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L'invention concerne la production d;amino-acides, et plus spécialement un procédé pour la production d'acide 1-glutamique et sel de celui-ci, par fermentation. En particulier, la présente invention concerne un procédé comprenant les phases qui consistent à cultiver une race de microorganismes mentionnée ci-après, dans un milieu de culture contenant de-la saccharine, des matières azotées et inorganiques, dans des conditions déterminées d'avance, pour accumuler une grande quantité d'un amino-acide dans ce milieu, et à récupérer cet amino-acide. Il est bien connu que lors-
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que des microorganismes sont cultivés dans un milieu approprié, diverses espèces d'amino-acides sont produites dans ce milieu.
La quantité produite était toutefois extrêmement faible et il n'a jamais été signalé qu'une espèce particulière quelconque d'aminoacide s'accumule en grande quantité dans le milieu par un processus de fermentation. La raison de l'extrême difficulté d'accumulation d'amino-acides quelconques dans un système biologique est apparue sur la base du fait que les amino-acides sont les composantes de protéines et que tout amino-acide une fois produit dans un milieu est apte à être aisément resynthétisé en protéines, polypeptides ou analogues, ou est apte à être converti ou décomposé en d'autres substances par diverse.s réactions biochimiques. En d'autres termes, un amino-acide peut difficilement être accumulé dans un milieu de culture sous la forme d'amino-acide à l'état monomère.
L'expression '"état monomère" est utilisée dans la présente description pour désigner l'état monomoléculaire, qu'il s'agisse d'un acide libre ou d'un sel.
C'est la raison pour laquelle un processus de fermentation, une utilisation directe d'activités biochimiques d'une population vivante de microorganismes n'a jamais été proposée jusqu'à présent pour la biosynthèse et l'accumulation d'acide 1-glutaminique. La biosynthèse connue est effectuée dans quelque système enzymique, c'est-à-dire qu'une espèce particulière d'enzyme est extraite demicroorganismes ou de certains tissus animaux ou végétaux, et que, l'on fait réagir l'enzyme avec des substrats appropriés, par exemple de l'acids alpha-cétoglutarique et des composés d'ammonium dans des conditions de réaction très limitées .
Un objet de la. présente invention est de prévoir un procédé pour produire directement une quantité substantielle d'un aminoacide par la culture d'un certain microorganisme dans un milieu liquide..
Un - .tire objet de l'invention est de prévoir un procédé
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pour produire directement une quantité substantielle d'acide
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lClt1-0':JX::.iq1..1e en cultivant un certain microorganisme dans un milieu liquide.
Encore un autre objet de l'invention est de prévoir un procédé pour accumuler une grande quantité d'drnlk't0"L;ICt' spécialement d'acide 1-glutamique sous la forme d'acide à l'état nonon3r3$ en cultivait L: certain micro organisme dans un milieu li- quide Un autre objet de ¯' 33î.'vsliiG1 est de prévoir un procédé pour minimiser les rÓ,,-,:;tinl:2 accessoires, telles que la polymérisation. ou la décomposition d'acide l-glutamiquej qui auraient lieu pendant la culture d'un certain microorganisme dans un milieu liquide,
Encore un autre objet de l'invention est de prévoir un procédé pour accumuler de l'acide 1-glutamique dans un milieu
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liquide sous une forme iixxxxx à l'état monosiè-re, c'est-à-dire sous une forme facilement récupérable.
Selon la présente invention, une race de microorganismes ayant certains caractères biochimiques particuliers est inoculée
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à un milieu liquide, et une grande quantité d'un amino-acicb est produite dans la milieu en ajustant et en maintenant la -la leur du pli du milieu dans les limites de 6 à 9 pendant la fermentation.
La présents invention est spécialement applicable à la production d'acide 1-glutamique et sera décrite d'une façon dé-
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taillée en relation avec la production d'acide lMglut@aiu2. Il est toutefois bien entendu que l'invention est également applicable à la production des autres 8Jno-acides.
Il a été découvert que les races de micro organismes conve- nant à l'utilisation dans la présente invention doivent satisfaire à deux exigences biochimiques spécifiques, à savoir, (1) le micro- -
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organisme doit produire de l'acide alphaHcétoglutarique à partir de matières saccharinées et (2), il doit posséder une forte
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activité de déhydrogénase d'acide 1-glutamique et doit, en particulier, être fortement actif pour la réaction inverse de la susdite réaction enzymique réversible, c'est-à-dire l'aminatini réductive d'acide alpha-cétoglutarique.
Selon l'invention, des microorganismes ont été sélectionnés qui satisfont aux deux exigences biochimiquement spécifiques mentionnées ci-dessus, et il a été constaté qu'il existe beaucoup d'espèces de ces microorganismes dans des habitats naturels.
Ils sont trouvés fréquemment dans divers champs microbiens, comprenant les groupes des bactéries, des levures et des champignons ou moisissures, sans être limités à des groupes taxonomiques quelconques. On les trouve, par exemple, dans divers genres de microorganismes, tel que montré par la liste ci-après. Les microorganismes mentionnés dans la liste ne le sont qu'à titre illustrab tif et il n'est aucunement question de limiter les microorganismes convenant à la mise en oeuvre de la présente invention à ceux portés dans #tte liste.
Bactéries :
Bacillus
Xanthomonas
Rhizobium
Escharichia
Proteus
Streptomyces
Pseudomonas
Azotobacter
Micrococcus
Aerobacter
Salmonella lactobacillus
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Levures: .
