BE1029567B1 - Procede de production de bacteriophages - Google Patents

Abstract

Procédé de production de bactériophages comprenant: fournir au moins une chambre de culture cellulaire; fournir un premier réservoir contenant un milieu de culture étant en première connexion en circuit fermé avec ladite au moins une chambre de culture cellulaire, le milieu de culture comprenant au moins une souche de phages et au moins une souche de bactéries; transférer le milieu de culture du premier réservoir via la première connexion en circuit fermé dans ladite au moins une chambre de culture cellulaire pour déposer le milieu de culture sous la forme d’une couche de culture dans ladite au moins une chambre de culture, incuber le milieu de culture pour propager des phages; fournir un récipient qui est en deuxième connexion en circuit fermé avec ladite au moins une chambre de culture cellulaire, la deuxième connexion en circuit fermé comprenant un système de filtration entre ladite au moins une chambre de culture cellulaire et le récipient ; et transférer le milieu de culture comprenant les phages propagés depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé et purifier lesdits phages propagés via le système de filtration, le milieu de culture étant sous forme liquide lors du transfert depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé et de la purification.

Description

PROCEDE DE PRODUCTION DE BACTERIOPHAGES

Domaine technique

La présente invention permet la production à une échelle intermédiaire de bactériophages à visée thérapeutique.

Arrière-plan technologique

Les bactériophages ou phages sont des virus n'infectant que des bactéries. Un phage possède du matériel génétique encapsidé dans une structure protéique constitué le plus souvent d'une tête et d'une queue. Pour plus de 95 % des phages connus, ce matériel est une molécule d'ADN double-brin d'une longueur de 5 à 650 kpb (kilobases) et leur dimension varie de 24 à 200 nm. L'infection d'une cellule bactérienne par un phage peut provoquer sa lyse avec libération de quelques dizaines voire de centaines de particules phagiques. Chaque particule phagique ainsi libérée va infecter une nouvelle bactérie et recommencer le cycle lytique. Les bactériophages, incapables de se reproduire par leurs propres moyens, injectent leur matériel génétique dans des bactéries hôtes. Grâce aux enzymes et aux ribosomes de l'hôte (et à certaines protéines virales selon les cas), le génome viral peut être répliqué et traduit pour former de nombreuses copies du virus qui sont libérés avec la lyse de la bactérie- hôte : on parle de cycle lytique ou cycle de production. Certains bactériophages se comportent autrement, leur matériel génétique est répliqué et s'intègre au chromosome de la bactérie (ou existe sous forme de plasmide). Le virus est alors désigné sous le terme de prophage, lequel est transmis à la descendance de la bactérie infectée (lignée lysogénique) et on parle alors de lysogénie ou de cycle lysogénique. Dans certains cas (par exemple, un stress de la bactérie), l'infection lysogénique peut potentiellement basculer vers un cycle lytique.

Cette capacité naturelle qu’ont les phages à infecter et tuer les bactéries ainsi que les interactions spécifiques entre les phages et les bactéries forment la base de la phagothérapie.

Ces dernières années, la phagothérapie gagne en intérêt comme étant une solution prometteuse pour traiter efficacement les maladies infectieuses bactériennes, particulièrement au vu des nombreuses résistances aux antibiothérapies.

Les antibiotiques ont permis de faire considérablement reculer la mortalité associée aux maladies infectieuses au cours du 20e siècle. L'efficacité remarquable des antibiotiques a motivé leur utilisation massive et répétée en santé humaine et animale. Toutefois, leur utilisation massive et répétée a conduit à l’apparition de souches bactériennes résistantes.

Ponctuelles au départ, ces résistances sont devenues massives et préoccupantes. Certaines souches sont multi-résistantes, c’est-à-dire résistantes à plusieurs antibiotiques. D’autres sont même devenues toto-résistantes, c’est-à-dire résistantes à quasiment tous les antibiotiques disponibles. Ce phénomène, en augmentation constante, place les médecins dans une impasse thérapeutique : ils ne disposent plus d’aucune solution pour lutter contre l'infection.

Certaines bactéries sont naturellement résistantesà des antimicrobiens. Plus préoccupante, la résistance acquise concerne l’apparition d’une résistance à un ou plusieurs antibiotiques chez une bactérie auparavant sensible. Ces résistances peuvent survenir via une mutation génétique affectant le chromosome de la bactérie, ou bien être liées à l'acquisition de matériel génétique étranger (plasmide, transposon) porteur d’un ou plusieurs gènes de résistanceen provenance d’une autre bactérie. Les résistances chromosomiques ne concernent en général qu’un antibiotique ou une famille d’antibiotiques.

Les résistances plasmidiques peuvent quant à elles concerner plusieurs antibiotiques, voire plusieurs familles d’antibiotiques. Elles représentent le mécanisme de résistance le plus répandu, soit 80% des résistances acquises.

La phagothérapie ou la thérapie par phages est l’utilisation thérapeutique de bactériophages pour traiter une infection bactérienne pathogène. La thérapie par phages a de nombreuses applications potentielles en médecine humaine ainsi qu’en dentisterie, en science vétérinaire et en agriculture.

Les bactériophages sont beaucoup plus spécifiques que les antibiotiques. Ils sont typiquement inoffensifs non seulement pour l’organisme hôte, mais également pour d’autres bactéries bénéfiques, telles que la flore intestinale, en réduisant les chances d’infections opportunistes. De plus, les phages sont assez spécifiques que pour cibler certaines souches d'espèces bactériennes, alors qu’ils sont inefficaces contre d’autres souches de ces mêmes espèces. Ils ont un indice thérapeutique élevé, c’est-à-dire qu’une thérapie par phages serait censée donner lieu à peu d’effets secondaires. Du fait que les phages se répliquent in vivo, une petite dose efficace peut être utilisée.

Par ailleurs, la spécificité des phages constitue un obstacle pour le développement de thérapies basée sur des phages. Au vu de leur spécificité, il est généralement nécessaire d'accéder à une libraire de phages différents et de tester l’efficacité des phages contre l'infection bactérienne d’un patient spécifique. En tant que tel, la phagothérapie tend à être personnalisée et les méthodes de production de phages actuelles sont généralement trop longues et demandent beaucoup de ressources pour être commercialement viable. En outre, les méthodes de production de phages actuelles sont encore souvent destinées à la production pour la recherche scientifique et ne conviennent pas à la génération de compositions pouvant être administrées sans danger comme médicament.

A cette fin, il est crucial de développer des procédés de production de compositions de bactériophages qui sont efficaces, c’est-à-dire qui sont suffisamment virulentes, non toxiques, hôte-spécifiques, et utilisables en pratique.

Un procédé de production de compositions de bactériophages basé sur une méthode de culture à double couche est connu. Le document WO2004/052274 divulgue une méthode de production de souches de phages actifs contre Pseudomonas aeruginosa. Une phase solide comprenant de l’agar à une concentration de 1,5% est étalée sur des boites et un mélange de phages et de bactéries est alors ajouté à une couche semi-solide comprenant 0,27% d’agar.

Après une incubation, la phase semi-solide est grattée de la boite et soumise à un protocole d’extraction répété plusieurs fois comprenant l’ajout de milieu frais (solution d’extraction) à la phase semi-solide pour obtenir une mixture et la centrifugation de la mixture pour obtenir un surnageant comprenant un extrait brut avec des bactériophages, l’extrait brut étant alors purifié.

Le procédé de production de compositions de bactériophages selon ce document a adapté les techniques utilisées à l’échelle de laboratoire, à savoir une méthode de culture à double couche, pour une production de compositions de bactériophages à une échelle commerciale. Le procédé selon le document WO2004/052274 vise à créer des conditions favorables à la culture des phages conduisant à l’obtention d’un titre élevé, en réduisant les volumes d’exploitation durant le procédé de production, ce qui permet d’éliminer l’utilisation de fermenteurs à gros volumes. Précisément, selon ce document, le volume d’exploitation initial, à savoir le volume de la phase semi-solide dans laquelle les phages sont propagés, est de l’ordre de 5 à 10 litres, voire de 10 à 20 litres. En outre, le volume de la solution d’extraction correspond à 20 à 100 fois le volume de la phase semi-solide, ce qui conduit à un volume d'exploitation total par cycle de production qui est compris entre 100 et 2000 litres. Les procédés selon ce document nécessitent également plusieurs étapes durant lesquelles les phages cultivés sont transférés d’un récipient à un autre, ce qui entraine des risques de contamination significatifs.

