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PROCEDE DE PREPARATION DE'SULFATE DIACIDE ALGINIQUE.
L'invention concerne des compositions de sulfate d'acide algini- que, c'est-à-dire des esters d'acide alginique d'acide sulfurique et leurs sels solubles dans l'eau; elle concerne également l'emploi de ces composés pour empêcher la coagulation du sang.
On a utilisé longtemps l'héparine dans les cliniques pour empêcher la coagulation du sang, par exemple pour empêcher des thromboses post-opératoi- res. On l'injecte en injections intra-veineuses sous la forme de son sel de sodium dissous dans une solution saline normale. L'héparine convient bien à cet usage parce qu'elle est un anti-coagulant puissant et a une faible toxici- té. Elle a cependant le grand inconvénient de n'être disponible qu'en quanti- tés relativement faibles, à un prix élevé. Aussi s'est-on efforcé de trouver un produit satisfaisant remplaçant l'héparine, qui soit meilleur marché et aisé à trouver.
La constitution de l'héparine n'est pas connue de façon exacte, mais il semble qu'elle consiste en un polysaccharide complexe contenant des unités d'acide glucuronique et de glucosamine dont les groupes hydroxyles li- bres sont estérifiés par l'acide sulfurique. Les efforts tentés pour trouver un produit de remplacement se sont largement dirigés vers l'examen de compo- sés tels que les sulfates de cellulose, pectine, chitine et chondroitine et les sulfates de dérivés de ces polysaccharides.
Bien que ces recherches aient rencontré un certain succès, toutes les substances examinées qui se sont mon- trées posséder une activité anticoagulante utile sont, pour autant qu'on le saéhe, suffisamment moins puissantes et plus toxiques que l'héparine pour rendre leur emploi impraticable', le plus puissant de ces produits de rempla- cement étant également en général le plus toxique.
Par exemple, d'après Kar- rer, Koenig et Usteri - Helvetica chimica Acta 26 (1943) 1299-1300- un es- ter de sulfate d'acide chondroitinesulfurique est 4 fois plus toxique que 1' héparine mais n'a seulement que 1/6 de sa puissance, tandis qu'un ester de sulfate de pectine ayant une puissance de 1/3 de celle de l'héparine, est 10 fois plus toxique - le tout en poids, et probablement sous forme de leurs sels de sodium.
La toxicité absolue n'est pas critique dans l'usage clinique et
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les expériences sur des animaux; il est essentiel, cependant , que la quanti- té de substances administrée pour produire une action anticoagulante voulue soit bien inférieure - c'est-à-dire représente 'une faible fraction - de la quantité toxique - minimum. Une autre caractéristique désirable d'un anticoa- gulant, à la fois pour l'emploi clinique et non-clinique, est la durée de 1' action; une action prolongée réduit la fréquence des administrations. Une autre caractéristique encore désirable est de pouvoir disposer d'un; approvi- sionnement industriel constant de matière première pour l'anticoagulant à un prix raisonnable.
On a découvert qu'on peut obtenir des anticoagulants hautement ef- ficaces par estérification de l'acide alginique avec l'acide sulfurique. On utilise de préférence ces anticoagulants sous forme de leurs sels non-toxi- ques solubles dans l'eau; c'est-à-dire les sels de sodium.
Les concentrations et quantités en doses efficaces sont suffisamment inférieures aux quantités toxiques pour qu'on puisse les utiliser de façon satisfaisante en clinique; mais en plus de leur emploi clinique possible sur l'être humain, ils se sont montrés efficaces sans danger et satisfaisants au cours d'expériences anima- 'les in vivo, et on les a aussi trouvés exceptionnellemènt utiles dans les ap- plications chimiques physiologiques in vitro, par exemple pour maintenir la fluidité du sang en relation avec des sphygmomanomètres à lecture continue.
