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L'invention concerne un procédé pour la préparation de nouveaux N-glycosides de 5-fluoro-uracile et de leurs sels a'ec des bases. Elle concerne en particulier la préparation de N-ribosides et de N-désoxy-ribos ides de 5-fluoro-uracile, par exemple de 5-fluoro-uridine, tel que le 1-p-D-ribofuranosyl- 5-fluoro-uracile, ou de 2'-désoxy-5-fluoro-uridine, tel que
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le 1-(P-D-2-désoxy-ribofuranosyl)-5-fluoro-uracile.
L'un des aspects de l'invention a trait à un procédé pour la préparation de N-glycosides de 5-fluoro-uracile et de leurs sels avec des.bases, caractérisé par le fait que l'on fait réagir du 5-fluoro-uracile avec du chlorure mercurique, qu'on traite le di-(5-fluoro-uracil)-mercure obtenu avec un halogénure
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de glycane acylé, qu'on désacyle le N-glycoside de 5-fluoro- uracile formé et, le cas échéant, qu'on transforme le produit de réaction en un sel au moyen d'une base.
Comme substance de départ appropriée, on utilise un halogénure de ribose acylé, de préférence l'halogénure de 2,3,5-tri-0-benzoyl--D-ribofuranosyle.
Un autre aspect de l'invention a trait à un procédé pour la préparation de N-glycosides de 5-fluoro-uracile et de leurs sels avec des bases, caractérisé par le fait que l'on transfère par action Enzymatique le 2'-désoxy-ribose d'un 2-désoxy-riboside sur un 5-fluor uracile et, le cas échéant, que l'on transforme la 2'-désoxy- 5-fluoro-uridine obtenue en un sel avec une base. Comme 2-désoxy-riboside, il est avantageux d'utiliser la thymidine.
Un fournisseur d'enzymes préféré est le Streptococcus fecalis (ATCC 8043).
Les N-glycosides de 5-fluoro-uracile sont utiles comme agents germicides, étant actifs par exemple contre les bactéries gram-positives, telles que les Staphylococcus aureus, et comme agents antifongiques, par exemple contre les Scopulariopsis brevicaulis. Les N-glycosides de 5-fluoro-uracile sont aussi utiles comme agents antimétaboliques; elles contrecarrent l'action métabolique de l'acide nucléique et, de ce fait, elles empêchent la croissance de cellules, par exemple des Lacto- bacillus leichmannii.
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Le produit de départ du procédé de l'invention, soit le 5-fluoro-uracile est une substance nouvelle qui n'a encore été décrite dans aucune publication. Afin que la description de l'invention soit complète, il est fait mention ci-après d'une méthode d'obtention de cette substance:
Un mélange de 200 g (2 moles) de fluoro-acétate de so- dium sec et 442 g (2,86 moles) de sulfate de diéthyle est chauffé au reflux pendant 32 heures dans un bain d'huile.
Le mélange de réaction est alors soumis à distillation fractionnée; on obtient 177,3 g de fluoro-acétate d'éthyle brut (point d'ébullition 116-120 ). Cette substance est soumise à une nouvelle distillation fractionnée, on obtient ainsi le fluoro-acétate d'éthyle pur du point de fusion
114-118
Dans un ballon à 3 cols de 2 litres, muni d'un agitateur, d'un entonnoir à robinet et d'un condenseur à reflux, on met
47,6 g (1,22 moles) de potassium, coupé en morceaux de 5 mm, en suspension dans 880 ce d'éther absolu. On y ajoute goutte à goutte, tout en remuant, 220 cc d'éthanol absolu; la chaleur de réaction produit un reflux. Afin d'obtenir une dissolution complète du potassium, on chauffe finalement le mélange de réaction dans un bain de vapeur.
On refroidit alors le mélange de réaction dans un bain de glacé, puis on y ajoute goutte à goutte au cours de 5/2 heures un mélange de
135 g (1,22 moles) de fluoro-acétate d'éthyle et 96,4 g (1,3 moles) de formiate d'éthyle fraîchement distillé, tout
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en remuant et refroidissant. Une fois l'addition de formiate d'éthyle complétée, on remue le mélange de réaction pendant encore 1 heure tout en refroidissant, puis on laisse au repos jusqu'au lendemain à la température ambiante. Ensuite, le précipité cristallisé est séparé par succion, lavé avec de l'éther, puis séché dans un dessicateur à vide.