Ainsi, les procédés de production de compositions de bactériophages de l’état de la technique, tel que celui divulgué dans le document WO2004/052274, rencontrent aujourd’hui des limites importantes caractérisées par l’absence d’un procédé de production de compositions de bactériophages destinées à la phagothérapie qui est rapide, mobile, facile à mettre en œuvre, et présentant des risques plus faibles de contamination.

Description de l'invention

L'invention permet de résoudre les inconvénients de l’état de la technique en procurant un procédé de production de compositions de bactériophages qui est rapide, transposable, facile à mettre en œuvre et plus économique, réduisant les risques de contamination, et ce en garantissant l’obtention de compositions de bactériophages exploitables en phagothérapie, c’est-à-dire qui sont suffisamment virulentes, non toxiques, hôte-spécifiques, et utilisables en pratique. En particulier, premièrement, l’inventeur a découvert qu’il était possible de produire des bactériophages en connectant, via une première connexion en circuit fermé, un premier réservoir contenant un milieu de culture comprenant une souche de phage et une souche de bactéries avec une chambre de culture cellulaire et, via une deuxième connexion en circuit fermé comprenant un système de filtration, la chambre de culture cellulaire avec un récipient. De cette manière, le milieu de culture comprenant la souche de bactéries et la souche de phages à propager est transféré du premier réservoir via la première connexion en circuit fermé à la chambre de culture cellulaire dans laquelle les phages sont alors propagés, puis transférés vers la deuxième connexion en circuit fermé et purifiés via le système de filtration. Deuxièmement, l'inventeur a découvert qu’il était possible de transférer les phages propagés vers la deuxième connexion en circuit fermé et de les purifier via le système de filtration, et ce grâce à un milieu de culture qui est sous forme liquide lors du transfert depuis la chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé et de la purification. Tout en maintenant des titres de bactériophages élevés, les procédés selon l'invention permettent de réduire considérablement les volumes d’exploitation requis,

peuvent être mis en œuvre facilement, sont transposables tout en conservant des conditions stériles, sont rapides et permettent de réduire le nombre d’étapes qui comportent également un risque de contamination.

Plus particulièrement, un procédé de production de compositions de bactériophages 5 selon l'invention permet d’obtenir des compositions de bactériophages présentant un titre qui est d’au moins 10"° pfu/ml, de préférence qui est compris entre 10% et 10% pfu/ml, préférentiellement qui est compris entre 10"° et 10? pfu/ml, et ce avec un volume total d’exploitation inférieur ou égal à 80 litres, de préférence inférieur ou égal à 50 litres, préférentiellement inférieur ou égal à 25 litres, encore préférentiellement inférieur ou égal à 10 litres, de préférence inférieur ou égal à 5 litres en un temps total qui est inférieur ou égal à 20 heures.

Pour résoudre ce problème, il est prévu suivant Vinvention un procédé de production de compositions de bactériophages comprenant: - fournir au moins une chambre de culture cellulaire; - fournir un premier reservoir contenant un milieu de culture etant en premiere connexion en circuit ferme avec ladite au moins une chambre de culture cellulaire, le milieu de culture comprenant au moins une souche de phages et au moins une souche de bacteries; - transferer le milieu de culture du premier reservoir via la premiere connexion en circuit ferme dans ladite au moins une chambre de culture cellulaire pour deposer le milieu de culture sous la forme d’une couche de culture dans ladite au moins une chambre de culture, - incuber le milieu de culture pour propager des phages; - fournir un recipient qui est en deuxieme connexion en circuit ferme avec ladite au moins une chambre de culture cellulaire, la deuxieme connexion en circuit ferme comprenant un systeme de filtration entre ladite au moins une chambre de culture cellulaire et le recipient ; et - transférer le milieu de culture comprenant les phages propagés depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé et purifier lesdits phages propagés via le système de filtration, le milieu de culture étant sous forme liquide lors du transfert depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé et de la purification.

Par le terme « bactériophage », il est entendu au sens de la présente invention un virus qui infecte uniquement des bactéries. Le terme « bactériophage » et le terme « phage » sont utilisés de façon interchangeable dans la présente invention. Selon l’invention, les bactériophages sont, de préférence, des bactériophages lytiques.

Dans le cadre de la présente invention, tous les pourcentages sont des pourcentages en poids sur volume, sauf s’il y a une indication contraire.

Au sens de la présente invention, tous les ratios sont des ratios en volume sur volume, sauf s’il y a une indication contraire.

Par les termes « volume total d’exploitation », il est entendu au sens de la présente invention, le volume de la couche de culture additionné du volume nécessaire pour l'extraction des phages propagés de la couche de culture.

Dans le cadre de la présente invention, il a été observé de façon surprenante que le procédé de production de bactériophages selon l'invention présente plusieurs avantages, et ce tout en permettant d’obtenir des compositions de bactériophages à haut titre et exploitables en phagothérapie.

Premièrement, le procédé de production de bactériophages selon l'invention peut être réalisé avec un volume total d’exploitation inférieur ou égal à 80 litres, de préférence inférieur ou égal à 50 litres, préférentiellement inférieur ou égal à 25 litres, encore préférentiellement inférieur ou égal à 10 litres, de préférence inférieur ou égal à 5 litres. Selon la nécessité de production recherchée, le volume total d’exploitation est, de préférence, compris entre 40 et 80 litres ou, de préférence, compris entre 1 et 5 litres.

Il a été observé, de manière surprenante, que cet effet est obtenu notamment grâce à un milieu de culture qui est sous forme liquide lors du transfert depuis la chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé et de la purification. La mise en œuvre du procédé de production de compositions de bactériophages avec un volume total d’exploitation selon l'invention permet d’obtenir un procédé de production de compositions de bactériophages qui est plus pratique, plus facilement réalisé, plus rapide et plus économique. En effet, un volume total d'exploitation tel que celui de la présente invention fournit un procédé qui ne nécessite pas de grosses installations, au contraire de l’art antérieur pour lequel des installations adaptées à de gros volumes (des centaines voire des milliers de litres) doivent être utilisées, qui peut être transposable c’est-à-dire qui peut être réalisé notamment dans des hôpitaux ou des laboratoires, qui nécessite moins de consommables et qui est mieux adapté au technicien qui manipulera plus facilement et plus rapidement de plus petits volumes.

Deuxièmement, le procédé de production de compositions de bactériophages selon l'invention est un procédé de culture direct qui comporte moins d’étapes que les procédés connus de l’état de la technique, en particulier le document WO2004/052274. En effet, selon ce document, les phages propagés dans la couche de culture sont d’abord extraits selon les étapes suivantes : - récolter la couche de culture (milieu de culture semi-solide) ; - ajouter du milieu frais à la couche de culture pour obtenir une mixture ; - mélanger la mixture intensément ; et - centrifuger la mixture pour obtenir un surnageant qui comprend un extrait brut de bactériophages.

Selon le document WO2004/052274, l’extrait brut de bactériophages est ensuite purifié selon les méthodes comme par exemple, la chromatographie sur colonne.

Contrairement au procédé divulgué dans ce document, le procédé de production de compositions de phages selon l’invention permet d’optimiser/de réduire le nombre d’étapes, ce qui le rend plus rapide, plus pratique, plus facile et plus économique que les procédés connus de l’état de la technique. En effet, dans le cadre de la présente invention, après

Vincubation du milieu de culture pour propager des phages, le milieu de culture comprenant les phages propagés est directement transféré et filtré pour purifier les phages propagés, une étape de centrifugation utilisée dans les procédés selon l’art antérieur n’étant donc pas nécessaire dans le cadre de la présente invention.

Troisièmement, le procédé selon l’invention est réalisé dans un système fermé ce qui améliore l’efficacité de la production des compositions de bactériophages car un tel système fermé diminue le risque de contaminations extérieures et donc le risque d’échec du cycle de production. En outre, l’utilisation d’une première connexion en circuit fermé et d’une deuxième connexion en circuit fermé qui comprend des filtres pour purifier les phages propagés selon le procédé de la présente invention, permet de fournir un procédé qui est transposable, c’est-à-dire qui peut être réalisé notamment dans des hôpitaux ou des laboratoires, et qui ne nécessite pas d’être réalisé dans un environnement stérile. En effet, les première et deuxième connexions en circuit fermé permettent de conserver des conditions stériles tout au long du procédé de production selon la présente invention. En particulier, il n'est pas nécessaire d'ouvrir ou de fermer la chambre de culture pour réaliser les transferts du milieu de culture tout au long du procédé de production selon l’invention. Par conséquent, il n’est pas nécessaire de réaliser le procédé de production selon l’invention dans un environnement stérile, comme c'est le cas généralement pour la culture cellulaire.