L'acidité alginique ou algine, provenant principalement d'algues marines, est un complexe formé d'unités d'acide nannuronique; sa formule pro- bable est la suivante
EMI2.1
C'est par conséquent un acide polyanhydromannuronique. Le produit obtenu industriellement, utilisé comme matière première, est une substance col- loïdale. Comme la plupart des substances naturelles à poids moléculaires éle- vés de ce genre, ce n'est pas un composé chimique défini, mais un mélange de polymères de poids moléculaires différents, tous constitués cependant, appa- remment, d'unités d'acide anhydro-mannuronique.
Comme l'indique la formule ci-dessus, chaque unité possède deux groupes hydroxyles marqués x qui peuvent être estérifiés. En traitant 1-'acide alginique, préparé à partir du sel de sodium industriel à température modé- rée par un acide halo-sulfonique tel que l'acide chlorsulfonique, en présence d'un accepteur d'acide anhydre tel que la pyridine, on estérifie une grande proportion des groupes hydroxyles libres pour former des sulfates, sans dépo- lymérisation notable de l'acide alginique.
Le produit est un mélange de polyesters contenant différents pour- centages du groupe -0-SO H. La teneur en soufre théorique approximative du disulfate est de 19%, et du monosulfate 12,5 % Les pourcentages de soufre cor- respondants dans les sels de sodium. des di- et monosulfates sont de 16,9% et 11,6 % de soufre, en supposant que le sodium n'existe que dans les groupes NaOSO2, On arrive à fractionner le mélange de sulfatation en fractions pauvre, intermédiaire et riche en soufre en se basant sur la solubilité dans l'eau.
Les fractions obtenues contiennent respectivement environ 11-17 %, 9,5-12,5 % et 5 % de soufre en poids, Les quantités de soufre dans ces fractions indi- quent qu'il ne s'est produit qu'une sulfatation partielle, mais il a été im-
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possible jusqu'à présent de déterminer la répartition des groupes de sulfa- tes dans les molécules d'acide alginique polymériques.
On a évalué l'action anti-coagulante et la toxicité des produits sur des animaux de laboratoire (souris, lapins, chiens) et on a comparé les résultats obtenus avec ceux produits par l'héparine naturelle. La durée de l'action chez les lapins a également été déterminée. En général, les résul- tats sont plus favorables in vivo que in vitro comparativement à l'héparine.
Si les produits obtenus sont moins puissants que l'héparine, la dose efficace est suffisamment inférieure à la dose toxique pour que leur emploi soit sans danger. La durée d'action anticoagulante des produits après enlèvement du sang est plus longue que celle de 1-'héparine. Par exemple, dans le cas où 110 uni- tés Toronto d'héparine par Kgr de lapin prolonge la durée de coagulation du sang extrait de 20 minutes après l'injection à 5 heures et 20 minutes, 110 unités (calculées diaprés un essai in vitro) d'une fraction riche en soufre du produit de l'invention prolonge le temps de coagulation d'un échantillon de 20 minutes à plus de 7 heures. La durée d'action comparée de l'action sur le système du lapin est représentée par une série d'expériences effectuées au moyen d'héparine et du produit de l'invention.
On a injecté différentes doses d'héparine standard (110 unités Toronto par mgr.) par voie intravei- neuse à des lapins et on a déterminé le temps nécessaire au sang des lapins pour revenir à la normale au point de vue du temps de coagulation. Les ré- sultats sont les suivants :
EMI3.1
<tb> Dosage <SEP> d'héparine-Unités <SEP> Toronto <SEP> Temps <SEP> nécessaire <SEP> au <SEP> sang <SEP> pour
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> par <SEP> Kgr. <SEP> de <SEP> poids <SEP> du <SEP> corps, <SEP> revenir <SEP> à <SEP> l'état <SEP> normal.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
27,5 <SEP> unités <SEP> 17 <SEP> minutes
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 55 <SEP> 55
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 110 <SEP> 60
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 220 <SEP> 72
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 330 <SEP> 95
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 440 <SEP> 135
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 550 <SEP> 135
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 660 <SEP> ' <SEP> 153 <SEP>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 770 <SEP> 125
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 880 <SEP> 140
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 990 <SEP> 145
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1100 <SEP> 125
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 1500 <SEP> 135
<tb>
Ces résultats montrent qu'une durée maximum d'action (environ 21/2 heures) est produite par des doses comprises entre 440 et 660 unités/Kgr,
et qu'une augmentation nouvelle de la dose jusque 1500 unités/Kgr n'aug- mente pas1la durée de l'activité de coagulation réduite du sang au delà d' environ 22 heures.