Saccharomyces
Pichia
Schizosacharomyces
Torulopsis
Rhodotorula
Endomyces Zygo saccharomyce s
Willia
Mycoderma
Monillia Champignons :
Mucor
Rhizopus
Aspergillus Neurospora
Pénicillium
Ces groupes comprennent des micro organismes qui répondent aux deux conditions biochimiques mentionnées ci-dessus et peuvent être utilisés pour la production d'acide 1-glutamiuqe selon la présente invention, bien que les rendemeents puissent être différents.
L'examen de leur pouvoir de prodaction d'acide alphacétoglutarique à partir de matières @@ ressort des exemples qui seront décrits ci-après* La puissance de l'activité de déhydrogénase d'acide 1-glutamique, spécialement l'activité pour l'animation réductive d'acide alpha-cétoglutairuqe, d'une race particulière, se trouva en corrélation avec sa capacité de production d'acide 1-glutamique.
Ces proporiétés biochimiques spécifiques d'un microorganisme sont '; importance primordiale pour l'accumulation d'acide Une des particularitésde la présente invention réside dans :' emploi.- pour la fermenta...
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tion d'acide 1-glutamique, de tous microorganismes particuliers possédant de telles propriétés biochimiques spécifiques etchoisis parmi divers groupes taxonomiques connus, de genres ou espèces différentes.
Une autre particularité de la présente invention réside dans le contrôle des conditions -de fermentation. La composition d'un milieu de culture peut être n'importe quelle composition connue convenant au développement du microorganisme particulier considéré. En vue d'accomplir un vigoureux métabolisme d'hydrates de carbone par le microorganisme particulier, il va de soique diverses sortes de matières azotées, matières inorganiques ou autres matières connues requises par 1* organisme sont ajoutées au milieu de culture.
En général, par le métabolisme d'hydrates de carbone d'un microorganisme, les acides ont tendance à s'accumuler, rendant le milieu acide. Il a été constaté que la production d'acide 1-glutamique est sensiblement affectée par la valeur du pH du milieu au cours de la fermentation. La production se fait favorablement lorsque le pH est réglé entre 6,0 et 9,0, et la valeur optimum du pH s'avère être d'environ 7,0 à environ 8,5.
Selon la présente invention, la valeur du pH est ajustée et maintenue dans les Imites de 6,5 à 8,5, par l'ajoute d'un composé contenant un radical azoté basique. Ainsi, l'acide alpha-cétoglutarique produit est combiné avec des ions d'ammonium tires du radical azoté basique ajouté, par la forte action d'amination réductive de la déhydrogénase d'acide 1-glutamique, contenue dans le microorganisme, et donne lieu àla fondation d'acide 1-glutami- que.
Grâce à la forte activité d'aminatino réductive de la dénydrogénase d'acide glutamique du nier D'organisme et en maintenant la valeur du pH dans les limites optima, les diverses réactions secondaires sont minimisées-, de sorte que la réaction de formation d'acide 1-glutamique maîtrise les réactions secondaires et se
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traduit par l'accumulation d'une grande quantité d'acide 1- glutamique
Divers procédés peuvent être utilisés pour neutraliser le milieu de culture. En tout cas, une quantité requise d'ions d'ammonium doit être fournie au milieu. L'emploi combiné de sels d'ammonium et d'alcalis tombe aussi dans le cadre de la présente invention.
L'acide glutamique ou son sel accumulé dans le milieu est récupéré par un procédé approprié connu quelconque, tel que la méthode à la résine échangeuse d'ions, un tel procédé n'étant pas en soi une partie importante de la présente invention*.
La présente inventicn est aussi applicable .our la productino d'amino-acides autres que l'acide 1-glutamique. On peut, par exemple, choisir des organismes qui produisent des alphacéto-acides, par exemple l'acide pyruvique, l'acide oxalacétique, etc.., à partir de matières saccharinées, et qui ont aussi une forte activité pour l'amination réductive desdits alpha-cétoacides, et les amino-acides correspondants, tels que l'alanine, l'acide aspartique, etc.., pourront être produits et accumulés dans le milieu par un réglage convenable du pH du milieu de fermentation.
Afin de mieux faire comprendre l'objet de l'invention quelques exemples seront décrits ci-après en relation avec la .Production d'acide 1-glutamique. exemple 1.
Divers microorganismes ont été examinés au point de que des deux capacités biochimiques spécifiques requises dont qres- tion ci-dessus, et des organismes appropries or/;- été sélectrionmés.
Les deux conditions biochimiques spécifiques ont été exeminées comme exposé ci-après. La méthode d'essai de la capacité de production- de l'acide alpha-cétoglutarique à partir de matières
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8,(;C.L -,rinée" est bien connue des spécialistes: ainsi, par exemple, une race a été cultivée par culture agitée dans un milieu liquide contenant des matières saccharinées et d'autres éléments nutritifs. L'acide désiré a été examiné par la chromât- graphie au papier et, si nécessaire, il a aussi été fait usage
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de l'analyse quantitative colorimétrique de Friedemann-Hangen.
Par cet essai, on a sélectionné des microorganismes qui étaient capables de produire une quantité appréciable d'acide alpha- cétoglutarique . @
On a ensuite examiné l'activité de déhydrogénase d'acide 1-glstamique, spécialement quant à la puissance de la capacité d'amination réductive ' d'acide alpha-cétoglutarique.. L'essai a été effectué par la voie de l'absorption d'ammoniaque dans un mélange de réaction tel que décrit ci-après, en utilisant les cellules ou le mycélium intact. L'essai quantitatif d'absorption d'ammo- niaque a été opéré selon la méthode décrite dans "Microdiffusion Analysis and Volume trie error" (E.J. Conuay, London Crosby Lockwood and Son Ltd.. 1950).