Contrairement au procédé de production selon l’invention, le procédé selon le document

WO2004/052274 nécessite quant à lui un environnement stérile car la boite de culture est d’abord ouverte pour y étaler une phase solide comprenant de l’agar et ensuite pour y ajouter une couche semi-solide comprenant également de l’agar et un mélange de phages et de bactéries. Après une incubation, la boite de culture est à nouveau ouverte et la phase semi- solide est grattée de la boite et soumise à un protocole d’extraction répété plusieurs fois comprenant l’ajout de milieu frais (solution d’extraction) à la phase semi-solide pour obtenir une mixture et la centrifugation de la mixture pour obtenir un surnageant comprenant un extrait brut avec des bactériophages, l’extrait brut étant alors purifié. Plusieurs étapes du procédé selon le document WO2004/052274, en particulier durant lesquelles les boites de culture sont ouvertes et durant lesquelles les phages cultivés sont transférés d’un récipient à un autre, entrainent des risques de contamination significatifs.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l’invention, la couche de culture formée par le dépôt du milieu de culture dans ladite au moins une chambre de culture a une épaisseur inférieure ou égale à 10 cm, de préférence inférieure ou égale à 5 cm, encore préférentiellement inférieure ou égale à 2 cm.

L’inventeur a observé de manière surprenante que les effets avantageux du procédé selon l'invention sont particulièrement bons lorsque la couche de culture a une épaisseur inférieure ou égale à 10 cm et sont encore meilleurs lorsqu'elle est inférieure ou égale à 5 cm, et encore améliorés lorsqu’elle est inférieure ou égale à 2 cm. En particulier, un procédé selon ce mode de réalisation préféré permet d’obtenir des compositions de bactériophages à titre particulièrement élevé tout en étant facile et économique.

Selon un mode de réalisation préféré, la couche de culture est incubée selon une durée suffisante pour avoir une multiplication du bactériophage.

De manière préférée, la couche de culture est incubée selon une durée suffisante pour obtenir une confluence des bactériophages multipliés.

Avantageusement, la température d’incubation de la couche de culture est comprise entre 25 et 45 °C, de préférence d'environ 37 °C.

De préférence, la durée d’incubation de la couche de culture est comprise entre 15 et 20 heures, de préférence d’environ 18 heures.

Selon un mode de réalisation particulier, le procédé de production selon l’invention comprend en outre: - déposer une couche de substrat comprenant un premier polymère apte à la gélifier dans ladite au moins une chambre de culture cellulaire, préalablement au transfert du milieu de culture du premier réservoir dans ladite au moins une chambre de culture cellulaire, de telle sorte que le milieu de culture se dépose sous la forme d’une couche de culture sur la couche de substrat gélifiée.

L’inventeur a observé de manière surprenante que les avantages du procédé selon l'invention sont également obtenus lorsqu’une couche de substrat comprenant un premier polymère apte à la gélifier est déposée préalablement au milieu de culture dans la chambre de culture cellulaire, de telle sorte que le milieu de culture se dépose sous la forme d’une couche de culture sur la couche de substrat gélifiée.

Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention comprend en outre, préalablement à l’étape de fourniture du premier réservoir contenant le milieu de culture, - fournir un deuxième réservoir contenant le substrat comprenant un premier polymère qui est en première connexion en circuit fermé avec ladite au moins une chambre de culture cellulaire; et - transférer le substrat du deuxième réservoir via la première connexion en circuit fermé dans ladite au moins une chambre de culture cellulaire pour déposer la couche de substrat dans ladite au moins une chambre de culture.

Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l’invention comprend: - fournir ladite au moins une chambre de culture cellulaire; - fournir le deuxième réservoir contenant le substrat comprenant le premier polymère apte à la gélifier qui est en première connexion en circuit fermé avec ladite au moins une chambre de culture cellulaire; - transférer le substrat du deuxième réservoir via la première connexion en circuit fermé dans ladite au moins une chambre de culture; - déposer la couche de substrat dans ladite au moins une chambre de culture cellulaire;

- fournir le premier réservoir étant en première connexion en circuit fermé avec ladite au moins une chambre de culture cellulaire et contenant le milieu de culture comprenant au moins une souche de phages et au moins une souche de bactéries; - transférer le milieu de culture du premier réservoir via la première connexion en circuit fermé dans ladite au moins une chambre de culture cellulaire pour déposer le milieu de culture sous la forme d’une couche de culture dans ladite au moins une chambre de culture sur la couche de substrat gélifiée; - incuber le milieu de culture pour propager des phages; - fournir le récipient qui est en deuxième connexion en circuit fermé avec ladite au moins une chambre de culture cellulaire, la deuxième connexion en circuit fermé comprenant le système de filtration entre ladite au moins une chambre de culture cellulaire et le récipient ; et - transférer le milieu de culture comprenant les phages propagés depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé et purifier lesdits phages propagés via le système de filtration, le milieu de culture étant sous forme liquide lors du transfert depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé et de la purification.

Selon un mode de réalisation particulier, le premier réservoir contenant le milieu de culture et le deuxième réservoir contenant le substrat sont identiques. Selon ce mode de réalisation particulier, le réservoir contient d’abord le substrat qui est transféré via la première connexion en circuit fermé dans ladite au moins une chambre de culture. Le réservoir ne contenant plus le substrat qui a été transféré est alors rempli avec le milieu de culture qui est ensuite également transféré via la première connexion en circuit fermé dans ladite chambre de culture pour déposer le milieu de culture sous la forme d’une couche de culture dans ladite au moins une chambre de culture sur la couche de substrat gélifiée. Préférentiellement, durant le remplissage du réservoir avec le milieu de culture, le réservoir est isolé de ladite au moins une chambre de culture de sorte que le système reste en circuit fermé. Encore préférentiellement, le réservoir est nettoyé et désinfecté entre le transfert du substrat et le remplissage avec le milieu de culture.

Selon un autre mode de réalisation particulier, le premier réservoir contenant le milieu de culture et le deuxième réservoir contenant le substrat sont différents. Selon ce mode de réalisation particulier, le second réservoir est en première connexion en circuit fermé avec ladite au moins une chambre de culture. Après le transfert du substrat dans ladite au moins une chambre de culture pour déposer une couche de substrat, le second réservoir est déconnecté de la première connexion en circuit fermé et le premier réservoir contenant le milieu de culture est connecté via la première connexion en circuit à ladite au moins une chambre de culture pour transférer le milieu de culture dans ladite au moins une chambre de culture et déposer le milieu de culture sous la forme d’une couche de culture dans ladite au moins une chambre de culture sur la couche de substrat gélifiée. Préférentiellement, durant la déconnexion du deuxième réservoir et la connexion du premier réservoir ladite au moins une chambre de culture est isolée de sorte que le système reste en circuit fermé. De manière alternative, le premier réservoir et le second réservoir sont connectés en parallèle à la première connexion en circuit fermé et les transferts du substrat et du milieu de culture sont réalisés séquentiellement via la première connexion en circuit fermé.

Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, le milieu de culture comprend en outre un deuxième polymère apte à le gélifier, de telle sorte que des phages sont propagés dans le milieu de culture gélifié, et en ce que le procédé comprend en outre, après l’incubation du milieu de culture pour propager des phages et préalablement au transfert du milieu de culture comprenant les phages propagés depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé, une étape comprenant une liquéfaction du milieu de culture gélifié de façon à obtenir un milieu de culture liquéfié. De manière particulièrement avantageuse, la liquéfaction du milieu de culture gélifié comprend : - mettre en contact une solution d’extraction avec le milieu de culture gélifié selon un rapport de volume compris entre 5:1 et 1:5; et - dissoudre le milieu de culture gélifié dans la solution d’extraction pour obtenir un milieu de culture liquéfié.

Selon un mode de réalisation particulier, la mise en contact de la solution d’extraction avec le milieu gélifié est réalisée par un transfert de la solution d’extraction depuis un troisième réservoir contenant la solution d’extraction via la première connexion en circuit fermé avec ladite au moins une chambre de culture cellulaire.

Selon ce mode de réalisation particulier, la liquéfaction du milieu de culture gélifié est également réalisée en circuit fermé ce qui améliore encore l'efficacité de la production des compositions de bactériophages car un tel système fermé diminue le risque de contaminations extérieures et donc le risque d’échec du cycle de production.

