliforme.
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2. Fermentation des sucres ( milieu d'Ayers)
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<tb> Production <SEP> Production
<tb>
<tb> d'acide <SEP> de <SEP> pais
<tb>
<tb> arabinose
<tb>
<tb>
<tb> xylose <SEP> 4 <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> glucose <SEP> + <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> galactose <SEP> + <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> fructose <SEP> + <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> sucrcse <SEP> + <SEP> on <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> Mannitol <SEP> + <SEP> -
<tb>
<tb>
<tb> lactose <SEP> @ <SEP> + <SEP> -
<tb>
3. induction des nitrates ; positive 4. Production anaérobie de gaz à partir de ni- trate :positive
5, Réaction de Voges-Proskauer (co) t faiblement positive 6. Réaction du rouge-méthyle :post tive
7. Utilisation de citrate:positive
8. Hydrolyse de l'amidon ; faible
9.
Hydrolyse de le, caséine :positive
10 Culture inclinée sur agar-agar à latyrosine: inchangée.
11. Catalase :positive
12. Accumulation d'acide guanylique-5' et d'a- cide adénylique-5' : positive( forte accumulation) l'accu- mulation de nucléosides ou de dérivés inférieures d'acide nucléique est négative.
13. Source :isolée d'un sol.
(oo) Milieu peptone-eau parce que le G 396 ne peut pas se développer dans le milieu protéose-peptone-glucose.
Cette souche G 396 est reconnue comme appar- tenant au genre Bacillus décrit dans l'ouvrage de Bargey déjà cité, parce qu'elle contient des cellules en bâtonnets,
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Gram\ formatrices de spores, qui ont un test de catalase positif. Les sporanges de cette zouche ne sont pas nettement gonflés et le protoplasme des jeunes cellules présente des vacuoles si elles sont légèrement colorées. De plus, la dia- mètre de la cellule végétative est de 0,9 micron ou davan- tag. Cette souche G 396 est donc surtout proche du Bacillus megaterium ou du Bacillus ceraus.
Toutefois, elle diffère de ceux-ci pâr les caractères suivants;
EMI14.1
<tb> Bacillus <SEP> Bacillus <SEP> G <SEP> 396
<tb> megaterium <SEP> cereus
<tb>
<tb> Cellules <SEP> normales <SEP> en <SEP> bâ- <SEP> normales <SEP> en <SEP> bâ- <SEP> au <SEP> jeune <SEP> Age,
<tb> végéta- <SEP> tonnet, <SEP> non <SEP> en <SEP> tonnet, <SEP> non <SEP> en <SEP> normales <SEP> en <SEP> bâtives <SEP> fuseau <SEP> ni <SEP> en <SEP> fuseau <SEP> ni <SEP> en <SEP> tonnât <SEP> mais
<tb> coin <SEP> coin <SEP> plus <SEP> tard,
<tb> cellules <SEP> en
<tb> fuseau <SEP> ou
<tb> en <SEP> coin
<tb>
<tb> Colonie <SEP> entière <SEP> et <SEP> con- <SEP> plate <SEP> et <SEP> ir- <SEP> entière <SEP> et
<tb> sur <SEP> agar-agr <SEP> vexe <SEP> ou <SEP> en <SEP> re- <SEP> régulière <SEP> convexe <SEP> ou
<tb> lief <SEP> en <SEP> relief
<tb>
<tb>
<tb> Réaction <SEP> de <SEP> négative <SEP> positive <SEP> faiblement
<tb> Voges <SEP> Pros- <SEP> positive
<tb> kauer
<tb>
<tb> hydrolyse <SEP> positive <SEP> positive <SEP> légère
<tb> de <SEP> l'amidon
<tb>
<tb> fermentation <SEP> négative <SEP> positive
<tb> du <SEP> mannitol
<tb>
<tb> Production <SEP> négative <SEP> positive <SEP> @ <SEP> "
<tb> anaérobie
<tb> de <SEP> gaz <SEP> à <SEP> partir <SEP> de
<tb> nitrate
<tb>
<tb> Accumulation <SEP> " <SEP> négative <SEP> "
<tb> d'acides
<tb> guanylique-5'
<tb> et <SEP> adénylique-51
<tb>
La souche G
396 est donc reconnue comme n'étant ni un B. mJgaterium ni un B. cereus mais une nouvelle espèce du genre Bacillus. Cette souche est capable d'accumuler à la Tois l'acide guanylique-5' et l'acide adénylique-3'et de plus, elle peut accumuler aussi au moins un composé du
<Desc/Clms Page number 15>
groupe qui comprend les acides cytidylique-5', uridylique-5' et xanthylique-5', dans des conditions appropriées.
