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La présente invention est relative à un nouveau compose et plus
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spécialement à un nouvel agent chimiothérapeutique, et à un procède de préparation d'un tel agento Beaucoup d-9agents ohimiothéraFeutiques communément appelés antibiotiques ont été obtenus jusqueà, présent en partant du milieu de culture dans lequel des micro-organismes se sont développés sous des conditions soigneusement régléeso Dans certains cas? l'antibiotique obtenu montre une
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activité contre un très large groupe "d,\)organis:#es pathogènes et, dans du autres cas, l'antibiotique 1!IO!ltre une activité particulière contre un grou- pe relativement restreint d'organisme.
Un but de la présente invention est de procurer un nouveau composé qui''agit sur la croissance ou le développement de bactéries et d'organismes pathogènes,
Un autre but de l'invention est de procurer un composé qui règle de manière efficace;
, la croissance ou le développement de souches de bacté-
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ries et d!>organisI#s pathogènes, qui n'est pas réglée de manière efficace, par d'autres antibiotiques connuso
Un but de la présente invention est également de prévoir un procédé de production aisée de quantités importantes du nouvel antibiotique.
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Deautras buts de la présente invention apparaîtront de la des- cription détaillée et des revendications suivanteso
La nouvelle substance antibiotique a été trouvée efficace contre un groupe relativement particulier de bactéries. Parmi les bactéries qui sont annihilées ou contrôlées, par la nouvelle substance antibiotique,
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10rsqu.9on procède à des tests par la "Agar Streak Method" de Waksman et Rielly (Indo Engo Che Anal.
Edo 1 556, (1945), on a le Bacillus ere s ATCC 7064, le BaciZus .btilis ATCC J1JW?,9 le alroplom Qum fatdau ATCC 105419 le StreDtooocau.s py003nes ATOO 9342 le ta la o re ATCC 65-38-P, le Diploooccus pneu#oniae Type I.,le Sarcina lutes. ATeC 9341, le M.voobaotenum. s#cies ATGG 607, et le Ky.gobagte3aum- amag tio ATOC 101430 Des résultats supplémentaires obtenus par un processus de dilution périodique dans des milieux liquides montrent que les bactéries suivantes sont annihilées ou rendues inefficaces par les substances antibiotiques de la
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présente invention ô S taphylocpoçus aureus, souche de Kozam1k (;
résistant à la carbomycine et l'érythroIl\Vcine), 9 Stauhwloooozs aureus, Difco 1251 résistant va la pénicilline, l9auréonyciney la terramcôine9 et la chloromycétine) Staphylococçus aureus ATCC 6538-Pg s St entoooa.s '0, Djalag22ZLq¯Me¯UM2nLa,e TYW Il et StroPl9coeùas- faeo s ATOO 10 Les études in vivo sur des souris montrent que les substances antibiotiques cle la présente invention, administrées par voie intrau.tsculairye, protègent les souris contre le pz2genes,, le Sta yl coc eus aureus. et le DiPlocoGous nneumoniae, lorsque ces souris ont été infeo- téesdans le péritoine aved les organismes de teste Les tests de toxicité intraveineuse violente avec le nouvel antibiotique montrent que le LD 50 dans les souris est compris entre 2 et 3 grammes par kg de corps.
La nou-
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velle matière antibiotique est tolérée intramusculaire4mnt, à un degré de 800 mgr/kg de corps par jour sur une période de 5 jours.
L'organisme produisant l'antibiotique de la présente invention était isolé d'un échantillon de sol recueilli au Gardon of the Gods, Colo-
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rado Springs, au Golorado, L'isolement était réalisé par des processus stan- dards de dilution,utilisant un milieu solide,le Trypticase Soy Agar des Laboratoires Biologiques de Baltimore, dans des boîtes de Pétri.
Du point de vue structurel et fonctionnel, cet organisme est trouvé dans le sol en,
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tant qu'un membre de l'espèce Npoardia suivant la classification du Manual of Determinative Bacteriology (6e édition) de Bergeyo La souche particulière de Nocardia actinomycète utilisée dans la présente invention est identifiée ie)[ c :
mz# -étâil-± une souche Nocardia NA3-TE19, Il doit être entendu, cependant, que le procédé de fermentation de l'invention englobe en .plus
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de l'utilisation de la souche Nocardia NA)=TE19, d'autres souches de cette espèce Nocardia, qui produisent le nouvel antibiotique,de telles souches
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comprenant des modifications ou variantes de cette souche NA3-TE19> telles qu'aisément produites et isolées par des méthodes courantes d'isolement et de modification de souchequi comprennent le choix de l'organisme dé culture,et l'exposition de l'organisma à des moyens modificateurs, tels que les rayons x, la lumière ultra-violette,, et des agents chimiques.
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La souche Nocardia NA3-TE19 se distingue des autres espèces con- nues, et est caractérisée par les nombreux tests physiques physiologiques et de culturedéveloppés dans le paragraphe suivante
Lors d'un développement sur le Tryptone Dextrin Agar de la So-
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ciété Upjfx9 ayant la composition suivante Tryptone 0,5% Dextrine 1,0% Agar 2,0%
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Eau de ville quantité suffisante pour amener à 100%, une croissance modérée est observée, les colonies de Nocardia ayant un. millimètre de diamètre,, après quatre jours de croissance 2 mm de diamètre après 7 jours, et 3 mm de diamètre après 11 jours de ciibissance.
Les colonies for- . meus sont de structure circulaire devenant légèrement irrégulière, sont brillantes avec un aspect vitreux devenant très inégal ou plissé, et un mycélium substratal de couleur dorée comme le miel ou dorée claire (2ic), de couleur bambou ou chamois (2gc), un mycélium aérien blanc crème se formant autour des bords de la colonie,avec un mycélium aérien de couleur crème peu abondait aux surfaces le plus fortement croissantes, Les références au code des couleurs, employées ici, sont données suivant le "Color Harmony Manual" 3e édition, Ro Jacobsen, W.C Granville, et GoEoFoss, 1948., de la Container
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Corporation of Amaricao
Lorsqu'il est examiné au microscope,
on observe que le mycélium de la souche d'organisme NA3-TE19 croît ou se développe de façon modérément denseet a une structure à ramification du type monopode. De croissance rapide,il est sans spore cloisonnéeo Cependant, une segmentation du mycélium
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commence dans les 48 heures et une fragnmtatiàn. complète s'est réalisée dans les 72 à 96 heures. Les fragments ou iodiospores sont en forme de tiges avec des extrémités carrées bien définieso Ils mesurent environ 0, à 1,5
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micron de longo Le mycén'um mesure environ 0,5 micron de largeo Des enroule- ments à simple ou double boucle sont observés dans le mycélium au fur et
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à mesure que la 6\Üture vieillit, lorsque celle-ci est développée en vue d' une observation microscopiqueOn n'observe pas de conidies.
L'organisme produisant l'antibiotique de la présente invention montre les caractéristiques de culture suivantes, lorsqu'il est développé sur les milieux standard suivant s
A Tryptone, extrait de boeuf, extrait de levure, dextrose agar croissance modérée, très inégal au début mais, lors d'une incubation ultérieure, l'aspect inégal semble disparaître, mycélium substratal de couleur tan moutarde clair (2ie),mycélium aérien blanc peu développé, pas de spores, pas de pigment soluble dans l'eau.