Selon un mode de réalisation particulier, le troisième réservoir est identique au premier et/ou au deuxième réservoir. Selon ce mode de réalisation particulier, le réservoir contient, optionnellement, d’abord le substrat qui est transféré via la première connexion en circuit fermé dans ladite au moins une chambre de culture. Le réservoir est alors rempli avec le milieu de culture qui est ensuite également transféré via la première connexion en circuit fermé dans ladite chambre de culture pour déposer le milieu de culture sous la forme d’une couche de culture dans ladite au moins une chambre de culture, optionnellement, sur la couche de substrat gélifiée. Enfin, le réservoir est rempli avec la solution d’extraction qui est ensuite également transférée via la première connexion en circuit fermé dans la dite chambre de culture, et ce pour la mise en contact de la solution d'extraction avec le milieu gélifié.

Préférentiellement, durant le remplissage du réservoir avec le milieu de culture ou avec la solution d'extraction, le réservoir est isolé de ladite au moins une chambre de culture de sorte que le système reste en circuit fermé. Encore préférentiellement, le réservoir est nettoyé et désinfecté avant le remplissage avec le milieu de culture ou avec la solution d’extraction.

Selon un autre mode de réalisation particulier, le troisième réservoir est différent du premier et/ou du deuxième réservoir. Selon ce mode de réalisation particulier, le procédé comprend une étape optionnelle selon laquelle le second réservoir est en première connexion en circuit fermé avec ladite au moins une chambre de culture, le substrat est transféré dans ladite au moins une chambre de culture pour déposer une couche de substrat et le second réservoir est déconnecté de la première connexion en circuit fermé. Ensuite, le procédé comprend la connexion du premier réservoir contenant le milieu de culture via la première connexion en circuit à ladite au moins une chambre de culture pour transférer le milieu de culture dans ladite au moins une chambre de culture, le dépôt du milieu de culture sous la forme d’une couche de culture dans ladite au moins une chambre de culture, optionnellement, sur la couche de substrat gélifiée et la déconnexion du premier réservoir de la première connexion en circuit fermé. Enfin, le procédé comprend la connexion du troisième réservoir contenant la solution d’extraction qui est ensuite également transférée via la première connexion en circuit fermé dans la dite chambre de culture, et ce pour la mise en contact de la solution d’extraction avec le milieu gélifié. Préférentiellement, optionnellement durant la déconnexion du deuxième réservoir et la connexion du premier réservoir, et durant la déconnexion du premier réservoir et la connexion du troisième réservoir, ladite au moins une chambre de culture est isolée de sorte que le système reste en circuit fermé. De manière alternative, le premier réservoir, optionnellement le second réservoir, et le troisième réservoir sont connectés en parallèle à la première connexion en circuit fermé et les transferts du substrat, du milieu de culture et de la solution d’extraction sont réalisés séquentiellement via la première connexion en circuit fermé.

De préférence, la solution d’extraction est mise en contact avec la couche de culture selon un rapport de volume compris entre 4:1 et 1:4, de préférence compris entre 3:1 et 1:3, de préférence compris entre 2:1 et 1:2, de préférence compris entre 1:1 et 1:2, préférentiellement qui est d’environ 1:1.

Avantageusement, l’étape de dissolution de la couche de culture gélifiée dans la solution d’extraction pour obtenir un milieu de culture liquéfié comprend une incubation de la solution d’extraction directement sur la couche de culture.

Selon un mode de réalisation particulier, l’étape de dissolution de la couche de culture gélifiée dans la solution d’extraction comprend une extraction des phages propagés dans la solution d’extraction.

De préférence, incubation de la solution d'extraction est d’environ 1 heures ou moins, préférentiellement d’environ 30 minutes ou moins, encore préférentiellement d’environ 20 minutes.

Selon un mode de réalisation préféré, la chambre de culture est mise sous agitation durant l’incubation de la solution d’extraction.

Ainsi, selon l'invention, il n’est pas nécessaire que la couche de culture soit récoltée, par exemple par grattage, au préalable de l’étape de transfert du milieu de culture comprenant les phages propagés depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé. Dans le cadre de la présente invention, la solution d'extraction peut être directement ajoutée sur la couche de culture encore étalée.

Après l’incubation, une fois que la solution liquéfiée est obtenue, celle-ci est soumise aux étapes suivantes du procédé.

De manière préférée, les étapes de transfert du milieu de culture, et optionnellement du substrat et de la solution d’extraction, sont réalisées par pompage.

Préférentiellement, l’étape de purification du milieu de culture comprenant les phages propagés via le système de filtration est réalisée par pompage ou par gravité, encore préférentiellement, par pompage.

L’utilisation d’une pompe pour réaliser les transferts du milieu de culture, et optionnellement du substrat et de la solution d’extraction, en particulier pour le transfert du milieu de culture comprenant les phages propagés depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé, et pour la purification est particulièrement avantageux dans le cas où le milieu de culture comprend un deuxième polymère apte à le gélifier car cela permet de diminuer le risque de contamination lié à une étape de récolte de la couche de culture gélifiée, par exemple par grattage à l’aide d’une spatule, nécessitant l’ouverture de la chambre de culture comprenant la couche de culture.

De préférence, la solution d'extraction est une solution de DPBS (Dulbecco’s Phosphate - buffered Saline).

Avantageusement, dans le cadre de la présente invention, les phages sont présents dans un volume d’au plus 5 fois le volume de la couche de culture tout au long de la méthode de production, préférentiellement dans un volume d’au plus 4 fois le volume de la couche de culture, de préférence dans un volume d’au plus 3 fois le volume de la couche de culture, encore préférentiellement dans un volume d’au plus 2 fois le volume de la couche de culture, encore préférentiellement les phages sont présents dans un volume d’au plus le volume de la couche de culture.

Dans une forme de réalisation particulière de la présente invention, ledit premier polymère est sélectionné dans le groupe constitué de l’agar, des polymères ionotropiques, des polymères thermoplastiques à polymérisation lente et de leurs mélanges.

De manière préférentielle, ledit premier polymère est sélectionné dans le groupe constitué des polymères ionotropiques, des polymères thermoplastiques à polymérisation lente et de leurs mélanges.

Selon un mode de réalisation particulier, ledit deuxième polymère est sélectionné dans le groupe constitué des polymères ionotropiques, des polymères thermoplastiques à polymérisation lente et de leurs mélanges.

Selon un mode de réalisation particulier du procédé selon l'invention, lesdits premier et deuxième polymères sont sélectionnés indépendamment dans le groupe constitué des polymères ionotropiques, des polymères thermoplastiques à polymérisation lente et de leurs mélanges

Il a été observé, dans le cadre de la présente invention, que le procédé selon

Vinvention dans lequel le premier et/ou le deuxième polymère(s) est un polymère ionotropique et/ou un polymère thermoplastique à polymérisation lente est optimisé.

Les polymères ionotropiques sont des polymères dont la polymérisation est enclenchée par une réaction ionique. Contrairement aux polymères thermoplastiques classiques, les polymères ionotropiques restent sous une forme liquide à température ambiante. C’est l’ajout d'ions, par exemple d’ions sodium dans le cas de l’alginate, qui va être responsable de la polymérisation.

Au sens de la présente invention, les polymères thermoplastiques à polymérisation lente sont des polymères thermoplastiques, c’est-à-dire des polymères qui deviennent sous une forme liquide quand ils sont chauffés, par exemple à une température de 60°C, mais qui, contrairement aux polymères thermoplastiques classiques, présentent une polymérisation lente. Par les termes « polymérisation lente », on entend au sens de la présente invention, une polymérisation qui n’est pas complète lorsque le polymère atteint une température qui permet une manipulation sécurisée, par exemple une température de 36°C ou moins, de préférence à température ambiante. De préférence, au sens de la présente invention, les polymères thermoplastiques à polymérisation lente comprennent les polymères qui présentent un point de solidification compris entre 5 et 40 °C, de préférence compris entre 15 et 30 °C, préférentiellement à température ambiante.