Les caractères physiologiques et morplologiques des sept autres souches sont presque similaires à ceux du G 396. Donc, ces sept souches ainsi que le G 396 sont recon- nues comme étant une nouvelle espèce appartenant au genre Bacillus. Il est inutile de dire que l'invention comprend l'utilisation de cette nouvelle espèce de Bacillus.
Les exemples suivants illustrent le procédé de l'invention.
EXEMPLE
On cultive avec agitation la souche de Bacillus G 396 dans un milieu comprenant, par litre:
EMI15.1
<tb> K2HPO4 <SEP> 7,0 <SEP> g
<tb>
<tb> KH2P04 <SEP> 3,0 <SEP> g
<tb> (NH4)2S04 <SEP> 1,0 <SEP> g
<tb>
<tb>
<tb> MgS04.7H20 <SEP> 0,2 <SEP> g
<tb> citrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb>
<tb> hydrolysat <SEP> de <SEP> caséine <SEP> 10,0 <SEP> g
<tb>
<tb> glucose <SEP> 20,0 <SEP> g
<tb>
<tb> thiamine <SEP> 100 <SEP> g
<tb>
<tb> riboflavine <SEP> 100 <SEP> g
<tb>
<tb> pyridoxine <SEP> 200 <SEP> g
<tb>
<tb> pentothénate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb> acide <SEP> nicotinique <SEP> 20 <SEP> g
<tb>
<tb> acide <SEP> p-aminobenzoique <SEP> 1 <SEP> g
<tb>
<tb> biotine <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb>
Après 4 jours de culture & 28 C, on élimine les cellules,
et on tire du milieu de culture les acides guanylique-5' et adénylique-5' suivant des méthodes connues.
Les rendements sont les suivants :
<Desc/Clms Page number 16>
EMI16.1
pH initial pH final acide guanylique-5 acide adény11que.5' mg/1PO cm3 mg/100 cm) 6,8 6 20,6 17,6 EXEMPLE 2
EMI16.2
On cultive avec agitation la souche de Bac11lul 0 2293 dans le milieu décrit à l'exemple 1. Après 3 jours
EMI16.3
de culture à 2Ô C, on tire du milieu de culture les acides gUany11que-' 'et adénylique-5' suivant des méthodes connues.
Les rendements sont les suivants:
EMI16.4
pH initial pH iinal acide 4uanylique-5' acide adénylique-5 ,¯¯ ,# ¯ # m"1U cm 3 mg/10Q cm3 6,5 5,6 25,, 23,9
EMI16.5
Ek-E14PI$ - '3- On cultiver avec agitation une oouche 4'Eocheri- chia Ci 443 isolée du 8o# dans le mfirae milieu que dans l'exemple 1. Après 4 jours de culture à 2Ô*C, on tire les acides guanylique-5' et ad6nylique-59 du milieu de culture suivant des méthodes connues, les rendements sont les suivant*!
EMI16.6
pH initial pH final acide guanylique-5' acide adénylique-5' ¯¯¯¯¯ ¯¯¯¯¯ m/100 cm3 mp/LQQ cm3 608 5t4 liez 8,9 EXEMPLE 4
On cultive avec agitation, dans le milieu de l'exemple 1, une souche d'Escherichia G 1959 isolée du
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sol.
Au bout de 3 jours de culture à 3000, on tire les acides guanylique-5' et adénylique-5' du milieu de culture par des méthodes connues. Les rendements sont les suivants
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pH initial pH final acide guanylique-5' acide adénylique-5' ##¯#¯ 'm/7,U0 cm3 MR/100 cm3 6,5 5,0 9,7 8,0
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' KX&-1PLE 5
On cultive avec agitation, dans le milieu de l'exemple l'une souche d'Aerobacter G 103 isolée
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du sol . Après 14 jours de culture à 4?' C, on tire du milieu da culture les'acides E,uanyliyue-5' et adénylique-5i,' par des méthodes connues.
Les rendements sont les suivants;
<Desc/Clms Page number 17>
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pH initial pH final acide uanylique-5 acide adénylique-5' ¯¯¯¯¯ .. p'R:/100 cm) 111IdlOQ qm3 6,8 596 51,3 44,2 EXEMPTS 6,
On cultive avec agitation, dans le milieu de l'exemple 1, une couche de Paeudomonaa 0 1956 isolée du sol. Après 3 jours de culture à 28 C, on tire les acides
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guanylique-59 et adénylique-5' du milieu de culture par des méthodes connues. Les rendements sont les suivants 4 pH initial oH final acide Kuanvllaue-5' acide adénvliaue-5
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#####¯# # ¯¯ mr:/100 cm3¯¯¯ nip./lOU crn3 6gg 5,0 13,2 lie$
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!')ÇF1!fll.z
On cultive avec agitation, dans le milieu de l'exemple 1, une souche de Serratia G 2262 isolée du sol.