Bo Peptone, extrait de boeuf, dextrose, chlorure de sodium a- gar - croissance modérée, aspect fortement inégal durant la période d'in- . cubation, mycélium substratal de couleur brun moutarde (2Pi) , tournant au brun d'or ou brun tabac (3Pi) , mycélium aérien blanc peu développé, pas de spores, pigment soluble dans l'eau. , gris-brun, léger;
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Co Forme d'aminé de Carvajal agar - croissance modérée, nircélium substratal de couleun jaune poudreux (1 1/2 gc) , tournant à doré comme le., miel ou doré' clair (2ic) , mycélium aérien blanc mince, pas de spores, pas de pigment soluble dans l'eau;
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DoDextrose - Asparagine agar - croissance modérée, mycélium substratal de couleur (2ie) tan moutarde clair, pas de mycélium aérien, pas de spores, pas de pigment soluble dans l'eau;
Eo Czapek-Dox (Dextrose) agar - croissance modérée, fortement inégal, mycélium substratal de couleur (31e) jaune cannelle ou érable, tour- nant au brun adobe ou brun clair (31g) mycélium aérien blanc peu développé, pas de spores, pas de pigment soluble dans l'eau, ;
Fo Malate de calcium agar - croissance modérée,mycélium sub- stratal de couleur (2ec) sable ou écru, mycélium aérien mince de couleur (2ba) perle, pas de spores, pas de pigment soluble dans l'eau ;
Go Rondelles de pomme de terre-croissance modérée, mycélium substratal de couleur (2ie) dorée comma le miel ou dorée claire, mycélium aérien mince de couleur perle (2ba) , pas de spores, pas de pigment soluble dans l'eau;
Ho Bouillon de glucose - croissance modérée, pellicule formée en 7 jours, aspect très inégal, mycélium substratal, dans la formation de pellicule, et de couleur bambou ou chamois (2gc) à doré comma le miel ou doré clair (2ic), pas de mycélium aérien, pas de spores, pas de pigment soluble dans l'eau ;
Io Lait de tournesol -pas de formation de flocon.
L'hydrolyse (éclaircissement) commence environ le dixième jour d'incubation à 28 C et est totale le ou avant le 21e jouroUne réaction colorée alcaline était observée à 7 jours. La détermination électrométrique du pH à 21 jours donnait un pH de 8,0 ,
Jo Agar d'amidon -croissance modérée, mycélium substratal de couleur (1-1/2PE) or antique aux bords des bandes de croissance, mycélium substratal de couleur gris olive clair (1-1/2gE) à la partie intérieure de croissance;
lors d'une incubation ultérieure, les bords deviennent de couleur chamois au beige (3gE) et la partie intérieure devient beige-brun ou brun brumeux (3ig) , mycélium aérien de couleur (2ba) perle peu développé, pas de spores, pas de pigment soluble dans l'eau, pas d'hydrolyse d'amidon
Ko Base d'agar sang tryptose croissance modérée, mycélium substratal de couleur (3PN) café ou brun foncé, pas de mycélium aérien pas de spores, hémolyse dans zone de 11 mm
Lo Gelatine ordinaire -croissance modérée, aspect cotonneux immédiatement sous la surface, devenant floconneux lors d'une incubation ultérieure, mycélium aérien blanc peu développé, c'est-à-dire, non perceptible lorsque la gélatine est liquifiée, la croissance tombe à un niveau solide,2/3 du tube liquéfié en 21 jours,
pas de pigment soluble dans l'eau; et
M Nitrate agar - les tests pour le nitrite étaient uniformé- ment négatifso
L'aptitude de l'antibiotique de la présente invention à utiliser diverses sources commerciales de carbone est donnée dans le tableau : suivant :
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TABLEAU Utilisation de carbone
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<tb>
<tb> Source <SEP> de <SEP> Utilisation <SEP> Vitesse <SEP> de
<tb> carbone <SEP> croissance
<tb> Pentoses <SEP> Xylose <SEP> # <SEP> modérée
<tb> Arabinose <SEP> # <SEP> modérée
<tb> Rhamnose <SEP> Hexoses <SEP> Dextrose <SEP> # <SEP> modérée
<tb> Galactose <SEP> # <SEP> "
<tb> Mannose <SEP> # <SEP> "
<tb> Cétoses <SEP> Fructose <SEP> # <SEP> modérée
<tb> S <SEP> orbose <SEP> Disaccharides <SEP> Sucrose <SEP> Lactose <SEP> Maltose <SEP> Cellibiose <SEP> # <SEP> rapide
<tb> Trisaccharide <SEP> Raffinose <SEP> Polysaccharide <SEP> Amidon <SEP> soluble <SEP> Cellulose
<tb> Glucoside <SEP> Salicine <SEP> # <SEP> lente
<tb> Alcools <SEP> Glycérol <SEP> # <SEP> modérée
<tb> Mannitol <SEP> # <SEP> rapide
<tb> Dulcitol <SEP> Inositol <SEP>
SorbitolAcides <SEP> Citrate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> # <SEP> lente
<tb> Lactate <SEP> de <SEP> " <SEP> # <SEP> "
<tb> Succinate <SEP> de <SEP> "
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> " <SEP> # <SEP> modérée
<tb> Tartrate <SEP> de <SEP> "
<tb> potassium
<tb> Témoin
<tb>
Il doit être entendu que les tests ci-avant pour l'utilisation de sources d'énergie sont mis en oeuvre sous des conditions spéciales de croissance, et que la carence des actinomycete à utiliser certaines sources d'énergie sous les conditions de test n'exclut pas leur .utilisation sous des conditions différentes. (* T.G Pridham et D. Gottliebo The Utility of arbon Compounds By some Actinomycetales as an Aid to S e s Determination J. Bacteriology 56,107-114,1948).
La présence et la concentration de l'antibiotique de la présente invention dans des liqueurs de fermentation et dans d'autres solutions sont déterminées par l'une quelconque des quatre méthodes : (1) la technique de la dilution d'agar avec le Bacillus subitlis comme organisme de test
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préféré e (2 ) l'essai ou la détermination périodique de dilution du bouillon avec de préférence le S treotococous pyoe:
enes ou le BacilLu .2 subtilig comme organisme de test(3) la détermination ou l'essai opacimétrique, et (4) 1' essai du disque de papiero
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Processus de l'essai de diluton de bouillon L'organisme de test(inpoulum) est d'abord préparé en faisant
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cioftre l'organisme d'essai désiré, choisi dans le groupe comprenant le Bacillus subtilis ATCC 10707, le Streotococcus faecalis ATCC 1.05.1 , et le Streptococcus Dyoe:
enes ATCC 9342 Les organismes Baçillus subtilis et Streptocoocus faecalis sont développés dans un milieu d'essai comprenant une base de bouillon Difco ToBo contenant 5& en volumes de glycérol,et l' organisme Streptococcuenes est développé dans un bouillon Difco Tryptose-Phosphateo
Dans plusieurs tubes de test, on place 5 ml du milieu d'essai comprenant la base de bouillon bifco ToBo contenant % en poids de glycé- rolo Le milieu et les tubes d'essai sont stérilisés dans un autoclave pendant 15 minutes à une pression de 1,05 kg par centimètre carrée Dans chacun des tubes contenant les 5 ml de milieu d'essai, on ajoute une solution ayant différentes concentrations de la substance antibiotique de la présente invention,en dissolution dans de l'eau distillée stérile contenant environ ' 15% d'alcool méthylique.
Une dilution appropriée de la solution antibiotique est ajoutée au premier tube de test contenant le milieu d'essai, et des dilutions périodiques (deux fois) sont ensuite réalisées dans les autres tubes, le volume de passage périodique étant rejeté après mélange dans le dernier tube de chaque série.
Chacun des tubes est alors ensemencé de 0,1 ml d'une dilution 1/100 du second bouillon de culture de 24 heures de l' inooulum préparé de la manière décrite ci-avent. Les tubes sont soumis à
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agitation et à incubation pendant 48 heures à 37BC, et on les observe en vue de remarquer la croissance de l'organisme de test, après des incubations de 24 et 48 heureso La concentration inhibitrice minimum du composé antibio-
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tique, qui annihilera complètement la croisamae de l'organisme de test, est ensuite notéeo Praessus de l'essai de dilution d'pgar
Des dilutions périodiques des échantillons contenant l'antibio- tique sont mélangées avec un agar nutritif ayant la composition suivante :
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Cérélose 0 ,7, KH POt 0 , l
Extrait de levure 0,1% KHPO 0,3%
Tryptone 0,3%
Extrait de boeuf 0,3%
Agar 2,0%
Eau de ville une quantité suffisante pour amener à 100%
L'agar nutritif est versé dans des bottes de Pétri où on le laisse se solidifiero Ensuite, la plaque d'agar obtenue est ensemencée d'une culture de l'organisme de test, qui est susceptible d'attaque, en faisant passer à la surface de l'agar durci dans chaque boîte, un dispositif d'application garni de coton stérile, qui a été plongé dans une suspension contenant
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100000000 de spores par ml de Bacillus subtilis ATCC 10707 (Ill1nois)o Chaque boite est alor incubée à 37 C pendant 24 heures, et ensuite observée pour déterminer le degré de croissance de l'organisme.