Le produit consiste essentiellement en sel de potassium de l'hydroxy- méthylène-fluoro-acétate d'éthyle,
Un mélange de 103,6 g (0,6 mole) de ce produit fraîchement préparé, 83,4 g (0,3 mole) de sulfate de S-méthyl-isothiourée et 32,5 g (0,6 mole) de méthanolate de sodium est chauffé au reflux dans::1500 cc de méthanol absolu, tout en étant remué.
Apres dissolution passagère, on observe la formation d'un @ précipité. Le mélange de réaction est chauffé au reflux pendant
2 heures, puis évaporé à siccité dans le vide. Le résidu est traité avec 280 ce d'eau ; il ne se dissout qu'incomplètement.
On clarifie le mélange obtenu en le filtrant à travers du charbon. Le filtrat est rendu légèrement acide au congo par l'addition de 48 'ce d'acide chlorhydrique aqueux concentré à 37%. La substance cristallisant dans la solution acide est séparée par filtrat ion, lavée à l'eau jusqu'à élimination complète des ions de sulfate et séchée à 100 ; on obtient ainsi le S-méthyléther brut de 2-thio-5-fluoro-uracile (limites de fusion 202-211 ). Après recristallisation par dissolution dans
2035 cc d'acétate d'éthyle bouillant et refroidissement à -20 ,ce produit fond à 230-237 ; il est suffisamment pur pour être utilisé directement dans l'échelon suivant.
Après
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recristallisation dans de l'eau (alternativement dans de l'acétate d'éthyle), son point de fusion monte à 241-243 .
Pour l'analyse, on purifie encore le produit par sublimation dans le vide à 140-150 /0,1 mm.
Une solution de 10,0 g de S-méthyléther de 2-thio- 5-fluoro-uracile (point de fusion 230-2370) dans 150 ce d'acide chlorhydrique aqueux concentré à 37% est chauffée pendant 4 heures au reflux, sous azote. Le mélange de réaction est alors évaporé dans le vide. Le résidu cristallisé brunâtre est alors recristallisé dans de l'eau. Le produit recristallisé obtenu est en outre purifié par sublimation dans le vide à 190-200 (température du bain) et sous une pression de 0,1 mm.
On obtient le 5-fluoro-uracile sous la forme de cristaux in- colores ou rougeâtres fondant à 282-283 (avec décomposition).
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Exemple 1
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Di-( 5-fluoro-urac ill-mercure .
Une solution de 4,81 g (17,7 millimoles) de chlorure mercu- rique dans 16 ce d'éthanol est versée dans une solution de 2,3 g (17,7 millimoles) de 5-fluoro-uracile dans 82 cc d'hydroxyde de sodium aqueux 0,086 N. Le pH du mélange est ajusté à 5,1 par l'addition de 8,5 cc d'hydroxyde de sodium aqueux N afin de de précipiter le di-(5-fluoro-uracil)-mercure. Le mélange est laissé au repos jusqu'au lendemain à 4 ; le produit cristallisé est alors séparé par filtration et lavé avec de l'eau jusqu'à disparition totale des ions de chlore, puis avec de l'éthanol et finalement avec de l'éther. Rendement: 3,3 g (79,4%)
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5-Fluoro-j',.3',5'-tri-o-benzoyl-uridine.
A 245 cc d'éther anhydre, saturé au préalable avec du chlorure d'hydrogène à 0 , on ajoute 13,2 g (26,2 millimoles) de
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l-0-acétyl-2,3,5-tri-0-benzoyl-p-D-ribose Kissmann et coll., J.A.C.s. 77 (1955) page 21. Le ballon est bouché et laissé au repos à 4 pendant 8 jours. Le solvant est alors éliminé dans le vide et, par trois fois, on ajoute au résidu 40 cc de benzène anhydre, que l'on élimine chaque fois dans le vide. Le chlorure
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de 2t3e5-tri-0-benzoyl-p-D-ribofuranosyl est dissous dans 73 cc de benzène
Une suspension sèche de di-(5-fluoro-uracil)-mercure est préparée en mettant 6 g (13,1 millimoles) de ce sel en suspension
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dans 130 cc de xylène et en éliminant 40 cc de xylène par distillation.