Comme indiqué plus haut, le procédé selon l’invention dans lequel ces types de polymères sont choisis est optimisé car leur manipulation est plus facile, le risque de brûlures est quasi supprimé, le support n’est pas déformé lors de leur application à cause d’une température élevée, et ce contrairement aux polymères thermoplastiques classiques. En effet, les polymères thermoplastiques classiques polymérisent rapidement et doivent donc être appliqués alors qu’isl présentent encore une température élevée, à savoir une température comprise entre 60 et 70°C, ce qui peut entrainer des brûlures lors de la manipulation, la fonte du support, mais également le bouchage du matériel de par sa polymérisation rapide ou encore de la détérioration de la couche de substrat lors de l'application de la couche de culture à une température élevée. L'utilisation de tels polymères selon ce mode particulier de l'invention est utile avec des matériaux de support en plastique, en particulier avec des chambres de culture cellulaire en plastique comprenant des supports multiples parallèles, comme expliqué plus en détails ci-après. L’utilisation de solutions de substrat et/ou de culture qui restent fluides à des températures réduites pendant un temps suffisant, permet de déposer les couches sur le support sans avoir le risque de brûlures pour l'opérateur, le risque d’une déformation du support ou le risque d’un durcissement d’une partie de la solution arrivant trop tôt. Il a également été observé de manière surprenante que de tels polymères selon ce mode particulier de l'invention permettent une zone de contact entre la couche de substrat et la couche de culture qui est plus régulière et qui permet donc une meilleure culture des phages et des bactéries sur la couche de substrat. En particulier, une zone de contact entre la couche de substrat et la couche de culture plus régulière signifie que la surface de contact entre la couche de substrat et la couche de culture est plus grande que la surface de contact entre la couche de substrat et la couche de culture lorsque de tels polymères selon ce mode de réalisation particulier de l'invention ne sont pas utilisés.

De préférence, la couche de substrat et la couche de culture sont déposées à une température de 45°C ou moins, de préférence 40°C ou moins, 36°C ou moins, ou 30°C ou moins.

Avantageusement, les polymères ionotropiques sont choisis dans le groupe constitué de l’alginate, du chitosan, du pullulane et de leurs mélanges.

Avantageusement, les polymères ionotropiques sont choisis dans le groupe constitué de l’alginate, du pullulane et de leurs mélanges.

De manière particulièrement avantageuse, le polymère ionotropique est l’alginate.

Dans un mode de réalisation particulier du procédé de l'invention, la couche de culture formée par le dépôt du milieu de culture dans ladite au moins une chambre de culture comprend des billes d’alginate polymérisé.

Dans une forme particulièrement avantageuse du procédé selon l’invention, les polymères thermoplastiques à polymérisation lente sont sélectionnés dans le groupe constitué du collagène, de la gélatine, de la cellulose et de leurs mélanges

Préférentiellement, le polymère thermoplastique à polymérisation lente est le collagène.

De préférence, lesdits premier et deuxième polymères sont sélectionnés indépendamment dans le groupe constitué de l’alginate et du collagène.

En effet, il a été observé que les avantages du procédé selon l'invention sont améliorés lorsque lesdits premier et deuxième polymères sont sélectionnés indépendamment dans le groupe constitué de l’alginate et du collagène.

Selon un mode de réalisation préféré, lesdits premier et deuxième polymères sont identiques.

Selon un autre mode de réalisation préféré, lesdits premier et deuxième polymères sont identiques et sont sélectionnés dans le groupe constitué de l’alginate et du collagène.

Dans une forme de réalisation particulièrement avantageuse du procédé selon l'invention, le premier polymère est présent à une concentration comprise entre 2 et 5 % de la couche de substrat, de préférence comprise entre 3 et 4 % de la couche de substrat. Il a été observé qu’une concentration du premier polymère comprise entre 2 et 5% de la couche de substrat, de préférence comprise entre 3 et 4 % de la couche de substrat, est particulièrement adéquate dans le cadre de la présente invention et permet une amélioration de la culture des phages et des bactéries présents dans la couche de culture, notamment en améliorant encore la surface de contact entre les deux couches, et permet donc d’obtenir un titre des compositions de bactériophages produites acceptable en phagothérapie tout en faisant intervenir un faible volume d'exploitation total.

Avantageusement, le deuxième polymère est présent à une concentration inférieure à la concentration du premier polymère, en particulier comprise entre 1 et 2 % du milieu de culture de la couche de culture. Il a été observé, dans le cadre de la présente invention, qu’une concentration du deuxième polymère comprise entre 1 et 2% de la couche de culture est particulièrement adéquate et permet une amélioration du procédé selon l’invention, notamment en améliorant la propagation des phages, la capacité des bactéries à former des colonies mais aussi en améliorant l’efficacité de l’extraction des phages propagés, et permet donc d’obtenir un titre des compositions de bactériophages produites acceptable en phagothérapie tout en faisant intervenir un faible volume d’exploitation total.

Selon un mode de réalisation, les compositions de bactériophages selon l’invention peuvent être préparées en cultivant les phages en présence d’un microorganisme incluant, par exemple, staphylococci, hemophili, helicobacter, mycobacterium, streptococci, neisseria, klebsiella, enterobacter, proteus, bacteroides, pseudomonas, borrelia, citrobacter, escherichia, salmonella, propionibacterium, treponema, shigella, enterococci et leptospirex.

De préférence, le microorganisme inclut, par exemple, Staphylococcus aureus,

Staphylococcus epidermidis, Helicobacter pylori, Streptococcus pneumomae, Streptococcus mutans, Streptococcus oralis, Streptococcus parasanguis, Streptococcus pyogenes,

Streptococcus viridans, Group A streptococcus et anaerobic streptococcus, Hemophilus influenzae, Shigella dysenteriae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae,

Mycobacterium asiaticum, Mycobacterium intracellulare, Mycoplasma pneumoniae,

Mycoplasma hominis, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhea, Klebsiella pneumoniae,

Pseudomonas aeruginosa, Propionibacterium acnes, Treponema pallidum, Treponema pertanue, Treponema carateum, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Borrelia burgdorferi et Leptospirex tel que Leptospirex hemoragia Citrobacter fruendii.

Préférentiellement, le microorganisme est sélectionné parmi staphylococci, streptococci, citrobacter, escherichia et klebsiella, et encore plus préférentiellement, le microorganisme est sélectionné parmi Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Klebsielia oxytoca,

Escherichia coli et Citrobacter fruendii.

La combinaison spécifique bactérie-bactériophage est ensuite sélectionnée selon l’utilisation prévue.

De préférence, le volume de la couche de substrat est similaire au volume de la couche de culture. En particulier, le ratio du volume de la couche de substrat sur le volume de la couche de culture est environ de 1 : 1.

Selon un mode de réalisation préféré, les couches de substrat et de culture sont incubées selon une durée suffisante pour avoir une multiplication du bactériophage.

Avantageusement, la température d’incubation des couches de culture et de substrat est comprise entre 25 et 45 °C, de préférence d’environ 37 °C.

De préférence, la durée d’incubation des couches de culture et de substrat est comprise inférieure ou égal à 20 heure, de préférence comprise entre 15 et 20 heures, de préférence d’environ 18 heures.

Selon un mode de réalisation préféré, la couche de substrat est polymérisée avant le dépôt de la couche de culture, de préférence la couche de substrat est polymérisée en 30 minutes ou moins.

Dans une forme de réalisation particulière de la présente invention, le système de filtration comprend au moins deux filtres en cascade. Le terme « en cascade » signifie que les filtres sont montés en série. Le terme « en cascade » et le terme « en série » sont utilisés de manière interchangeable dans la présente invention.

Selon un autre mode de réalisation, au moins trois filtres placés en série sont utilisés.

Selon un mode particulier, le premier filtre (c’est-à-dire le premier filtre selon le sens de filtration) est un filtre à particules avec une taille de pores comprise entre environ 0,5 et

2,0 um, de préférence entre environ 0,8 et 1,6 um, plus préférentiellement entre 1,0 et 1,4 um. Un tel filtre est également référencé comme un filtre « in-depth ».

Selon un autre mode de réalisation particulier, le deuxième filtre (c’est-à-dire qui est placé après le premier filtre selon le sens de filtration) est un filtre stérilisant, en particulier un filtre stérilisant avec une taille de pores inférieure à 0,5 um, plus particulièrement inférieure à 0,4 um. Dans un autre mode de réalisation, le filtre stérilisant a une taille de pores inférieure à 0,3 um. Dans encore un autre mode de réalisation, la taille de pores du deuxième filtre est de 0,01 um ou plus. De préférence, la taille de pores du deuxième filtre est comprise entre 0,1 et0,3 um, tel que 0,2 um. Un tel filtre est également référencé comme un filtre « bioburden ».

Selon un autre mode de réalisation particulier, the troisième filtre (c’est-à-dire qui est placé après le deuxième filtre selon le sens de filtration) est un filtre qui enlève les particules virales et les endotoxines. De préférence, the troisième filtre est un échangeur d’anions, en particulier un filtre comprenant une membrane échangeuse d’anions qui lie l'ADN plasmique et les protéines chargées négativement. Un tel filtre est également référencé comme un filtre «endotoxin ».