La plus grande dilu- tion du milieu de culture, qui provoque un arret total de la croissance de l'organisme de test, est déterminée,en unités arbitraires de dilution d' agar par ml, en observant la plus grande dilution de l'antibiotique à laquelle il n'y a pas de croissance de l'organisme de testo
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Processus de l'essai opaciz#triaue
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Le processus de l'essai opacimétrique, employé avec l'antibiotique de la présente invention, correspond au processus qui a été utilisé avec
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d'autres antibiotiques et suit les principes décrits par D.À.Joslyn et H.
Galbraith dans le Journal of Baeteriolosv. 59 . 711-6 (1950). Pour cet essai, on emploie comme organisme de test le Staphylococcus aureus, souche 314M.
Le milieu d'essai est constitué par : Cérélose 0,1%
Peptone 1,0%
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NAOL z
Extrait de levure 0,1%
Extrait de-boeuf 0,3%
Eau distillée une quantité suffite pour amener à 100%
Des dilutions des échantillons , standards et d'essai sont réalisées dans de l'eau distillée stérileo 'incubation est réalisée à 37 C pendant trois heures et demi,après quoi on mesure l'opacité par un néphélomètre
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photoélectriqueo La courbe standard va de 4 à. 32 unités de dilution d'agar Bac11lus subtiis par millilitre.
Processus de l'essai au disque de papier
Le processus de l'essai au disque de papier, employé avec le présent antibiotique, correspond au processus décrit par T.H Loo, PoS.
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Skell, HoHoThomberry, Jo Ehrlich; Jo3oIecGuire, GoMo Savage, et JoCoSylvester dans le Journal of Baeteriolopy. 50. 701 (1945). Lorsqu'on soumet à essai les milieux de fermentation de la présente invention, la bière centrifugée est placée sur les disques de papier et est alors manipulée, d' une façon générale, de la même manière que la matière contenant de la strep- tomycine, dont il est question dans l'article de revue ci-avant.
On a trouvé désirable, cependant, dans la préparation des échantillons standards et dressai, d'employer une solution un peu plus concentrée de l'antibioti- queo C'est ainsi que l'échantillon standard est, de préférence, dilué dans
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un tampon (1) de phosphate de il 8 jusqu'à 400 unités/ml, àp0 unités/ml, 100 unités/mlr 40 unités/ml, lesdites unités étant des unités de dilution d'agar Bac..3.lus subtiJ.,:s (UoDoAo);
et l'échantillon d'essai est dilué dans un tampon (1%) de phosphate de il 8 jusqu'à environ 150 UDA/mlo Après que les échantillons d'essai ont été transformés en plaques, celles-ci sont réfrigérées pendant deux heures et ensuite soumises à incubation pendant
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une nuit à 30 Co Ensuite les dimensions de zone sont lues en min, et 1' inclinaison standard est déterminée de la manière habituelleo
Le nouvel antibiotique de la présente invention est préparé en
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cultivant une source de l'espèce ar " a par voie aérobique, de préférence en fermentation profonde, dans un milieu nutritif contenant une source de carbone, une source convenable d'azote, et des traces nécessaires de minéraux
Comme source de carbone, on peut utiliser des sucres, tels que dextrose fructose, et cellibiose,
ou d'autres substances carbohydratées, telles que alcools de sucre, notamment mannitol, glycérol, etco et des huiles végétales et également de l'oléineo
Des sources convenables d'azote pour le procédé de fermentation sont constituées par une large variété de substances, notamment les farines végétales et animales, telles que la farine de soya, des; extraits de farine, et diverses autres substances azotées d'origine végétale ou animaleo Une liqueur infusée de froment .qui'.contient une large variété de substances essentielles de croissance, à la fois organiques et inorganiques,
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peut être ajoutée" aux milieux de fermentation.
Un milieu de peptone-mélasses est également intéressant à la fois dans la fermentation avec agitation de flacon et dans la fermentation à culture submergée,
L a température préférée du procédé de fermentation est compri-
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se entre environ 24 et 28 C bien que des températures aussi basses qu' environ 22 C et aussi élevées qu'environ 32 C puissent être utiliséeso Les productions manima peuvent être obtenues en.
environ 4 jours de fermentation sous des conditions optima de température et d'aération, telles que décri- teso
EXEMPLE I
Un plan d'agar d'un agar de farine d'avoine est préparé en traitant à la vapeur 30 gr d'avoine moulue pendant 30 minutes dans un li- tre d'eau de ville après quoi la matière est filtrée à travers une étamine et 2% d'agar sont ajoutés pour former un milieu solide on ensemence ensui- te avec un ;échantillon d'une charge de sol du nouvel antibiotique de la présente invention, souche Nocardia NA3-TE19.
Le plan est soumis à incuba- tion à 28 pendant 4 à 7 jourso De l'eau distillée stérile est ajoutée au plan et la croissance de surface est enlevée en grattant avec un anneau d'inoculation stérileo
Des flacons standards d'Erlenmeyer de 500 ml, contenant 125 ml du milieu suivant
Avoine moulue 20 gr
Dextrine 10 gr Cérélose 5 gr
NaCL 5 gr
CaCO3 5 gr
KH2PO4 1 gr
NH4NO3 5 gr
Eau de ville 1 litre sont stérilisés à 121 C pendant 30 minutes sous une pression de vapeur et sont ensemencés avec la croissance de surface provenant du plan d'agar stérile ci-avant,, Les flacons sont soumis à incubation sur une machine rotative d'agitation à secousses, opérant à 240 tours par minute, avec un rayon excentrique de 5,7 cm,
à une température de 28 C pendant une période de 48 heureso Quatre % en volumes de la croissance provenant des flacons d'Erlenmeyer sont utilisés pour ensemencer deux flacons supplémentaires contenant le même milieu de fermentât!on Ces flacons nouvellement ensemencés sont soumis à incubation pendant 48 heures à 28 C sous les mêmes conditions de rotationo A la fin de la période de croissance de 48 heures, l'inoculum est facile à transférer au milieu de production.
Ensuite, des flacons contenant le milieu de croissance suivants
Cérélose 10 gr
Mélasses 20 gr
Peptone 5 gr
Eau de ville 1 litre sont ensemencés avec 4% en volumes de la croissance contenue dans la dernière paire de flacons d'Erlenmsyer et son soumis à incubation de la même manière que les flacons d'Erlenmeyer oi-avanto Après 4 jours d'incubation sur la machine rotative d'agitation à secousses9 la croissance est récoltée et la masse de bière est utilisée comme source de la nouvelle substance antibiotique de la présente inventiono Des essais sont réalisés par la technique de dilution d'agar Bacillus subtilis et indiquent une moyenne d'environ 80 à 320 UDA par mlo
EXEMPLE II
Un appareil de fermentation de 30 litres, contenant un milieu de fermentation ayant la composition suivante :
Cérélose jo gr
Mélasses 20 gr
Peptone 5 gr
Eau de ville 1 litre
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qui a été stérilisé à la vapeur à 3219C pendant une heure, est ensemencé avec 300 m1o (25% en volumes) de la souche N ocardi a4 NA3 TEIg , culture déve- loppée dans les flacons soumis à agitation, de la manière décrite à l'exem-
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ple 10 La fermentation est réalisée à oc avec une vitesse d'aération de 0,8 litre d'air par litre de milieu par minutée L'agitation est réalisée au moyen d'une roue à 4 aubes de 20,3 cm de diamètre qui opère à 480 tours par minutée De l'oléine,contenant 2,5% d'octadécanol., est utilisée pour régler la production de mousseo On récolte dans, les appareils de fermenta-
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tilon après quatre jours, et la bière,
lorsqu'elle est soumise à essai, par la méthode d'essai avec disque en papier, décrite ci-avant, montre des productions comprises entre environ 250 et 500 unités de dilution d'agar Bacil- lus subtilis par ml.