Un microorganisme à essayer a été soumis à culture agitée dans le milieu, par exemple bouillon de glucose, extrait de Koji, ou solution de Czapek, et après culture pendant 20 à 40 heures, les cellules ou le mycélium se trouvant dans le milieu a été séparé par centrifugation et lavé à l'eau. Les cellules ou le mycélium a ensuite été mis en suspension dans une solution tampon de phosphate, ayant un pli de 8. Le mélange de réaction employé pour examiner ladite activité enzymique est donné ci-après.
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TABLEAU . 1 Composition du mélange de réaction
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<tb>
<tb> Concentration <SEP> Quantité <SEP> .employée <SEP>
<tb> solution <SEP> de <SEP> glucose <SEP> 100 <SEP> mM <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> solution <SEP> diacide <SEP> alphacetoglutarique <SEP> 200 <SEP> mM <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> solution <SEP> de <SEP> phosphate <SEP> diammonique <SEP> 100 <SEP> Dit <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> suspension <SEP> de <SEP> cellules <SEP> (ou
<tb> mycélium) <SEP> (cellules <SEP> ou
<tb> mycélium <SEP> humide) <SEP> . <SEP> 30-50 <SEP> mg/ml <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> solution <SEP> tampon <SEP> de <SEP> phosphate
<tb> (pH <SEP> 8) <SEP> 1/15 <SEP> M <SEP> 5 <SEP> ml <SEP>
<tb> 9 <SEP> ml
<tb>
Le pH du mélange de réaction a été ajusté à 8. 0 et on a complété à 10 ml.
Deux expériences de contrôle ont été effectuées en même temps. L'une avec une solution dont le glucose a été enlevé et l'autre avec une solution dont le glucose et l'acide alpha-céto- glutarique ont été enlevés, en partant du susdit mélange de réaction. Cette dernière solution de contrôle donnait la quantité de base de l'absorption d'ammoniaque dans cette réaction. On a laissé la réaction se poursuivre pendant 1 heure à 37 C. Les quantités d'ammoniaque consommées ont été mesurées pour déterminer lesdites activités enzymiques.
Les résultats sont donnés dans le tableau 2.
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TABLEAU 2
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- -- ---^--------- ^¯3 S ÇW c, t 1 Otl C. !r.r,o1112 e ("6' /ml) * f.:élanS3 de Mélange de réac- Puissance de O::c !1isne réaction (a) tien (b) (pas l'action
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<tb>
<tb> (contenant <SEP> de <SEP> glucose') <SEP> enzymique
<tb> glucose)
<tb>
EMI10.3
1 :'c.cilh-;s subtilis 23 5 + aci1luJ natto 16 7 + 2 Bacillus r#c:atheriU!:J 15 4 + 4 Ps eu dosons & ae 'L"" U -;
'1' Dosa 25 5 ++ 5 Aerobacter aarog8Des 42 6
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<tb>
<tb> 6 <SEP> Escherichia <SEP> coli
<tb> N . <SEP> 116 <SEP> 18 <SEP> 5
<tb> 7 <SEP> " <SEP> N <SEP> 128 <SEP> 52 <SEP> 12 <SEP> +++
<tb> 8 <SEP> " <SEP> No. <SEP> 165 <SEP> 32 <SEP> 8 <SEP> ++
<tb>
EMI10.5
9 Micrococcus N . 534 98 16 +++++
EMI10.6
<tb>
<tb> 10 <SEP> " <SEP> No. <SEP> 416 <SEP> 82 <SEP> 14 <SEP> ++++
<tb> 11 <SEP> Streptomyces <SEP> No.1056 <SEP> 42 <SEP> 5 <SEP> +++
<tb>
EMI10.7
12 " iT .21r3 17 4 +
EMI10.8
<tb>
<tb> 13 <SEP> Saccharomyces <SEP> No.618 <SEP> 18 <SEP> 4 <SEP> +
<tb> 14 <SEP> Torulopsis <SEP> No.
<SEP> 812 <SEP> 62 <SEP> 16 <SEP> ++++
<tb> 15 <SEP> Zygosaccharomyces
<tb> major <SEP> 42 <SEP> 8 <SEP> +++
<tb> 16 <SEP> Aspergillus <SEP> N .3181 <SEP> .26 <SEP> 12 <SEP> +
<tb> 17 <SEP> " <SEP> NO.3216 <SEP> 46 <SEP> 16 <SEP> +++
<tb> 18 <SEP> Mucor <SEP> No <SEP> .3423 <SEP> 48 <SEP> 14 <SEP> +++
<tb>
EMI10.9
19 Pénicillium N .4235 32 12 ++
EMI10.10
<tb>
<tb> 20 <SEP> " <SEP> N .4261 <SEP> 16 <SEP> 8 <SEP> +
<tb>
La quantité d'ammoniaque absorbée a été calculée par l'équation suivante:
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Absorption d'arononique = (Trouvée) - (Quantité de base).
La quantité de ,base de 1' = :.btio d'ammoniaque est donnée lorsque l'acide alpta-cétoglutarique et le glucose sont enlevés du mélange de réaction complet. Les chiffres individuels de la quantité de base de l' 8.!Jnoniave absorbée sont omis dans ce tableau.
