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PROCEDE DE PRODUCTION DE SELS DE ZINC DE LA KALLIKREINE.
Il est connu que la Kallikréine contenue dans les solutions impures est précipitée par un nombre de sels de métaux lourds, tels que l'acétate d'uranyle, le phosphate de plomb basique, etc. On sait par les travaux de H.
Kraut, E.K. Frey, E. Bauer et F. Schultz, Zeitschr. physiol. Chem. 205,99, 1937 qu'il s'agit ici d'adsorptions de Kallikréine à des précipités formés par ces métaux lourds, soit avec de la protéine soit avec de l'acide phosphorique ; car dans des préparations plus pures les précipités faisaient défaut dans les conditions opératoires adoptées à cette époque.
Or, la société demanderesse a trouvé que la Kallikréine et le zinc se combinent en formant un composé qui possède des avantages particuliers.Les sels de zinc de la Kallikréine sont relativement facilement solubles dans l'eau dans la gamme de pH comprise entre 5 et 6, mais difficilement solubles dans de l'alcool étendu (par exemple de l'alcool à 30 %) ou des mélanges de solvants organiques miscibles à l'eau, par exemple un mélange d'alcool et d'acétone.
Il est donc possible de précipiter les matières d'accompagnement inactives des solutions plus pures de Kallikréine par addition d'acétate de zinc à une valeur pH de 5 - 6, sans pertes substantielles de Kallikréine.
Après élimination des matières d'accompagnement, la Kallikréine peut être précipitée sous la forme de sel de zinc d'un haut degré de pureté par addition d'alcool ou d'acétone.
Dans les solutions impures de l'addition de sels de zinc donne lieu à la formation de précipités volumineux de protéine ou de phosphate de zinc qui adsorbent la Kallikréine. Il est donc nécessaire d'ajouter aux solutions de Kallikréine des solutions à 30 % d'alcool ou d'acétone avant l'addition de l'acétate de zinc, grâce à quoi les impuretés gênantes sont
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précipitées sans aucune perte substantielle de Kallikréine. Lorsque l'acé- tate de zinc est ajouté dans ce stade, tous les sels de zinc difficilement solubles dans des solutions aqueuses diluées d'alcool sont précipités en- semble avec la Kallikréine.
Le sel de zinc de Kallikréine est extrait à partir de ce précipité au moyen d'une faible quantité d'eau ou d'une solu- tion de sel neutre, par exemple avec une solution physiologique de chlorure de sodium, tandis que les sels de zinc difficilement solubles dans l'eau. restent dans le précipité dont ils peuvent être séparés.
Les sels de zinc de la Kallikréine sont stables dans des solutions aqueuses pendant une période de durée prolongée, mais ils ne peuvent pas être obtenus sous la forme de poudre sèche par les méthodes usuelles, sans que leur activité biologique en soit sérieusement comprise. Cependant, il est possible d'éliminer le zinc des solutions de sel de zinc au moyen d'échangeurs d'ions et de récupérer ensuite la Kallikréine sous forme de poudre sèche biologique- ment active suivant les méthodes usuelles,par exemple par évaporation dans le vide ou par précipitation avec de l'alcool ou de l'acétone. Ces poudres sèches se prêtent aussi à la purification supplémentaire de la Kallikréine.
EXEMPLE
3 litres d'un autolysat pancréatique sont additionnés de 1,5 li- tres d'alcool et le précipité obtenu est éliminé par essorage. La solution limpide est additionnée de 50 g d' acétate de zinc dissous dans 500 cc d'al- cool à 30 %. Le précipité qui ne tarde pas à se former est séparé par esso- rage au bout de 12 heures et mis en suspension dans 1 litre d'une solution physiologique de chlorure de sodium.Le sel de zinc de Kallikréine entre! en solution et est séparé du précipité par filtration. Le rendement en Kalli- ,kréine est de 80 % environ, le degré de pureté est de 40 - 60 par unité de Kallikréine.
La solution de sel de zinc de Kallikréine ainsi obtenue est dialysée pendant 24 heures dans des sacs de cellulose régénérée contre de l'eau courante, la concentration en ions hydrogène étant maintenue entre
5 et 6. Ensuite on y ajoute une nouvelle quantité de 10 g d'acétate de zinc par litre de liquide. La faible quantité du précipité exempt de Kallikréine est séparée par essorage. Ceci fait, la solution est portée à une teneur de 30 % d'alcool ou d'acétone et le précipité qui se sépare graduellement est recueilli dans une centrifuge. Ce précipité se dissout complètement dans l'eau . Le rendement est de 60 - 80 % de la Kallikréine mise en oeuvre.
Le degré de pureté s'élève à 20 - 30 par unité de Kallikréine.
La solution du sel de zinc de Kallikréine est filtrée à travers une colonne d'échangeurs de cations chargée de chlorure de sodium, puis ad- ditionnée à froid de 4 fois son volume d'alcool. Après un repos prolongé à froid, le précipité qui en résulte est séparé par essorage et séché en- suite avec l'acétone et de l'éther. Le rendement en substance active est de 60 %. La poudre sèche est soluble dans l'eau et stable.