Le processus de récupération suivi comprend l'absorption de 1' antibiotique sur une élution de carbone de celui-ci avec de l'atone aqueu-
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se acidifiée chaude, l'enlèlvemant du solvant et la concentration des solides par évaporation la précipitation des impuretés avec du méthanol, l'évaporation jusqu'à siccité, l'extraction répétée des solides du méthanol chaud, l'extraction avec 50% de glycérol dans du méthanol, et la précipitation du produit bactéricide avec du méthanol° EXEMPLE III
La nouvelle matière antibiotique est récupérée de la bière de fermentation, produite à l'exemple II, en traitant la bière qui a été fil-
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trée pour en enlever les particules solides, avec 1% de Darco G-60, qui est une matière carbonée absorbante commerciale,
qui adsorbe plus de 95$ de la matière active de le( bièreo Le carbone est recueilli par filtration. avec
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de l'Hyflo Super-Cello Le gâteau de'filtre est lavé à l'eau et élué avec de l'acétone, aqueuse à z, chaude, acidifiée jusqu'au pH 3 environo Environ 30% de l'acitivité sont élués par un volume de solvant égale au six. semez en volumes de la bière du filtre.
Une triple répétition de l'élution réoupà- re une nouvelle fois 30%. Les fractions d'éluat sont combinées, neutralisées, et évaporées à pression réduite pour enlever l'acétoneo L'évaporation est poursuivie jusqu'à ce qu'un volume final d'environ 5% du volume de la bière soit obtenuo Un volume égal de méthanol est ajouté et un pricipité inactif est enlevé par filtrationo Le liquide de filtration est évaporé jusqu'à siccité, et le résidu est extrait de manière répétée avec du méthanol absolu chaud jusqu'à ce que la dernière portion de celui-ci ne soit que légère- ment colorée.
La matière pcudreuse brune restante est alors extraite avec 505 de glycérine dans du méthanol, qui est centrifugé pour enlever les solides inactifs. la substance active est alors précipitée par l'addition d'un quintuple volume de méthanolo Le précipité est refroidi par centrifugation,
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lavage au mét4noly et séchage pour produire une poudre de couleur gris-tano Le produit impur titre environ 250 UDA Bacillus subtilis par mgr.
EXEMPLE IV Un appareil de fermentation de 30 litres, contenant un milieu de fermentation ayant la composition suivante
Farine de soya 10 gr Cérélose 10 gr
NaCL 5 gr
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GAGO3 1 gr Oléine 5 ml Eau de ville 1 litre
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qui a été stérilisé à la vapeur à 121 G pendant une heure, est ensemencé avec 300 ml (2 ,5% mTvolumes) de la souche o ardia N13 E19 , culture déve- loppée dans les flacons soumis à agitation, de la manière décrite dans l' exemple Io La fermentation est réalisée à 24 C avec une vitesse d'aération de 0,8 litre d'air par litre de milieu par minuteL'agitation est réalisée
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au moyen à'une roue à quatre aubes de 2 0 ,3 cm de diamètre,
qui opère à 480
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tours par minuteo De l'oléine contenant 2 5% d'octadéoanol est utilisée pour régler la production de mousse. On récolte dans les appareils de fer- mentation après 4 jours, et la bière, lorsqu'elle est soumise à essai par la méthode, décrite ci-avant, d'essai au disque de papier, montre des
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productions d'environ 500 à 1000 UDA Bacill,s ,sabt3.lis par mlo
Le processus de récupération suivi comprend l'absorption de l'antibiotique sur une élution de carbone de celui-ci avec de l'acétone
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ueuse acidifiée chaude, l'enlèvebant du solvant et la concentration des solides par évaporation, la précipitation des impuretés avec du méthanol, l'évaporation jusqu'à siccité, l'extraction répétée des solides avec du méthanol chaud,
l'extraction avec 50% de glycérol dans du méthanol, et la précipitation du produit bactéricide atec du méthanol, substantiellement comme spécifié à l'exemple III.
La matière de la présente invention est soluble dans l'eau, les acides dilués et les alcalis, en donnant une solution brune foncée, et insoluble dans les alcools méthylique et éthylique, l'acétone, l'éther le dioxane, le chloroforme, et l'acide acétique glaciale
Des tests périodiques de sensibilité de dilution montrent que le nouvel antibiotique est efficace contre des souches de staphylocoques et de streptocoques qui résistent à la pénicilline, l'auréomycine, la ter-
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ramyoine, la streptomycine, l'érythromycine, ou la carbonycine.
Des tests de c1Vomatographie au papier étaient réalisés dans des cylindres graduésde 100- ml par la technique de la bande ascendante, dans laquelle des bandes étaient suspendues dans le solvant développateur
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(irriguant) contenu au fond du cylindre, en engageant à frot##nt la ban- de entre le bouchon du cylindre en verre poli, et le goulot dudit cylindre.
Dans certains des systèmes solvants utilisée les bandes étaient équilibrées avec l'atmosphère du cylindre en les laissant pendre au-dessus de la surface du solvant pendant une certaine période avant de les abaisser dans le solvant. Tous les systèmes solvants fonctionnaient dans un incuba-
EMI9.6
teur à air maintenu à 280C.
Des systèmes solvants ianscibles étaient admis à se séparer à 28ego L'organisa de test pour des bioautogr,phes était le Bacii1us subtilis 1TCG 10707, et le papier employé était une bande de 1,60 cm de Faton,-Dikeman 4, 5JJ 0 Système de solvant 1 : n-Butanol saturé d'eau désionisée Equilibrage - 3 heures Durée de développement - 16 à 17 heureso Vitesse de circulation = 0 Système de solvant II n- Butanol saturé d'eau désionisée 2,0% poids/volume d'acide paratoluènesulfonique ajoutés à la couche riche en n-butanolo Equilibrage - 3 heures Durée de développement - 16 à 17 heureso
EMI9.7
Vitesse de circulation =0 - oa359 0,!L6 (l'activité mineure 0 ,16 apparaît avec 500 mogi/bande)o système de solvant III :
n-Butanol saturé d'eau désionisée 2,0% poids/volume d'acide parat oluène sulfoni que et 2,0% de pipéridine volo/volo ajoutésà la couche riche en butanol.
Equilibrage - 3 heures Durée de développement - 16 à 17 heures Vitesse de circulation = 0,L'activité mineure à la vitesse
EMI9.8
o,7 apparaît avec 500 mcgr/bandeo
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Système de solvant IV : Méthylisobutyl cétone saturée d'eau désionisée Equilibrage néant Durée de développement - 3 heures Vitesse de circulation = 0 Système de solvant V Méthylisobutyl cétone saturée d'eau à laquelle sont ajoutés 2,0% d'acide paratoluènesulfonique en pods/volume
EMI10.1
Equilibrage néant Durée de' dévè7oppent m 3 heures Vitesse de circulation = 0 Systène de solvant VI Méthylisobutyl cétone saturée d'eau désionisée plus 2% vol/vol.
de pipéridineo Equilibrage - néant Durée de développement - 3 heures Vitesse de circulation = 0
EMI10.2
Svstème de solvant VII Eau désionisée saturée de méthylisobutyl cétone , Equilibrage - néant Durée de développement - 3 heures
EMI10.3
n.t.e.sSIL..4e 11 ation = 0 m 0,05, 0,80o Ces deux fracions ap- paraissent avec 500 mcgr/bande; la fraction lente apparaît avec moins de 100 mcgr/bande seulement.
Système de solvant VIII Eau désionisée saturée avec de la méthylisobutyl cétone avec addition de 1,0 % poids/volo d'acide paratoluènesulfonique.