On chauffe le restant (90 cc) de la suspension et, 'en remuant, on y ajoute les 73 cc de la solution benzénique de
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chlorure de 2,3,5-tri-o-benzoyl-p-D-ribofuranosylo Le mélange est chauffé au reflux pendant 4/2 heures, puis f iltré à chaud. Le précipité cristallisé insoluble fondant à 236-257 s'est avéré être du 5-fluoro-uracile impure; les 2,78 g obtenus représentent une récupération d'env. 82%. Le filtrat est refroidi, après
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quoi le 5"fluoro-2', 3 ', 5 '-tri-0-benzoyl-uracil-ribofuranoside cristallise. Ce précipité cristallisé est séparé par filtration, lavé avec un peu de benzène, puis avec de l'éther. Rendement 1,9 g ; point de fusion 185-189 .
On dissout ce produit dans 22 cc d'acétate d'éthyle chaud, puis on y ajoute 54 cc d'éther de pétrole (limites d'ébullition 30-60 ); on laisse le.mélange au repos dans une glacière, après quoi 0,5 g d'un produit pur cristallise. Point de fusion 207-209 .
Le filtrat benzène-xylénique, au repos, donne une seconde récolte '(2,07 g) de substance brute fondant à 182-184 . Cette dernière est recristallisée de la manière indiquée ci-dessus par dissolution dans 25 cc d'acétate d'éthyle chaud et addition de 33 cc d'éther de pétrole (30-60 ); on obtient ainsi 1,33 g.
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de 5-f luoro-2 ,3",5 -tri-0-benoyl-uracil-ribofuranoside du point de fusion 207-209 .
Par l'addition de 500 cc d'éther de pétrole (30-60 ) aux eaux-mères, on obtient une troisième récolte d'un produit gommeux. Ce dernier est séparé par décantation des eaux-mères
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et dissous dans 110 ce de chloroforme. Un peu de substance insoluble''est séparée par filtration. Le filtrat chloroformé est libéré du mercure par 3 lavages avec 20 ce de solution aqueuse d'iodure de potassium à 30%,puis lavé 5 fois avec de l'eau et finalement séché au moyen de sulfate de sodium.
Le chloroforme est éliminé dans le vide sur le bain-marie; on obtient ainsi une huile qui se solidifie au traitement avec de l'éth de pétrole (30-60 ). Le produit solide est séparé par filtration et lavé avec de l'éther de pétrole (30-60 ).
Rendement: 5,83 g. Le produit est recristallisé de la manière décrite ci-dessus par dissolution dans 18 cc d'acétate d'éthyle chaud et addition de 25 cc d'éther de pétrole (30-600); on obtient ainsi 0,87 g d'un produit purifié fondant à 196-200 .
Au moyen d'une seconde recristallisation dans un mélange de 10 ce d'acétate d'éthyle et 32 cc d'éther de pétrole (30-60 ), on obtient 0,53 g de produit pur fondant à 207-209 .
Le rendement total de produit pur fondant à 207-209 est de 2,71 g ce qui correspond à 18% de la théorie (calculé par rapport au 5-fluoro-uracile mis en réaction et sans tenir compte du 5-fluoro-uracile récupéré).
5-Fluror-uridine
Une suspension de 1 g (1,74 millimoles) de 5-fluoro-2',3', 5'-tri-0-benzoyl-uracil-ribofuranoside fondant à 207-209 dans 20 cc d'ammoniac éthanolique (saturé à 0 )est chauffé à 1000 pendant 16 heures dans un tube scellé. Le résidu est repris trois fois dans 30 ce d'eau et chaque fois évaporé à siccité.
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Le résidu brun semi-cristallisé est repris dans 30 ec d eaue la suspension turbide obtenue est traitée avec 5 portions de 10 cc d'éther, les extraits éthérés étant élimines.!La Gauche aqueuse est évaporée à siccité dans le vide; on obtient ainsi un résidu mousseux brun, que l'on dissout dans 2 cc d'éthanel Par l'addition de 8 CE d'éther, on obtient 220 mg d'un préci- pité solide de coule tannin.
En ajoutant 30 cc d'éther aux eaux-mères,on obtient comme seconde récolte 35 mg d'un produit fondant à 143-1440 (avec ramollissement préalable).