Au moyen des produits de l'invention,en revanche, aucun indice de durée maximum n'apparaît, comme le montrent les résultats suivants
EMI3.2
<tb> Sulfate <SEP> diacide <SEP> alginique <SEP> de <SEP> sodium. <SEP> Temps <SEP> nécessaire <SEP> au <SEP> sang <SEP> pour
<tb> Doses <SEP> en <SEP> mgr/Kgr <SEP> de <SEP> poids <SEP> du <SEP> corps <SEP> revenir <SEP> à <SEP> l'état <SEP> normal.
<tb>
<tb>
10 <SEP> Inefficace
<tb> 20 <SEP> 120 <SEP> minutes
<tb> 40 <SEP> 180 <SEP> minutes
<tb> 125 <SEP> Plus <SEP> de <SEP> 8 <SEP> heures <SEP> et
<tb> moins <SEP> de <SEP> 24 <SEP> heures.
<tb>
La durée d'action maximum atteinte est plus de 3 fois celle de l'héparine avec une dose approximative de 1/8 de LD 50. Aucune action toxique dange- reuse sur l'animal n'a été observée.
En utilisant un sphygmomanomètre à lecture continue dans des examens physiologiques et pharmacologiques, on a empêché avec succès le sang
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de se coaguler dans la canule pendant 6 heures en remplaçant la solution saline citrique usuelle dans le tube reliant la canule au manomètre par une solution saline contenant 0,1 % d'une des préparations conformes à l'inven- tion. Dans ce cas, aucun produit conforme à l'invention n'avait été intro- duit dans le système de l'animal expérimenté.
Des exemples spécifiques de la préparation et des propriétés des produits conformes à l'invention sont donnés ci-après, mais ils ne doivent être considérés qu'à titre d'illustration seulement et non pas comme limitant la portée de l'invention.
EXEMPLES
1. Purification de l'acide alginique
On dissout 100 grs de sel sodique d'acide alginique commercial dans 5 litres d'eau, et on précipite l'acide libre en ajoutant une quantité suffisante d'acide chlorhydrique concentré dilué par un volume égal d'eau pour donner une faible valeur du pH, par exemple comprise entre 1 et 2, pour laquelle l'acide alginique libre est précipité sous une forme facile à filtrer.
On recueille le précipité sur un linge et on le libère en grande partie du li- quide par pressage dans une presse hydraulique. On lave alors successivement le précipité pressé une fois avec de l'eau, quatre fois avec du HCl à 0,5 %, deux fois à l'eau distillée et jusqu'à ce qu'il soit exempt d'ions chlores, et deux fois avec de l'éthanol à 95 % en utilisant chaque fois des portions d'environ 12 litres. On obtient un rendement de 72 grs d'acide alginique puri- fié, séché dans le vide sur du P2O5 en broyant finement le produit avant le séchagefinal.
2. Sulfatation:
On remue neuf grammes d'acide alginique purifié ne contenant de préférence pas plus de 1 % à 2 % d'humidité, dans un mélange de 90 ml de pyridine sèche et 21 ml d'acide chlorsulfonique à 60 C pendant 8 heures, à l'abri de l'humidité de l'air. On refroidit le mélange de réaction et on le verse dans 250 ml d'eau froide; on sépare les corps solides non-dissous par filtration. On précipite ensuite le sel de pyridinium de l'ester sulfate de l'acide alginique en ajoutant 4 volumes de méthanol (on peut également uti- liser de l'éthanol) on lave plusieurs fois à l'alcool et on sèche partielle- ment, Le rendement est de 6 grammes de produit sec.