Equilibrage - néant Durée de développement - 3 heures
EMI10.4
Vitesse. de circulation = 0 ,68, 0,880 Deux fractions d'activite-.à; peu'près égale (diamètre de zone) à 500 mcgr/bandeo La fraction lente disparaît après application de moins de pids à la bandeo
EMI10.5
S:.vstèz# de solvant IX Eau désionisée saturée de méthylisobutyl cétone à laquelle on ajoute 1,0% volo/volo de pipéridineo Equilibrage -néant Durée de développement - 3 heures Vitesse de circulation = environ 0 ,75 , 0,90 zones fondues.
Système de solvant X 3 parties d'eau désionisée, 1 partie d'un mélange de méthanol/
EMI10.6
acétone, à 3/1 volo/volo Régler le il à 1D,5 avec NH40H, ensoi-ëe retour à pH 7 , 5 avec acide phosphorique.
Equilibrage - néant Durée de développement - 3 heures Vitesse de circulation = à 500 mcgr/bande, apparemment deux
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zones fondues avec des vitesses d'environ 0,75 et D,90o Lorsquon empleia moins de 100 mcgr/bande, seule une zone à 0,90 apparaît.
Système de solvant XI Méthanol$ 89 parties; eau désionisée, 20 parties volo/volo
EMI10.8
plus 1,5% de NaCL poids/volo ajoutés à; la solutibno Les bandes sont tamponnées avec une solution contenait 0,95 3 NagS04 et 0,05 ï NaHSO/,0 Equilibrage - 3 heures Durée de développement 16 à 17 heures Vitesse de circulation = 0,16, 0,41 Deux zones ayant à peu près
EMI10.9
le même diamètre à 500 mcgrfbandeQ Avec moins de 100 mcgr/bande,
<Desc/Clms Page number 11>
la zone à 0.16 seule apparaito
Système de solyant XII :
80 parties d'éthanol, 20 parties d'eau désionisée, vola/vola
On ajoute 1,5 % de NaCL poids/volo à cette solution,, Les bandes sont tamponnées avec une solution de 0,95 M Na2SO4 et 0,05 M NaHSO4 dans de l'eau désioniséeo
Equilibrage - 3 heures
Durée de développement - 16 à 17 heureso
Vitesse de circulation =0,20.
Système de solvant AA
Acétate d'amyle saturé de 0,1 M phosphate de potassium tampon à 6,15 Le tampon est réalisé en partant de sels K2HPOet KH2PO4 dans de l'eau désionisée
Equilibrage - 3 heures
Durée de développement - 16 à 17 heures (une partie du solvant - passe au goulot du cylindre et s'évapore)o
Vitesse de circulation =0
Système de solvant MO
40 ml de n-butanol, 10 ml de méthanol, 20 ml d'eau désionisée.
Mélanger ensemble et ajouter un excès de méthylorange (environ
1,5 gr) et laisser au repos à 28 C
Séparer du méthylorange non dissous.
Equilibrage - 3 heures
Durée de développement - 16 à 17 heures
Vitesse de circulation =0,30 -0,34 et 0 Avec moins de 100 mogr/bande, seule l'activité à 0,30 et 0,34 apparaît aux bio- autographeso
Les étudesde chromatographie au papier montrent que l'antibi- otique peut se distinguer de n'importe lequel des antibiotiques ou agents chimiothérapeutiques connuso De plus, le test de chromatographie au papier montre également que l'antibiotique de la présente invention est un membre d'une nouvelle famille d'agents chimiothérapeutiques, et il semble être plus qu'un composant et peut contenir jusqu'à 3 ou 4 membres du groupe.
Il doit être entendu que l'invention n'est pas limitée aux caractéristiques ci-avant mais que bien desvariantes ou modifications pourraient être prévues sans sortir du cadre du présent breveté
REVENDICATIONS.
<Desc / Clms Page number 1>
The present invention relates to a new compound and more
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especially to a novel chemotherapeutic agent, and to a method of preparing such an agent. Many chemotherapeutic agents commonly referred to as antibiotics have heretofore been obtained, present from the culture medium in which microorganisms have grown under conditions. carefully regulated o In some cases? the antibiotic obtained shows a
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activity against a very large group of pathogens and, in other cases, the antibiotic 1! 10! l be particular activity against a relatively small group of organisms.
An object of the present invention is to provide a new compound which acts on the growth or development of bacteria and pathogenic organisms,
Another object of the invention is to provide a compound which regulates effectively;
, the growth or development of strains of bacteria
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pathogenic organisms, which are not effectively controlled by other known antibiotics.
An object of the present invention is also to provide a process for the easy production of large quantities of the novel antibiotic.
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Further objects of the present invention will become apparent from the detailed description and the following claims:
The new antibiotic substance has been found to be effective against a relatively specific group of bacteria. Among the bacteria that are annihilated or controlled, by the new antibiotic substance,
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10rsqu.9on tests are carried out using the "Agar Streak Method" of Waksman and Rielly (Indo Engo Che Anal.
Edo 1 556, (1945), we have Bacillus ere s ATCC 7064, BaciZus .btilis ATCC J1JW ?, 9 alroplom Qum fatdau ATCC 105419 StreDtooocau.s py003nes ATOO 9342 ta la o re ATCC 65-38-P , the Diploooccus tire # oniae Type I., the Sarcina lutes. ATeC 9341, M.voobaotenum. s # cies ATGG 607, and Ky.gobagte3aum- amag tio ATOC 101430 Additional results obtained by a process of periodic dilution in liquid media show that the following bacteria are annihilated or rendered ineffective by the antibiotic substances of the
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present invention ô S taphylocpoçus aureus, strain of Kozam1k (;
resistant to carbomycin and erythroIl \ Vcine), 9 Stauhwloooozs aureus, Difco 1251 resistant to penicillin, aureonyciney terramcôine9 and chloromycetin) Staphylococçus aureus ATCC 6538-Pg s St entoooa.s2LqM2LqM2LqMlag The in vivo studies in mice show that the antibiotic substances of the present invention, administered intrau.tsculairye, protect mice against pz2genes, Sta yl coceus aureus. and DiPlocoGous pneumoniae, when these mice were infected in the peritoneum with the test organisms. Violent intravenous toxicity tests with the new antibiotic show that the LD 50 in mice is between 2 and 3 grams per kg of body.
The Nou-
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This antibiotic material is tolerated intramuscularly, at a level of 800 mgr / kg of body per day over a period of 5 days.
The antibiotic producing organism of the present invention was isolated from a soil sample collected at Gardon of the Gods, Colo-
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rado Springs, Golorado, Isolation was performed by standard dilution procedures, using a solid medium, Trypticase Soy Agar from Baltimore Biological Laboratories, in Petri dishes.
From a structural and functional point of view, this organism is found in the soil in,
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as a member of the species Npoardia according to the classification of the Manual of Determinative Bacteriology (6th edition) of Bergeyo The particular strain of Nocardia actinomycete used in the present invention is identified ie) [c:
mz # -étâil- ± a strain Nocardia NA3-TE19. It should be understood, however, that the fermentation process of the invention further encompasses.
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of the use of the strain Nocardia NA) = TE19, other strains of this species Nocardia, which produce the new antibiotic, such strains
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comprising modifications or variants of this strain NA3-TE19> as readily produced and isolated by current methods of isolation and strain modification which include selection of the organism to culture, and exposure of the organism to modifying means, such as x-rays, ultra-violet light, and chemical agents.
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The strain Nocardia NA3-TE19 is distinguished from other known species, and is characterized by the numerous physical, physiological and culture tests developed in the following paragraph
When developing on Tryptone Dextrin Agar from So-
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ciety Upjfx9 having the following composition Tryptone 0.5% Dextrin 1.0% Agar 2.0%
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City water quantity sufficient to bring to 100%, moderate growth is observed, colonies of Nocardia having a. millimeter in diameter, after four days of growth 2 mm in diameter after 7 days, and 3 mm in diameter after 11 days of growth.