Au bout de 3 jours de culture à 28 C. on tire du milieu de
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culture les acides guanylique-5' et adényli.que-5 par des méthodes connues. Les rendements sont les suivants: pH initial pH final acide guanylique5 acide adénylique-5'
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-¯¯¯¯¯-- ..¯.r. m/10'J cm3¯¯¯¯. mgllüj cmj 7,0 6,8 15,) 1708 - EXEMPLE
Un cultive avec agitation dans le milieu de
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l'exemple 1/4 une souche de l3revibactsrium G 42$ isolée du 601.
Après 4 jours de culture à 30 C, on tire du milieu de cul-
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ture les acides guanylique-5' et ade::nyliqua-5' par des mô- thodesfconnues. Les rendements sont les suivants: pH initial pH final acide puanylique-51 acide adénylique-5'
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#¯¯¯¯ ¯¯ ¯ ¯¯ MF,11() CM3 wriluu cno
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<tb> 6,8 <SEP> 5,8 <SEP> 22,9 <SEP> 16,8
<tb>
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E..#. iPl.E 9
On cultive avec agitation dans le milieu de l'exemple laine souche de Brevibacterium G 565 isolée du sol.
Après 4 jours de culture à 28 C, on tire du milieu de culture, par des méthodes connues, les acides guanylique-5' et adé-
<Desc/Clms Page number 18>
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nylique-5'* Les rendements sont les suivante :
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pH initial pH final acide guanylique-5* acide adénylique-5' ; . 'im ",/la0 , cm, <nc/100 cm 7,0 5,0 32,5 30,1 EXEMPLE 10
On cultive avec agitation, dans le milieu de l'exemple 1, une bouche de Micrococcus G 418 isolée du
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soi, Après 3 jours de culture à 28 C, on tire du milieu de culture , , par des méthodes com:s, lea acides ;uanylique-.5 et addnyt idue-5 .
Les rendements sent les suivants: pH initial pH final acide gu..-inyliqtie-5? acide adényiQt1e-5't
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<tb> 7,0 <SEP> 6,2 <SEP> 13,7 <SEP> 15,2
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> @ <SEP> EXEMPLE <SEP> 11
<tb>
<tb>
<tb> ' <SEP> ######
<tb>
On cultive avec agitation, dans le milieu de
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l'exemple le une souche d'Escherhhia G 2282 isolée . ci. ' . 1.
Après 2 jours de culture à 28 C, on tire l'acide guanyliqu,, @ 5' du milieu de culture, par des méthodes connues, le rende- ment est le suivant;
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pH initial pH final acide guanylique-51 L n)f';/lUO cm3 792 692 807
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,#dP'Pt: - 12 On cultive avec agitation, dans le milieu de l'exemple'1, la souche de Uacillus ü 493 Au bout de 3 jours de culture à 28 C, on tire l'acide guanylique-5' du milieu de culture par des méthodes connues.
Le rendement est le suivant:
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pH initial pH final acide guanylique-51
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<tb> mg/100 <SEP> cm3
<tb>
<tb> 6,8 <SEP> 4,4 <SEP> 15,2
<tb>
<Desc/Clms Page number 19>
EXEMPLE 13
On cultive avec agitation la nouvelle espèce de Kurthia G 620 dans un milieu comprenant 80 g/l de glucose, 20 g/1 d'hydrolysat acide de caséine et dont les autres con- stituants sont les! mêmes que dans l'exemple 1. Après 5 jours de culture à 28 C, on tire du milieu : de culture, par des méthodes connues, les acides guanylique-5'et adénylique- 5'.
Les rendements sont les suivants;
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<tb> pH <SEP> initial <SEP> pH <SEP> final <SEP> acide <SEP> guanylique-5' <SEP> acide <SEP> adénylique-5'
<tb> mg/100 <SEP> cm3 <SEP> mg/coo <SEP> cm3
<tb>
<tb> 7,0 <SEP> 5,8 <SEP> 48,1 <SEP> 85,3
<tb>
EXEMPLE 14
On cultive avec agitation la nouvelle espèce de Kurthia G 620 ci-dessus dans un milieu comprenant 250 g/1 de liqueur de macération de mats à la place de l'hydrolysa- ge de caséine, 40 g/1 de glucose et les autres constituants indiqués à l'exemple 1. Au bout de 9 jours de culture à 28 C, on tire du milieu de culture, par des méthodes connues, les acides guanylique-5', adénylique-5', cytidylique-5', uridylique-5' et xanthylique-5'.