3. Fractionnement
Les constituants plus riches en soufre sont plus facilement so- lubles dans l'eau que les constituants pauvres en soufre. On remue par con- séquent le produit d'ester sulfate de pyridinium ainsi obtenu pendant environ 1 minute avec 50 ml. d'eau à la température ordinaire, et on le centrifuge immédiatement. On désigne le liquide surnageant par A et le dépôt par A'. A- près une séparation rapide du dépôt A' de A, on traite à nouveau le dépôt A' de la même manière en le remuant avec 50 ml. d'eau et centrifugation, en produisant un liquide surnageant B et un second dépôt B'. On sépare rapide- ment B' et on le dissout dans 150 ml. d'eau pour produire une solution C.
On trouve ensuite que la solution C n'a que peu ou pas de valeur comme an- ti-coagulant. On traite séparément les solutions A, B et C comme suit :
On forme les sels de sodium des esters en portant les solutions au pH 9, déterminé par potentiométrie, en ajoutant d'abord une solution de NaOH 5N puis en effectuant le réglage final par une solution plus diluée.
On ajoute quatre volumes de méthanol (on peut également employer l'éthanol), on sépare le précipité, on le presse, on le redissout dans l'eau, on le repréci- pite par 4 volumes d'alcool, on le lave deux fois à l'alcool et deux fois à .l'éther diéthylique, et on le sèche dans le vide sur du P2O5 Les productions respectives d'une série des trois solutions et les 25 teneurs en sou- fre respectives des produits obtenus à l'analyse sont les suivantes :
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EMI5.1
<tb> Solution <SEP> Production <SEP> Pourcents <SEP> de <SEP> soufre
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> A <SEP> 4,29 <SEP> grs <SEP> 11,16 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> B <SEP> 1,01 <SEP> 9,5
<tb>
<tb>
<tb> C <SEP> 0,34 <SEP> 5,35
<tb>
Dans une autre série, 54 grs d'acide alginique purifié donnent les résultats suivants @
EMI5.2
<tb> Solution <SEP> Production <SEP> Pourcentage <SEP> de <SEP> soufre
<tb>
<tb> A <SEP> 20,86 <SEP> grs <SEP> 13,05%
<tb>
<tb> B <SEP> 11,31 <SEP> 12,63
<tb>
4. Essai et toxicité :
On compare la puissance d'échantillons de sels de sodium de sul- fate d'acide alginique à celle d'héparine standard par des essais in vitro semblables en principe à ceux décrits par Foster, J. Lab.
Clin.Med. 27 (1942), 820
On détermine la toxicité par injection intraveineuse chez des sou- ris en LD50 en termes de mgr. de substance par Kgr du poids du corps de la sou- ris, LD 50 représentant la dose minimum qui provoque la mort chez 50 % des a- nimaux soumis à l'essai.
On donne dans les exemples suivants la puissance et la toxicité déterminées de cette manière pour un certain nombre de préparations.
5. Essais in-vivo :
On essaie le solide séparé de la solution A comme dans l'exemple 3 sur des lapins par injection intraveineuse de la dose dissoute dans 2 ml d'eau distillée réglée au pH de 7 par HCl ou NaOH, puis, après les interval- les de temps indiqués, on prélève des échantillons de sang et on détermine leur temps de coagulation. Les résultats obtenus sont les suivants :
EMI5.3
<tb> Teneur <SEP> en <SEP> soufre <SEP> @ <SEP> Il,16 <SEP> %
<tb>
<tb> Puissance <SEP> in <SEP> vitro <SEP> 7,5 <SEP> unités/mgr.
<tb>
<tb>
LD <SEP> 50 <SEP> 988 <SEP> mg./Kgr.