The colonies for-. meus are circular in structure becoming slightly irregular, are shiny with a glassy appearance becoming very uneven or wrinkled, and a substrate mycelium of golden color like honey or light golden (2ic), of bamboo or buff color (2gc), an aerial mycelium creamy white forming around the edges of the colony, with sparse cream-colored aerial mycelium on the most strongly growing surfaces. References to color coding, employed herein, are given according to the "Color Harmony Manual" 3rd Edition, Ro Jacobsen, WC Granville, and GoEoFoss, 1948., from the Container
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Corporation of Amaricao
When examined under a microscope,
The mycelium of organism strain NA3-TE19 is observed to grow or develop moderately dense and has a branching structure of the monopod type. Of rapid growth, it is without septate spore o However, a segmentation of the mycelium
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begins within 48 hours and a fragnmtatiàn. complete within 72 to 96 hours. The fragments or iodiospores are rod-shaped with well-defined square endso They measure approximately 0, to 1.5
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micron longo The mycenaum is about 0.5 micron wide o Single or double loop coils are observed in the mycelium as it grows
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as the body ages, as it is developed for microscopic observation. No conidia are observed.
The antibiotic producing organism of the present invention exhibits the following culture characteristics, when grown on the following standard media:
A Tryptone, beef extract, yeast extract, dextrose agar moderate growth, very uneven at first but, on subsequent incubation, uneven appearance seems to disappear, light mustard tan substrate mycelium (2ie), white aerial mycelium poorly developed, no spores, no water soluble pigment.
Bo Peptone, beef extract, dextrose, sodium chloride a- gar - moderate growth, strongly uneven appearance during the in- period. cubation, substrate mycelium mustard brown (2Pi), turning golden brown or tobacco brown (3Pi), poorly developed white aerial mycelium, no spores, pigment soluble in water. , gray-brown, light;
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Co Amine form of Carvajal agar - moderate growth, substrate nircelium of powdery yellow color (1 1/2 gc), turning to golden like, honey or light gold (2ic), thin white aerial mycelium, no spores , no water soluble pigment;
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DoDextrose - Asparagine agar - moderate growth, substrate mycelium colored (2ie) light mustard tan, no aerial mycelium, no spores, no water soluble pigment;
Eo Czapek-Dox (Dextrose) agar - moderate growth, strongly uneven, substrate mycelium in color (31e) cinnamon or maple yellow, turning to adobe brown or light brown (31g) sparsely developed white aerial mycelium, no spores, no pigment soluble in water,;
Fo Calcium malate agar - moderate growth, sub-stratal mycelium colored (2ec) sand or ecru, thin aerial mycelium colored (2ba) pearl, no spores, no water soluble pigment;
Go Potato slices - moderate growth, substrate mycelium colored (2ie) golden like honey or light golden, thin aerial mycelium pearl-colored (2ba), no spores, no water soluble pigment;
Ho Glucose broth - moderate growth, skin formed in 7 days, very uneven appearance, substrate mycelium, in skin formation, and bamboo or buff colored (2gc) to golden like honey or light golden (2ic), no aerial mycelium, no spores, no water soluble pigment;
Io Sunflower milk - no flake formation.
Hydrolysis (lightening) begins on about the tenth day of incubation at 28 ° C and is complete on or before day 21. An alkaline color reaction was observed at 7 days. The electrometric determination of the pH at 21 days gave a pH of 8.0,
Jo Starch Agar -moderate growth, antique gold colored substrate mycelium (1-1 / 2PE) at edges of growth bands, light olive gray colored substrate mycelium (1-1 / 2gE) at inner growth part;
on subsequent incubation the edges become buff to beige (3gE) and the inner part becomes beige-brown or hazy brown (3ig), pearl-colored aerial mycelium (2ba) poorly developed, no spores, no pigment soluble in water, no starch hydrolysis
Ko Moderate growth tryptose blood agar base, coffee colored or dark brown substrate mycelium (3PN), no aerial mycelium no spores, hemolysis in 11 mm area
Lo Gelatin Ordinary -moderate growth, cottony appearance immediately below the surface, becoming fluffy on subsequent incubation, white aerial mycelium poorly developed, i.e., not noticeable when gelatin is liquified, growth falls to a low solid level, 2/3 of the tube liquefied in 21 days,
no water soluble pigment; and
M Nitrate agar - tests for nitrite were uniformly negative.
The ability of the antibiotic of the present invention to utilize various commercial sources of carbon is given in the following table:
<Desc / Clms Page number 4>
TABLE Carbon use
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<tb>
<tb> Source <SEP> of <SEP> Use <SEP> Speed <SEP> of
<tb> carbon <SEP> growth
<tb> Pentoses <SEP> Xylosis <SEP> # <SEP> moderate
<tb> Arabinose <SEP> # <SEP> moderate
<tb> Rhamnose <SEP> Hexoses <SEP> Dextrose <SEP> # <SEP> moderate
<tb> Galactose <SEP> # <SEP> "
<tb> Mannose <SEP> # <SEP> "
<tb> Ketosis <SEP> Fructose <SEP> # <SEP> moderate
<tb> S <SEP> orbose <SEP> Disaccharides <SEP> Sucrose <SEP> Lactose <SEP> Maltose <SEP> Cellibiose <SEP> # <SEP> fast
<tb> Trisaccharide <SEP> Raffinose <SEP> Polysaccharide <SEP> Starch <SEP> soluble <SEP> Cellulose
<tb> Glucoside <SEP> Salicin <SEP> # <SEP> slow
<tb> Alcohols <SEP> Glycerol <SEP> # <SEP> moderate
<tb> Mannitol <SEP> # <SEP> fast
<tb> Dulcitol <SEP> Inositol <SEP>
SorbitolAcids <SEP> Citrate <SEP> of <SEP> sodium <SEP> # <SEP> slow
<tb> Lactate <SEP> of <SEP> "<SEP> # <SEP>"
<tb> Succinate <SEP> of <SEP> "
<tb> Acetate <SEP> of <SEP> "<SEP> # <SEP> moderate
<tb> Tartrate <SEP> of <SEP> "
<tb> potassium
<tb> Witness
<tb>
It should be understood that the above tests for the use of energy sources are carried out under special growth conditions, and that the failure of actinomycete to use certain energy sources under the test conditions n ' do not exclude their use under different conditions. (* T.G Pridham and D. Gottliebo The Utility of arbon Compounds By some Actinomycetales as an Aid to S e s Determination J. Bacteriology 56,107-114,1948).
The presence and concentration of the antibiotic of the present invention in fermentation liquors and other solutions is determined by any of four methods: (1) the technique of diluting agar with Bacillus subitlis as test organism
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preferred (2) the periodic dilution test or determination of the broth with preferably S treotococous pyoe:
enes or BacilLu .2 subtilig as a test organism (3) the determination or opacimetric test, and (4) the paper disc test.
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Broth diluton assay process The test organism (inpoulum) is first prepared by making
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Choose the desired test organism from the group consisting of Bacillus subtilis ATCC 10707, Streotococcus faecalis ATCC 1.05.1, and Streptococcus Dyoe:
enes ATCC 9342 The organisms Baçillus subtilis and Streptocoocus faecalis are grown in a test medium comprising a base of Difco ToBo broth containing 5% by volume of glycerol, and the organism Streptococcuenes is grown in a Difco Tryptose-Phosphateo broth
Into several test tubes are placed 5 ml of the test medium comprising the bifco ToBo broth base containing% by weight of glycerol.The medium and the test tubes are sterilized in an autoclave for 15 minutes at a pressure of 1.05 kg per square centimeter To each of the tubes containing the 5 ml of test medium is added a solution having different concentrations of the antibiotic substance of the present invention, dissolved in sterile distilled water containing about 15 % methyl alcohol.
An appropriate dilution of the antibiotic solution is added to the first test tube containing the test medium, and periodic dilutions (twice) are then made in the other tubes, the periodic passage volume being discarded after mixing in the last tube. of each series.