Le filtre de type « in-depth » sépare les composants du milieu de culture selon la taille et ne va laisser passer que les bactériophages ainsi que les composants qui possèdent une taille inférieure ou égale aux bactériophages. Dans un mode de réalisation particulier, les filtres de type « in-depth » utilisés dans le cadre de la présente invention, possèdent une taille de pores comprise entre environ 0,1 et 1,5 um, de préférence comprise entre environ 1 et 1,5 um et, encore préférentiellement environ de 1,2 um. Le filtre de type « endotoxin » purifie le milieu de culture des endotoxines qui peuvent être responsables d’effets secondaires lors de phagothérapies. Le filtre de type « bioburden » stérilise la milieu de culture de tous micro- organismes encore présents dans la solution.

Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention ne comprend pas de centrifugation.

De préférence, ladite au moins une chambre de culture comprend un fond. Selon ce mode de réalisation préféré, le milieu de culture est déposé sur le fond de ladite au moins une chambre de culture pour former une couche de culture sur le fond de ladite au moins une chambre de culture cellulaire.

Le terme « fond » au sens de la présente invention correspond à la paroi inférieure de la chambre de culture cellulaire qui est destinée à reposer sur son support, par exemple une table.

Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le fond de ladite au moins une chambre de culture cellulaire présente une surface adaptée pour permettre des échanges optimaux d’Oz entres les bactériophages et les bactéries.

Avantageusement, la surface du fond de ladite au moins une chambre de culture cellulaire est comprise entre 50 et 800 cm”.

Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, la couche de culture formée par le dépôt du milieu de culture dans ladite au moins une chambre de culture a une épaisseur inférieure ou égale à 10 cm, de préférence inférieure ou égale à 5 cm, encore préférentiellement inférieure ou égale à 2 cm, et la surface du fond de ladite au moins une chambre de culture cellulaire est comprise entre 50 et 800 cm”, de préférence comprise entre 75 et 650 cm”, préférentiellement comprise entre 250 et 650 cm”, encore préférentiellement compris entre 600 et 650 cm?.

Préférentiellement, la couche de culture formée par le dépôt du milieu de culture dans ladite au moins une chambre de culture présente un volume compris entre 50 et 750 ml, de préférence entre 250 et 500 ml, préférentiellement d’environ 500 ml.

De préférence, la chambre de culture cellulaire est en plastique. Dans un mode de réalisation particulier, la chambre de culture cellulaire est jetable.

Selon un autre mode de réalisation particulier, la chambre de culture cellulaire comprend un sac de culture, de préférence le sac de culture est en plastique.

Préférentiellement, le sac de culture repose sur un support rigide. Selon ce mode de réalisation, le support rigide sur lequel repose le sac de culture fournit un fond au sac de culture. Ainsi, le milieu de culture est déposé sur le fond dudit sac de culture fourni par le support rigide sur lequel repose ledit sac de culture pour former une couche de culture sur le fond dudit sac de culture.

Avantageusement, le milieu de culture est déposé sur des multiples fonds parallèles d’une chambre de culture cellulaire, comme par exemple les chambres de culture CellStack® de Corning® ou Nunc"“ EasyFill"" Cell Factory"" Systems de Thermofisher. L'utilisation d’une chambre de culture cellulaire ayant de multiples fonds parallèles dans le procédé selon l'invention permet d'augmenter le rendement de bactériophages produits par cycle de production et donc d’améliorer encore la rapidité du procédé de production selon l’invention.

Selon un mode de réalisation de l’invention, la chambre de culture cellulaire peut être composée de plusieurs unités qui sont empilées pour former une chambre avec des multiples fonds parallèles.

La chambre de culture cellulaire selon l'invention permet de créer une chambre stérile avec une large surface de support pour la couche de culture et/ou la couche de substrat.

De manière particulière, chaque fond parallèle présente une surface comprise entre 250 et 650 cm? et présente un volume compris entre 250 et 500 ml.

Selon un mode de réalisation préféré, la chambre de culture cellulaire comprend une entrée et une sortie unique, de telle sorte que le dépôt de la couche de culture, et optionnellement de la couche de substrat et de la solution d’extraction est réalisé sur les multiples fonds parallèles via la première connexion en circuit fermé et que la récolte du milieu de culture liquide ou liquéfié déposé sur les multiples fonds parallèles est réalisée via la deuxième connexion en circuit fermé.

De préférence, le procédé selon l’invention comprend : - fournir au moins une chambre de culture cellulaire comprenant des multiples fonds parallèles; - fournir un premier réservoir contenant un milieu de culture étant en première connexion en circuit fermé avec ladite au moins une chambre de culture cellulaire, le milieu de culture comprenant au moins une souche de phages et au moins une souche de bactéries; - transférer le milieu de culture du premier réservoir via la première connexion en circuit fermé dans ladite au moins une chambre de culture cellulaire pour déposer le milieu de culture sous la forme de couches de culture sur les multiples fonds parallèles de ladite au moins une chambre de culture; - incuber le milieu de culture pour propager des phages; - fournir un récipient qui est en deuxième connexion en circuit fermé avec ladite au moins une chambre de culture cellulaire, la deuxième connexion en circuit fermé comprenant un système de filtration entre ladite au moins une chambre de culture cellulaire et le récipient ; et

- transférer le milieu de culture comprenant les phages propagés depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé et purifier lesdits phages propagés via le système de filtration, le milieu de culture étant sous forme liquide lors du transfert depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé et de la purification.

De préférence, la chambre de culture cellulaire comprend 2 à 20 fonds parallèles, de préférence 5 à 15 fonds parallèles, de préférence 10 fonds parallèles.

Avantageusement, le titre des phages purifiés est compris entre 10"° à 10% pfu/ml, en particulier entre 10"° et 1022 pfu/ml.

Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention comprend en outre : - combiner les bactériophages purifiés avec un vecteur pharmaceutiquement acceptable pour produire une formulation pharmaceutique comprenant les bactériophages.

De préférence, la formulation pharmaceutique est administrée par injection, par exemple par injection intraveineuse, par voie orale sous la forme d’une boisson, de liposomes, de microcapsules lipophiles ou de dendrimères, par voie intranasale, par exemple via un spray, un aérosol ou une poudre à aérosol, par voie rectale, ou par voie transdermique, par exemple via une crème ou un gel.

Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention comprend en outre : - administrer une composition comprenant les bactériophages purifiés à une personne en ayant besoin.

La composition est administrée selon un dosage et pour une période permettant de traiter l’infection bactérienne. Par les termes « traiter l’infection bactérienne », il est entendu au sens de la présente invention, tuer ou inhiber assez de microorganismes bactériens pour rendre les microorganismes incapables d’infecter l'hôte.

Ces modes de réalisation ainsi que d’autres modes de réalisation de la présente invention sont indiqués dans les revendications annexées.

L'invention va maintenant être décrite plus en détails dans les exemples suivants qui décrivent des modes de réalisations non limitatifs de différents aspects de la présente invention.

Description des figures

Figure 1 : graphe représentant les titres de production de la souche de phages ICP selon la méthode en double agar (exemple comparatif) et selon différentes méthodes de production selon l’invention.

Figure 2 : graphe représentant les titres de production de la souche de phage 14/1 selon la méthode en double agar (exemple comparatif) et selon différentes méthodes de production selon l’invention. Les barres gris clair correspondent aux densités initiales et les barres gris foncé représentent les densités à 24 h.

Figure 3 : graphe représentant les titres de production de la souche de phage PNM selon la méthode en double agar (exemple comparatif) et selon différentes méthodes de production selon l'invention. Les barres gris clair correspondent aux densités initiales et les barres gris foncé représentent les densités à 24 h.

Exemples

Exemple 1 : Préparation de différentes solutions d’alginate

Les potentiels de gélatinisation de différents types d’alginate ont été comparés. Des solutions d’alginate ont été préparées en utilisant 4 poudres différentes d’alginate pure (BR-

GM, BR-W, BR-L et un prémix d’alginate:pullulane). En outre, du chlorure de sodium (0,9% de concentration finale), du milieu LB (/ysogeny broth) (standard 1x) et du carbonate de calcium (15 mM en concentration finale) ont été ajoutés aux différentes poudres avant stérilisation à l’autoclave des solutions obtenues.