* * + représente 1 - 20 Ó d'absorption d'ammoniaque dans un' mélange de réaction (a)
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Les résultats donnés dans le tableau 2 indiquent que la puissance de l'amination réductive d'acide alpha-cétoglutarique varie largement pour chaque race, même dans la même espèce, et d'autre part ils indiquent qu'il n'existe pas de corrélation entre les positions taxonomiques et la puissance de ladite action' enzymique. Ainsi, la puissance de l'activité enzymique doit être supposée appartenir au caractère spécifique de chaque race individuelle dans les diverses espèces ou groupes taxonomiques.
En outre, si l'on compare la quantité d'absorption d'ammonia- que dans les mélanges de réaction (a) et (b), les chiffres sont beaucoup plus élevés pour le premier que pour le dernier. Cela signifie que le glucose peut fournir l'énergie requise pour la réaction.
Ce résultat indique.que la réaction exige des matières saccharinées fermentables pour obtenir une forte absorption d'ammoniaque. En d'autres termes, la réaction'se fera de façon satisfaisante en présence- de sucre fermentable.:
Dans le Tableau 3, on a indiqué la quantité d'acide 1-glutamique formée par des microorganismes ayant une forte activité d'amination réductive, ainsi que celle formée par ceux qui ne possèdent pas une telle activité. La quantité d'acide 1-glutamique accumulée a été analysée après 3 jours de culture agitée.
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TABLEAU 3.
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<tb>
<tb>
Puis <SEP> sance <SEP> Production <SEP> d'acide
<tb> Organisme <SEP> d'amination <SEP> 1-glutamique
<tb>
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enzymique (mg/10D ma)
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<tb>
<tb> Milieu <SEP> A <SEP> * <SEP> Milieu <SEP> B <SEP> * <SEP> *
<tb> 1 <SEP> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ++ <SEP> 420
<tb> 2 <SEP> Eacillus <SEP> natto <SEP> + <SEP> 40
<tb> 3 <SEP> Escherichia <SEP> coli
<tb> N <SEP> 116 <SEP> 60
<tb> " <SEP> N <SEP> 128 <SEP> +++ <SEP> 410
<tb> 5 <SEP> Micrococcus <SEP> N <SEP> 534 <SEP> +++++ <SEP> 980
<tb> 6 <SEP> " <SEP> .
<SEP> NI! <SEP> 416 <SEP> ++++ <SEP> 420
<tb> 7 <SEP> Streptomyces <SEP> N <SEP> 1056 <SEP> +++ <SEP> 360
<tb> 8 <SEP> " <SEP> Ni <SEP> 0 <SEP> 2143 <SEP> + <SEP> 40
<tb> 9 <SEP> Torulopsis <SEP> N <SEP> 812 <SEP> ++++ <SEP> 670
<tb> 10 <SEP> Aspergillus <SEP> N <SEP> 3181 <SEP> + <SEP> 30
<tb> 11 <SEP> " <SEP> N <SEP> 3216 <SEP> +++ <SEP> - <SEP> 520
<tb> 12 <SEP> Mucor <SEP> N <SEP> 3423 <SEP> +++ <SEP> - <SEP> 340
<tb> 13 <SEP> Penicillium <SEP> N <SEP> 4261 <SEP> + <SEP> - <SEP> 60
<tb>
* Le milieu A contient : 50 g de glucose, 5 g de peptone,
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5 g d'urée, 1,0 g de HiT'0 , 0,1 g de IKSO 4.7H20 et est complété à 1 L avec de l'eau.
* * Le milieu B contient 50 g de glucose, 10 g de liqueur de céréale macérée (corn steep), 15 g de sulfate d'ammonium, 1,0 g de
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KZW04 ' 0,1 g de: Tn.ag0o1H0 , et est complété à 1 L are c de l'eau; pendant la culture, on ajoute de l'ammonique ou de la soude caustique de façon que le pH du milieu soit dans les limites 6,5 - 8,5.
Selon les résultats exposés dans le Tableau 3, il existe une corrélation évidente entre la puissance de la capacité d'amination ènzymique des ce llules ou du mycélium intact et l'accumula-
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tion effective d'acide 1-glutamiclue dans la fermentation à cul- ture agitée. Il ressort clairement des faits ci-dessus que les deux activités biochimiques spécifiques d'un microorganisme ont une corrélation directe avec la production et l'accumulation d'acide 1-glutamique. exemple 2.
Le contrôle du pH d'un milieu de fermentation.
Les milieux nutritifs employés étaient les mêmes que ceux auxquels se rapporte le Tableau 3. Pour le réglage de la valeur du pH du milieu dans les limites 6,5- 8,5 pendant la fermentation, on peut utiliser toutes sortes de substances qui contiennent de l'azote basique et peuvent fournir des ions d'ammonium
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et rendre le pH alcalin, par exemple NE? , hH4 OH, (lmZ) 2 CO, (Nh4) 2 0 3 etc.. Divers sels d'ammonium:, tels que (NB)2S04' NH4C1 et NH4NO3 peuvent être utilisés ensemble avec des alcalis caustiques. Les buts essentiels du contrôle du pH consistent à fournir la quantité requise\d'ions NH4 au milieu et à favoriser en même temps la réaction enzymique pour accumuler le 1-glutamate.
Les résultats ont été donnés dans le Tableau 4.
Tableau 4.