Each of the tubes is then inoculated with 0.1 ml of a 1/100 dilution of the second 24-hour culture broth of inooulum prepared as described above. The tubes are subjected to
EMI5.4
shaking and incubating for 48 hours at 37BC, and observed for growth of the test organism, after 24 and 48 hour incubations o The minimum inhibitory concentration of the antibiotic compound
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tick, which will completely annihilate the crusamae of the test organism, is then noted o Praessus of the gar dilution test
Periodic dilutions of the samples containing the antibiotic are mixed with a nutrient agar having the following composition:
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Cerelose 0, 7, KH POt 0, l
Yeast extract 0.1% KHPO 0.3%
Tryptone 0.3%
Beef extract 0.3%
Agar 2.0%
City water a sufficient quantity to bring to 100%
The nutrient agar is poured into Petri boots where it is allowed to solidify. Then, the resulting agar plate is seeded with a culture of the test organism, which is susceptible to attack, passing it through the surface of the hardened agar in each dish, an application device lined with sterile cotton wool, which has been dipped into a suspension containing
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100,000,000 spores per ml of Bacillus subtilis ATCC 10707 (Ill1nois) o Each dish is then incubated at 37 C for 24 hours, and then observed to determine the degree of growth of the organism.
The greatest dilution of the culture medium, which causes a complete arrest of the growth of the test organism, is determined, in arbitrary units of agar dilution per ml, observing the greatest dilution of the antibiotic. at which there is no growth of the testo organism
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Opaciz # triaue trial process
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The opacimetric assay process, employed with the antibiotic of the present invention, corresponds to the process that was used with
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other antibiotics and follows the principles described by D.A.Joslyn and H.
Galbraith in the Journal of Baeteriolosv. 59. 711-6 (1950). For this test, Staphylococcus aureus, strain 314M is used as the test organism.
The test medium consists of: Cerelose 0.1%
Peptone 1.0%
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NAOL z
Yeast extract 0.1%
Beef extract 0.3%
Distilled water a sufficient quantity to bring to 100%
Dilutions of samples, standards and tests are carried out in sterile distilled water, incubation is carried out at 37 C for three and a half hours, after which the opacity is measured by a nephelometer.
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photoelectric o The standard curve goes from 4 to. 32 Bac11lus subtiis agar dilution units per milliliter.
Paper Disc Test Process
The process of the paper disc assay employed with the present antibiotic corresponds to the process described by T.H Loo, PoS.
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Skell, HoHoThomberry, Jo Ehrlich; Jo3oIecGuire, GoMo Savage, and JoCoSylvester in the Journal of Baeteriolopy. 50. 701 (1945). When testing the fermentation media of the present invention, the centrifuged beer is placed on the paper discs and is then handled, in general, in the same manner as the streptomycin-containing material, discussed in the review article above.
It has been found desirable, however, in the preparation of standard and erected samples, to employ a somewhat more concentrated solution of the antibiotic. Thus, the standard sample is preferably diluted in.
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a phosphate buffer (1) of up to 400 units / ml, at p0 units / ml, 100 units / ml or 40 units / ml, said units being dilution units of Bac..3.lus subtiJ agar. ,: s (UoDoAo);
and the test sample is diluted in 11 8 phosphate buffer (1%) to about 150 UDA / mlo After the test samples have been made into plates, these are refrigerated for two hours and then incubated for
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overnight at 30 Co Then the area dimensions are read in min, and the standard inclination is determined in the usual way.
The novel antibiotic of the present invention is prepared by
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cultivating a source of the species ar "a aerobically, preferably by deep fermentation, in a nutrient medium containing a source of carbon, a suitable source of nitrogen, and the necessary traces of minerals
As a carbon source, sugars, such as dextrose, fructose, and cellibiose, can be used,
or other carbohydrate substances, such as sugar alcohols, in particular mannitol, glycerol, etco and vegetable oils and also oleino
Suitable sources of nitrogen for the fermentation process consist of a wide variety of substances, including vegetable and animal meals, such as soybean meal,; flour extracts, and various other nitrogenous substances of vegetable or animal origin o A liquor infused with wheat. which contains a wide variety of essential growth substances, both organic and inorganic,
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can be added "to fermentation media.
A peptone-molasses medium is also useful in both flask shake fermentation and in submerged culture fermentation,
The preferred temperature of the fermentation process is included.
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is between about 24 and 28 C although temperatures as low as about 22 C and as high as about 32 C can be used. Manima productions can be obtained by.
about 4 days of fermentation under optimum temperature and aeration conditions, as described
EXAMPLE I
An agar plan of an oatmeal agar is prepared by steaming 30 g of ground oats for 30 minutes in one liter of tap water after which the material is filtered through cheesecloth. and 2% agar is added to form a solid medium which is then seeded with a sample of a soil load of the novel antibiotic of the present invention, strain Nocardia NA3-TE19.
The plane is incubated at 28 for 4-7 days o Sterile distilled water is added to the plane and the surface growth is scraped off with a sterile inoculation ring.
Standard 500 ml Erlenmeyer flasks, containing 125 ml of the following medium
Ground oats 20 gr
Dextrin 10 gr Cerelose 5 gr
NaCL 5 gr
CaCO3 5 gr
KH2PO4 1 gr
NH4NO3 5 gr
1 liter tap water are sterilized at 121 C for 30 minutes under steam pressure and are seeded with the surface growth from the above sterile agar plane. The vials are incubated on a rotary machine. shaking stirring, operating at 240 revolutions per minute, with an eccentric radius of 5.7 cm,
at a temperature of 28 ° C for a period of 48 hours o Four% by volume of the growth from the Erlenmeyer flasks are used to inoculate two additional flasks containing the same fermentation medium! These newly seeded flasks are incubated for 48 hours at 28 C under the same rotation conditions At the end of the 48 hour growth period, the inoculum is easy to transfer to the production medium.
Then vials containing the following growth medium
Cerelose 10 gr
Molasses 20 gr
Peptone 5 gr
1 liter tap water are inoculated with 4% by volume of the growth contained in the last pair of Erlenmsyer flasks and its incubated in the same manner as the Erlenmeyer flasks oi-avanto After 4 days of incubation on the rotary shaking machine9 the growth is harvested and the beer mass is used as the source of the novel antibiotic substance of the present invention. Tests are carried out by the Bacillus subtilis agar dilution technique and indicate an average of approximately 80 to 320 UDA per mlo
EXAMPLE II
A 30 liter fermentation apparatus, containing a fermentation medium having the following composition:
Cerelose jo gr
Molasses 20 gr
Peptone 5 gr
City water 1 liter
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which has been steam sterilized at 3219C for one hour, is inoculated with 300 ml (25% by volume) of the strain N ocardi a4 NA3 TEIg, culture grown in the flasks subjected to shaking, as described in l 'exem-
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ple 10 The fermentation is carried out at oc with an aeration speed of 0.8 liters of air per liter of medium per timer The stirring is carried out by means of a 4-paddle wheel 20.3 cm in diameter which operates at 480 revolutions per minute Olein, containing 2.5% octadecanol., is used to regulate the production of foam o It is harvested in, the fermenta-
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tilon after four days, and beer,
when tested by the paper disc test method described above shows yields of between about 250 and 500 dilution units of Bacillus subtilis agar per ml.
The recovery process followed includes absorption of the antibiotic on an elution of carbon therefrom with aqueous atone.
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acidified hot, removing solvent and concentration of solids by evaporation precipitation of impurities with methanol, evaporation to dryness, repeated extraction of solids from hot methanol, extraction with 50% glycerol in methanol, and precipitation of the bactericidal product with methanol ° EXAMPLE III
The new antibiotic material is recovered from the fermentation beer, produced in Example II, by treating the beer which has been filtered.
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designed to remove solid particles, with 1% Darco G-60, which is a commercial absorbent carbonaceous material,
which adsorbs more than $ 95 of the active ingredient of the (beero Carbon is collected by filtration. with
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Hyflo Super-Cello The filter cake is washed with water and eluted with acetone, aqueous to z, hot, acidified to approximately pH 3 About 30% of the activity is eluted by a volume of solvent equal to six. sow in filter beer volumes.