Les rendements sont les suivants : @
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<tb> pH <SEP> initial <SEP> pH <SEP> final <SEP> acide <SEP> guanylique-5' <SEP> acide <SEP> adénylique-5'
<tb>
<tb> mg/100 <SEP> cm3 <SEP> mg/luu <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 6,8 <SEP> 9,2 <SEP> 70,4 <SEP> 110,5
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> acide <SEP> cutidylique-5' <SEP> acide <SEP> uridylique-51 <SEP> acide <SEP> xanthylique-5'
<tb>
<tb> mg/100 <SEP> cm3 <SEP> mg/100 <SEP> cm3 <SEP> mg/100 <SEP> cm3
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 69,0 <SEP> 48,6 <SEP> 17,5
<tb>
EXEMPLE 15
On cultive avec agitation la nouvelle espèce de Kurthia G 620 dans un milieu comprenant 10 g/1 d'hydroly- sat de caséine, 80 g/1 de glucose, 0,4 g/1 de MgSO4.7H2O et les autres constituants indiqués à l'exemple 1 .
Après 7 jours de culture à 28 C, on tire seulement de l'acide quanylique-5' du milieu par des méthodes usuelles. Le ren- dement est le suivant:
<Desc/Clms Page number 20>
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pH initial pH final acide guanylique-5 ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ - mf7l00 cm3
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<tb> 6,8 <SEP> 5,8 <SEP> 10,3
<tb>
EXEMPLE 16
On cultive avec agitation la nouvelle espèce de Kurthia G 1958 dans le milieu de l'exemple 13. Après 6 jours de culture à 28 C, on tire du milieu de culture les
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acides guanylique-5' et adénylïque-5v par lea méthodes usuel- les.
Les rendements sont les suivants: riz initial pH final acide imanylique-5' acide adénylioue-5
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vawrrrrrlrr mrnrm tnp/100 CM3 MI?/100 CM3
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<tb> 6,8 <SEP> 5,8 <SEP> 50,5 <SEP> 82,3
<tb>
EXEMPLE 17
On cultive avec agitation la nouvelle espèce de Bacillus o 396 dans un milieu comprenant 100 g/1 de li- queur de macération/le maïs à la place de l'hydrolysat de caséine, 30 g/1 de glucose et les autres constituants con- formes à l'exemple 1.
Après 9 jours de culture à 28 C, on tire du milice de culture, par les méthodes usuelles, les acides suivants avec les rendements suivants:
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pH initial pH final acide guanylique-5* acide adényliqile-59 ¯¯¯¯¯¯ m, y/1C)b cm3 mg/100 cni3 7,0 3,8 43#2 z acide cytidylique-5@ acide uridylique-5* ' 'acide xat-ithylique-5 mpr/10Q cm3 MF/100 cm3 m:/l0U xm, 40,5 ,1 805
EXEMPLE 18
On cultive avec agitation la nouvelle es pèce de Bacillua C 396 dans un milieu comprenant 5 g/1 de !peptone,
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5 g/1 d'acide 'succinique, 7,353 g/1 de (NH4)2HP04o 0,493 g/1 de Mg04.7i20 z9 g/1 de KC1, 0,147 g/1 de.CaCl2*2H200 40 g/1 de glucose et 1 litre de solution d'extrait de soja qui sert de solvant dans ce milieu.
On opère la solution d'extrait de soja de la façon suivante; on extrait pen - dant 1 heure 5 g/l de soja dégraissé au moyen de 100 cm3
<Desc/Clms Page number 21>
de solution à 0,1% de NaOH dans un bain d'eau bouillante et on dilue à 1 litre de liquide qui surnage en ajoutant de'l'eau distillée. Après 8 jours de culture à 28 C, on tirs du milieu de culture l'acide guanylique-5' par les méthodes usuelles.
Le rendement est le suivant :
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<tb> pH <SEP> initial <SEP> pH <SEP> final <SEP> acide <SEP> guanylique-5'
<tb> - <SEP> - <SEP> mg/100 <SEP> cm3
<tb>
<tb> 7,2 <SEP> 5,8 <SEP> 13,7
<tb>
REVENDICATIONS 1. - Procédé de préparation d'acide guanylique-5', @ caractérisé en ce qu'on cultive une souche de bactérie appro @ priée dans des conditions aérobies , en milieu nutritif aqueux, pendant un temps suffisant.