Les eaux-mères-de ce produit sont évaporées à siccité dans le vide,- et le résidu obtenu est repris dans 0,5 cc d'éthanol.
Par l'addition de 10 cc d'éther, on obtient comme troisième récolte 70 mg d'un produit fondant à 136-1380 (avec ramollis- sement préalable).
Afin de purifier davantage le N-riboside de 5-fluoro-uracile brut, on dissout la première récolte de 220 mg dans 1 ce d'hydro- xyde de sodium aqueux N, pour obtenir une solution contenant le sel de sodium de 5-fluoro-uridine. Cette solution est alors passée à travers une colonne de "dowex 1-X4" de 1,1 cm x 23 cm. résine échangeuse d'anions de la Dow Chemical Co., Midland, Michigan, consistant en un copolymère, lié en croix, de styrène et de benzène divinylique (4% de ce dernier), contenant de%- groupements d'ammonium quaternaires comme groupements fonction- nels. distance des mailles 0,075-0,15 mm, préalablement con- vertie en formiate.
Après l'adsorption la résine est lavée
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avec de l'eau jusqu'à ce que les eaux de lavage soient neutres.
L'élution est mise en oeuvre avec de l'acide formique aqueux 0,01 N, les éluats étant récoltés, à une vitesse d'env. 1 cc par minute, par fractions de 25 cc. Chaque fraction est examinée individuellement quant à son absorption dans l'ultraviolet ; dans chacune des fractions 2 à 6, le rapport d'absorption 280 m 260 m est de 0,99 (pH 14). L'absorption totale (densité optique observée x dilution de la substance x volume total en cc) est de 2070, # max. 270 m (pH 14).
Les fractions 2 à 6 sont alors combinées et évaporées à siccité dans le vide à 50 ,Le résidu huileux est dissous dans 0,3 ce d'éthanol, et 4 cc d'éther sont ajoutés à la solution; il se forme un précipité amorphe. Ce dernier est séparé par filtratidn et dissous dans 3 ce d'éthanol à 60 . On ajoute de l'éther jusqu'à ce que la solution commence à devenir turbide.
Le mélange est alors laissé au repos jusqu'au lendemain. Le peu de substance amorphe précipitée qui en résulte est éliminé par filtration. En évaporant le filtrat dans le vide à 45 , on obtient 48 mg de 5-fluoro-uridine comme résidu cristallisé.
Observée sous conditions chaudes au microscope, la substance fond à 151-152 , se resolidifie, puis fond de nouveau à 180- 182 , après léger ramollissement à 165 .L'absorption dans l'ultraviolet, caractéristique pour un riboside, est similaire à celle de l'uridine, mais avec déplacement du maximum vers de plus grandes longeurs d'ondes. Comme prévu pour un riboside, et en contraste avec la pyrimidine libre, il n'y a pratiquement aucun déplacement du maximum en milieu alcalin; au pH de 7,2
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,Â. max. ::: 269 mF' S ü 8120t au pH de 14, A max 270 mp,
6 = 6500.
La seconde récolte (35 mg, point de fusion 143-144 ) et la troisième récolte (70 mg, point de fusion 136-138 ) de N-ri- boside de 5-fluoro-uracile sont combinées et purifiées par chromatographie échangeuse d'ions, comme décrit ci-dessus.
On obtient ainsi 90 mg de substance cristallisée pure; point de fusion microscopique 147-152 , resolidification, nouveau point de fusion à 177-178 , avec ramollissement préalable à 1720. Au pH 7,2, # max. = 270 m , 7540; au pH 14, # max. = 270m , & - 6330,
Le rendement total en 5-fluoro-uridine est de 138 mg, soit 30,3% de la tribenzoyl-5-fluoro-uridine, 5,5% du 1-0-acétyl-
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2, 3, 5-tri-0-benzoyl-i-D--ribose, et 4,3% du 5-fluoro-uracile mis en réaction.
La 5-fluoro-uridine possède des propriétés acides et forme des sels avec des bases. L'invention comprend également les sels obtenus en faisant réagir la 5-fluoro-uridine avec des bases, telles que les hydroxydes alcalins et alcalino-terreux, l'ammoniaque, des bases organiques telles que l'éthanolamine; . et des bases similaires.