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11 OL1 rélé 5 w Pcogt-rlé PH règle 6,5 - 8,5 contrôlé <:)
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<tb>
<tb> ilieu <SEP> Organisme <SEP> Quantités <SEP> Quantités <SEP> Glucose <SEP> Rendements
<tb> d'acide <SEP> d'acide <SEP> consommé <SEP> (%)basés <SEP> sur
<tb>
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1-glutsunique 1-. gl uta!!li que (g/100 ml) glucose (nW100 MI) (/lOfl m1 consonne.
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<tb>
<tb>
A <SEP> Bacillus
<tb> subtilis <SEP> 22 <SEP> 420 <SEP> 2.4 <SEP> 17.5
<tb> Micrococcus
<tb>
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' 55-= 240 980 3.2 OQ6 Torulo'Osis "0 812 s., z 3.0 ....i a ,3 Aspergillus i: û215 8 enz 0 3.4 1 :J'- : .u4l.lA C V Ko 311:2.3 34.) 3.2 10.6
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(Les compositions des milieux A et B sont les mëes c'Le ;-Cour le Tableau 3).
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Le Tableau 4 montre que la fermentation sous un contrôle rationnel du pH est essentielle pour l'accumulation d'une quantité appréciable d'acide 1-glutamique dans le milieu de culture, tandis qu'en cas d'absence de contrôle du pH, même l'organisme qui accumulerait cet acide autrement, ne parvient pas à l'accumuler.
REVENDICATIONS.
1 - Procédé pour la production d'acide 1-glutamique, comprenant les phases consistant à cultiver, dans un milieu de culture, un microorganisme qui satisfait à deux conditions biochimiques, dont l'une est la capacité de produire de l'acide alpha-cétoglutarique à partir de matières saccharinées et dont l'autre est la possession d'une forte activité de déhydrogénase d'acide 1-glutamique, spécialement une forte activité pour l'ami. nation réductive dudit acide alpha-cétoglutarique, et à régler la valeur du pH du milieu de culture à une valeur de 6 - 9 par .l'addition d'agents neutralisants, de façon à obtenir l'accumulation d'une quantité appréciable d'acide 1-glutamique et ses sels dans le milieu de culture.
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The invention relates to the production of amino acids, and more especially to a process for the production of 1-glutamic acid and salt thereof, by fermentation. In particular, the present invention relates to a process comprising the phases which consist in cultivating a race of microorganisms mentioned below, in a culture medium containing saccharin, nitrogenous and inorganic materials, under conditions determined in advance, to accumulate a large amount of an amino acid in this medium, and to recover this amino acid. It is well known that when
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As microorganisms are grown in a suitable medium, various species of amino acids are produced in this medium.
The amount produced, however, was extremely small and it has never been reported that any particular species of amino acid accumulates in large amounts in the medium by a fermentation process. The reason for the extreme difficulty in accumulating any amino acids in a biological system has arisen on the basis that amino acids are the building blocks of proteins and that any amino acid when produced in a medium is capable of being readily resynthesized into proteins, polypeptides or the like, or is capable of being converted or broken down into other substances by various biochemical reactions. In other words, an amino acid can hardly be accumulated in a culture medium in the form of amino acid in the monomeric state.
The expression “monomeric state” is used in the present description to denote the monomolecular state, whether it is a free acid or a salt.
This is the reason why a fermentation process, a direct use of biochemical activities of a living population of microorganisms has never been proposed so far for the biosynthesis and accumulation of 1-glutaminic acid. Known biosynthesis is carried out in some enzyme system, i.e. a particular species of enzyme is extracted from microorganisms or certain animal or plant tissues, and the enzyme is reacted with substrates suitable, for example alpha-ketoglutaric acid and ammonium compounds under very limited reaction conditions.
An object of the. The present invention is to provide a method for directly producing a substantial amount of an amino acid by culturing a certain microorganism in a liquid medium.
One object of the invention is to provide a method
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to directly produce a substantial amount of acid
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lClt1-0 ': JX ::. iq1..1e by culturing a certain microorganism in a liquid medium.
Still another object of the invention is to provide a method for accumulating a large amount of drnlk't0 "L; ICt 'especially of 1-glutamic acid in the form of nonon3r3 $ acid in cultured L. : certain microorganism in a liquid medium Another object of ¯ '33î.'vsliiG1 is to provide a process for minimizing rÓ ,, -,:; tinl: 2 accessories, such as polymerization or decomposition of'. l-glutamic acid which would occur during the cultivation of a certain microorganism in a liquid medium,
Yet another object of the invention is to provide a method for accumulating 1-glutamic acid in a medium.
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liquid in a form iixxxxx in the monosiè-re state, that is to say in an easily recoverable form.
According to the present invention, a race of microorganisms having certain particular biochemical characters is inoculated
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to a liquid medium, and a large amount of an amino-acicb is produced in the medium by adjusting and maintaining the fold of the medium within 6 to 9 during fermentation.
The present invention is especially applicable to the production of 1-glutamic acid and will be described in a de-
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trimmed in relation to the production of lMglut @ aiu2 acid. However, it is understood that the invention is also applicable to the production of the other 8No-acids.
It has been found that the races of microorganisms suitable for use in the present invention must meet two specific biochemical requirements, namely, (1) the micro-
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organism must produce alphaHketoglutaric acid from saccharine material and (2) it must have a high
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1-glutamic acid dehydrogenase activity and must, in particular, be strongly active for the reverse reaction of the aforesaid reversible enzymic reaction, i.e. the reductive aminatin of alpha-ketoglutaric acid.