Le protocole pour faire 400 ml d’une solution d’alginate 5% est le suivant : - chauffer 400 ml d’eau pure à 65°C sur une plaque chauffante ; - ajouter 3,6 g de NaCl et mixer pour dissoudre ; - ajouter lentement 20 g de la poudre d’alginate, mixer de manière constante jusqu’à dissolution complète (jusqu’à 20 minutes) ; - ajouter 8 g de milieu LB et continuer de mixer jusqu’à dissolution ; - ajouter 0,6 g de chlorure de calcium (va rester en suspension dans la solution jusqu’à 30 minutes) ; - verser la solution dans une bouteille Duran de 500 ml, puis stériliser à 121 °C pendant 20 minutes ;

- Après refroidissement, mixer complètement par inversion pour resuspendre le carbonate de calcium ; - Ajouter 12 ml de GDL (glucono delta-lactone, 1M), inverser pour mélanger ; et - Verser immédiatement dans une chambre de culture.

A une concentration de 5%, les poudres d'alginate BR-GM et BR-W ont produit des solutions très épaisses, qui n'étaient pas utilisables. En revanche, le prémix d’alginate:pullulane et les poudres BR-L ont produit des solutions plus fines, cependant, les plaques produites à l'aide de ces solutions à 5% étaient encore trop molles par rapport à l’agar standard. BR-L est décrit comme un produit à faible viscosité et à faible résistance au gel, et ne convient donc pas aux exigences de production de phages.

À des concentrations plus faibles, les solutions BR-GM et BR-W sont plus fines, mais le temps de gélification reste rapide pour toutes les concentrations (moins de 5 minutes pour le versement), avec une variation de la solidité du produit gélifié dépendant de la concentration en alginate. Les alginates BR-GM et BR-W produisent des gels fermes à une concentration de 2%, adaptés à la propagation des bactéries ou servant de couche inférieure pour le placage des phages. Pour minimiser l'humidité et améliorer l'adhérence de la couche, il est préférable de verser les couches la veille et de les laisser toute la nuit sur la paillasse avant utilisation.

Pour les plaques d'alginate double couche, 1,5% d'alginate (BR-GM, Tableau 1) fournit une couche supérieure (couche de culture) appropriée, adhérant bien à la couche inférieure (couche de substrat).

Pour la préparation d’une solution d’alginate 2%, en simple ou double couche, les solutions d’alginate sont préparées suivant le procédé ci-dessus, en ajustant les proportions pour correspondre avec la concentration d’alginate voulue (Tableau 1).

Tableau 1 : composition d’une solution d’alginate 2% et 1,5%

Pour une culture en double couche d’alginate, la couche inférieure (de substrat) est préparée en utilisant une solution d’alginate 2% comme ci-dessus et laissée pour séchage toute la nuit. Pour la couche supérieure (couche de culture) : - ajouter 100 ul de la culture hôte appropriée dans un tube Falcon® de 15 ml et ajouter les phages comme requis ; - inverser la solution d’alginate 1,5% pour resuspendre le chlorure de calcium et ajouter au mélange de bactéries/phages jusqu’à obtenir une solution ayant un volume de 14 ml; et - ajouter 420 ul de GDL, inverser pour mélanger et verser immédiatement pour déposer la couche sur la couche de substrat.

Exemple 2 : Evaluation de la croissance bactérienne en fonction de différentes conditions de production

La comparaison de la croissance de S. aureus sur des plaques d'alginate:pullulane et des plaques d’agar standard n'a révélé aucune différence de densité, avec une morphologie de colonie similaire sur tous les milieux. Cependant, en raison de l'humidité sur les plaques d'alginate, les colonies de P. aeruginosa se répandent beaucoup plus sur les plaques d'alginate que sur l’agar et, bien que les densités soient similaires, ne peuvent être comptées avec précision. Ceci suggère que si l'alginate est un milieu approprié pour la croissance bactérienne, un alginate à prise plus ferme (c'est-à-dire l'alginate BR-GM) est préférable au prémix alginate:pullulane.

Exemple 3 : Evaluation de la production de bactériophages selon la méthode en double couche d’agar (exemple comparatif) et selon le procédé de l’invention

Les conditions de production de bactériophages suivantes ont été testées : - double couche d’agar (exemple comparatif) — 50 ml 1,2% d’agar dans du milieu LB pour la couche inférieure (de substrat) ; 15ml 0,6% d’agar dans du milieu LB pour la couche supérieure (de culture) - couche unique d’agar (LBA, exemple comparatif) — 15 ml 0,6% d’agar dans du milieu

LB (couche de culture) - couche d’agar sur collagène (exemple comparatif) — 15 ml 0,6% d’agar dans du milieu

LB (couche de culture) ; 2,4 ug/cm? de collagène (couche de substrat)

- double couche d’alginate — 50 ml 2% d'alginate BR-GM dans du milieu LB pour la couche inférieure (de substrat) ; 15 ml 1,5% d’alginate BR-GM dans du milieu LB pour la couche supérieure (de culture) - milieu liquide (LB) — 30 ml de milieu LB (couche de culture) - milieu liquide sur collagène — 30 ml de milieu LB (couche de culture) ; 2,4 ug/cm? de collagène (couche de substrat) - couche unique d’alginate — 15 ml 1,5% d’alginate BR-GM dans du milieu LB (couche de culture) - couche d'alginate sur collagène — 15 mi 1,5% d’alginate BR-GM dans du milieu LB (couche de culture) ; 2,4 ug/cm? de collagène (couche de substrat) - billes d’alginate — 15 ml 1,5% de billes d’alginate

Trois souches de phages (ISP, PNM et 14/1) ont été testées selon chacune des conditions de production mentionnées ci-dessus, et ce en triplicat. Les densités de départ ont été calculées pour maximiser la production des phages (à savoir une dilution des phages adaptée pour obtenir un motif en réseau) : PNM à 10* unités et ISP et 14/1 à 10° unités.

Les bactéries sont préparées au préalable (voir Exemple 2) et récoltées en phase exponentielle dans du DPBS avec du calcium et du magnésium. Les phages à produire sont également suspendus dans du DPBS avec du calcium et du magnésium.

Les couches de substrat et de culture sont préparées selon les protocoles correspondants indiqués ci-dessus et sont déposées dans la chambre de culture selon les différentes conditions expérimentales testées, à savoir, double agar (exemple comparatif, double agar), double couches d’alginate (double_alginate), milieu liquide LB (LB), milieu liquide LB sur collagène (LB _collagène), couche unique d’agar (exemple comparatif, LBA), couche unique d’agar sur collagène (exemple comparatif, LBA collagène), couche unique — d’alginate (alginate), couche unique d’alginate sur collagène (alginate_collagène) et couche unique d’alginate comprenant des billes d’alginate (billes_alginate).

Les couches de substrat et/ou de culture sont alors incubées à 37 °C pendant 12 heures (pour la souche ISP) ou 24 h (pour les souches 14/1 et PNM) jusqu’à observer une lyse bactérienne.

Dans le cas où du milieu liquide LB n’est pas utilisé pour la couche de culture, un tampon d’extraction consistant en 130 ml de DPBS avec du calcium et du magnésium est alors ajouté à la chambre de culture sur la couche de culture comprenant les phages propagés et incubés sous agitation à température ambiante pendant 3 heures.

La couche de culture liquéfiée ou le milieu liquide LB comprenant les phages propagés est alors filtré successivement par un filtre de type « Bioburden » HDC II 1.2 um (Pall,

KA1)012P2), un filtre de type « In depth » STRL 0.2 um (Pall) et un filtre de type « Endotoxin »

Mustang Q (Pall).

Les résultats des titres de productions obtenus pour les souches ISP, 14/1 et PNM sont respectivement représentés aux Figures 1, 2 et 3. Pour les Figures 2 et 3, les barres gris clair correspondent aux densités initiales et les barres gris foncé représentent les densités à 24 h.

Ces résultats ont révélés, dans un premier temps, que la production des souches de bactériophages ISP, 14/1 et PNM en circuit fermé et en utilisant de faibles volumes d’exploitation (couche de culture de 15 ml) était efficace et permettait d'obtenir des titres de phages élevés, et ce en utilisant (1) une couche de culture comprenant de l’alginate, (2) une couche de culture comprenant de l’alginate et une couche de substrat comprenant du collagène, (3) une double couche (de culture et de substrat) d’alginate ou (4) une couche de culture comprenant de l’alginate sous forme de billes (Figures 1, 2 et 3). En effet, les procédés de production selon ces conditions permettent d’obtenir des titres de production comparables à ceux obtenus selon les méthodes connues, par exemple la méthode en double couche d’agar (exemple comparatif), et ce en réduisant le risque de contamination grâce au système (notamment les première et deuxième connexions) en circuit fermé du procédé selon l'invention et en faisant intervenir de faible volumes d’exploitation (seulement 15 ml pour les couches de culture comprenant de l’alginate), rendant ainsi le procédé de production selon l'invention plus rapide, plus économique, plus facile à mettre en œuvre et transposable, par exemple dans des hôpitaux. En particulier, l’utilisation de 15 ml de milieu de culture comprenant de l’alginate comme couche de culture dans le procédé selon l'invention fournit des titres de production atteignant 1022 pfu/ml (Figure 3).