La 5-fluoro-uridine et ses sels avec des bases acceptées en médecine sont utiles commes compositions antibactériennes, actives qu'elles sont, par exemple, contre les St. aureus, B. subtilis et B. simplex, et commes compositions antifongiques, par exemple contre les Scopulariopsis brevicaulis et C. albicans,
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Exemple
Des cellules de Streptococcus fecalis (ATCC 8043) sont cultivées dans le milieu d'essai AOAC d'acide folique Lepper, Official and Tentative Methods of the Association of Official Agricultural Chemists, washington, D. C., 7ème édition, (1950) page 784/auquel on a ajouté 2 mg/1. de thymine ; selonles indications de Prusoff, Proc.Soc.Exp.Biol. # Méd.85 (1954), page 564. Après 20 heures d'incubation à 37 les cellules sont récoltées par centrifugation.
Les cellules récoltées sont lavées trois fois avec 4 volumes d'une solution-tampon de phosphate de potassium (orthophosphate monopotassique aqueuX N/15, ajusté au pH de 8,0 par l'addition d'hydroxyde de potassium aqueux 2 N) et les cellules mouillées sont pesées. Ces dernières sont finalement mises en suspension dans la solution-tampon de phos- phate de potassium ci-dessus et triturées dans un homogénéiseur en verre selon Potter.
On prépare une composition enzymatique de 25 cc équivalant à 900 mg de cellules mouillées avec la solution-tampon de phosphate de potassium ci-dessus. 150 mg (1,15 millimoles) de 5-fluoro-uracile et 1,0 g (4,12 millimoles) de thymidine sont dissous dans 15 cc de cette même solution-tampon de phosphate de sodium. Les deux solutions sont mélangées, puis incubées à 37 pendant 18 heures, après quoi l'action enzymatique est arrêtée par l'addition de 4 volumes d'acétone et de 1 volume d'éther exempt de peroxyde. Les précipités solides sont éliminés par filtration, et le filtrat est évaporé sous azote et sous
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pression réduite jusqu'à ce que tout le solvant organique soit éliminé. Il reste 20 ce d'une solution aqueuse, essentiel- lement libre de solvant organique.
Cette solution est diluée à 100 cc avec de l'eau distillée.
10 microlitres de cette solution sont soumis à la chroma- tographie descendante sur du papier tamponné d'orthophosphate monopotassique 0,2 N (pH 7,8), pour laquelle on. utilise un solvent composé d'alcool amylique tertiaire, d'eau et d'éther n-butylique (rapport des volumes 80:13:7). Une tache visible dans l'ultraviolet et ayant la valeur Rf= 0,55 est épuisée au moyen d'acide chlorhydrique 0,1 N et éprouvée quant à la présence de désoxyribose par la méthode de Stumpf, décrite dans J.Biol.Chem. 169 (1947), 367. Cette analyse indique la présence d'un minimum de 85,5 mg (0,35 millimole) de 2'-désoxy-5-fluoro- uridine dans le mélange de réaction libre de protéine.
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La 2'-désoxY-5-fluoro-uridine possède des propriétés acides et forme des sels avec des bases. L'invention comprend également les sels obtenus en faisant réagir la 2'-désoxy-5-fluoro-uridine avec des bases, telles que les hydroxydes alcalins et alcalino- terreux, l'ammoniaque, des bases organiques telles que l'-éthanolamine; et des bases similaires.
La 2'-désoxy-5-fluoro-uridine et ses sels avec des bases acceptées en médecine sont utiles comme compositions anti- bactériennes et antifongiques, étant actives par exemple contre les St. aureus, Sarcina lutea, B. subtilis, E. bacillus, B. simplex, Scopulariopsis brevicaulis, C.albicans, etc.
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Exemple 3 -Des cellules de Streptococcus fecalis (ATCC 8043) sont, cultivées et traitées suivant les indications de l'exemple 2.
On.prépare une composition enzymatique de 105 cc équi- valant à 4,06 g de cellules mouillées avec la solution-tampon de phosphate de potassium décrite à l'exemple 2.200 mg (1,54 millinoles) de 5-fluoro-uracile et 1,50 g (6,16 millimoles) de thymidine sont dissous dans 15 cc de la même solution-tampon de phosphate de sodium. Les deux solutions sont mélangées, puis incubées à 37 pendant 18 heures, après quoi l'action enzymatique est arrêtée'par l'addition de 4 volumes d'acétone et 1 volume d'éther exampt de peroxyde. Les précipités solides sont éliminés par filtration, et le filtrat est évaporé sous azote et sous pression réduite jusqu'à ce que tout le solvant organique soit éliminé.Il reste env. 20 cc de solution aqueuse. Cette solution est diluée à 100 cc avec de l'eau distillée.