According to the invention, microorganisms have been selected which satisfy the two biochemically specific requirements mentioned above, and it has been found that there are many species of these microorganisms in natural habitats.
They are frequently found in various microbial fields, including the bacteria, yeast, and fungi or mold groups, without being limited to any taxonomic groups. They are found, for example, in various genera of microorganisms, as shown by the list below. The microorganisms mentioned in the list are only illustrative and there is no question of limiting the microorganisms suitable for the implementation of the present invention to those included in #tte list.
Bacteria:
Bacillus
Xanthomonas
Rhizobium
Escharichia
Proteus
Streptomyces
Pseudomonas
Azotobacter
Micrococcus
Aerobacter
Salmonella lactobacillus
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Yeasts:.
Saccharomyces
Pichia
Schizosacharomyces
Torulopsis
Rhodotorula
Endomyces Zygo saccharomyce s
Willia
Mycoderma
Monillia Mushrooms:
Mucor
Rhizopus
Aspergillus Neurospora
Penicillium
These groups include microorganisms which meet the two biochemical conditions mentioned above and can be used for the production of 1-glutamic acid according to the present invention, although the yields may be different.
Examination of their ability to produce alpha-ketoglutaric acid from materials is evident from the examples which will be described below. The potency of 1-glutamic acid dehydrogenase activity, especially the activity for Reductive animation of alpha-ketoglutamic acid, of a particular breed, was found to correlate with its ability to produce 1-glutamic acid.
These specific biochemical properties of a microorganism are '; paramount importance for the accumulation of acid One of the peculiarities of the present invention lies in: 'use.- for fermentation ...
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tion of 1-glutamic acid, of any particular microorganisms possessing such specific biochemical properties and selected from various known taxonomic groups, of different genera or species.
Another feature of the present invention lies in the control of the fermentation conditions. The composition of a culture medium can be any known composition suitable for the growth of the particular microorganism under consideration. In order to effect a vigorous metabolism of carbohydrates by the particular microorganism, it is also necessary to add various kinds of nitrogenous materials, inorganic materials or other known materials required by the organism to the culture medium.
In general, through the carbohydrate metabolism of a microorganism, acids tend to accumulate, making the medium acidic. It has been found that the production of 1-glutamic acid is significantly affected by the pH value of the medium during fermentation. Production proceeds favorably when the pH is set between 6.0 and 9.0, and the optimum pH value is found to be from about 7.0 to about 8.5.
According to the present invention, the pH value is adjusted and maintained in the Imites from 6.5 to 8.5, by adding a compound containing a basic nitrogenous radical. Thus, the alpha-ketoglutaric acid produced is combined with ammonium ions derived from the added basic nitrogenous radical, by the strong reductive amination action of 1-glutamic acid dehydrogenase, contained in the microorganism, and gives rise to to the foundation of 1-glutamic acid.
Due to the strong aminatin reductive activity of the organism's glutamic acid denydrogenase and by keeping the pH value within optimum limits, the various side reactions are minimized, so that the reaction of formation of 1-glutamic acid controls side reactions and is
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results in the accumulation of a large amount of 1- glutamic acid
Various methods can be used to neutralize the culture medium. In any case, a required amount of ammonium ions must be supplied to the medium. The combined use of ammonium and alkali salts also falls within the scope of the present invention.
Glutamic acid or its salt accumulated in the medium is recovered by any suitable known method, such as the ion exchange resin method, such method not being in itself an important part of the present invention *.
The present invention is also applicable .our the productino of amino acids other than 1-glutamic acid. One can, for example, choose organisms which produce alpha-keto acids, for example pyruvic acid, oxalacetic acid, etc., from saccharine materials, and which also have a strong activity for reductive amination. said alpha-keto acids, and the corresponding amino acids, such as alanine, aspartic acid, etc., can be produced and accumulated in the medium by suitable adjustment of the pH of the fermentation medium.
In order to better understand the subject of the invention, a few examples will be described below in relation to the production of 1-glutamic acid. example 1.
Various microorganisms have been examined to the point that the two specific biochemical capacities required as mentioned above, and suitable organisms or /; - have been selected.
The two specific biochemical conditions were examined as discussed below. The test method for the production capacity of alpha-ketoglutaric acid from materials
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8, (; CL -, rinée "is well known to those skilled in the art: thus, for example, a breed was cultivated by shaking culture in a liquid medium containing saccharine material and other nutrients. The desired acid was examined. by paper chromatography and, if necessary, use was also made of
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of the Friedemann-Hangen quantitative colorimetric analysis.
By this test, microorganisms were selected which were capable of producing an appreciable amount of alpha-ketoglutaric acid. @
Next, the activity of 1-glstamic acid dehydrogenase was examined, especially as to the potency of the reductive amination capacity of alpha-ketoglutaric acid. The test was carried out by the absorption route. ammonia in a reaction mixture as described below, using cells or intact mycelium. The quantitative ammonia absorption test was carried out according to the method described in "Microdiffusion Analysis and Volume trie error" (E.J. Conuay, London Crosby Lockwood and Son Ltd. 1950).
A microorganism to be tested was cultured stirred in the medium, e.g., glucose broth, Koji extract, or Czapek's solution, and after culturing for 20 to 40 hours, the cells or mycelium in the medium was cultured. separated by centrifugation and washed with water. The cells or mycelium were then suspended in a phosphate buffer solution, having a fold of 8. The reaction mixture used to examine said enzyme activity is given below.