A triple repetition of the elution again results in 30%. The eluate fractions are combined, neutralized, and evaporated at reduced pressure to remove the acetone o Evaporation is continued until a final volume of about 5% of the volume of the beer is obtained o An equal volume of methanol is added and an inactive substance is removed by filtration o The filtration liquid is evaporated to dryness, and the residue is repeatedly extracted with hot absolute methanol until the last portion of it is only slightly colored.
The remaining brown pudding is then extracted with 505 glycerin in methanol, which is centrifuged to remove inactive solids. the active substance is then precipitated by the addition of a quintuple volume of methanol The precipitate is cooled by centrifugation,
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washing with met4noly and drying to produce a gray-tano powder. The impure product contains approximately 250 UDA Bacillus subtilis per mgr.
EXAMPLE IV A 30 liter fermentation apparatus, containing a fermentation medium having the following composition
Soy flour 10 gr Cerelose 10 gr
NaCL 5 gr
EMI8.8
GAGO3 1 gr Olein 5 ml City water 1 liter
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which has been steam sterilized at 121 G for one hour, is inoculated with 300 ml (2.5% mTvolumes) of the o ardia strain N13 E19, culture grown in the flasks subjected to shaking, as described in Example Io The fermentation is carried out at 24 C with an aeration speed of 0.8 liters of air per liter of medium per minute The stirring is carried out
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by means of a four-bladed impeller 20.3 cm in diameter,
which operates at 480
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rpm Oolein containing 25% octadeoanol is used to control foam production. The fermentation apparatus is harvested after 4 days, and the beer, when tested by the method described above, of the paper disc test, shows
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productions of about 500 to 1000 UDA Bacill, s, sabt3.lis per mlo
The recovery process followed includes absorption of the antibiotic on an elution of carbon from it with acetone
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hot acidified water, removing it from the solvent and concentrating the solids by evaporation, precipitating impurities with methanol, evaporating to dryness, repeatedly extracting the solids with hot methanol,
extracting with 50% glycerol in methanol, and precipitating the bactericidal product with methanol, substantially as specified in Example III.
The material of the present invention is soluble in water, dilute acids and alkalis, giving a dark brown solution, and insoluble in methyl and ethyl alcohols, acetone, ether, dioxane, chloroform, and glacial acetic acid
Periodic dilution sensitivity tests show that the new antibiotic is effective against strains of staphylococci and streptococci that are resistant to penicillin, aureomycin, ter-
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ramyoin, streptomycin, erythromycin, or carbonycin.
Paper vomatography tests were carried out in 100 ml graduated cylinders by the ascending strip technique, in which strips were suspended in the developing solvent.
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(irrigating) contained at the bottom of the cylinder, by rubbing the strip between the stopper of the polished glass cylinder and the neck of said cylinder.
In some of the solvent systems used the bands were equilibrated with the cylinder atmosphere by allowing them to hang over the solvent surface for a period of time before lowering them into the solvent. All solvent systems operated in an incubator.
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air tor maintained at 280C.
Transformable solvent systems were allowed to separate at 28 ego. The test organism for bioautogr, phes was Bacii1us subtilis 1TCG 10707, and the paper used was a 1.60 cm strip of Faton, -Dikeman 4, 5JJ 0 System of solvent 1: n-Butanol saturated with deionized water Balancing - 3 hours Development time - 16 to 17 hours o Circulation speed = 0 Solvent system II n- Butanol saturated with deionized water 2.0% weight / volume of paratoluenesulfonic acid added to the layer rich in n-butanolo Balancing - 3 hours Development time - 16 to 17 hours o
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Circulation speed = 0 - oa359 0,! L6 (minor activity 0.16 appears with 500 mogi / band) o Solvent system III:
n-Butanol saturated with deionized water 2.0% w / v parat oluenesulphonic acid and 2.0% piperidine vol / vol added to the butanol-rich layer.
Balancing - 3 hours Development time - 16 to 17 hours Circulation speed = 0, Minor activity at speed
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o, 7 appears with 500 mcgr / Bandeo
<Desc / Clms Page number 10>
Solvent system IV: Methyl isobutyl ketone saturated with deionized water Balancing none Development time - 3 hours Circulation speed = 0 Solvent system V Methyl isobutyl ketone saturated with water to which 2.0% paratoluenesulfonic acid is added in pods / volume
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Balancing none Duration of development m 3 hours Circulation speed = 0 Solvent systene VI Methyl isobutyl ketone saturated with deionized water plus 2% vol / vol.
of piperidine Balancing - none Development time - 3 hours Circulation speed = 0
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Solvent system VII Deionized water saturated with methyl isobutyl ketone, Equilibration - none Development time - 3 hours
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n.t.e.sSIL..4e 11 ation = 0 m 0.05, 0.80o These two fracions appear with 500 mcgr / band; the slow fraction appears with less than 100 mcgr / band only.
Solvent System VIII Deionized water saturated with methyl isobutyl ketone with the addition of 1.0% w / v paratoluenesulfonic acid.
Balancing - none Development time - 3 hours
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Speed. of circulation = 0, 68, 0.880 Two fractions of activity-.à; about equal (zone diameter) to 500 mcgr / bando The slow fraction disappears after applying less weight to the bando
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S: .vstèz # of solvent IX Deionized water saturated with methyl isobutyl ketone to which is added 1.0% vol / vol of piperidine Equilibration - nil Development time - 3 hours Circulation speed = approximately 0, 75, 0.90 molten zones .
Solvent system X 3 parts deionized water, 1 part of a mixture of methanol /
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acetone, at 3/1 volo / volo Adjust it to 1D.5 with NH40H, then return to pH 7.5 with phosphoric acid.
Balancing - none Development time - 3 hours Circulation speed = at 500 mcgr / strip, apparently two
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zones melted with velocities of about 0.75 and D, 90o When example is less than 100 mcgr / tape, only a zone at 0.90 appears.
Solvent System XI Methanol $ 89 parts; deionized water, 20 parts volo / volo
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plus 1.5% w / v NaCL added to; the solutibno The bands are buffered with a solution contained 0.95 3 NagS04 and 0.05 ï NaHSO /, 0 Balancing - 3 hours Development time 16 to 17 hours Circulation speed = 0.16, 0.41 Two zones having to roughly
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the same diameter at 500 mcgrfbandeQ With less than 100 mcgr / band,
<Desc / Clms Page number 11>
the zone at 0.16 only appears
Solyant system XII:
80 parts ethanol, 20 parts deionized water, vola / vola
1.5% NaCL w / v is added to this solution, The bands are buffered with a solution of 0.95 M Na2SO4 and 0.05 M NaHSO4 in deionized water.
Balancing - 3 hours
Development time - 16 to 17 hours o
Circulation speed = 0.20.
AA Solvent System
Amyl acetate saturated with 0.1 M potassium phosphate buffer at 6.15 The buffer is made by starting from K2HPO and KH2PO4 salts in deionized water
Balancing - 3 hours
Development time - 16 to 17 hours (part of the solvent - passes through the neck of the cylinder and evaporates) o
Circulation speed = 0
MO solvent system
40 ml of n-butanol, 10 ml of methanol, 20 ml of deionized water.
Mix together and add an excess of methyl orange (approximately
1.5 gr) and leave to stand at 28 C
Separate from undissolved methyl orange.
Balancing - 3 hours
Development time - 16 to 17 hours
Circulation speed = 0.30 -0.34 and 0 With less than 100 mogr / band, only activity at 0.30 and 0.34 appears on bio-autographso
Paper chromatography studies show that the antibiotic can be distinguished from any of the known antibiotics or chemotherapeutic agents. In addition, the paper chromatography test also shows that the antibiotic of the present invention is a member of a new family of chemotherapeutic agents, and it appears to be more than a component and may contain up to 3 or 4 members of the group.
It should be understood that the invention is not limited to the above characteristics but that many variations or modifications could be provided without departing from the scope of this patent.
CLAIMS.