La solution est de nouveau concentrée dans le vide à 5 ce et rendue alcaline par l'addition de 20 cc de solution d'hydroxyde de sodium aqueux N. On obtient ainsi un mélange contenant des sels de sodium de : N-désoxy-riboside de 5-fluoro- uracile, thymine, thymidine et 5-fluoro-uracile.
Ce mélange est purifié par l'adsorption à une résine échangeuse d'ions et élution consécutive au moyen d'une solution-tampon à acidité graduellement augmentée, les composés de pyrimidine étant élues dans l'ordre suivant : thymine, 5-fluoro-uracile et 2'-déxoxy-5-fluoro-uridine La purification est effectuée en
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passant le mélange alcalin ci-dessus à travers une colonne de :"dowex 1-X4" de 2,2 cm x 27 cm (identifiée à l'exemple 1), distance des mailles 0,075 - 0,15 mm, préalablement convertie en formiate et lavée à neutralité comme dans l'exemple 1. La colonne est alors éluée avec 280 cc d'une soluti.on-tampon aqueuse de formiate d'ammonium (pH 9,8) ayant une normalité de 0,1 en ce qui concerne les ions de formiate.
L'éluat ne contient aucune substance absorbant l'ultraviolet. L'élution est continuée avec une solution-tampon aqueuse de formiate d'ammonium (pH 7,4) ayant une normalité de 0,1 en ce qui concerne les ions de formiate, à une vitesse d'écoulement de 46 cc à l'heure. Ensuite, l'élution est encore continuée avec une so- lution-tampon aqueuse de formiate d'ammonium (pH 6,5) ayant une normalité de 0,1 en ce qui concerne les ions de formiate, à une vitesse d'écoulement de 60 cc à l'heure. Des fractions sont séparées par intervalles de 30 minutes et examinées individuel- lement quant à leur absorption dans l'ultraviolet à la longeur d'onde de 260 et de 280 m (pH 14).
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1 <SEP> II <SEP> 111 <SEP> IV <SEP> V <SEP> VI <SEP> VII <SEP> VIII <SEP> IX
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<tb> 7,4 <SEP> 1- <SEP> 5 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
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<tb> 7,4 <SEP> 6-17 <SEP> 23700 <SEP> 24500 <SEP> 1,04 <SEP> a) <SEP> 2,33 <SEP> 2,41-
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<tb> 7,4 <SEP> 8-26 <SEP> 0 <SEP> 0- <SEP> - <SEP> - <SEP> -
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<tb> 6,5 <SEP> 27-33 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> -
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<tb> 6,5 <SEP> 34-48 <SEP> 3760 <SEP> 5870 <SEP> 1,56 <SEP> b) <SEP> - <SEP> - <SEP> 0,56 <SEP> 0,44 <SEP> c) <SEP>
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<tb> 6,
5 <SEP> 49-50 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> - <SEP> - <SEP> -
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<tb> 1 <SEP> = <SEP> pH <SEP> de <SEP> l'agent <SEP> d'élution
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<tb> II <SEP> Fractions
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<tb> III <SEP> = <SEP> Absorption <SEP> totale <SEP> (pH <SEP> 14) <SEP> à <SEP> 260 <SEP> m
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<tb> IV <SEP> = <SEP> Absorption <SEP> totale <SEP> (pH <SEP> 14) <SEP> à <SEP> 280 <SEP> m
<tb>
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<tb>
<tb>
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<tb> V <SEP> = <SEP> Rapport <SEP> moyen <SEP> 280 <SEP> m /260 <SEP> m
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<tb> VI <SEP> = <SEP> Thymine <SEP> (en <SEP> millimoles)
<tb>
<tb>
<tb>
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<tb> VII <SEP> = <SEP> Thymidine <SEP> (en <SEP> millimoles)
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<tb>
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<tb> VIII <SEP> 5-fluoro-uracile <SEP> (en <SEP> millimole)
<tb>
EMI16.2
IX 2'-dsoxy 5-fluoro uridine (en millimole)
EMI16.3
<tb> a) <SEP> progression <SEP> de <SEP> 0,75 <SEP> à <SEP> 1,5
<tb>
<tb> b) <SEP> = <SEP> Dégression <SEP> de <SEP> 1,97 <SEP> à <SEP> 0.98
<tb>
<tb> c) <SEP> = <SEP> 0.5 <SEP> millimole <SEP> de <SEP> désoxy-ribose(épreuve <SEP> selon <SEP> Stumpf,
<tb> loc. <SEP> cit.)