<tb>
<tb>
Dosage <SEP> mgr./Kgr <SEP> Echantillon <SEP> pris <SEP> Temps <SEP> de <SEP> coagulation
<tb>
EMI5.4
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ après ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
EMI5.5
<tb> 20 <SEP> mgr <SEP> 30 <SEP> minutes <SEP> 18 <SEP> minutes
<tb>
<tb> 60 <SEP> @ <SEP> 30 <SEP> @
<tb>
<tb> 90 <SEP> @ <SEP> 2 <SEP> @
<tb> 80 <SEP> mgr <SEP> 180 <SEP> Il <SEP> Au <SEP> delà <SEP> de <SEP> 72 <SEP> heures.
<tb>
6. On effectue un autre essai comme décrit dans l'exemple 3 et on soumet la fraction riche en soufre à des essais, qui donnent les résul- tats suivants
EMI5.6
<tb> Teneur <SEP> en <SEP> soufre <SEP> @ <SEP> 13,26 <SEP> % <SEP>
<tb>
<tb>
<tb> Puissance <SEP> in <SEP> vitro <SEP> @ <SEP> 5-10 <SEP> unité/mgr
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> LD <SEP> 50 <SEP> @ <SEP> 1050 <SEP> mgr/Kgr.
<tb>
<tb>
<tb>
Doses- <SEP> mgr/Kgr <SEP> Echantillon <SEP> pris <SEP> Temps <SEP> de <SEP> coagulation
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯après¯¯¯¯ <SEP> @
<tb>
<tb>
<tb> 10 <SEP> mgr <SEP> inefficace
<tb>
<tb>
<tb> 20 <SEP> mgr <SEP> 30 <SEP> minutes <SEP> 17 <SEP> heures
<tb>
<tb> 60 <SEP> " <SEP> 16 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb> 90 <SEP> " <SEP> 5 <SEP> minutes
<tb>
<tb> 120 <SEP> " <SEP> Normal
<tb>
<tb>
<tb> 40 <SEP> mgr <SEP> 30 <SEP> " <SEP> Au-delà <SEP> de <SEP> 72 <SEP> heures
<tb>
<tb>
<tb> 60 <SEP> " <SEP> 24 <SEP> heures
<tb>
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EMI6.1
<tb> Doses <SEP> - <SEP> mgr/Kgr <SEP> Echantillon <SEP> pris <SEP> Temps <SEP> de <SEP> coagulation
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯après¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 90 <SEP> minutes <SEP> 2 <SEP> heures
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 120
<SEP> 1 <SEP> heure
<tb>
<tb>
<tb> 180 <SEP> " <SEP> Normal
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 125 <SEP> mgr <SEP> 8 <SEP> heures <SEP> Au <SEP> delà <SEP> de <SEP> 24 <SEP> heures
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 24 <SEP> Il <SEP> Normal
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 150 <SEP> mgr <SEP> 30 <SEP> minutes <SEP> Au <SEP> delà <SEP> de <SEP> 72 <SEP> heures
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 60 <SEP> " <SEP> " <SEP> 72 <SEP> tr
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 90 <SEP> " <SEP> " <SEP> 72 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 120 <SEP> " <SEP> " <SEP> 72 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 150 <SEP> " <SEP> " <SEP> 72 <SEP> "
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> 180 <SEP> " <SEP> partiellement <SEP> coagulé
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb> en <SEP> 21 <SEP> heures.
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
<tb>
250 <SEP> mgr <SEP> 180 <SEP> " <SEP> Au <SEP> delà <SEP> de <SEP> 72 <SEP> heures.
<tb>
Dans les cas cités, des doses jusque 1/4 LD 50 ne produisent au- cun effet toxique dangereux sur les animaux d'essais.
REVENDICATIONS 1.- Procédé de préparation de sulfate d'acide alginique carac- térisé en ce qu'on fait réagir de l'acide alginique contenant une petite quan- tité d'humidité avec un agent de sulfatation anhydre en présence d'un accep- teur d'acide anhydre à une température élevée inférieure au point d'ébulli- tion de l'eau et en l'absence d'humidité autre que celle que contient l'acide alginique.