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BOARD . 1 Composition of the reaction mixture
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<tb>
<tb> Concentration <SEP> Quantity <SEP> .employee <SEP>
<tb> solution <SEP> of <SEP> glucose <SEP> 100 <SEP> mM <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> solution <SEP> diacid <SEP> alpha ketoglutaric acid <SEP> 200 <SEP> mM <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> solution <SEP> of <SEP> phosphate <SEP> diammonium <SEP> 100 <SEP> Said <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> suspension <SEP> of <SEP> cells <SEP> (or
<tb> mycelium) <SEP> (<SEP> cells or
<tb> mycelium <SEP> wet) <SEP>. <SEP> 30-50 <SEP> mg / ml <SEP> 1 <SEP> ml
<tb> <SEP> phosphate <SEP> buffer <SEP> solution
<tb> (pH <SEP> 8) <SEP> 1/15 <SEP> M <SEP> 5 <SEP> ml <SEP>
<tb> 9 <SEP> ml
<tb>
The pH of the reaction mixture was adjusted to 8.0 and made up to 10 ml.
Two control experiments were performed at the same time. One with a solution from which glucose has been removed and the other with a solution from which glucose and alpha-keto-glutaric acid have been removed, starting from the above reaction mixture. This latter control solution gave the base amount of ammonia uptake in this reaction. The reaction was allowed to continue for 1 hour at 37 ° C. The amounts of ammonia consumed were measured to determine said enzymic activities.
The results are given in Table 2.
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TABLE 2
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- - --- ^ --------- ^ ¯3 S ÇW c, t 1 Otl C.! Rr, o1112 e ("6 '/ ml) * f.:elanS3 of Reaction mix Power of O :: c! 1isne reaction (a) tien (b) (not the action
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<tb>
<tb> (containing <SEP> of <SEP> glucose ') <SEP> enzymic
<tb> glucose)
<tb>
EMI10.3
1: 'c.cilh-; s subtilis 23 5 + aci1luJ natto 16 7 + 2 Bacillus r # c: atheriU!: J 15 4 + 4 Ps eu dosons & ae' L "" U -;
'1' Dosa 25 5 ++ 5 Aerobacter aarog8Des 42 6
EMI10.4
<tb>
<tb> 6 <SEP> Escherichia <SEP> coli
<tb> N. <SEP> 116 <SEP> 18 <SEP> 5
<tb> 7 <SEP> "<SEP> N <SEP> 128 <SEP> 52 <SEP> 12 <SEP> +++
<tb> 8 <SEP> "<SEP> No. <SEP> 165 <SEP> 32 <SEP> 8 <SEP> ++
<tb>
EMI10.5
9 Micrococcus N. 534 98 16 +++++
EMI10.6
<tb>
<tb> 10 <SEP> "<SEP> No. <SEP> 416 <SEP> 82 <SEP> 14 <SEP> ++++
<tb> 11 <SEP> Streptomyces <SEP> No.1056 <SEP> 42 <SEP> 5 <SEP> +++
<tb>
EMI10.7
12 "iT .21r3 17 4 +
EMI10.8
<tb>
<tb> 13 <SEP> Saccharomyces <SEP> No.618 <SEP> 18 <SEP> 4 <SEP> +
<tb> 14 <SEP> Torulopsis <SEP> No.
<SEP> 812 <SEP> 62 <SEP> 16 <SEP> ++++
<tb> 15 <SEP> Zygosaccharomyces
<tb> major <SEP> 42 <SEP> 8 <SEP> +++
<tb> 16 <SEP> Aspergillus <SEP> N .3181 <SEP> .26 <SEP> 12 <SEP> +
<tb> 17 <SEP> "<SEP> NO.3216 <SEP> 46 <SEP> 16 <SEP> +++
<tb> 18 <SEP> Mucor <SEP> No <SEP> .3423 <SEP> 48 <SEP> 14 <SEP> +++
<tb>
EMI10.9
19 Penicillium N. 4235 32 12 ++
EMI10.10
<tb>
<tb> 20 <SEP> "<SEP> N .4261 <SEP> 16 <SEP> 8 <SEP> +
<tb>
The amount of ammonia absorbed was calculated by the following equation:
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Arononic absorption = (Found) - (Base amount).
The amount of ammonia base is given when alpta-ketoglutaric acid and glucose are removed from the complete reaction mixture. The individual figures for the base amount of 8.! Jnoniave absorbed are omitted from this table.
* * + represents 1 - 20% ammonia uptake in reaction mixture (a)
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The results given in Table 2 indicate that the potency of the reductive amination of alpha-ketoglutaric acid varies widely for each breed, even within the same species, and on the other hand they indicate that there is no correlation. between taxonomic positions and the potency of said enzymic action. Thus, the potency of the enzyme activity must be assumed to belong to the specific character of each individual race in the various species or taxonomic groups.
Further, if the amount of ammonia uptake in reaction mixtures (a) and (b) is compared, the figures are much higher for the former than for the latter. This means that glucose can provide the energy required for the reaction.
This result indicates that the reaction requires fermentable saccharine materials to obtain a high absorption of ammonia. In other words, the reaction will proceed satisfactorily in the presence of fermentable sugar:
In Table 3, there is indicated the amount of 1-glutamic acid formed by microorganisms having a strong reductive amination activity, as well as that formed by those which do not have such activity. The amount of 1-glutamic acid accumulated was analyzed after 3 days of shaking culture.