En outre, l'inventeur a observé de manière tout à fait surprenante que des titres de production plus élevés sont atteints lorsque du milieu liquide LB est utilisé comme milieu de culture (couche de culture) qu'il soit déposé directement dans la chambre de culture cellulaire (LB, sans couche de substrat déposée au préalable) ou qu’il soit déposé sur une couche de substrat comprenant du collagène (LB_collagène). En effet, des titres de production compris entre 10% pfu/mI (souches ISP et PNM) et 107 pfu/mI (souche 14/1) sont obtenus en réalisant le procédé de l'invention en circuit fermé dans seulement 30 ml de milieu liquide LB (couche de culture). En particulier, l’utilisation de 30 ml de milieu liquide LB comme couche de culture dans le procédé selon l’invention fournit des titres de production jusqu’à 100 fois plus élevés que la méthode connue en double agar (Figure 1).

En conclusion, les résultats obtenus démontrent que le procédé selon l'invention permet d’obtenir des titres de phages élevés (comparables voire plus élevés que les titres de phages obtenus avec la méthode connue en double agar), et ce en réduisant le risque de contamination grâce au système en circuit fermé et en faisant intervenir de faibles volumes d'exploitation, rendant ainsi le procédé de production selon l’invention plus rapide, plus économique, plus facile à mettre en œuvre et transposable, par exemple dans des hôpitaux.

Claims (17)

29 BE2021/5524 REVENDICATIONS

1. Un procédé de production de bactériophages comprenant: - fournir au moins une chambre de culture cellulaire: - fournir un premier réservoir contenant un milieu de culture étant en première connexion en circuit fermé avec ladite au moins une chambre de culture cellulaire, le milieu de culture comprenant au moins une souche de phages et au moins une souche de bactéries: - transférer le milieu de culture du premier réservoir via la première connexion en circuit fermé dans ladite au moins une chambre de culture cellulaire pour déposer le milieu de culture sous la forme d’une couche de culture dans ladite au moins une chambre de culture, - incuber le milieu de culture pour propager des phages; - fournir un récipient qui est en deuxième connexion en circuit fermé avec ladite au moins une chambre de culture cellulaire, la deuxième connexion en circuit fermé comprenant un système de filtration entre ladite au moins une chambre de culture cellulaire et le récipient ; et - transférer le milieu de culture comprenant les phages propagés depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé et purifier lesdits phages propagés via le système de filtration, le milieu de culture étant sous forme liquide lors du transfert depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé et de la purification, dans lequel le système de filtration comprend, dans le sens de la filtration, un premier filtre à particules avec une taille de pores comprise entre environ 0,5 et 2,0 um, un deuxième filtre stérilisant avec une taille de pores comprise entre 0,1 et 0,3 um et un troisième filtre échangeur d’anions.

2. Le procédé de production de phages selon la revendication 1, caractérisé en ce qu’il comprend en outre - déposer une couche de substrat comprenant un premier polymère apte à la gélifier dans ladite au moins une chambre de culture cellulaire, préalablement au transfert du milieu de culture du premier réservoir dans ladite au moins une chambre de culture

30 BE2021/5524 cellulaire, de telle sorte que le milieu de culture se dépose sous la forme d’une couche de culture sur la couche de substrat gélifiée.

3. Le procédé de production de phages selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le milieu de culture comprend en outre un deuxième polymère apte à le gélifier, de telle sorte que des phages sont propagés dans le milieu de culture gélifié, et en ce que le procédé comprend en outre, après l'incubation du milieu de culture pour propager des phages et préalablement au transfert du milieu de culture comprenant les phages propagés depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé, une étape comprenant une liquéfaction du milieu de culture gélifié de façon à obtenir un milieu de culture liquéfié. 16

4. Le procédé de production de phages selon la revendication 3, caractérisé en ce que la liquéfaction du milieu de culture gélifié comprend: - mettre en contact une solution d'extraction avec le milieu de culture gélifié selon un rapport de volume compris entre 5:1 et 1:5; et - dissoudre le milieu de culture gélifié dans la solution d'extraction pour obtenir un milieu de culture liguéfié.

5. Le procédé de production de phages selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les phages sont présents dans un volume d'au plus 5 fois le volume du milieu de culture tout au long de la méthode de production, de préférence dans un volume d'au plus 3 fois le volume du milieu de culture, préférentiellement, les phages sont présents dans un volume d'au plus le volume du milieu de culture.

6. Le procédé de production de phages selon l'une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que ledit premier polymère est sélectionné dans le groupe constitué de l’agar, des polymères ionotropiques, des polymères thermoplastiques à polymérisation lente et de leurs mélanges.

7. Le procédé de production de phages selon Pune quelconques des revendications 3 à 6, caractérisé en ce que ledit deuxième polymère est sélectionné dans le groupe constitué des polymères ionotropiques, des polymères thermoplastiques à polymérisation lente et de leurs mélanges.

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8. Le procédé de production de phages selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la couche de substrat et/ou le milieu de culture sont déposés à une température de 36°C ou moins.

9. Le procédé de production de phages selon l’une quelconque des revendications 2 a 8, caractérisé en ce que le premier polymère est présent à une concentration comprise entre 2 et 5 % de la couche de substrat.

10. Le procédé de production de phages selon l’une quelconque des revendications 3 à 9, caractérisé en ce que le deuxième polymère est présent à une concentration comprise entre 1 et 2 % du milieu de culture. 16

11. Le procédé de production de phages selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la couche de substrat et/ou le milieu de culture sont déposés sur des multiples fonds parallèles d’une chambre de culture cellulaire.

12. Le procédé de production de phages selon l’une quelconque des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que les polymères ionotropiques sont choisis dans le groupe constitué de l’alginate, du chitosan, du pullulane, et de leurs mélanges.

13. Le procédé de production de phages selon l’une quelconque des revendications 6 à 11, caractérisé en ce que les polymères thermoplastiques à polymérisation lente sont sélectionnés dans le groupe constitué du collagène, de la gélatine, de la cellulose, et de leurs mélanges.

14. Le procédé de production de phages selon l’une quelconque des revendications précédentes, 28 comprenant: - fournir au moins une chambre de culture cellulaire comprenant des multiples fonds parallèles ; - fournir un premier réservoir contenant un milieu de culture étant en première connexion en circuit fermé avec ladite au moins une chambre de culture cellulaire, le milieu de culture comprenant au moins une souche de phages et au moins une souche de bactéries: - transférer le milieu de culture du premier réservoir via la première connexion en circuit fermé dans ladite au moins une chambre de culture cellulaire pour déposer le

32 BE2021/5524 milieu de culture sous la forme de couches de culture sur les multiples fonds parallèles de ladite au moins une chambre de culture: - incuber le milieu de culture pour propager des phages; - fournir un récipient qui est en deuxième connexion en circuit fermé avec ladite au moins une chambre de culture cellulaire, la deuxième connexion en circuit fermé comprenant un système de filtration entre ladite au moins une chambre de culture cellulaire et le récipient ; et - transférer le milieu de culture comprenant les phages propagés depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé et purifier 16 lesdits phages propagés via le système de filtration, le milieu de culture étant sous forme liquide lors du transfert depuis ladite au moins une chambre de culture vers la deuxième connexion en circuit fermé et de la purification.

15. Le procédé de production de phages selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le titre des phages purifiés est compris entre 10° à 10% pfu/mi, en particulier entre 10" et 102 pfu/ml.

16. Le procédé de production de phages selon l’une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre: - combiner les hactériophages purifiés avec un transporteur pharmaceutiquement acceptable pour produire une formulation pharmaceutique comprenant les bactériophages.

17. Le procédé de production de phages selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la couche de culture formée par le dépôt du milieu de culture dans ladite au moins une chambre de culture a une épaisseur inférieure ou égale à 10 cm, de préférence inférieure ou égale à 5 cm.