REVENDICATIONS
1 Procédé de production de sels de zinc de la Kallikréine, consistant à précipiter la Kallikréine à partir de solutions alcooli- ques étendues, de préférence des solutions à 30 %, ou de solutions aqueu- ses de solvants organiques appropriés miscibles à l'eau, au moyen d'une solution d'acétate de zinc à une valeur pH de 5 - 6, et à extraire du préci- pité le sel de zinc de Kallikréine avec de l'eau ou une solution étendue de sels neutres.
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PROCESS FOR THE PRODUCTION OF ZINC SALTS FROM KALLIKREIN.
It is known that Kallikrein contained in impure solutions is precipitated by a number of heavy metal salts, such as uranyl acetate, basic lead phosphate, etc. We know from the work of H.
Kraut, E.K. Frey, E. Bauer and F. Schultz, Zeitschr. physiol. Chem. 205, 99, 1937 that this is adsorptions of Kallikrein to precipitates formed by these heavy metals, either with protein or with phosphoric acid; because in purer preparations the precipitates were lacking under the operating conditions adopted at that time.
However, the applicant company has found that kallikrein and zinc combine to form a compound which has particular advantages. Zinc salts of kallikrein are relatively easily soluble in water in the pH range between 5 and 6 , but hardly soluble in extended alcohol (eg 30% alcohol) or mixtures of water-miscible organic solvents, eg a mixture of alcohol and acetone.
It is therefore possible to precipitate the inactive accompanying materials from the purer Kallikrein solutions by adding zinc acetate at a pH value of 5 - 6 without substantial losses of Kallikrein.
After removal of the accompanying materials, Kallikrein can be precipitated as a zinc salt of a high degree of purity by adding alcohol or acetone.
In impure solutions the addition of zinc salts gives rise to the formation of bulky precipitates of protein or zinc phosphate which adsorb Kallikrein. Therefore, it is necessary to add 30% alcohol or acetone solutions to the Kallikrein solutions before the addition of zinc acetate, whereby the troublesome impurities are
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precipitated without any substantial loss of Kallikrein. When zinc acetate is added at this stage, all the zinc salts sparingly soluble in dilute aqueous alcohol solutions are precipitated together with kallikrein.
The zinc salt of Kallikrein is extracted from this precipitate by means of a small amount of water or a neutral salt solution, for example with physiological sodium chloride solution, while the salts of zinc hardly soluble in water. remain in the precipitate from which they can be separated.
Zinc salts of kallikrein are stable in aqueous solutions for a prolonged period of time, but they cannot be obtained in the form of dry powder by the usual methods, without their biological activity being seriously understood. However, it is possible to remove the zinc from the zinc salt solutions by means of ion exchangers and then recover the Kallikrein in the form of a biologically active dry powder according to the usual methods, for example by evaporation in the gas. vacuum or by precipitation with alcohol or acetone. These dry powders also lend themselves to the further purification of Kallikrein.
EXAMPLE
1.5 liters of alcohol are added to 3 liters of a pancreatic autolysate and the precipitate obtained is removed by suction. To the clear solution are added 50 g of zinc acetate dissolved in 500 cc of 30% alcohol. The precipitate, which does not take long to form, is filtered off after 12 hours and suspended in 1 liter of physiological sodium chloride solution. The zinc salt of Kallikrein enters! in solution and is separated from the precipitate by filtration. The yield of Kallikrein is approximately 80%, the degree of purity is 40-60 per unit of Kallikrein.
The solution of Kallikrein zinc salt thus obtained is dialyzed for 24 hours in bags of regenerated cellulose against running water, the concentration of hydrogen ions being maintained between
5 and 6. Then a further quantity of 10 g of zinc acetate per liter of liquid is added. The small amount of the precipitate free of Kallikrein is filtered off. This done, the solution is brought to a content of 30% alcohol or acetone and the precipitate which gradually separates is collected in a centrifuge. This precipitate dissolves completely in water. The yield is 60 - 80% of the Kallikrein used.
The degree of purity is 20 - 30 per unit of Kallikrein.
The solution of the zinc salt of Kallikrein is filtered through a column of cation exchangers loaded with sodium chloride, then added cold to 4 times its volume of alcohol. After standing in the cold for a long time, the resulting precipitate is filtered off and dried with acetone and ether. The yield of active substance is 60%. The dry powder is water soluble and stable.
CLAIMS
1 Process for the production of zinc salts of Kallikrein, comprising precipitating Kallikrein from extended alcohol solutions, preferably 30% solutions, or aqueous solutions of suitable organic solvents miscible with water, using a solution of zinc acetate at a pH value of 5 - 6, and extracting the zinc salt of Kallikrein from the precipitate with water or an extended solution of neutral salts.
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