<tb>
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L'examen des spectres d'absorption dans l'ultraviolet et la chromatographie sur papier des fractions individuelles a démontré que les fractions 6 à 17 ne contiennent que de la thymine et de la thymidine, tandis que les fractions 34 à 48 contiennent les composés de fluore. Les fractions 34 à
48 sont donc combinées et évaporées à siccité dans le vide.
Le résidu obtenu est dissous dans 30 ce de la phase supérieure d'un mélange biphasé obtenu en mélangeant 60 volumes d'acétate d'éthyle, 35 volumes d'eau et 5 volumes d'acide formique.
Une colonne de 4,4 cm x 49 cm est alors préparée en mouillant
285 g de poudre de cellulose (sans cendres, de qualité standard) avec la phase supérieure du mélange susmentionné d'acétate d'éthyle, d'eau et d'acide formique, et en pressant la cellulose mouillée dans le tube d'absorption au môyen d'une baguette. Les 30 cc de la solution sont alors passés à travers la colonne. L'élution est effectuée avec la phase supérieure du même mélange susmentionné d'acétate d'éthyle, d'eau et d'acide formique, à une vitesse d'écoulement de 40 ce à l'heure les fractions étant séparées par intervalles de 30 minutes.
Les fractions sont examinées individuellement quant à leur ab- sorption dans l'ultraviolet à la longueur d'onde de 260 m et de
280 mR (pH 14).
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EMI18.1
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11 <SEP> III <SEP> IV <SEP> VI
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<tb> 1-56 <SEP> 0 <SEP> 0- <SEP> - <SEP> -
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<tb> 57-93 <SEP> 1405 <SEP> 3735 <SEP> 2,61 <SEP> 0,57 <SEP> 0,01
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<tb> 94 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> -
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<tb> 95-96 <SEP> 118 <SEP> 124 <SEP> 1,05 <SEP> négligeable <SEP> 0,02
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<tb> 97-104 <SEP> 1275 <SEP> 1905 <SEP> 0,92- <SEP> 0,38a)
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<tb> I <SEP> - <SEP> Fractions
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<tb> II <SEP> = <SEP> 'Absorption <SEP> totale <SEP> (pH <SEP> 14) <SEP> à <SEP> 260 <SEP> m
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<tb> III <SEP> Absorption <SEP> totale <SEP> (pH <SEP> 14)
<SEP> à <SEP> 280 <SEP> m
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<tb> IV <SEP> = <SEP> Rapport <SEP> moyen <SEP> 280 <SEP> m /260 <SEP> m
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<tb> V <SEP> = <SEP> 5-luoro-uracile <SEP> (en <SEP> millimole)
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EMI18.2
VI = 21-désoXY-5-fluoro-uridine (en millimole)
EMI18.3
<tb> a) <SEP> 0,39 <SEP> millimole <SEP> de <SEP> désoxy-ribose <SEP> (épreuve
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<tb> selon <SEP> Stumpf, <SEP> loc. <SEP> cit. <SEP> )
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@
Les inactions 97 à 104 sont combinées et évaporées à siccité dans le vide à 45 la '-désoxy-5-fluoro-uridine rési- duelle se présente sous la forme d'un verre incolore..Rendement:
96 mg (25,3). L'absorption dans l'ultraviolet, caractéristique pour un désoxy-riboside. est similaire à celle de la désoxy- uridine, mais avec déplacement du maximum vers de plus grandes longueurs d'ondes, comme prévu pour un désoxy-riboside, et en contraste avec la pyrimidine libre,il n'y a qu'un léger déplace- ment du maximum en milieu alcalin; au pH de 7,2, # max. = 268 m - t -7570 au pH de 14, max. = 270 m , # = 6480.