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TABLE 3.
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<tb>
<tb>
Then <SEP> sance <SEP> Production <SEP> of acid
<tb> 1-glutamic <SEP> amination <SEP> organism
<tb>
EMI12.2
enzymic (mg / 10D ai)
EMI12.3
<tb>
<tb> Medium <SEP> A <SEP> * <SEP> Medium <SEP> B <SEP> * <SEP> *
<tb> 1 <SEP> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> ++ <SEP> 420
<tb> 2 <SEP> Eacillus <SEP> natto <SEP> + <SEP> 40
<tb> 3 <SEP> Escherichia <SEP> coli
<tb> N <SEP> 116 <SEP> 60
<tb> "<SEP> N <SEP> 128 <SEP> +++ <SEP> 410
<tb> 5 <SEP> Micrococcus <SEP> N <SEP> 534 <SEP> +++++ <SEP> 980
<tb> 6 <SEP> "<SEP>.
<SEP> NI! <SEP> 416 <SEP> ++++ <SEP> 420
<tb> 7 <SEP> Streptomyces <SEP> N <SEP> 1056 <SEP> +++ <SEP> 360
<tb> 8 <SEP> "<SEP> Ni <SEP> 0 <SEP> 2143 <SEP> + <SEP> 40
<tb> 9 <SEP> Torulopsis <SEP> N <SEP> 812 <SEP> ++++ <SEP> 670
<tb> 10 <SEP> Aspergillus <SEP> N <SEP> 3181 <SEP> + <SEP> 30
<tb> 11 <SEP> "<SEP> N <SEP> 3216 <SEP> +++ <SEP> - <SEP> 520
<tb> 12 <SEP> Mucor <SEP> N <SEP> 3423 <SEP> +++ <SEP> - <SEP> 340
<tb> 13 <SEP> Penicillium <SEP> N <SEP> 4261 <SEP> + <SEP> - <SEP> 60
<tb>
* Medium A contains: 50 g of glucose, 5 g of peptone,
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5 g of urea, 1.0 g of HiT'0, 0.1 g of IKSO 4.7H20 and is made up to 1 L with water.
* * Medium B contains 50 g of glucose, 10 g of macerated cereal liqueur (corn steep), 15 g of ammonium sulfate, 1.0 g of
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KZW04 '0.1 g of: Tn.ag0o1H0, and is made up to 1 L are c of water; during cultivation, ammonia or caustic soda is added so that the pH of the medium is within the limits of 6.5 - 8.5.
According to the results shown in Table 3, there is a clear correlation between the potency of the enzymic amination capacity of cells or intact mycelium and the accumulation.
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effective tion of 1-glutamic acid in the stirred fermentation. It is clear from the above facts that the two specific biochemical activities of a microorganism have a direct correlation with the production and accumulation of 1-glutamic acid. example 2.
The control of the pH of a fermentation medium.
The nutrient media used were the same as those referred to in Table 3. For the adjustment of the pH value of the medium within the limits 6.5-8.5 during fermentation, all kinds of substances can be used which contain. basic nitrogen and can provide ammonium ions
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and make the pH alkaline, eg NE? , hH4 OH, (lmZ) 2 CO, (Nh4) 2 0 3 etc. Various ammonium salts :, such as (NB) 2SO4, NH4C1 and NH4NO3 can be used together with caustic alkalis. The essential purposes of pH control are to supply the required amount of NH4 ions to the medium and at the same time to promote the enzymic reaction to accumulate 1-glutamate.
The results have been given in Table 4.
Table 4.
EMI13.3
11 OL1 real 5 w Pcogt-rlé PH rule 6.5 - 8.5 controlled <:)
EMI13.4
<tb>
<tb> ilieu <SEP> Organism <SEP> Quantities <SEP> Quantities <SEP> Glucose <SEP> Yields
<tb> of acid <SEP> of acid <SEP> consumed <SEP> (%) based on <SEP>
<tb>
EMI13.5
1-glutsunique 1-. gl uta !! li que (g / 100 ml) glucose (nW100 MI) (/ lOfl m1 consonant.
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<tb>
<tb>
A <SEP> Bacillus
<tb> subtilis <SEP> 22 <SEP> 420 <SEP> 2.4 <SEP> 17.5
<tb> Micrococcus
<tb>
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'55- = 240 980 3.2 OQ6 Torulo'Osis "0 812 s., Z 3.0 .... ia, 3 Aspergillus i: û215 8 enz 0 3.4 1: J'-: .u4l.lA CV Ko 311: 2.3 34 .) 3.2 10.6
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(The compositions of media A and B are the same; see Table 3).
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Table 4 shows that fermentation under rational pH control is essential for the accumulation of an appreciable amount of 1-glutamic acid in the culture medium, while in the absence of pH control even the organism that would otherwise accumulate this acid fails to accumulate it.
CLAIMS.
1 - A process for the production of 1-glutamic acid, comprising the steps of cultivating, in a culture medium, a microorganism which satisfies two biochemical conditions, one of which is the ability to produce alpha- acid ketoglutaric acid from saccharine material and the other of which is the possession of strong activity of 1-glutamic acid dehydrogenase, specially strong activity for friend. reductive nation of said alpha-ketoglutaric acid, and to adjust the pH value of the culture medium to a value of 6-9 by the addition of neutralizing agents, so as to obtain the accumulation of an appreciable quantity of 1-glutamic acid and its salts in the culture medium.